16/09/2015. Técnicas Analíticas Espectrometria. Técnicas Analíticas Espectrometria

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1 1 Métodos usados em análise de alimentos Colorimetria Turbidimetria Absorção no Ultravioleta, Vísivel e Infravermelho Fluorimetria Absorção atómica e Emissão de Chama Ressonância Magnética Nuclear Espectroscopia de massa 2 Radiação electromagnética ondas electromagnéticas 2 campos oscilantes eléctrico magnético orientados em ângulo recto na direcção da propagação 1

2 3 Radiação electromagnética propaga-se a velocidade constante depende do índice de refracção do meio que atravessa comprimento de onda (l) depende da frequência (n), da velocidade da luz (c) e do índice de refracção do meio (h) c l hn c velocidade da luz 3x10 10 cm/seg 4 Radiação electromagnética ondas electromagnéticas formadas por fotões energia de um fotão E hc E hl hn h constante de Planck 6.624x10-27 erg.seg quanto menor o comprimento de onda, maior a quantidade de energia necessária para a absorção 2

3 5 Radiação electromagnética requisitos para que uma molécula absorva radiação: radiação incidente deve ter a mesma frequência que a frequência rotacional, vibracional, electrónica ou nuclear da molécula molécula deve ter um dipolo permanente ou um dipolo induzido energia absorvida deve promover uma transição, rotação ou vibração 6 Radiação electromagnética estado fundamental átomo ou molécula no seu nível energético mais baixo (mais estável) estado excitado quando um átomo ou molécula possuem uma energia superior à mínima 3

4 7 Radiação electromagnética espectro de absorção quando uma molécula absorve energia (radiação, colisão) e passa do estado fundamental ao excitado espectro de emissão quando a molécula cede o excesso de energia e volta ao estado fundamental 8 Radiação electromagnética técnicas de absorção de radiação UV e Vísivel baseiam-se na radiação de ressonância e - excitado pode passar de um nível de menor energia para outro de maior energia tendência para voltar ao normal, emitindo energia em excesso 4

5 9 Radiação electromagnética radiação de raios X maior energia de excitação pode provocar a saída de um e - interno lugar será preenchido por outro e - de um nível superior radiação infravermelha e de microondas moléculas possuem energia interna associada a rotações das moléculas e vibrações entre os átomos que formam a molécula 10 Espectro electromagnético 5

6 Espectro electromagnético raios cósmicos e raios g 0 1 ː transições nucleares raios X 1 ː - 10 nm e - das camadas internas UV distante nm ionização de átomos e moléculas e - da camada do meio UV nm transições dos e - de valência Visível nm transições dos e - de valência 11 Espectro electromagnético IV próximo nm vibrações moleculares IV 2000 nm nm vibrações moleculares IV afastado mm rotações moleculares Microondas 500 mm 3 cm rotações de grupos Ressonância electrónica de spin (ESR) 3 cm 5 m orientação do spin Ressonância magnética nuclear (NMR) 5 30 m orientação do spin 12 6

7 13 de absorção electrónica transições dos e - da camada de valência amostra atravessada por radiação contínua de luz branca intensidade de radiação decresce, de modos diferentes, para diferentes comprimentos de onda radiação emergente pode ser colorida (Vísivel) ou incolor (UV) radiação absorvida é uma característica da amostra absorvente 14 de absorção electrónica Colorimetria transformar uma substância incolor ou pouco colorida numa colorida, através de reacções químicas permite analisá-la absorção de radiação medida em espectrofotómetros ou colorímetros 7

8 15 Turbidimetria também chamada nefelometria mede absorção da radiação incidente numa amostra devido à sua turvação intensidade da turvação proporcional à quantidade do componente que está a ser medido utiliza equipamento semelhante ao da colorimetria usada para estudar líquidos que tenham uma 2ª fase em suspensão fase suspensa dispersa a luz em geral, mede-se intensidade da luz dispersa 16 Turbidimetria sistemas estudados: concentrações de gás ou bolhas de ar em solução emulsões de óleo ou gordura partículas sólidas em suspensão permite determinar concentrações, mas também distribuição do tamanho das partículas 8

9 17 Turbidimetria pode ser medida por 2 métodos: 1)mesma configuração que em colorimetria intensidade da luz emergente atenuada por um mecanismo de bloqueio 2)detector montado a 90º relativamente à luz incidente captura a radiação dispersa 1) Nefelometria; 2) Turbidimetria utilização indiferenciada 18 Turbidimetria soluções turvas têm tempo de vida limitado medidas e resultados dependem do tempo 9

10 Energia 16/09/ de absorção electrónica radiação no UV e visível apenas afecta os e - que formam as ligações 3 tipos de e - : s ligações simples p ligações duplas n e - não ligantes (elementos electronegativos O, S) s * p * n s * Antiligante Antiligante n p * n p s s s * p p * Não ligante Ligante Ligante de absorção electrónica ligações s muito fortes transição s s* dá-se no UV do vácuo compostos saturados hidrocarbonetos transições n s* dão-se no UV do vácuo compostos com e - não ligantes cloreto de metilo ligações p são mais fracas transição p p* dá-se no UV e Visível transições n p* dão-se no UV próximo e Visível compostos com ligações duplas conjugadas 20 10

11 21 de absorção electrónica ordem energética das transições electrónicas s s* >> n s* > p p* > n p* cromóforos compostos que absorvem radiação UV/Visível possuem ligações duplas (p) conjugadas transições electrónicas p p* transições n p* não seguem regras de selecção espectros com fraca intensidade 22 Lei de Beer-Lambert absorção de radiação por interacção com moléculas da matéria pode variar de intensidade absorção medida através da radiação transmitida 11

12 23 Lei de Beer-Lambert quando encontra uma molécula, radiação pode ser: refractada reflectida difundida radiação totalmente reemitida em todas as direcções, de modo uniforme produzir fluorescência parte da energia absorvida é retida pela amostra radiação reemitida tem menor energia (> l) 24 Lei de Beer-Lambert desprezando fenómenos de reflexão, difusão e fluorescência: T - transmitância I 0 radiação incidente I radiação transmitida I T I 0 12

13 25 Lei de Beer-Lambert absorvância é o log do inverso da transmitância 1 A log T 0 log I I 26 Lei de Beer-Lambert passagem de um feixe de radiação monocromática num nº sucessivo de moléculas absorventes idênticas resulta na absorção de fracções iguais da energia radiante que as atravessa di I x x ds S fracção absorvente da radiação (I) é igual à secção S absorvida 13

