IDENTIFICAÇÃO COMPUTACIONAL DE ANOMALIAS DO GENOMA HUMANO

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1 IDENTIFICAÇÃO COMPUTACIONAL DE ANOMALIAS DO GENOMA HUMANO Tatiana Arimura Fialho

2 ROTEIRO Introdução Contextualização e motivação Fundamentação Teórica Introdução à genética Coleta e armazenamento de sequencias genéticas Alinhamento de sequencias genéticas Classificação da qualidade de leitura de sequências genéticas Rede neural Multilayer Perceptron Weka Desenvolvimento Leitura de arquivos do formato.ab1 Classificação de qualidade Alinhamento Tradução de bases para aminoácidos Análise da possibilidade de anomalia Base de dados Demonstração Conclusão Considerações Finais Contribuições Trabalhos Futuros

3 CONTEXTUALIZAÇÃO E MOTIVAÇÃO Uma mutação no gene IRF6 causa a síndrome de Van der Woude. Tal mutação tem pelo menos 50% de chance de passar de pai para filho. O centro de estudos do genoma humano realiza o teste genético. Além da pesquisa, o centro fornece diagnósticos clínico para pacientes. A principal motivação desse trabalho decorre do processo manual realizado pelos pesquisadores. Imagem adaptada de Center for disease control and prevention

4 CONTEXTUALIZAÇÃO E MOTIVAÇÃO Com o auxílio do programa Sequencher, para cada posição em que ocorra uma troca, deleção ou inserção, cabe ao pesquisador: 1. Analisar a confiabilidade de tal informação buscando a qualidade de leitura nessa posição. 2. Buscar qual a posição referente de tal anomalia em um banco de dados. 3. Verificar se já existe a troca registrada no banco de dados, e caso exista, se é um polimorfismo. 4. Caso não exista registro em banco de dados, realizar a tradução de base para aminoácido e verificar resultados. Requer a utilização de softwares auxiliares: Versões demo de software de análise genética Tradutores encontrados na web Editores de texto

5 CONTEXTUALIZAÇÃO E MOTIVAÇÃO Exemplo: No programa sequencher observa-se um troca de base. Busca se existe o polimorfismo em banco de dados, como Ensembl. Como não é encontrado, realiza-se a tradução para aminoácidos. Observa-se então uma anomalia.

6 CONTEXTUALIZAÇÃO E MOTIVAÇÃO A análise de sequências genéticas é em grande parte um processo manual. Deve ser realizada para todos os éxons do gene em questão para todo paciente. O gene IRF6 possui 9 éxons. Se existirem por exemplo 300 pacientes, a comparação de sequencias deve ser realizada 300*9 = 2700 vezes O processo é repetitivo e dispendioso para o pesquisador. Pode gerar erros, além de demora na entrega do diagnóstico do paciente, gerando ainda mais ansiedade por parte da família. Softwares que automatizem tal processo não são de livre acesso.

7 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA Serão introduzidos: Conceitos básicos de biologia que foram necessários para a realização do trabalho. Como é realizado o processo de coleta e armazenagem de sequencias genéticas em laboratório e como estas são armazenadas em arquivos. Algoritmo utilizado para alinhamento. Técnica escolhida para classificação de qualidade de leitura de sequências genéticas. Rede neural Multilayer Perceptron. Ferramenta Weka.

8 INTRODUÇÃO À GENÉTICA O gene é uma sequência de nucleotídeos representados por quatro letras (A T C G) A estrutura do DNA é dupla-hélice sendo que existe somente emparelhamento entre bases A-T e C-G O DNA é dividido em porções chamadas éxons e íntrons. DNA reside dentro do núcleo. RNA é responsável por carregar a informação genética. Retirado de Genome Retirado de TechNYou

9 INTRODUÇÃO À GENÉTICA Tradução é a transformação de códons em aminoácidos Dogma central da biologia. DNA -> transcrição -> RNA -> tradução -> proteína Fonte: JONES, N. C.; PEVZNER, P. A. An introduction to bioinformatics algorithms. MIT Press, 2004

