Relatório Final. Síntese de Nanopartículas (Ag e Au) em fluxo contínuo como fonte de substratos para análise SERS (SurfaceEnhanced Raman Scattering)
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- Sabina Figueiroa Anjos
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1 Relatório Final Síntese de Nanopartículas (Ag e Au) em fluxo contínuo como fonte de substratos para análise SERS (SurfaceEnhanced Raman Scattering) Aluna: Juliana Brasil Villela Linhares Orientador: Omar Pandoli Rio de Janeiro, 16 de Julho de 2016
2 ÍNDICE 1. RESUMO INTRODUÇÃO OBJETIVOS PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Síntese de Nanopartículas Limpeza, Hidroxilação e Silanização dos Vidros para Impregnação Limpeza do vidro Hidroxilação do vidro Silanização dos vidros com MPTS e funcionalização com Ag-NPs Testes analíticos UV-Vis para a determinação quantitativa dos fármacos Em Batelada Em Fluxo RESULTADOS E DISCUÇÕES Caracterização das NPs Espectroscopia de Absorção phmêtro Potencial Zeta Impregnação de NPs no vidro Testes analíticos UV-Vis para a determinação quantitativa dos fármacos em batelada e fluxo contínuo Análise espectroscópica UV- Vis da interação Fármaco-Ag-NPs em Batelada Análise espectroscópica UV- Vis da interação Fármaco-Ag-NPs em Fluxo contínuo CONCLUSÕES REFERÊNCIAS...21
3 1. Resumo A preparação de nanopartículas (NPs) é um desafio de fundamental importância na área da nanociência, pois elas podem ser utilizadas como nanosondas, onde as NPs em solução ou depositadas sob substratos sólidos são usadas como detectores de analitos de interesse biológico. Foi feito um estudo sobre a síntese e caracterização das nanopartículas de prata (NPs-Ag) com diferentes ligantes, analisando, após cada síntese, as nanopartículas por espectroscopia UV-Vis. Subdividiu-se, então, o projeto em duas áreas: a impregnação da nanopartícula sobre o vidro e a detecção do fármaco pela nanopartícula em solução. A primeira tinha o intuito de criar um filme homogêneo de nanoparticulas no vidro para substrado SERS. Já a segunda parte, tinha como objetivo determinar a menor concentração de fármaco possível para a detecção deste numa solução coloidal de nanoparticulas. 2. Introdução A descoberta das nanopartículas de prata (NPs-Ag) trouxeram vários benefícios para a sociedade. Seus campos de aplicação são informática, medicina, química analítica, optoeletrônica, biotecnologia, catálise e muitos outros. Todo esse espaço de aplicações que se abre é devido às propriedades espectroscópicas peculiares das NPs. Em particular, o fenômeno de ressonância plasmônica de superfície (SPR- Surface Plasmons Ressonance) se manifesta quando a frequência de oscilação dos elétrons na superfície metálica das NPs entra em ressonância com a frequência de oscilação da luz electromagnetica incidente [1]. SPR é um fenômeno que ocorre na fronteira de um metal na nano escala, quando excitado por um campo eletromagnético externo. Os elétrons livres na superfície do metal são induzidos pelo campo eletromagnético, gerando uma oscilação máxima em determinada frequência, caracterizando a ressonância com a frequência de oscilação da luz incidente. Por causa disso, soluções coloidais de nanopartículas de prata (NPs- Ag) apresentam coloração amarelada quando o diâmetro destas são de 5-25 nm. Essa frequência de ressonância está diretamente ligada à forma, tamanho, organização das nanopartículas e índice de refração do meio. Desse modo, é possível que nanopartículas de mesma natureza apresentem frequências diferentes, através da variação destas propriedades. Através da espectroscopia na região visível do ultravioleta (UV-Vis), é possível analisar o fenômeno SPR das nanopartículas em solução. O resultado é uma banda de absorção característica da dispersão das nopartículas em solução, que representa a superposição das fenômenos SPR das partículas examinadas. No caso, as NPs-Ag são esféricas e possuem diâmetro entre nm, a solução coloidal apresenta uma banda de absorção com um máximo de absorção em torno de 400 nm [2]. A síntese de nanopartículas metálicas pode ser feita no método clássico em batelada ou em fluxo contínuo através da tecnologia de reatores microfluídicos. O uso de tecnologias em fluxo contínuo pode apresentar uma série de vantagens em comparação a um processo em batelada mais tradicional, pois, devido à elevada relação superfície/volume encontrada nestes microrreatores, a transferência de calor é