14 27 Lei de Beer-Lambert ds proporcional ao nº de moléculas absorventes na secção transversal ds k. dn I I di I x x n 0 0 k. dn S ln I k n I S 0 se V S b V = volume do bloco ln I k nb I V 0 28 Lei de Beer-Lambert substituindo n e V por c (concentração) e ln por log e incluindo a constante e (absortividade ou coeficiente de extinção molar) e é uma característica de cada composto log I ebc A I 0 14

15 29 Lei de Beer-Lambert A de uma solução directamente proporcional à concentração da espécie absorvente, para um comprimento de percurso fixo lei de Beer-Lambert válida se: radiação incidente é monocromática centros absorventes actuam independentemente uns dos outros no processo de absorção absorção ocorre numa secção transversal uniforme 30 Lei de Beer-Lambert desvios à lei de Beer-Lambert: químicos mudanças na concentração da solução por interacção das moléculas do soluto entre si e com o solvente associação ou dissociação trabalhar com soluções diluídas (<0.01 M) para evitar instrumentais radiação não monocromática sinal do detector não linear nem proporcional à concentração da solução 15

16 31 Análise qualitativa identificação tentativa do composto através da comparação com padrões de: valor de l max perfil do espectro total l max afectado pela natureza do solvente solvente tem que ser transparente na região espectral necessária confirmação por métodos complementares compostos diferentes com l max idênticos e perfis muito semelhantes 32 Análise quantitativa quantidade de composto medida pelo valor da absorvância máxima escolher l em que e seja máxima variação na absorvância para uma dada mudança de concentração será maior efeito relativo de outras substâncias e impurezas é minimizado mudança de absorvância com l é menor espectro de absorção médio não afectado por pequenos erros no ajuste de l 16

17 33 Análise quantitativa exemplos cálculo da concentração numa amostra em que e é conhecido aplicação directa da lei de Beer-Lambert A c eb solução de Co(H 2 O) 2+ tem uma absorvância de 0.20 a 530 nm numa célula de 1.00 cm. e = 10 L mol -1 cm c x1.00 M 34 Análise quantitativa cálculo da concentração numa amostra em que e é desconhecido fazer recta padrão constrói-se recta com pelo menos 4 concentrações diferentes coloca-se no gráfico o valor da absorvância máxima da amostra tira-se a concentração do composto analisado 17

18 35 Análise quantitativa necessário verificar linearidade da resposta em relação à curva padrão acima de uma certa concentração a relação A vs. c deixa de ser linear 36 Análise quantitativa absorvância de uma solução de MnO 4- é a 525 nm. Em condições idênticas, uma solução de MnO 4- com concentração 1.0x10-4 M tem uma absorvância de cálculo da concentração desconhecida e eb10 bc desc. 4 c desc x M 18

19 37 Análise quantitativa problemas de interferência na medida da absorvância 2 compostos com l max igual ou próximo absorvância é aditiva interferência de um composto sobre o outro necessário separar os compostos cromatografia 38 Análise quantitativa exemplo cálculo da concentração de um complexo metalreagente (MR) que absorve a 522 nm (e = 1.18x10 4 ) solução também contém R em excesso 1.00x10-4 M (e = 5.12x10 2 a 522 nm) absorvância total a 522 nm = x10. c x MR 5 c RM 5.72x 10 M 19

20 39 Análise quantitativa exemplo 2 complexos metálicos (X e Y) A l1 = 0.533, A l2 = em l x10. c 2.96x10. c X Y em l x10. c 1.45x10. c X Y x x10. cy x10. c 3 Y 3.55x10 c x 10 M Y c x 10 M X 40 Equipamentos Colorímetros simples e fotoeléctricos aplicados apenas na região Visível Absorciómetros inclui a classe dos colorímetros, mas podem ser usados noutras regiões do espectro regiões selecionadas por filtros ópticos 20

21 41 Equipamentos Espectrofotómetros usa uma banda mais estreita de comprimento de onda seleccionada por um monocromador feixe simples simples e barato apresenta erros devido a flutuações de voltagem e interferências do solvente não regista espectro 42 Equipamentos feixe duplo mais sofisticado e caro não apresenta os erros encontrados no de feixe simples regista espectro da amostra fonte de radiação dividida em 2 feixes um feixe passa na célula de referência onde fica o solvente puro outro feixe passa na célula da amostra efeitos da fonte ou do solvente registado por ambas as células detector mede a diferença entre ambos os sinais espectro apenas da amostra 21

22 Equipamentos componentes básicos fonte lâmpada com descarga de hidrogénio utilizada na região UV ( nm) lâmpada de tugsténio utilizada na região visível ( nm) atenuador ou fenda diminui largura do feixe da fonte, deixando passar apenas o comprimento de onda de interesse passa por uma fenda estreita fenda demasiado grande passa radiação em excesso, provocando desvio à lei de Beer-Lambert (radiação não monocromática) fenda demasiado estreita diminuição da intensidade da radiação e perca de sensibilidade Equipamentos monocromador ou filtro selecciona uma banda ou comprimento de onda rede de difracção placa metálica polida (reflexão) ou de vidro (transmissão) com ranhuras muito próximas, paralelas e equidistantes separação do feixe de radiação em vários comprimentos de onda seleccionados em função do tipo de amostra prisma vidro (visível) ou quartzo (UV) dispersa o feixe de radiação 22

23 45 Equipamentos célula para amostra amostras colocadas em células apoiadas em porta-células, colocados num compartimento vidro ou plástico região visível quartzo UV mais eficientes 2 janelas paralelas 2 lados bem polidos espessura mais comum 1 cm 46 Equipamentos detector fotocélulas detectam a quantidade de radiação transmitida após passagem pela amostra radiação transmitida provoca emissão de e - a partir de uma superfície sólida com um cátodo e um ânodo produção de corrente eléctrica amplificador fotomultiplicador quando atravessado por um fotão, amplifica a resposta para maior nº de e - 23

24 47 Equipamentos registador transforma sinal eléctrico que chega ao detector e amplificador em energia mecânica regista um sinal 48 Solventes Visível qualquer líquido incolor água destilada mais usada UV qualquer solvente que não absorva nesta região sem ligações duplas conjugadas água ou hidrocarbonetos saturados elevada pureza dissolver bem a amostra 24