10 INTRODUÇÃO À GENÉTICA Mutação pontual é a troca de um único nucleotídeo Polimórfica não gera qualquer anomalia Exemplo: AUG UAC GGG - Met(Metionina) Tyr(Tirosina) Gly(Glicina) AUG UAU GGG - Met(Metionina) Tyr(Tirosina) Gly(Glicina) Anômala quando o código não gera a proteína apropriada Exemplo: AUG UAC GGG - Met(Metionina) Tyr(Tirosina) Gly(Glicina) AUG UAA GGG - Met(Metionina) STOP Gly(Glicina)

11 INTRODUÇÃO À GENÉTICA A comparação é realizada entre sequências genéticas de pacientes e sequencias genéticas em banco de dados (Emsembl,HGMD, UCSC, NCBI). Caso tal troca já esteja presente no banco de dados, é possível averiguar se esta é um polimorfismo ou uma anomalia, caso contrário, é necessário realizar a tradução de bases para aminoácidos.

12 INTRODUÇÃO À GENÉTICA Vários resultados são possíveis: Que a troca de nucleotídeo gere um código de parada ao invés do aminoácido que deveria ser gerado,caracterizando uma anomalia; Que sejam gerados os mesmos aminoácidos, não influenciando na doença; Que aminoácidos diferentes sejam gerados; Nesse caso pode ocorrer ou não a anomalia

13 INTRODUÇÃO À GENÉTICA Para ser possível a comparação entre duas ou mais sequências genéticas, é necessário realizar o alinhamento. Como o DNA é dupla-fita, é possivel fazer a leitura de qualquer uma delas. (Fita F e R) Existe um sentido de leitura obrigatório conhecido como 3-5, Para a fita R é necessário encontrar o complementar reverso.

14 PROCESSO DE COLETA E ARMAZENAMENTO DE SEQUÊNCIAS GENÉTICAS O primeiro passo do sequenciamento é replicar fragmentos de DNA Um dos métodos usados é o PCR (Reação em cadeia de polimerase) n iterações = 2 n cópias Repete um ciclo de três operações: desnaturação (94ºC) priming (50 ºC) extensão(75 ºC). (Jones e Pevzner, 2004)

15 PROCESSO DE COLETA E ARMAZENAMENTO DE SEQUÊNCIAS GENÉTICAS A sequência genética é submetida a um sequenciador automático Cada base nitrogenada é associada com um corante e estes são excitados por um laser e captados por uma câmera

16 PROCESSO DE COLETA E ARMAZENAMENTO DE SEQUÊNCIAS GENÉTICAS O armazenamento do sequenciamento genetico pode ser feito em arquivos de codificação ASCII. Formatos de arquivos de sequências: EMBL, SwissProt, FASTA, GCG,XML e ABIF. Este projeto faz o uso do arquivo de extensão.ab1

17 ALINHAMENTO DE SEQUÊNCIAS GENÉTICAS Possibilita a análise de regiões semelhantes. Alinhamento par a par Entre duas sequências genéticas. Alinhamento múltiplo Entre múltiplas sequências genéticas. Alinhamento Global Alinha sequências de ponta a ponta e precisa ser feito entre sequências de tamanho parecido. Alinhamento Local Partes onde há maior taxa de similaridade entre as sequências são alinhadas. Mais adequado para sequências de tamanho diferente.

18 MÉTODO DE ALINHAMENTO PAR A PAR USANDO PROGRAMAÇÃO DINÂMICA Algoritmo de Smith-Waterman Garante matematicamente fornecer o alinhamento ótimo a partir de variáveis determinadas pelo usuário. Inclui bases semelhantes, não semelhantes e espaços entre duas sequências.

19 ALGORITMO DE SMITH-WATERMAN Dada duas sequências A = a 1 a 2 a 3...a n e B = b 1 b 2 b 3...b n s(a i, b j ) = similaridade entre a e b Para deleções de tamanho k é dado o peso W k É utilizada a matriz H H ij é a similaridade máxima entre duas sequências terminadas em a i e b j respectivamente Faça: H k0 = H 0l = 0 para 0 k n e 0 l m. H ij = max {H i-1,j-1 + s(a i,b j ), H i-1,j W k, H i,j-1 W l, 0}, tal que 1 i n e 1 j m Complexidade O(n 2 )