4 muito eficiente, permitindo desta forma a doação ou remoção de calor de forma extremamente eficiente. Além disso, as características relacionadas à transferência de massa são melhoradas devido ao fenômeno eficiente de micromixing, que é a rápida mistura dos reagentes e pode-se observar uma maior homogeneidade de temperatura, por exemplo, quando são utilizados estes microrreatores. Esses dispositivos contribuem de forma vantajosa em termos de segurança de transformações químicas, redução dos passos da reação e de produtos secundários, maximização do rendimento, minimização do tempo de reação, redução no consumo de energia e aumento na seletividade da reação. A utilização de microrreatores tem chamado à atenção tanto no ambiente acadêmico quanto no industrial em virtude da sua elevada eficiência no gerenciamento do calor e da cinética reacional. É possível variar a velocidade de fluxo, o tempo de reação, razão molar entre as espécies, a temperatura e a pressão do sistema reacional [3]. Após a síntese das nanopartículas, devido à sua elevada reatividade da superfície metálica, é necessário estabilizá-las, caso contrário elas agregarão em alguns dias. Uma maneira de realizar a estabilização é adicionar excesso de borohidreto de sódio, pois após a redução da prata, ele fica adsorvido na superfície das nanopartículas, dotando-as de cargas negativas, dificultando a agregação por repulsão colombiana. De outra forma é possível utilizar templantes orgânicos capazes de complexar o íon Ag + para induzir a nucleação, crescimento e agregação das nanopartículas metálicas e, desta forma, controlar a morfologia e a monodispersão dos coloides [2]. NPs-Ag em solução ou depositadas sob substratos sólidos, se usadas como detectores de analitos de interesse biológicos são chamadas nanosondas. Quando uma molécula biológica interage sobre a superfície metálica de uma nanopartícula, a propriedade físico-química muda e assim uma alteração do fenômeno de ressonância plasmônica pode ser observado. Por exemplo, numa solução coloidal de NPs na presença de um analito é possível observar uma mudança da banda de absorção característica das NPs (supressão, aumento ou deslocamento). O interesse pelo desenvolvimento de nanosondas analíticas é devido à sensibilidade do fenômeno SPR que facilitam a detecção de espécies químicas diversas e pela multiplicidade de detectação de alterações no sinal da nanosonda. A deposição de monocamadas de NPs-Ag sobre o vidro visa o desenvolvimento de métodos analíticos Lab-on-chip para a determinação de substâncias de interesse clínico-biológico. Com as NPs-Ag ligadas quimicamente ao vidro, é possível fazer a avaliação da atividade espectroscópica UV-VIS e SERS (Surface Enhanced Raman Scattering) em presença de um analito específico adsorvido fisicamente na superfície metálica das nanosondas. A espectroscopia Raman amplificada é uma técnica analítica altamente sensível que resulta na ampliação da dispersão Raman por absorção de moléculas sobre superfícies metálicas de prata ou ouro. O fator de amplificação pode ser da ordem de , o que permite que a técnica seja suficientemente sensível para detectar moléculas isoladas. Esta intensificação permite detectar compostos, cujas concentrações são da ordem de 10-6 a mol L -1. As principais características do efeito SERS, que o tornam uma das melhores técnicas para estudo de superfícies são: boa resolução e largo intervalo espectral; nenhuma limitação quanto à fase em contato com a superfície; intensificação do sinal Raman só ocorre na interface, não há interferência do espectro Raman de moléculas na vizinhança; aplicações em fase sólida e em fase líquida; um grande número de moléculas adsorvidas já foram estudadas por SERS, formando um banco de dados enorme [4].