25 49 Aplicações na análise de alimentos absorção no Visível pigmentos naturais corantes artificiais absorção no UV conservantes antioxidantes caracterização de óleos e gorduras grau de oxidação de óleos e gorduras vitaminas A, B, C, E e K pesticidas micotoxinas pectina e polissacáridos 50 Aplicações na análise de alimentos colorimetria proteínas aminoácidos vitaminas A, B, C, D e E carboidratos metais pesticidas antioxidantes caracterização de óleos e gorduras grau de oxidação de óleos e gorduras 25

26 51 Emissão de radiação electromagnética átomos, iões e moléculas podem ser excitados por diversos processos ao relaxar, libertam energia em excesso relaxação pode resultar em emissão de radiação electromagnética emissão é característica da substância 52 Emissão de radiação electromagnética tipos de espectro riscas espécies atómicas riscas estreitas diversas transições electrónicas e subníveis 26

27 53 Emissão de radiação electromagnética bandas compostas por diversas riscas orbitais moleculares estados vibracionais e rotacionais 54 Emissão de radiação electromagnética contínuos produzidos por aquecimento intenso de sólidos luz emitida ao longo de um amplo intervalo de energia l max é função da temperatura do material 27

28 55 56 Emissão de radiação electromagnética luz produzida é directamente proporcional à concentração das espécies a serem medidas c=ki c concentração I intensidade da luz k constante de proporcionalidade 28

29 57 Espectroscopia atómica absorção e emissão de radiação por átomos obtêm-se espectros de riscas utilização em análise elementar qualitativa e quantitativa 58 Espectroscopia atómica pode ocorrer alargamento das riscas por: efeito Doppler durante a atomização/ionização, a amostra pode aproximar-se ou afastar-se do detector desvio de Doppler na risca riscas espectrais que deveriam estar separadas de 1 5 nm, podem alargar até 100 vezes efeito de pressão colisão dos átomos da amostra com outras substâncias permuta de energia efeito aumenta com a temperatura 29

30 59 Espectroscopia atómica Emissão atómica átomos promovidos a um nível energético elevado ao decair emitem luz, que é medida técnicas classificadas segundo fonte de excitação fotometria de chama fluorescência atómica excitação eléctrica emissão de plasma permitem análises qualitativas e quantitativas 60 Espectroscopia atómica análise qualitativa Emissão atómica baseada na presença de riscas de emissão específicas 30

31 61 Espectroscopia atómica análise quantitativa Emissão atómica baseada na medição da intensidade das riscas de emissão intensidade proporcional à concentração grande erro relativo funciona melhor com metais 62 Espectroscopia atómica fontes de excitação Emissão atómica eléctrica eléctrodos de carbono de elevada pureza arco excitação eléctrica contínua faísca pequena rajada de excitação T = ºC para uma faísca V disposição dos eléctrodos depende do estado da amostra 31

32 63 Espectroscopia atómica chama Emissão atómica funciona melhor com elementos dos grupos IA e IIA mais fáceis de ionizar amostras (líquidos ou gases) introduzidos na chama por aspiração utiliza temperaturas relativamente baixas (~ ºC) < 1 % dos átomos são ionizados emissão de plasma permite temperaturas mais elevadas 64 Espectroscopia atómica plasma Emissão atómica semelhante à fotometria de chama gás inerte (geralmente Ar) excitado ioniza a amostra temperaturas mais elevadas (> 10 3 K) permitem maior sensibilidade 32

33 65 Espectroscopia atómica plasma acoplado por indução (ICP) Emissão atómica ºC funciona melhor para elementos com mais elevadas energias de excitação plasma acoplado directamente (DCP) plasma por microondas 66 Espectroscopia atómica monocromador Emissão atómica círculo de Rowland redes de elevada resolução devido a riscas muito estreitas 33

34 67 Espectroscopia atómica detecção Emissão atómica olho, para sistemas mais simples análise qualitativa película qualitativa posição das riscas quantitativa grau de exposição tubo fotomultiplicador análise quantitativa 68 Espectroscopia atómica fotómetro de chama Emissão atómica sistema monocromador/detector mais simples menos espécies observáveis construção semelhante a espectrofotómetros de feixe único 34

35 69 Emissão atómica 70 Emissão atómica 35

36 71 Emissão atómica 72 Espectroscopia atómica Absorção atómica absorção de luz por átomos no estado atómico livre lei de Beer-Lambert maioria dos átomos não passa ao estado excitado com os processos de excitação atómica utilizados método de análise dos átomos livres é mais sensível 36

37 73 Espectroscopia atómica vantagens relativamente à emissão atómica Absorção atómica menos interferências menor dependência da temperatura melhores sensibilidade e rigor para maioria dos elementos (gama de ppb) desvantagens relativamente à emissão só analisa metais apenas análise quantitativa 74 Absorção atómica 37

38 75 Espectroscopia atómica equipamento Absorção atómica 76 Espectroscopia atómica equipamento Absorção atómica semelhante a espectrofotómetro de feixe simples fontes lâmpada de cátodo oco fonte produz riscas de emissão específicas para o elemento usado na construção do cátodo lâmpada de descarga sem eléctrodo maior intensidade mas menor estabilidade 38

39 77 Espectroscopia atómica lâmpada de cátodo oco Absorção atómica lâmpada contém gás inerte (Ar, Ne) aplicação de um potencial provoca excitação do gás, deslocando-o para o cátodo metal passa ao estado excitado devido ao contínuo bombardeamento pelo gás após relaxar, produz riscas de emissão atómica específicas 78 Absorção atómica 39

40 79 Espectroscopia atómica lâmpada de descarga sem eléctrodo Absorção atómica sal contendo o metal de interesse selado num tubo de quartzo com um gás inerte campo de radiofrequência excita o gás gás excitado ioniza o metal 80 Espectroscopia atómica interruptor rotativo usado para dividir feixe de Absorção atómica luz em 2 reduz ruído da fonte 40

41 81 Espectroscopia atómica equipamento Absorção atómica métodos de atomização exposição da amostra a temperaturas elevadas atomização separa partículas em moléculas individuais e estas em átomos átomos no estado estacionário em forma gasosa absorvem radiação produzem um sinal proporcional à sua concentração 82 Espectroscopia atómica equipamento Absorção atómica métodos de atomização chama líquidos e gases C 2 H 2 usado como combustível e ar ou N 2 O como oxidantes N 2 O produz uma chama mais quente, mas mais ruidosa requer amostras grandes (> 1 ml) amostra continuamente consumida limites de detecção elevados pequena parte da amostra oxidada pela chama a cada momento 41