20 ALGORITMO DE SMITH-WATERMAN Exemplo: s(a i ; b j ) = +2 para bases iguais s(a i ; b j ) = -1 para bases diferentes W = -1 Matriz de alinhamento entre as sequências : "a t c g" e "a t g H ij = max{ H i-1,j-1 + s(a i,b j ), H i-1,j W k, H i,j-1 W l, 0 },

21 ALGORITMO DE SMITH-WATERMAN Exemplo a t c g a t - g Fazendo-se o rastreamento a partir do maior elemento encontrado obtemos o caminho: H(4,5) - H(3,4) - H(3,3) - H(2,2) O salto de H(3,4) - H(3,3) implica em uma inserção

22 CLASSIFICAÇÃO DA QUALIDADE DE LEITURA DE SEQUÊNCIAS GENÉTICAS O método de leitura de sequências genéticas pode gerar erros, e um meio de identificá-los está na análise do cromatograma.

23 CLASSIFICAÇÃO DA QUALIDADE DE LEITURA DE SEQUÊNCIAS GENÉTICAS Existem casos em que podem existir duas ou mais curvas formando picos muito próximos. Existem poucos casos em que duas bases sejam a representação de heterozigotos Cada símbolo representa uma ou mais bases nitrogenadas.

24 REDES NEURAIS Sistemas computacionais biologicamente inspirados. Neurônios fazem cálculos e juntos, em uma ou mais camadas, ganham a capacidade de aprender e generalizar informações. Capacidade de aprendizagem por meio de exemplos. Aprendizado não-supervisionado - não existe a interferência de uma parte externa para acompanhar a aprendizagem Aprendizado supervisionado - requer um supervisor que compara a saída obtida pela rede neural com a saída desejada.

25 REDES NEURAIS A arquitetura mais comum de uma rede neural artificial é composta por uma camada de entrada, possíveis camadas intermediárias e uma camada de saída. Número de neurônios e ligações entre eles podem variar. Cada neurônio contém uma função de ativação que é responsável por gerar a saída a partir dos pesos e da entrada. A funções de ativação mais comuns se apresentam na forma de degrau, sigmoidal, linear ou gaussiana.

26 REDE NEURAL MULTILAYER PERCEPTRON Composta por várias camadas Resolve problemas não-linearmente separáveis. Camadas de entrada, intermediárias e de saída. O número de camadas intermediárias e número de neurônios por camada podem variar Quanto maior o número de neurônios maior a capacidade de resolução de problemas complexos. Um número excessivo dessas camadas pode dificultar a convergência da rede. (Braga et al., 2007)

27 REDE NEURAL MULTILAYER PERCEPTRON Aprendizado supervisionado. A cada iteração os pesos de cada neurônio são ajustados após o cálculo do erro de cada camada. Para as camadas intermediárias é necessário o uso da técnica de back-propagation que alimenta as camadas anteriores com o erro obtido da camada de saída.

28 REDE NEURAL MULTILAYER PERCEPTRON Algoritmo de back-propagation Para a camada de saída: j - índice do neurônio. e(j) - vetor de erros L - indice que representa a camada do neurônio l kj φ - derivada da função de ativação φ Então é calculado o gradiente δ Para as camadas intermediárias: l kj - peso da i-ésima entrada do neurônio j da camada l

29 REDE NEURAL MULTILAYER PERCEPTRON α termo de momentum η taxa de aprendizagem y i - i-ésimo elemento do vetor de saída Y = {y 1, y 2,..., y n } Base de dados de 156 elementos observando-se o cromatograma. Obtenção de valores ideais dos parâmetros foi realizado com auxílio da ferramenta Weka.