5 3. Objetivo O projeto tem como objetivo sintetizar em fluxo contínuo e caracterizar nanopartículas de prata com diferentes ligantes para criação de filmes finos de Ag- NPs sobre o vidro e seu uso como nanosonda pela detecção de fármacos. 4. Procedimento Experimental 4.1 Síntese de Nanopartículas A síntese de NPs-Ag na presença de um ligante orgânico foi realizada em fluxo com auxilio de duas bombas seringas. Em uma seringa contendo o precursor de prata e na outra o precursor do ligante desejado (tartarato de sódio e potássio, oxalato de sódio e citrato de sódio). Ambas são fluxadas na mesma vazão passando por um microrreator, onde ocorre a formação do complexo Ag + -Ligante. O complexo é recolhido em um vial (recipiente de vidro) sobre agitação magnética de 900 RPM contendo sódio borohidreto (NaBH 4 ) como agente redutor. A fim de aumentar a eficiência da interação entre o fármaco e a nanosonda de prata, um estudo foi realizado variando as concentrações de ligantes nas seguintes proporções de Ag/Ligante/Boroidreto1:1:1,25 e 1:0,5:1,25. A primeira proporção foi obtida pela preparação de uma solução de 10-3 mol L -1 de AgNO 3 e do ligante desejado e uma solução de 1,25*10-3 mol L -1 de NaBH 4, já para a segunda proporção a única diferença foi a concentração da solução do ligante, a qual foi de 0,5*10-3 mol L -1. A solução de borohidreto de sódio foi mantida na geladeira durante a síntese para não se decompor rapidamente. Água, soluções do ligante e de AgNO 3 foram utilizadas para limpar o microrreator antes da sua utilização. Um volume de 4 ml de NaBH 4 foi colocado no vial de 20 ml e aquecido à temperatura ambiente. Os fluxos foram iniciados a uma velocidade de 0.25 ml s -1 e terminados quando o volume adicionado atingiu 4 ml de cada solução. Após cada síntese a caracterização físico-química das dispersões de nanopartículas foi realizada por espectroscopia UV-Vis, phmêtro e potencial Zeta. A metodologia de síntese é representada na Figura 1. Figura 1 Esquema da síntese de NPs-Ag em microrreator. 4.2 Limpeza, Hidroxilação e Silanização dos Vidros para Impregnação Para a formação do filme homogênio de NPs-Ag sobre o vidro um procedimento de limpeza, hidroxilação e silanização dos vidros foi feito. Primeiramente, limpou-se os vidros com água, detergente neutro (extran) e um pano macio. Em seguida, retirouse o detergente com água destilada e logo MilliQ. Colocou-se os vidros em uma cuba de teflon com água MilliQ e levou-se ao ultrassom por 10 min.
6 4.2.1 Limpeza Os vidros foram secos e transferidos para uma cuba limpa e em seguida foi adicionado 25 ml de solução de C 2 HCl₃ (tricloroetileno), permanecendo no ultrassom por 10 min. Após isto, os vidros foram transferidos para outro suporte e colocados em outra cuba contendo 25 ml de acetona, permanecendo no ultrassom por 10 min. Posteriormente, os vidros foram transferidos para outra cuba contendo 25 ml de etanol, sendo levados ao ultrassom por mais 10 min. Repetiu-se esta etapa. Os vidros foram secos com N₂ e depois deixados na estufa a 100 ºC por 10 min Hidroxilação A hidroxilação da superfície do vidro pode ser feita de duas maneiras: utilizando o Plasma Cleaner de O 2 ou uma solução piranha. E tem como objetivo a ativação grupos siloxano (Si-O-Si) em Si-OH, como demonstrado na Figura 2. Figura 2 Processo de Hidroxilação da superfície de vidro. a) Plasma Cleaner: a superfície interna da câmera do Plasma Cleaner (aparelho que cria nuvem de plasma) foi limpa com álcool isopropílico. Primeiramente fez-se a ativação do plasma para uma limpeza interna do equipamento (2 min no vácuo e 3 min no plasma em High Frequency). Posteriormente, os vidros limpos foram inseridos no Plasma Cleaner no centro da câmara, criando um vácuo por 2 minutos. Após isso o plasma foi ligado e ao aparecer uma nuvem de plasma de cor roxa, deixou-se a nuvem de plasma em contato como vidro por 3 min. b) Solução Piranha: os vidros foram colocados num suporte limpo e inseridos em uma cuba contendo 25 ml desta solução, a qual é constituída de ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio numa razão volumétrica (3:1). Após isso a cuba foi colocada em banho-maria a 70 C por 40 min. Posteriormente, o suporte foi colocado em uma cuba com 25 ml de água MilliQ e deixado no ultrassom por 2 min para retirar o excesso de solução piranha. Por fim, os vidros foram enxaguados com jato de água MilliQ e secos com N 2. Após a hidroxilação os vidros foram colocados em um suporte limpo para serem silanizados com MPTS (3-mercaptopropiltrimetoxisilano) pela introdução do novo grupo funcional -SH Silanização dos vidros com MPTS e funcionalização com Ag-NPs Para este procedimento, o suporte de amostras com os vidros hidroxilados foi transferido para uma cuba limpa contendo MPTS (3-mercaptopropiltrimetoxisilano) 2,5% em tolueno anidro em banho-maria, a 40 C por 2 e 4 h. Em seguida, enxaguouse os vidros no ultrassom em três diferentes soluções por 5 min cada: tolueno (100%),