42 83 Espectroscopia atómica equipamento Absorção atómica métodos de atomização sem chama (forno de grafite) líquidos e sólidos maior intensidade mas menor estabilidade amostra colocada num tubo de carbono aquecido por corrente eléctrica maior tempo de residência da amostra melhores sensibilidade e limite de detecção 84 Espectroscopia atómica equipamento Absorção atómica métodos de atomização sem chama (forno de grafite) usado um programa de temperatura para aquecer a amostra secagem ºC para remover solvente carbonização ºC para decompor a matriz atomização aumento rápido até ºC em poucos segundos recolha dos dados 42

43 85 Espectroscopia atómica equipamento Absorção atómica métodos de atomização sem chama (forno de grafite) Ar usado como gás de purga: remoção de material em excesso durante a secagem e carbonização e após a atomização redução da oxidação do tubo impede a reacção de C com N durante a atomização não se dá produção de cianogénio 86 Espectroscopia atómica equipamento Absorção atómica monocromador e detector rede holográfica para resolver as riscas detector habitual é um tubo fotomultiplicador habitual usar um método para correcção do background bandas largas devidas a absorção ou emissão molecular correcção com D 2 ou efeito de Zeeman 43

44 87 Espectroscopia atómica equipamento Absorção atómica monocromador e detector correcção com lâmpada de D 2 luz da fonte e de uma lâmpada de D 2 passam alternadamente pela amostra banda de luz da lâmpada de D 2 que atravessa a amostra é mais larga diferença entre os 2 sinais dá a correcção 88 44

45 89 Espectroscopia atómica equipamento Absorção atómica limitações da correcção com lâmpada de D 2 : pode ocorrer sub- ou sobrecorrecção, dependendo da amostra requer bom alinhamento das lâmpadas D 2 funciona mal a > 350 nm 90 Espectroscopia atómica equipamento Absorção atómica monocromador e detector correcção com efeito de Zeeman campo magnético forte aplicado à amostra separação dos níveis de energia electrónica dos átomos desloca-se o comprimento de onda de absorção da amostra, permitindo medir directamente o ruído de fundo 45

46 91 Espectroscopia atómica interferências Absorção atómica absorção de radiação da fonte elementos diferentes do analisado podem absorver o comprimento de onda utilizado ionização formação de iões em vez de átomos causa menor absorção da radiação podem adicionar-se supressores de ionização auto-absorção átomos absorvem mais radiação no centro da risca do que nos lados provoca alteração na forma e intensidade da risca 92 Espectroscopia atómica interferências Absorção atómica absorção de fundo da radiação da fonte presença de partículas resultantes de uma atomização incompleta problema reduzido por aumento da temperatura da chama transporte velocidade de aspiração, nebulização ou transporte da amostra 46

47 93 Absorção atómica 94 Absorção atómica 47

48 95 Absorção atómica 96 Absorção atómica 48

49 97 Espectroscopia atómica Absorção atómica vs. Emissão atómica Absorção Mede concentrações reduzidas de metal em matrizes complexas Depende do nº de átomos no estado fundamental Mede a radiação absorvida por átomos no estado fundamental Presença de uma fonte luminosa (lâmpada de cátodo oco) Temperatura do atomizador ajustada de modo a apenas atomizar os átomos da amostra no estado fundamental Emissão Mede concentrações reduzidas de metal em matrizes complexas Depende do nº de átomos excitados Mede a radiação emitida por átomos excitados Ausência de fonte luminosa Temperatura do atomizador suficientemente elevada, de modo a atomizar e excitar os átomos da amostra 98 Espectroscopia atómica Fluorescência atómica modificação no equipamento usado para absorção atómica lâmpada colocada em ângulo recto relativamente ao detector mede qualquer átomo que fluoresça 49

50 99 Espectroscopia atómica Aplicações análise clínica análise de metais em fluidos biológicos sangue e urina análise ambiental avaliar o nível de diversos elementos em rios, água do mar, ar e combustíveis farmácia detecção de pequenas quantidades de catalisadores usados na produção de fármacos indústria verificar a presença dos principais elementos e garantir que impurezas tóxicas estão abaixo do nível permitido ex: teor de Pb no betão 100 Espectroscopia atómica Aplicações minas detecção de ouro em rochas análise de alimentos determinação de elementos existentes em quantidades residuais cosmética análise de elementos existentes em quantidades residuais ex: no cabelo 50

51 101 Raios X Absorção Difracção Emissão/fluorescência 102 Raios X se um e - de uma camada interna for ejectado de um átomo, o seu lugar será preenchido por outro proveniente da camada externa diferença de energia emitida como raios X função do nº atómico 51

52 103 Raios X emissão de raios X é independente da forma química intensidade usada para identificar elementos com nº atómico 20 fonte de raios X tem que possuir um nº atómico superior ao da amostra 4 Z absorção massa atómica 104 Raios X equipamento 52

53 105 Raios X equipamento feixe de e - produz raios X a partir de um metal (Cu, W, Mo) colimador é constituído por uma série de placas metálicas perfuradas absorve todos os raios X não correctamente direccionados filtro constituído por um metal com nº atómico superior ao do elemento a analisar 106 Raios X monocromadores são raramente usados quando existem são de NaCl iões difractam raios X 53

54 107 Raios X detectores por ionização em gases tubo cheio de Ar ( 1000 V) elevado nº de ionizações um único pulso de radiação com muitos iões não é discriminatório 108 Raios X detectores cintilação usados na detecção de raios X e g raios X interagem com cristais de NaI(Tl) e produzem luz 1 fotão por cada 200 ev nº de fotões proporcional à energia dos raios X luz dirigida para um tubo fotomultiplicador 54

55 109 Raios X detectores estado sólido semicondutores de Si(Li) aplicando uma pequena diferença de potencial ao cristal obtêm-se 3 zonas positiva, negativa e vazia quando atravessado por uma radiação ionizante, esta deixa um rasto de cargas positivas e negativas na zona vazia detecção baseada na corrente necessária para reestabelecer a zona vazia 110 Raios X Difracção usada para medir dimensão e forma de cristais análise elementar estrutura de novos materiais identificação de substâncias 55