30 WEKA Software que auxilia na aplicação de técnicas de aprendizado de máquina. Origem em um projeto em Waikato (Nova Zelândia) no ano de Aplicação de aprendizado de máquina na agricultura Desenvolvido em C Atualmente utiliza-se o Weka 3 Implementado em 1997 O Weka possui várias bibliotecas Java que implementam técnicas de aprendizado de máquina

31 WEKA Principais funcionalidades: Pré-processamento de dados.arff,.csv, conexão com banco de dados JDBC. Classificação Mais de 100 classificadores Clustering Aprendizado não supervisionado por meio do clustering Seleção de atributos Critérios de seleção e busca Visualização de dados Pode ser realizado em gráficos

32 WEKA Escolhido o dataset e classificador MLP: Taxa de acerto de 92.9% Cross-validation de 10 folds 10 camadas intermediárias Taxa de aprendizagem de 0.3 Momentum de 0.7

33 DESENVOLVIMENTO BioJava Desenvolvimento de softwares de bioinformática em Java Criada em 1999 por Thomas Down e Matthew Pocock Principais utilizações Alfabetos de nucleotídeos e aminoácidos, Entrada e saída de sequências genéticas, Programação dinâmica, Manipulação das sequências, Tradução. Foi utilizado o Biojava1.8.2 que foi lançada dia 22 de Março de A interface foi desenvolvida utilizando-se da ferramenta Swing GUI contida no IDE Netbeans.

34

35 LEITURA DE ARQUIVOS DO FORMATO.AB1 API da classe ABITrace

36 LEITURA DE ARQUIVOS DO FORMATO.AB1 Informações como o cromatograma e sequência de bases podem ser extraídos SymbolList é uma lista de símbolos que representam bases getsequence() traduz o arquivo em uma SymbolList

37 LEITURA DE ARQUIVOS DO FORMATO.AB1 O cromatograma representa em cada ponto o resultado da leitura da sequência Com a função getimage é possível exibir esses dados em uma imagem

38 LEITURA DE ARQUIVOS DO FORMATO.AB1 Somente as sequências do paciente e de controle estão no formato.ab1 e apresentam cromatograma. Para mais detalhes sobre o cromatograma, como valores das bases em pontos de pico, é possível abrir uma nova janela ao clicar em "Dados Cromatograma".

39 CLASSIFICAÇÃO DA QUALIDADE DE LEITURA Realizada com a rede neural Multilayer Perceptron Foi utilizado a biblioteca Java Weka Treinamento da rede Método learn() Faz a leitura da base de dados dataset.arff e treina a rede Vetor options define parâmetros Método verificar(int Va, int Vt, int Vc, int Vg) Transforma 4 valores em uma instância a ser classificada.

40 ALINHAMENTO Clicar do botão "Alinhar" Sequência a ser alinhada quanto a sequência de referência devem estar abertas

41 ALINHAMENTO Realizada com o uso do Biojava. Matriz de substituição Contém os pesos de bonificação ou penalização para cada par de símbolos Matriz NUC 4.4 criada por Todd Lowe

42 ALINHAMENTO Define-se duas sequências a serem alinhadas, "query"e "target". Objeto do tipo SmithWaterman define os parâmetros e qual matriz de substituição a ser usada. Chama-se a função pairwisealignment passando as duas sequências a serem alinhadas.

43 TRADUÇÃO DE BASES PARA AMINOÁCIDOS Deve ser fornecida a posição de início de tradução Saber previamente a posição de início de tradução e inserí-la no campo adequado Alinhar a sequência de referência com a sequência de RNAmensageiro e obter um alinhamento perfeito

44 TRADUÇÃO DE BASES PARA AMINOÁCIDOS getquerystart() retorna a posição de início do alinhamento Com esse resultado é possível a partir do resto da divisão deste por 3 (pois cada 3 bases definem um aminoácido), concluir a posição de início de tradução. RNATools.transcribe(symL) e RNATools.translate(symL) realizam a tradução.

45 ANÁLISE DA POSSIBILIDADE DE ANOMALIA Botão "Gerar possíveis mutações A opção só estará disponível após ser efetuado o alinhamento da sequência em questão com a de referência.

46 ANÁLISE DA POSSIBILIDADE DE ANOMALIA Na ocorrência de encontrar uma diferença de bases no alinhamento: Só será considerada como possível mutação caso a qualidade de leitura seja boa. Mesma diferença de bases existente na sequência do paciente for encontrada na sequência controle. Apenas para sequência paciente F e quando houver sequência controle Troca de bases resulta em um mesmo aminoácido Apenas quando fornecida a posição de início de tradução da sequência de referência.