7 tolueno/etanol (1:1) e etanol (100%). Por fim, os vidros foram secos com N₂ e deixados na estufa a 100 C por 5 min. Depois da funcionalização dos vidros com MPTS, os vidros foram imersos em solução de NPs-Ag e deixados por 1 hora, 12 horas e 24 horas, a fim de se verificar a formação do filme de NPs-Ag sobre o vidro. O mecanismo da silanização e impregnação da NPs estão ilustrados na Figura 3. Figura 3 Silanização e deposição de NPs-Ag sobre vidro. 4.3 Testes analíticos UV-Vis em batelada e fluxo para a determinação quantitativa dos fármacos Esse estudo consiste na síntese das dispersões de nanopartículas e na análise espectroscópica UV-VIS das dispersões aquosas de NPs-Ag na presença do fármaco em diferentes concentrações com o auxilio do espectrofotômetro UV-VarianCary 50scan. A interação NPs-Fármaco é analisada por meio de mudanças no espectro de absorção da solução coloidal de Ag-NPs (supressão, aumento ou deslocamento). Isso foi feito por dois métodos diferentes: análise no UV-Vis em batelada e no em fluxo. A síntese das NPs-Ag foi feita da mesma maneira explicitada anteriormente e foram usados três ligantes diferentes, o tartarato de sódio e potássio, o citrato de sódio e o oxalato sódio e dois fármacos (canamicina e o trisulfato de neomicina) ambos no intervalo de concentrações entre 10-6 a 10-8 mol L Em Batelada Para a preparação das amostras NPs-Ag/Fármaco, as dispersões de NPs-Ag foram diluídas de maneira a obter uma absorbância em torno de 0,3 u.a. Após isso, 1,80 ml de NPs-Ag foram transferidas para eppendorfes junto com 0,20 ml de fármaco em diferentes concentrações e em seguida a mistura foi homogeneizada manualmente. Nesta condição, e com a devida proporção, os fármacos foram analisados em uma faixa de concentração de 5*10-7 a 10-9 mol L -1. Após 5 minutos foi realizada uma análise espectroscópica UV-Vis. Para descontar a influência da diluição, primeiramente, foi feito a análise da nanopartícula diluída com 0,20mL de água (branco).
8 4.3.2 Em Fluxo Para o método de analise em fluxo contínuo foi utilizado o espectrofotômetro UV-Vis OceanOptics. O sistema consta de duas bombas, tubulações de teflon, uma junção em T, cabos de fibra ótica, uma cela de fluxo de 1 cm de caminho óptico, uma fonte continua de luz UV-Vis, um detector com câmera CCD e um computador. O sistema assemblado pode ser observado na Figura 4. Descarte Cabos de fibra ótica Fonte Célula de Fluxo Bombas e seringas Junção em T Detector Figura 4- Sistema para a análise espectroscópica UV-Vis em fluxo continuo. Para realizar a análise espectroscópica UV-Vis, duas seringas de 10 ml são preenchidas respetivamente com uma dispersão de NPs-Ag e fármaco. Posteriormente são conectadas com tubulações de 500 µm de diâmetro interno e 30 cm de comprimento a uma junção a T. Na saída é conectada uma terceira tubulação de 90 cm de comprimento ligada à cela de fluxo. A dispersão de nanopartículas entra em contato com a solução de fármaco na junção T, se mistura ao longo do tubulação de 90 cm e entra na cela de fluxo para ser analisada. Após a cela de fluxo, a solução é despejada em um recipiente para descarte. O detector UV-Vis transmite a informação desejada para o computador e com isso o programa gera uma curva de absorção para sucessiva análise. Com o fluxo é possível variar a vazão de cada componente, possibilitando assim a mistura das nanopartículas com diferentes concentrações de fármacos. Primeiramente, foi feito uma análise somente com as NPs-Ag, alterando sua vazão, para que o parâmetro, velocidade de fluxo, não influenciasse a intensidade do espectro de absorção e consequentemente o estudo espectroscópico na presença do fármaco. Após isso, foi utilizado somente as NPs-Ag e água, para descontar também o efeito da diluição. Por fim, foi feito a análise com o fármaco, inserindo nas bombas uma seringa com o fármaco desejado e a outra com as NPs. As nanopartículas foram diluídas novamente de maneira a obter uma absorbância em torno de 0,3 u.a. e soluções de fármaco de concentração iguais a 10-6, 10-7, 10-8 mol L -1 foram preparadas. A vazão da bomba que continha a nanopartícula foi mantida constante em 0,4 ml/min e a vazão da que continha o fármaco foi variada entre 0,1, 0,2, 0,3 e 0,4 ml/min, proporcionando diferentes concentrações deste.