56 111 Raios X Absorção usada para medir qualidade de metais e ligas medicina medicina dentária 112 Raios X Fluorescência quando uma amostra é exposta aos raios X, são produzidos raios X secundários para n os atómicos 11 obtém-se informação qualitativa e quantitativa técnica não destrutiva 56

57 113 Espectroscopia molecular absorção e emissão de radiação por moléculas espectroscopias de UV/Vis, IV e Fluorescência 114 Espectroscopia molecular absorção molecular UV/Vis analisa transições electrónicas espectros aparecem como bandas grande nº de estados vibracionais e rotacionais 57

58 Absorção molecular UV/Vis 115 Espectroscopia molecular para existir absorção no UV/Vis por compostos orgânicos energia absorvida pelo composto corresponda a uma transição de um orbital populado para um não populado s s* não observada habitualmente energia demasiado elevada n s* para compostos que contenham átomos com pares de e - não partilhados compostos com O, S, N e halogéneos nm pouco intensas Absorção molecular UV/Vis 116 Espectroscopia molecular n p* e p p* necessária insaturação para ter orbitais p* ligações múltiplas e estruturas de ressonância aumento de insaturação provoca desvio para >l nm intensas 58

59 Absorção molecular UV/Vis 117 Espectroscopia molecular efeito do solvente na fase de vapor não existe solvente interacções mínimas entre moléculas solvente pode causar alargamento das bandas Absorção molecular UV/Vis 118 Espectroscopia molecular em compostos inorgânicos também se verifica absorção para espécies com orbitais d parcialmente ocupados mais intensas para complexos com metais de transição resultado da interacção do ligando com as orbitais d do metal num ião livre, as orbitais d têm energias iguais, mas não são idênticas interacção com um ligando afecta umas orbitais mais que outras desdobramento das orbitais d resulta numa transição d d (zona do UV/Vis) tipo e grau de desdobramento dependem do ligando e da geometria do complexo formado 59

60 Absorção molecular UV/Vis 119 Espectroscopia molecular análise qualitativa pouco interessante bandas pouco estruturadas moléculas com grupos funcionais semelhantes apresentam espectros muito parecidos Absorção molecular UV/Vis 120 Espectroscopia molecular análise quantitativa diversas aplicações elevada sensibilidade limites de detecção entre 10-4 e 10-6 M razoável selectividade razoável simplicidade e baixo custo medida deve ser efectuada no l max maior sensibilidade minimiza erros 60

61 Absorção molecular UV/Vis 121 Espectroscopia molecular análise quantitativa condições de análise devem ser mantidas constantes: solvente temperatura ph preparação da amostra condições instrumentais iguais e constantes para amostra e padrões cuvettes fendas comprimento de onda Absorção molecular UV/Vis 122 Espectroscopia molecular análise quantitativa método apenas válido em condições de linearidade Abs vs. conc 61

62 123 Espectroscopia molecular absorção molecular IV energia demasiado baixa para promover transições electrónicas limitada aos níveis vibracional e rotacional em líquidos e sólidos, rotação molecular é limitada principal interacção é vibracional depende de: nº de átomos tipo de átomos tipo de ligação entre átomos Absorção molecular IV 124 Espectroscopia molecular cada molécula pode apresentar diversos tipos de vibração 62

63 Absorção molecular IV 125 Espectroscopia molecular principal vantagem: permite identificar grupos funcionais Absorção molecular IV 126 Espectroscopia molecular análise quantitativa bandas muito estreitas desvios à lei de Lambert-Beer pouco útil em análise quantitativa 63

64 Absorção molecular IV 127 Espectroscopia molecular FTIR espectrofotómetros modernos usam sistema de transformada de Fourier operação matemática que traduz uma curva complexa nas suas componentes Absorção molecular IV/FTIR 128 Espectroscopia molecular num FTIR, a curva complexa é um interferograma soma das interferências construtivas e destrutivas geradas pelas ondas de luz curvas componentes são o espectro IV luz incidente é dividida 50:50 para um espelho fixo e outro móvel espelho móvel é o principal e mais caro componente 64

65 Absorção molecular IV/FTIR 129 Absorção molecular IV/FTIR 130 Espectroscopia molecular exemplos de interferogramas 65

66 131 Espectroscopia molecular absorção molecular Raman fotões absorvidos por moléculas sofrem espalhamento maioritariamente elástico (espalhamento de Rayleigh) fotão emitido tem mesmo l que o que absorve pequena parte (1:10 7 ) tem espalhamento inelástico (efeito de Raman) energias dos fotões incidentes e espalhados são diferentes Raman 132 Espectroscopia molecular linhas de Stokes são equidistantes da de Rayleigh 1 quantum vibracional de energia perdido ou ganho linha de Stokes mais intensa apenas as moléculas que sofrem excitação vibracional antes da irradiação podem originar linhas anti-stokes em geral, apenas se medem as linhas de Stokes 66

67 Raman 133 Espectroscopia molecular para que uma vibração seja activa em IV, tem que haver alteração no momento dipolar da molécula para que uma transição seja activa em Raman, tem que haver alteração na polarizabilidade da molécula polarizabilidade varia com movimento vibracional espalhamento de Raman pouco eficaz necessária forte fonte de excitação laser laser é monocromático permite avaliar diferença de energia entre as linhas de excitação e de Stokes Raman 134 Espectroscopia molecular espectrómetro de Raman fonte luminosa normalmente laser óptica recolhe luz espalhada pelo efeito de Raman sistema de detecção 67

68 Raman 135 Espectroscopia molecular estudos biomédicos efectuados em microscópios de Raman ou sondas de fibra óptica acopladas a um sistema de Raman portátil permite trabalhar in vivo Raman 136 Espectroscopia molecular espectroscopias IV e Raman são complementares diferentes regras de selecção ex: moléculas diatómicas homonucleares não têm espectro IV não possuem momento dipolar têm espectro Raman ligação, ao contrair e esticar, altera interacções entre e - e núcleo, variando polarizabilidade ex: moléculas poliatómicas simétricas que possuem centro de inversão (benzeno) bandas activas no IV não são activas no Raman e vice-versa ex: moléculas com pouca ou nenhuma simetria activas tanto no IV como no Raman 68

