Prof a. Jennifer Lowe

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1 Prof a. Jennifer Lowe

2 A espectrofotometria - método de análises óptico mais usado nas investigações biológicas e fisico-químicas. O espectrofotômetro - instrumento que permite comparar a radiação absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma quantidade desconhecida de soluto, e uma quantidade conhecida da mesma substância.

3 Todas as substâncias podem absorver energia radiante, mesmo o vidro que parece completamente transparente absorve comprimentos de ondas que pertencem ao espectro visível. A água absorve fortemente na região do infravermelho. A absorção das radiações ultravioletas, visíveis e infravermelhas dependem das estruturas das moléculas, e é característica para cada substância química. Quando a luz atravessa uma substância, parte da energia é absorvida: a energia radiante não pode produzir nenhum efeito sem ser absorvida. A cor das substâncias se deve a absorção de certos comprimentos de ondas da luz branca que incide sobre elas, deixando transmitir aos nossos olhos apenas aqueles comprimentos de ondas não absorvidos.

4 Histórico Pierre Bouguer Nascimento 16 de Fevereiro 1698 Falecimento 15 de Agosto de 1758 Johann Heinrich Lambert 26 de Agosto de de Setembro de 1777 August Beer 31 de Julho de Novembro 1863

5 Primeiras investigações sobre a relação existente entre as intensidades de radiação incidente e transmitida: experiências de Pierre Bouguer (1729) e de Johann Heindrich Lambert (1760). Observações independentes que verificaram que as propriedades associadas ao processo de absorção de luz podem ser enunciadas em termos de duas leis fundamentais: A intensidade de luz (monocromática) transmitida por um corpo homogêneo é proporcional à intensidade de luz incidente. A intensidade de luz (monocromática) transmitida decresce exponencialmente com o aumento da espessura da camada do corpo homogêneo. Em 1852, August Beer estudou a influência da concentração de soluções coloridas sobre a transmissão de luz. A conclusão a que se chegou foi de que o valor para uma determinada substância é proporcional à sua concentração.

6 A lei de Beer é análoga à lei de Bouguer-Lambert. Bouguer e Lambert: variação na absorção de um feixe de luz, em função da variação da espessura da camada absorvente Beer: estudo no que se refere à concentração da solução, mantendo a espessura constante. Em ambos os casos, o resultado é o mesmo pois, quer se varie a concentração, quer se varie a espessura da solução a ser atravessada pela luz, em essência, aumentamos ou diminuímos o número de partículas que interagem com a radiação.

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9 O método utilizado para determinar de um modo quantitativo a concentração de substâncias em solução que absorvem radiação.

10 Através dessa lei, intensidades da radiação incidente e emergente podem ser relacionadas com as concentrações do material presente na solução. 1. São considerados desprezíveis os efeitos de reflexão, refração e espalhamento. 2. A radiação incidente deve ser monocromática, isto é, conter somente um comprimento de onda.

11 A luz que nossa visão percebe é uma pequena faixa do espectro de energia eletromagnética - conhecida como luz visível. O espectro de energia eletromagnética abrange outras faixas de luz que não são vistas pelo homem, tais como infra-vermelho, ultravioleta e raios-x. A luz síncrotron, emitida por elétrons, inclui essas quatro faixas do espectro. As características dessa luz a tornam uma ferramenta poderosa para permitir estudar as propriedades químicas, físicas e biológicas de diversos componentes da Natureza.

12 0 0 0

13 Limite de sensibilidade quando a absorbância é alta

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15 De maneira geral: três partes: Fonte de radiação: normalmente uma lâmpada incandescente. Existe também um controle de intensidade da radiação, mas é fundamental um meio de controle do comprimento da onda (por exemplo, filtros ou monocromatizadores como prismas ou grades de difração). Amostra: deve estar contida em um recipiente apropriado do tipo tubos de ensaio ou cubetas. Como normalmente medidas comparativas são feitas (uma medida somente com solvente, outra com solvente e soluto), as cubetas vêm emparelhadas. As cubetas são fabricadas o mais igual possível. Assim, no resultado final, somente o soluto faz uma contribuição à absorção. Detetor: é um elemento sensível à radiação e que pode nos dar uma medida da intensidade da mesma; varia desde foto-moléculas até o próprio olho. Um indicador no aparelho converte o sinal do elemento em um número. Os instrumentos em geral dispõe de duas escalas: uma delas nos dá a transmitância T e a outra dá a absorbância

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17 Em placa

18 Espectros de absorção

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20 Quantificação de: Proteínas totais e albumina no plasma Lipídeos totais e colesterol no plasma Glicose no plasma e na urina Glicose no sangue total e na urina Ácido Úrico no plasma e na urina Uréia no plasma e na urina Creatinina no plasma e na urina

21 Cálculo da equação de Lambert-Beer: ml

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23 A radiação ultravioleta (R-UV) é a parte do espectro eletromagnético Referente aos comprimentos de onda entre 100 e 400 nm Shortwave UV - causes skin redness and eye irritation, but does NOT cause skin cancer or cataracts. At nm:sterile Prolonged exposure could result in unhealthy effects on the skin and eyes. Long wave UV - blacklight, responsible for skin tanning is also used in medicine to treat certain skin disorders

24 Técnica de análise quantitativa baseada na propriedade de certas espécies químicas de emitirem fluorescência. A quantificação das espécies químicas se dá pela medida da fluorescência da substância a ser analisada. Átomos, moléculas ou sólidos que são excitados a níveis mais altos de energia podem cair a níveis mais baixos, emitindo radiações (emissão ou luminescência).

25 Átomos excitados por uma fonte de energia de alta temperatura esta emissão de luz é comumente chamado atômica ou de emissão óptica (espectroscopia de emissão atômica). Átomos excitados com luz é chamado de fluorescência atômica (espectroscopia de fluorescência atômica).

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28 Frog olfactory bulb neurons labeled with fluo-3 (Cat. no. F1240, F3715) and Fura Red (Cat. no. F14219) Ca 2+ indicators, demonstrating a Ca 2+ response to treatment with KCl and nifedipine. (J Physiol 487, 305 (1995)) The image is a ratio of fluo-3 and Fura Red fluorescence images acquired with a Leica confocal laser-scanning microscope. The image was contributed by J. Bischofberger and D. Schild, Physiology Institute, University of Göttingen.

29 Microscopia confocal Imunofluorescência

30 Aequorea victoria

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32 Prêmio Nobel de Química de 2008: Descoberta da GFP e seu uso na biologia Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien 1/3 of the prize 1/3 of the prize 1/3 of the prize USA USA USA Marine Biological Laboratory (MBL) Woods Hole, MA, USA; Boston University Medical School Massachusetts, MA, USA Columbia University New York, NY, USA University of California San Diego, CA, USA; Howard Hughes Medical Institute b (in Kyoto, Japan) b b. 1952

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