9 5. Resultados e Discussões 5.1 Caracterização das NPs Espectroscopia de Absorção Após cada síntese as nanopartículas eram analisadas no UV-Vis. A Figura 6 apresenta as diferenças entre as bandas SPR na presença dos diferentes ligantes em exame. Figura 5. Banda de absorção UV-Vis da solução coloidal Ag-NPs com os ligantes: oxalato de sódio (preto), tartarato de sódio e potássio (vermelho) e citrato de sódio (azul) phmêtro Além do UV-Vis, após cada síntese as nanopartículas foram analisadas no phmêtro. Nas tabelas 1 e 2 são indicados os ph de cada dispersão de nanopartículas, concentrada e diluída. Tabela 1: ph das NPs-Ag concentradas Ligante Proporção ph Citrato 1:1 8,30 Citrato 1:0,5 8,35 Tartarato 1:1 5,50 Tartarato 1:0,5 5,50 Oxalato 1:1 7,98 Oxalato 1:0,5 7,63
10 Tabela 2: ph das NPs-Ag diluídas para uma absorbância em torno de 0,3 u.a. Ligante Proporção ph Citrato 1:1 7,43 Citrato 1:0,5 5,62 Tartarato 1:1 5,68 Tartarato 1:0,5 5,68 Oxalato 1:1 5,23 Oxalato 1:0,5 5, Potencial Zeta Outra técnica para a caracterização das nanoparticulas é o potencial Zeta, onde é obtido a carga eletrostática superficial das nanopartículas. Na tabela 3 são indicados os valores de potencial Zeta das nanopartículas com os diferentes ligantes. Tabela 3: Valores de Potencial zeta das NPs-Ag concentradas Ligante Proporção Potencial Zeta (mv) Media(mV) Citrato 1:1-50,2-40,9-40,7-43,9 Citrato 1:0,5-77,0-76,0-74,2-75,7 Tartarato 1:1-96,3-71,7-83,1-83,7 Tartarato 1:0,5-88,0-93,6-97,1-92,9 Oxalato 1:1-98,3-110,6-103,0-104,0 Oxalato 1:0,5-115,1-100,7-103,0-106,3 5.2 Formação de Filme NPs-Ag no vidro Para essa etapa foram sintetizadas nanopartículas de prata com os ligantes tartarato e oxalato, os dois nas proporções de 1:1 e 1:0,5. Primeiramente a hidroxilação foi feita utilizando o Plasma Cleaner de O 2, já que este método é mais ecológico e seguro. Porém, após os vidros terem permanecido 24 horas nas soluções de nanopartículas, não foi observado a formação de filme com nenhum dos ligantes. Mudou-se então, o processo de limpeza e hidroxilação, fazendo esta por meio da solução piranha. Após as 24 horas as nanopartículas de tartarato não tinham impregnado no vidro, porém as de oxalato formaram o filme desejado.
11 5.3 Testes analíticos UV-Vis para a determinação quantitativa dos fármacos em batelada e fluxo continuo Para esse estudo foram utilizadas nanopartículas com três ligantes diferentes, o oxalato de sódio, o tartarato de sódio e potássio e o citrato de sódio, e dois fármacos, a canamicina e o trisulfato de neomicina. Essa variedade tinha o intuito de estabelecer qual ligante possuí uma melhor resposta quando entra em contato com um determinado fármaco em exame Análise espectroscópica UV- Vis da interação Fármaco-Ag-NPs em Batelada a. NPs-Ag na presença de Oxalato de Sódio e Canamicina Variação da banda de absorção UV-Vis da solução coloidal Ag-NPs na presença do fármaco, canamicina, no intervalo de concentração entre 10-7 e 10-9 mol L -1 é representada na figura 6. Como é possível observar pelos espectros, o oxalato não apresentou um limite de detecção muito baixo, já que não há uma diferença significativa entre a banda SPR da dispersão de nanoparticula pura e daquela com fármacos a 10-8 e 10-9 mol L -1 (concentração final). Devido a isso, os outros ligantes orgânicos foram estudados com o intento de obter resultados mais satisfatórios. Figura 6. Variação da banda de absorção UV-Vis da solução coloidal Ag-NPs-Oxalato na presença do fármaco, canamicina, no intervalo de concentração entre 10-7 e 10-9 mol L -1. b. NPs-Ag na presença de Tartarato de Sódio e Potássio e Canamicina/Neomicina Na figura 7 podemos observar que a intensidade da banda de absorção das NPs-Ag diminui conforme a concentração da canamicina aumenta, e, além disso, uma nova banda começa a se formar na faixa entre 550 e 650 nm a partir de uma elevada concentração de fármaco, maior de 10-7 mol L -1. Após testes iniciais, foi possível concluir que as nanopartículas de tartarato que possuíam uma melhor resposta eram as que estavam na proporção de 1:0,5 (Agtartarato).