69 Raman 137 Espectroscopia molecular espectroscopia de Raman fornece detalhes sobre: composição química estrutura molecular interacções moleculares células e tecidos obtém-se informação sobre proteínas, lípidos, carboidratos e ácidos nucleicos Raman

70 139 Espectroscopia molecular fluorescência molecular moléculas absorvem energia e passam ao estado excitado quando relaxam de volta ao estado excitado podem emitir: calor luz fluorescência Conversão interna Co Fluorescência 140 Espectroscopia molecular conversão interna e fluorescência podem ocorrer simultaneamente percentagem de moléculas que fluorescem definida pelo rendimento quântico taxa de relaxação por fluorescência Q taxa de relaxação total 70

71 Fluorescência 141 Espectroscopia molecular espectros de fluorescência tendem a apresentar-se como imagens reflectidas dos epectros de absorção energias menores parte da energia perdida de forma vibracional Fluorescência 142 Espectroscopia molecular excitação fluorescência produzida ao longo de uma gama de comprimentos de onda da luz incidente espectros de excitação corrigidos fluxo de fotões incidente mantido constante solução suficientemente diluída fracção da radiação absorvida é proporcional ao coeficiente de absorção do analito forma idêntica à do espectro de absorção 71

72 Fluorescência 143 Fluorescência 144 Espectroscopia molecular técnica muito sensível e com baixos limites de detecção poucos compostos exibem fluorescência estruturas rígidas com modos de relaxação vibracional reduzidos compostos com anéis aromáticos fundidos são mais fluorescentes ligações duplas conjugadas também exibem fluorescência derivatização com grupos fluorescentes 72

73 Fluorescência 145 Espectroscopia molecular fluorescência diminui com aumento da temperatura maior nº de colisões com o solvente resultam num aumento de relaxação vibracional aumento da viscosidade do solvente leva a um aumento da intensidade da fluorescência movimento mais lento das moléculas de solvente conduz a menores interacções entre elas Fluorescência 146 Espectroscopia molecular intensidade de fluorescência proporcional à concentração obtenção de curvas de calibração utilização dos valores mais convenientes de l max de emissão e excitação 73

74 Fluorescência 147 Espectroscopia molecular auto-extinção a concentrações elevadas aumenta a probabilidade de que um fotão emitido venha a ser absorvido por outra molécula da amostra 148 Ressonância magnética nuclear (NMR) técnica que fornece informações sobre o ambiente de núcleos magneticamente activos núcleos absorvem radiação na zona das frequências de rádio medição das frequências às quais ocorre absorção e intensidade da mesma permite obtenção de dados sobre estrutura molecular frequência depende da ligação química, da conformação molecular e de processos dinâmicos núcleos mais estudados 1 H e 13 C 74

75 149 NMR todos os núcleos possuem um spin descreve a natureza do campo magnético do núcleo nº de spin (I) pode ser 0 ou qualquer múltiplo de ½ (½, 2 / 2, ) núcleos com spin 0 não possuem campo magnético quanto mais alto I, mais complexo o campo magnético 12 C e 16 O têm I = 0 invisíveis em NMR usam-se aqueles que são visíveis I ʌ 0 1 H, 13 C (I = ½), 14 N (I = 1), I descreve forma do campo magnético, g descreve a sua intensidade g factor giromagnético 1 H possui o campo magnético mais forte 150 NMR spin do núcleo afectado por um campo magnético externo núcleo tenta alinhar-se segundo o campo aplicado alinhamentos são quantificados nº limitado de alinhamentos (depende de I) alinhamento (estados de spin I z ) varia de I a +I em intervalos de 1 cada núcleo possui 2I+1 estados de spin 75

76 151 NMR estados de spin variam em energia consoante a sua orientação relativamente ao campo magnético externo mais paralelos têm menor energia mais opostos possuem maior energia 152 NMR diferença de energia permite induzir transição entre diversos estados de spin irradiação de um dado núcleo induz um salto de um outro núcleo de menor energia para uma orientação de energia superior (absorção de energia) dão-se igualmente transições de mais alta para mais baixa energia (libertação de energia) se as populações em ambos níveis energéticos forem iguais, transições anulam-se e não há sinal observável sinal detectado pelo aparelho se populações diferentes 76

77 NMR espectro de NMR alterando a frequência da radiação electromagnética aplicada obtém-se gráfico de absorção de energia vs. frequência 77

78 155 NMR espectro de NMR alternativamente pode variar-se a intensidade do campo magnético aplicado, mantendo a frequência constante obtém-se gráfico de absorção de energiavs. intensidade do campo magnético aplicado 156 NMR espectro de NMR sistema homogéneo com um único tipo de núcleo um único pico no espectro compostos complexos núcleo influenciado pelo ambiente ambientes que aumentam separação energética entre estados de spin transições a frequências mais elevadas ambientes que provocam redução na separação transições a frequências mais baixas variações em frequência desvio químico 78

79 157 NMR blindagem e desblindagem e - possuem campo magnético (spin = ½) muito mais forte que o do núcleo polaridade oposta à do núcleo campo sentido pelo núcleo numa molécula é combinação do campo magnético externo aplicado e do gerado pela nuvem electrónica campo magnético externo oposto ao dos e - núcleo blindado da força total do campo externo 158 NMR blindagem e desblindagem blindagem afectada por factores que alteram a densidade electrónica à volta do núcleo diminuição da densidade - desblindagem aumento da densidade maior blindagem blindagem provoca redução da intensidade do campo magnético separação de energia entre estados de spin diminui transição de spin pode ser induzida por menor frequência desblindagem produz o efeito inverso variação resulta em deslocamento químico (d) 79

80 NMR deslocamento químico medido em relação a uma referência ex: TMS (0 ppm) 80

81 161 NMR blindagem e desblindagem e - mais próximos do núcleo são os que mais influenciam a blindagem e - que participam em ligações químicas electronegatividade afecta distribuição electrónica átomos electronegativos e grupos funcionais aceitadores de e - provocam desblindagem átomos electropositivos e grupos funcionais dadores de e - provocam blindagem 162 NMR blindagem e desblindagem ex: C menos electronegativo que O em O-H, e - ligantes atraídos para O densidade electrónica à volta de H menor que em C-H menor blindagem 81