47 ANÁLISE DA POSSIBILIDADE DE ANOMALIA

48 BASE DE DADOS Sequências de três pacientes, ambas as fitas F e R e dos éxons 3, 4 e 7, resultando em 18 sequências de pacientes. Sequências de referência dos éxons 3, 4 e 7. Sequências controle dos éxons 3, 4 e 7 das fitas F e R. Resultando em 6 sequências de controle. Sequência de RNAmensageiro que contém todos os éxons ordenados. Retiradas do banco de dados ensemble. Testes e implementação utilizando-se os arquivos localmente, salvos em.txt.

49 DEMONSTRAÇÃO Paciente Gene IRF6 Éxon 3

50 CONCLUSÃO Necessidade computacional pelo Centro de estudos do genoma humano. Foi essencial o conhecimento biológico para uma correta implementação do problema. Aprovado um modelo de software juntamente com pesquisadores. Interface gráfica que resulta em um software de fácil entendimento e utilização. Software desenvolvido neste trabalho será disponibilizado gratuitamente.

51 CONTRIBUIÇÕES Software poderá ser utilizado por qualquer pesquisador que busque analisar anomalias encontradas no genoma humano. Software livre. Pode ser utilizado em qualquer centro de pesquisa além de instituições de ensino. Vantagem para pesquisadores brasileiros por ter sido desenvolvido em português. Interface é de fácil entendimento e utilização Beneficia pesquisadores que não são da área computacional e alunos

52 TRABALHOS FUTUROS Existe espaço para melhorias Foi reservada à trabalhos futuros a implementação de novos módulos ao software já desenvolvido. Análise de múltiplas sequências em paralelo. Comunicação com banco de dados.

53 DÚVIDAS?

54 REFERÊNCIAS ALBERTS, B.; BRAY, D.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WATSON, J. Biologia molecular da célula. Porto Alegre: Artmed Editora, BRAGA, A. P.; CARVALHO, A. F. L. P.; LUDERMIR, T. B. Redes neurais artificiais. Rio de Janeiro: LTC, HALL, M.; FRANK, E.; HOLMES, G.; PFAHRINGER, B.; REUTEMANN, P.; WITTEN, I. H. The weka data mining software: an update. SIGKDD Explor. Newsl., v. 11, n. 1, p , Disponível em HOLLAND, R. C. G.; DOWN, T.; POCOCK, M.; PRLIC, A.; HUEN, D.; JAMES, K.; FOISY, S.; DRÄGER, A.; YATES, A.; HEUER, M.; SCHREIBER, M. J. Biojava: an open-source framework for bioinformatics. Bioinformatics, v. 24, n. 18, p , 2008a. HOLLAND, R. C. G.; DOWN, T. A.; POCOCK, M.; PRLI, A.; HUEN, D.; JAMES, K.; FOISY, S.; DRÄGER, A.; YATES, A.; HEUER, M.; SCHREIBER, M. J. Biojava: an open-source framework for bioinformatics. Bioinformatics, v. 24, n. 18, p , 2008b. Disponível em HOLMES, G.; DONKIN, A.; WITTEN, I. H. Weka: a machine learning workbench. 1994, p JEHEE, F. S.; BURIN, B. A.; ROCHA, K. M.; ZECHI-CEIDE, R.; BUENO, D. F.; BRITO,L.; SOUZA, J.; LEAL, G. F.; RICHIERI-COSTA, A.; ALONSO, N.; OTTO, P. A.;PASSOS-BUENO, M. R. Novel mutations in irf6 in nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate: When should irf6 mutational screening be done? American Journal of Medical Genetics Part A, v. 149A, n. 6, p , JONES, N. C.; PEVZNER, P. A. An introduction to bioinformatics algorithms. MIT Press, MOUNT, D. W. Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis, Second Edition. 2nd ed.cold Spring Harbor Laboratory Press, NEEDLEMAN, S. B.; WUNSCH, C. D. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. Journal of Molecular Biology, v. 48, n. 3, p , Disponível em SMITH, T. F.; WATERMAN, M. S. Identification of common molecular subsequences. Journal of molecular biology, v. 147, n. 1, p , WITTEN, I. H.; FRANK, E.; TRIGG, L.; HALL, M.; HOLMES, G.; CUNNINGHAM, S. J. Weka: Practical machine learning tools and techniques with java implementations

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