12 Figura 7. Variação da banda de absorção UV-Vis da solução coloidal Ag-NPs-Tartarato (1:0,5) na presença do fármaco, canamicina, no intervalo de concentração entre 10-6 e 10-9 mol L -1. Figura 8. Variação da banda de absorção UV-Vis da solução coloidal Ag-NPs-Tartarato (1:0,5) na presença do fármaco, neomicina, no intervalo de concentração entre 10-7 e 10-9 mol L -1. Também nesse caso, com a adição do fármaco, foi observado o crescimento de uma nova banda e a diminuição da intensidade da banda de absorção das NPs-Ag em 400nm a partir de uma concentração de10-8 mol L -1. Foi possível observar também que o limite de detecção diminuiu quando comparada com as NPs-Ag com oxalato, já que para o tartarato o limite foi de 10-9 mol L -1, tanto para a canamicina quanto para a neomicina. c. NPs-Ag na presença de Citrato de Sódio e Canamicina/Neomicina Na Figura 9 é possível perceber que com o aumento da concentração de canamicina a intensidade de absorção da dispersão NPs-Ag diminui e, além disso, nas concentrações de 5*10-7 e 10-7 mol L -1 uma nova banda surge em torno de 500nm.
13 Figura 9. Variação da banda de absorção UV-Vis da solução coloidal NPs-Ag-citrato (1:0,5) na presença do fármaco, canamicina, no intervalo de concentração entre 5*10-7 e 10-9 mol L -1. Observa-se também que entre as concentrações de 10-9, 5*10-9 e 10-8 mol L -1 não houve uma mudança significativa na banda, isso se deve provavelmente devido à baixa concentração do fármaco. Como nos casos anteriores, as nanopartículas de citrato que tiveram uma melhor resposta foram as de 1:0,5. Figura 10. Variação da banda de absorção UV-Vis da solução coloidal NPs-Ag-citrato (1:0,5) na presença do fármaco, neomicina, no intervalo de concentração entre 5*10-7 e 10-9 mol* L -1. Igualmente aos outros casos, com o aumento da concentração da neomicina houve uma diminuição da intensidade de absorção, porém o surgimento de outra banda só ocorreu quando a concentração de fármaco era igual a 5*10-7 mol L -1. No caso da neomicina, não houve uma grande diferença nas bandas de concentrações iguais a 5*10-9 /10-9 e 5*10-8 /10-8 mol L -1, porém houve uma diminuição da intensidade entre10-9 e 10-8 mol L -1.
14 5.3.2 Analise espectroscópica UV- Vis da interação Fármaco-Ag-NPs em Fluxo contínuo Para iniciar o estudo espectroscópico da interação do fármaco na presença de nanoparticulas em fluxo continuo, é necessário fazer testes para isolar o efeito da vazão e da diluição com água. Primeiramente foi variada a vazão da dispersão coloidal de NPs-Ag entre 0,1 e 0,6 ml min -1 e com isso não foi observada nenhuma variação na banda de absorção da dispersão coloidal, como pode ser confirmado na Figura 11. Figura 11. Variação da banda de absorção UV-Vis da solução coloidal Ag-NPs com a variação da vazão do fluxo entre 0,1 e 0,6 ml min -1. Após isso, foi feito o teste UV-Vis para determinar o efeito da diluição da dispersão NPs-Ag fluxando o solvente água. Tendo constante o fluxo de NPs-Ag com vazão igual a 0,4 ml min -1, a água, na outra bomba, foi injetada com diferentes vazões, de 0,1 à 0,4 ml min -1. Figura 12. Variação da banda de absorção UV-Vis da solução coloidal Ag-NPs com fluxo constante a 0,4 ml min -1 com a variação da vazão da água entre 0,1-0,4 ml min -1.
15 a. NPs-Ag na presença de Tartarato de Sódio e Potássio e Canamicina Para a análise UV-VIS das NPs-Ag com o tartarato foi utilizado a canamicina nas concentrações de 10-5 e 10-6 mol L -1. O fluxo da bomba de Ag-NPs foi mantido constante em 0.4 ml min -1, enquanto a de fármaco teve sua vazão variada de 0, 0.1, 0.2, 0.3 e 0.4 ml min -1. Com essas vazões e uma solução aquosa do fármaco à 10-6 mol L -1, as concentrações finais da canamicina após a mistura em fluxo com a dispersão coloidal de Ag-NPs foram de 0, 2*10-7, 3*10-7,4.29*10-7 e 5*10-7 mol L -1, como é observado na Figura 13. Figura 13. Variação da banda de absorção UV-Vis em fluxo da solução coloidal Ag-NPs na presença do fármaco, canamicina, nas concentrações de 2*10-7, 3*10-7, 4.29*10-7,5*10-7 mol L -1 respetivamente com uma vazão 0.1, 0.2, 0.3 e 0.4 ml min -1. Já para a canamicina a 10-5 mol L -1, as concentrações finais foram de 0, 2*10-6, 3*10-6, 4.29*10-6 e 5*10-6 mol L -1, como pode ser observado na Figura 14.