82 163 NMR blindagem e desblindagem corrente de anel em sistemas p uma carga em movimento (corrente) pode produzir um campo magnético átomos com hibridização sp 2 possuem 1 orbital p disponível orbitais p em átomos adjacentes têm tendência para se alinhar produzindo um sistema p ex: benzeno (corrente de anel) corrente de anel oposta ao campo magnético externo 164 NMR blindagem e desblindagem H do anel sofrem um reforço do campo magnético externo desblindados noutros sistemas p ocorre o mesmo orbitais p em átomos adjacentes têm tendência para se alinhar produzindo um sistema p 82

83 165 NMR blindagem e desblindagem em casos raros, H podem estar colocados acima ou abaixo do sistema p sofrem blindagem 166 NMR interpretação de espectros intensidade do sinal depende do nº de núcleos envolvidos área de um pico é proporcional ao nº de núcleos que contribuem para o sinal ex: espectro de MeOH (CH 3 OH) 2 tipos de átomos de H 2 deslocamentos químicos (d) área 3:1 83

84 167 NMR interpretação de espectros relaxação de spin rápida áreas dos picos reflectem nº de núcleos relaxação lenta núcleos promovidos ao estado de spin de maior energia mais rapidamente do que podem sair deste excesso de população do nível de mais baixa energia será reduzido e as 2 populações tornam-se iguais saturação sinal de NMR diminui de intensidade sinal desaparece com saturação total 168 NMR interpretação de espectros acoplamento dipolar produzidos por campos magnéticos dos núcleos vizinhos campos fracos mas fazem-se sentir se o núcleo não estiver afastado mais de 3 ligações 84

85 169 NMR interpretação de espectros acoplamento dipolar ex: moléculas com 2 H próximos (A e B) com desvios químicos diferentes H A tem estados de spin I z = ½ e I z = -½ na ausência de H B produz um único pico no NMR H B tem um pequeno campo magnético que pode estar alinhado ou oposto ao campo externo, com idêntica probabilidade se estiver alinhado H A fica desblindado se estiver em oposição H A fica blindado metade das moléculas possui ressonância a mais alta frequência metade a mais baixa 170 NMR interpretação de espectros acoplamento dipolar pico de H A desdobra-se em 2 (dobleto) por influência de H B e vice-versa* J (constante de acoplamento dipolar) frequência de separação ente os 2 picos varia entre 0 15 Hz *efeito usado para identificar que H estão acoplados um com outro 85

86 171 NMR interpretação de espectros acoplamento dipolar valores de constantes de acoplamento J trans > J cis 172 NMR D down U - up intensidade destas duas frequências é de 1:3 interpretação de espectros acoplamento dipolar se o nº de H acoplados aumentar, desdobramento torna-se mais complexo ex: C 2 H 6 para 3 H idênticos existem 8 combinações possíveis de spin blindagem ou desblindagem sentida por H A depende da soma dos campos magnéticos dos 3 H B maior blindagem ocorre quando 3 H B estão opostos ao campo externo (DDD) segue-se o caso em que 2 estão opostos 3 possíveis combinações (DDU, DUD, UDD) com a mesma probabilidade ( 1 / 18 ) 86

87 173 NMR interpretação de espectros acoplamento dipolar no caso de apenas 1 H B estar em oposição (DUU, UUD, UDU) no caso de nenhum H B estar em oposição (UUU) intensidade dos 4 picos é de 1:3:3:1 174 NMR interpretação de espectros acoplamento dipolar se tivermos 3 H idênticos acoplados quarteto N núcleos idênticos acoplados originarão 2NI+1 picos intensidade das linhas prevista de acordo com o triângulo de Pascal 87

88 175 NMR interpretação de espectros acoplamento dipolar no caso de acoplamento com um núcleo de spin mais elevado, situação é análoga ex: H acoplado com N (I = 1) tripleto de picos com igual intensidade representando as 3 possíveis orientações de spin do N (1, 0, -1) N acoplado a H (I = ½) dobleto 176 NMR interpretação de espectros acoplamento dipolar intensidades previstas com um método semelhante ao triângulo de Pascal para I = 1: 88

89 177 NMR interpretação de espectros acoplamento dipolar acoplamento de 1ª ordem aplica-se quando desvios químicos dos núcleos acoplados estão suficientemente separados quando desvios se aproximam, interacções mais fracas começam a predominar efeitos de acoplamento de 2ª ordem: energias dos estados de spin sofrem desvios probabilidades das transições entre níveis variam posições e intensidades dos picos deixam de ser as previstas pela teoria de 1ª ordem 178 NMR interpretação de espectros acoplamento dipolar sistema com 2 núcleos acoplados de spin ½ pico de cada núcleo divide-se em 2 (dobleto) quando desvios químicos se tornam semelhantes, picos do dobleto mudam de intensidade pico de cada dobleto mais próximo dos picos do núcleo acoplado aumenta de intensidade (aumento da probabilidade da transição) o outro pico diminui de intensidade 89

90 179 NMR interpretação de espectros acoplamento dipolar desdobramento não se verifica se protões estão separados por mais de 3 ligações s acoplamentos de longo alcance ocorrem quando protões estão separados por mais que 3 ligações s, mas com ligações duplas ou triplas 180 NMR sinais de H c, H d e H e sobrepostos sinais de H a, H b e H c não se sobrepõem 90

91 181 NMR velocidade de relaxação processo exponencial descrito por T 1 (tempo de relaxação) tempo necessário para que a energia em excesso desça para 1 / e ( ) do seu valor original T 1 para H em moléculas orgânicas 1 seg 182 NMR interpretação de espectros exemplos de moléculas com protões quimicamente equivalentes 1 único sinal no espectro de 1 H-NMR 91

92 183 NMR interpretação de espectros moléculas com protões não quimicamente equivalentes vários sinais no espectro de 1 H-NMR 184 NMR interpretação de espectros grupos aceitadores de e - provocam desvio de d para frequências mais altas ex: halogéneos 92

93

94 187 NMR interpretação de espectros valores típicos de d 188 NMR interpretação de espectros valores típicos de d 94

95 189 NMR interpretação de espectros variação com a temperatura ex: ciclohexano velocidade de conversão depende da temperatura 190 NMR espectroscopia de 13 C nº de sinais reflecte o nº de diferentes tipos de carbono intensidade do sinal muito menor que a de 1 H (~ 6400 vezes) d acima de 220 ppm (com 1 H até 10 ppm) 95

96 NMR espectroscopia de 13 C valores de d NMR NMR a 2 dimensões espectro COSY 1 H identifica acoplamentos picos cruzados indicam pares de H acoplados COrrelation SpectroscopY 96