16 Figura 14. Variação da banda de absorção UV-Vis em fluxo da solução coloidal Ag-NPs na presença do fármaco, canamicina, nas concentrações de 2*10-6, 3*10-6,4.29*10-6,5*10-6 mol L -1 respetivamente com uma vazão 0.1, 0.2, 0.3 e 0.4 ml min -1. Com os espectros apresentados nas Figuras 13 e 14 é possível plotar o gráfico da absorbância máxima em 404 nm versus a vazão (ml min -1 ) e com isso desconsiderar o efeito desta, e concluir qual é o real efeito da interação fármaco e Ag-NPs. Isso pode ser observado na Figura 15. 0,28 Agua 0,23 Canamicina 10^- 6M 0,18 0,13 0,08 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Canamicina 10^- 5M Figura15. Gráfico da Absorbância ( λmax em 404nm) vs Vazão da água e da canamicina 0.1, 0.2, 0.3 e 0.4 ml min -1. A concentração da canamicina é mantida costante à 10-5 e 10-6 mol L -1. b. NPs-Ag na presença de Citrato de Sódio diidratado e Canamicina/ Neomicina Já para a análise com o citrato foi utilizado a canamicina e a neomicina nas concentrações de 10-8, 10-7 e 10-6 mol L -1. O fluxo da bomba de Ag-NPs foi mantida
17 constante em 0.4 ml min -1, enquanto a de fármaco teve sua vazão variada de 0, 0.1, 0.2, 0.3 e 0.4 ml min -1. Com essas vazões e a canamicina a 10-8 mol L -1, as concentrações finais dela foram de 0, 2*10-9, 3*10-9, 4.29*10-9 e 5*10-9 mol L -1, como é observado na Figura 16. Figura 16. Variação da banda de absorção UV-Vis em fluxo da solução coloidal Ag-NPs na presença do fármaco, canamicina, nas concentrações de 2*10-9, 3*10-9, 4.29*10-9,5*10-9 mol L -1, respetivamente, com uma vazão 0.1, 0.2, 0.3 e 0.4 ml min -1. Já para a canamicina a 10-7 mol L -1, as concentrações finais foram de 0, 2*10-8, 3*10-8, 4.29*10-8,5*10-8 mol L -1. Os espectros UV-Vis são representados na Figura 17. Figura 17. Variação da banda de absorção UV-Vis em fluxo da solução coloidal Ag-NPs na presença do fármaco, canamicina, nas concentrações de 2*10-8, 3*10-8, 4.29*10-8,5*10-8 mol L -1, respetivamente, com uma vazão 0.1, 0.2, 0.3 e 0.4 ml min -1.
18 E para a canamicina a 10-6 M, as concentrações finais foram de 0, 2*10-7, 3*10-7, 4.29*10-7 e 5*10-7, como pode ser observado na Figura 18. Figura 18. Variação da banda de absorção UV-Vis em fluxo da solução coloidal Ag-NPs na presença do fármaco, canamicina, nas concentrações de 2*10-7, 3*10-7, 4.3*10-7,5*10-7 mol L -1, respetivamente, com uma vazão 0.1, 0.2, 0.3 e 0.4 ml min -1. Da mesma maneira que para o tartarato, o gráfico da absorbância versus a vazão foi feito a fim de descobrir a verdadeira influência do fármaco. Figura 19.Gráfico da Absorbância ( λmax em 404nm) vs Vazão da água e da canamicina 0.1, 0.2, 0.3 e 0.4 ml min -1. A concentração da canamicina é mantida costante à 10-6 e 10-7 e 10-8 mol L -1. A partir da Figura 19 é possível observar que nas concentrações de 10-8 e 10-7 mol L -1 não houve uma mudança muito significativa da absorbância máxima da NPs, ou seja, as diminuições observadas nas Figuras 16 e 17 eram de fato o efeito da vazão. Porém, quando a concentração da canamicina foi de 10-6 mol L -1 ocorreu uma diminuição da intensidade de absorção, a qual é demostrada pela linha rosa.
19 O mesmo foi feito para a neomicina, utilizando as mesmas vazões e concentrações. Os espectros de 10-8, 10-7 e 10-6 mol L -1 e o gráfico da Abs vs Vazão são encontrados abaixo. Figura 20. Variação da banda de absorção UV-Vis em fluxo da solução coloidal Ag-NPs na presença do fármaco, neomicina, nas concentrações de 2*10-9, 3*10-9, 4.29*10-9,5*10-9 mol L -1, respetivamente, com uma vazão 0.1, 0.2, 0.3 e 0.4 ml min -1. Figura 21. Variação da banda de absorção UV-Vis em fluxo da solução coloidal Ag-NPs na presença do fármaco, neomicina, nas concentrações de 2*10-8, 3*10-8, 4.29*10-8,5*10-8 mol L -1, respetivamente, com uma vazão 0.1, 0.2, 0.3 e 0.4 ml min -1.
20 Figura 22. Variação da banda de absorção UV-Vis em fluxo da solução coloidal Ag-NPs na presença do fármaco, neomicina, nas concentrações de 2*10-7, 3*10-7, 4.29*10-7,5*10-7 mol L -1, respetivamente, com uma vazão 0.1, 0.2, 0.3 e 0.4 ml min -1. Figura 23. Gráfico da Absorbância vs Vazão da água e da neomicina a 10-8,10-7 e 10-6 mol L -1. Comprimento de onda utilizado: 404nm Igualmente a canamicina, a neomicina nas concentrações de 10-8 e 10-7 mol L -1 não apresentaram, uma mudança muito significativa da absorbância máxima da NPs, ou seja, as diminuições observadas nas Figuras 20 e 21 também eram o efeito da vazão. Mas, a neomicina a 10-6 demonstrou uma diminuição da intensidade máxima, portanto na figura 22 também há a influência do fármaco. Tabela 4. Resumo das concentrações dos fármacos em exame detectados em solução coloidal de NPs-Ag em batelada Limite de detecção Oxalato de Sódio Tartarato de Sódio Citrato de Sódio do fármaco mol L -1 e Potássio Canamicina 1,0 x10-7 (Fig. 6) 1,0 x 10-9 (Fig.7) 1,0 x 10-9 (Fig.9) Neomicina ,0 x 10-9 (Fig.8) 1,0 x 10-9 (Fig.10)
21 Tabela 5. Resumo das concentrações dos fármacos em exame detectados em solução coloidal de NPs-Ag em fluxo contínuo Limite de detecção do fármaco mol L -1 Tartarato de Sódio e Potássio Citrato de Sódio Canamicina 1,0 x 10-6 (Fig.15) 1,0 x 10-6 (Fig.19) Neomicina ,0 x 10-6 (Fig.23) 6. Conclusão Foi verificada a reprodutibilidade da síntese de Ag-NPs com auxílio da tecnologia de microrreatores, já que o ph e a carga delas se assemelham com as NPs comerciais. Quanto à formação de filmes, o método será refeito devido a poucos resultados satisfatórios, e posteriormente será utilizado para a análise de nanosondas como substrato SERS. A não formação do filme possivelmente ocorreu devido a algum interferente como a variação do ph e/ou a condensação no processo de silanização. Ela pode também não ter ocorrido, devido à instabilidade das NPs, pois as soluções de boroidreto foram preparadas com a água a um ph de 5,52, sendo que o NaBH 4 é instável a ph ácido. Ou seja, o boroidreto possivelmente se decompôs, levando a agregação das NPs e com isso elas não foram capazes de se interagir com o vidro. Já no estudo da interação de NPs com o fármaco foi possível verificar que os ligantes tartarato e citrato na razão 1:0,5 (AgNPs-ligante) tiveram melhor resposta como sonda, sendo possível observar um limite de detecção pela supressão do sinal em batelada a 10-9 mol L -1. Já que o oxalato apresentou um limite de detecção de 10-7 mol L -1. Além disso, a interação do fármaco com as nanopartículas de prata deram origem a um fenômeno de agregação, o qual foi verificado pelo surgimento de uma nova banda SPR centrada entre nm, essa faixa grande se deve ao fato da nova banda SPR mudar de forma e posição em função do ligante orgânico utilizado. Foi possível observar também que o método em fluxo não demonstrou um limite de detecção tão baixo quanto o método em batelada, isso ocorreu, provavelmente, devido ao tempo de reação. Pois no método em batelada a NPs e o fármaco ficaram 5 minutos em contato antes da análise, enquanto em fluxo elas só ficaram cerca de 2 minutos, graças ao caminho percorrido. 7. Referências [1] I.Z. Zhang, C. Noguez, Plasmonic optical properties and applications of metal nanostructures. Plasmonics.3, , (2008). [2] Keating, Christine D.; Musick, Michael D.; Keefe, Melinda H.; Natan, Michael J. J. Chem. Educ. 1999, 76, 949. [3] Mason, B. P.; Price, K. E.; Steinbacher, J. L.; Bogdan, A. R.; McQuade, D. T. Greener Approaches to Organic Synthesis Using Microreactor Technology. Chemical Reviews 2007, 107, [4] Nie, S.; Emory, S. R., Probing Single Molecules and Single Nanoparticles by SurfaceEnhanced Raman Scattering. Science 1997, 275, 1102.
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