97 193 NMR NMR a 2 dimensões espectro HETCOR (HETeronuclear CORrelation spectroscopy) indica acoplamentos entre protões e carbonos, aos quais estão ligados 194 Ressonância paramagnética electrónica (EPR) técnica que detecta espécies com e - desemparelhados radicais livres, se forem moléculas orgânicas iões de metais de transição, no caso de complexos inorgânicos excitação dos spins electrónicos necessários campos magnéticos mais fracos e frequências mais altas que em NMR 97

98 195 EPR e - possuem momento magnético colocados num campo magnético externo (B 0 ) momento magnético alinha paralelo ou antiparalelo a B 0 alinhamento paralelo define um estado de menor energia separação entre os 2 estados: g e factor giromagnético do e - m B magnetão Bohr (9.27x10-24 JT -1 ) ΔE= g m B e B 0 para transitar entre os 2 níveis, um e - absorve radiação electromagnética ΔE=h n= g m B e B 0 equação fundamental do EPR 196 EPR centro paramagnético colocado num campo magnético energia absorvida pelo e - detectada e convertida num espectro 98

99 197 EPR e - livre tem um valor de g = (g e ) radiação de 9.75 GHz (mais comum) provoca ressonância a 0.34 Tesla (T) sinais de EPR produzidos: medição de energia absorvida a diferentes frequências num campo magnético constante (como no NMR) variando o campo magnético externo a frequência constante (mais comum) 198 EPR n MJ+1 nº de centros paramagnéticos a ocupar o nível M J+1 k constante de Boltzmann (1.38x10-23 JK -1 ) T temperatura (K) na realidade, não existem centros paramagnéticos isolados, mas sim grandes grupos de centros população dos centros em equilíbrio termodinâmico distribuição estatística segue a distribuição de Boltzman n n M M J 1 J e E ( ) kt à frequência de 9.75 GHz (radiação da banda X) e à temperatura ambiente n n M M J J 99

100 199 EPR g dá informação sobre a estrutura electrónica do centro paramagnético g ʌ g e razão do momento magnético do e - sobre o seu momento angular difere daquela de um e - livre como o momento magnético é constante (magnetão de Bohr), e - ganha ou perde momento angular resulta do acoplamento spin-órbita 200 EPR variação de g dá informação sobre a natureza do orbital atómico ou molecular que contém o e - se o átomo ao qual o e - está associado tiver spin nuclear diferente de 0 o seu campo magnético vai também afectar o e- acoplamento hiperfino, desdobrando o sinal em dobletos, tripletos, 100

101 201 Espectroscopia de massa produção de iões a partir de um composto e sua caracterização método qualitativo, podendo ser acoplado a outros 202 Espectroscopia de massa operação sob vácuo maior distância média percorrida pelos iões e moléculas antes de colidirem com outros iões ou moléculas fragmentação mais reprodutível maior sensibilidade maior rigor e fiabilidade na análise produzido por um sistema de 2 bombas uma rotativa ( torr) bomba turbomolecular ou bomba de difusão (10-5 torr) 101

102 203 Espectroscopia de massa existem diversos métodos de ionização: impacto de electrões (EI) ionização química (CI) fast atom bombardment (FAB) field ionization desorpção de plasma energia e fragmentação 204 Espectroscopia de massa impacto de electrões (EI) e - atinge uma molécula neutra liberta outro e - forma ião molecular energia adicional causa fragmentação da molécula 102

103 205 Espectroscopia de massa impacto de electrões (EI) e - com menos de 70 ev originam poucos iões e - com mais de 70 ev provocam fragmentação excessiva obtém-se pouca informação energia adicional causa fragmentação da molécula 206 Espectroscopia de massa impacto de electrões (EI) filamento e ânodo produzem e - repelente empurra iões positivos produzidos para fora da fonte de ionização lentes aceleram iões até atingirem energia cinética constante 103

104 207 Espectroscopia de massa analisadores de massa filtros que resolvem os fragmentos produzidos magnéticos electrostáticos time of flight (TOF) quadrupolo ion trap 208 Espectroscopia de massa analisadores de massa quadrupolos iões acelerados entram numa zona com 4 polos potencial dos polos varia iões com uma determinada massa alcançam o detector muito usados em GC/MS 104

105 209 Espectroscopia de massa quadrupolos para um determinado conjunto de condições, apenas iões com uma massa (M/Z) específica são capazes de atravessar todo o filtro faz-se um varrimento numa gama de massas tipicamente M/Z tempo de aquisição 1 seg 210 Espectroscopia de massa detecção habitualmente feita em multiplicadores de e - material electroemissivo ao ser atingido por um ião, ejecta um e - e - acelerados atingem parede do multiplicador, libertando mais e - sinal amplificado 105

106 211 Espectroscopia de massa recolha e processamento de dados identificação do espectro de massa computadores com bibliotecas cada linha representa uma massa/carga específica habitualmente carga é 1 eixo dos x dá directamente a massa 212 Espectroscopia de massa espectros mostram: massa dos fragmentos padrão de fragmentação presença de isótopos isótopo mais abundante considerado ter um valor de 100 % restantes isótopos normalizados relativamente ao mais abundante intervalos entre as linhas intensidade proporcional à abundância 106

107 213 Espectroscopia de massa interpretação de espectros de massa: analisar aspecto geral tentar encontrar o ião molecular determinar composição elementar identificar características estruturais analisar grau de fragmentação verificar a existência de aglomerados (clusters) presença de linhas com massas pares ou ímpares propor estruturas possíveis Ex: hidrocarbonetos saturados 214 Espectroscopia de massa interpretação de espectros de massa: espaçamento regular com 14 unidades de massa linha principal em cada cluster tem valor ímpar presença de ramificações linhas associadas a fragmentações de ambos os lados da ramificação aumento de ramificações aumento do nº de linhas 107

108 Ex: hidrocarbonetos saturados 215 Espectroscopia de massa interpretação de espectros de massa: n-hexano ião molecular a 86 linha mais intensa a 57 típico dos hidrocarbonetos Ex: hidrocarbonetos insaturados 216 Espectroscopia de massa interpretação de espectros de massa: em alcenos fragmentos contendo ligação dupla são deslocados de -2 unidades num alcano os iões principais seriam 43, 57, 71, 85, 108