Avaliação do potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais em feridas ocasionadas por queimaduras em ratos

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO CAROLINA CALIÁRI OLIVEIRA Avaliação do potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais em feridas ocasionadas por queimaduras em ratos Ribeirão Preto 2010

2 CAROLINA CALIÁRI OLIVEIRA Avaliação do potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais em feridas ocasionadas por queimaduras em ratos Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de Concentração: Imunologia Básica e Aplicada Orientador: Prof. Dr. Júlio César Voltarelli Ribeirão Preto 2010

3 AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE. FICHA CATALOGRÁFICA Caliári -Oliveira, Carolina Avaliação do potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais em feridas ocasionadas por queimaduras em ratos. Ribeirão Preto, p. il. 30cm. Dissertação de Mestrado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada. Orientador: Voltarelli, Júlio César 1. Queimaduras. 2. Células-tronco mesenquimais. 3. Terapia celular. 4. Cicatrização de feridas. 5. Célula multipotente mesenquimal estromal. 6. Medicina regenerativa.

4 FOLHA DE APROVAÇÃO Carolina Caliári Oliveira Avaliação do potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais em feridas ocasionadas por queimaduras em ratos Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de Concentração: Imunologia Básica e Aplicada Aprovado em: Banca Examinadora Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Prof. Dr. Instituição: Assinatura:

5 Dedico este trabalho à minha mãe, por me fazer ser, a cada dia, uma pessoa melhor.

6 Agradeço imensamente, aos profissionais sem os quais esse trabalho não teria sido realizado... Reinaldo e Ramon (Biotério da FCFRP/USP) Ana Cristine Silva Ferreira (Dpto. Imunologia Básica e Aplicada FMRP/USP) Patrícia V.B. Palma e Camila C.B.O. Menezes (FUNDHERP) Cici (Laboratório de Dermatologia do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto) Dr. Marco Andrey C. Frade (Depto. de Clínica Médica da FMRP) Alessandra Almeida (FUNDHERP) Rodrigo Gomes Teixeira e Cíntia Almeida da Silva Santos (FUNDHERP) Dra. Leandra Naíra Z. Ramalho (Laboratório de Patologia da FMRP/USP) Sr. Dejano e Sr. Otávio (Oficina de Precisão/USP) Carmem (FUNDHERP) Dra. Daniela Carlos (Laboratório de Farmacologia da FMRP/USP) Dr. Marcelo D. Baruffi (FCFRP/USP) Dra. Cristina R. B. Cardoso (FMTM/Uberaba) Dra. Maria Aparecida C. Fontes (FUNDHERP) Maria Emília N. Bonifácio da Silva (Laboratório de Análises Clínicas FCFRP/USP) Sandra Navarro (FUNDHERP) Rodrigo Gomes Teixeira (FUNDHERP) Cíntia Almeida da Silva Santos (FUNDHERP) Elaine e Renata (FUNDHERP) Dra. Rita de Cássia Carrara (FUNDHERP)...também aos funcionários da limpeza, da segurança, da copa, da manutenção e da jardinagem da FUNDHERP por tornarem a realização deste trabalho mais agradável.

7 À Daurea, por ter plantado essa idéia... Ao Jorge, por ter aceito o desfio e me ensinado os primeiros passos da cultura de células... Ao Dr. Júlio, por ter confiado em mim... Às meninas Voltarelli, por terem me recebido... À Ju, pela enorme colaboração (em todos os sentidos) e por todas as coisas que ainda virão... À Gabi, pelas discussões produtivas e pela objetividade... À Má, por picotar tecido adiposo alheio, pelas fotos, IHQ... pela alegria... À Kelen, por ter me recebido e ajudado... Ao Willian, por ter me acompanhado... Ao pessoal do laboratório de T. gênica, pela parceria freqüente... Às meninas Voltarelli que chegaram depois, pela companhia...

8 Ao meu irmão Ricardo, pela câmera fotográfica, pela formatação da tese e por todo o tempo perdido... À Kelen e à Isabella, pela correção da tese (pensou que eu ia esquecer?)... À comissão julgadora de defesa de dissertação, por me ouvir... À minha família (pais, irmãos, tios, tias...), pelo apoio constante sem o qual o que eu sou não seria possível... Os meus mais sinceros agradecimentos.

9 RESUMO Caliari-Oliveira, C. Avaliação do potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais na regeneração de feridas ocasionadas por queimaduras em ratos p. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, SP. Queimaduras extensas de pele são de difícil tratamento, principalmente porque levam ao comprometimento do sistema imunológico e de outros órgãos, podendo levar o paciente ao óbito em poucos dias. O paciente com queimaduras graves e extensas requer cuidados especiais e longos tempos de internação. Uma alternativa terapêutica recente para o tratamento de úlceras de pele é a utilização de células-tronco mesenquimais (CTMs) para acelerar o processo de cicatrização da pele. Vários fatores são favoráveis à utilização das CTMs no tratamento de queimaduras extensas, tais como suas propriedades de angiogênese, regeneração e imunoregulação. No entanto, pacientes com queimaduras graves necessitam de tratamento com urgência e a expansão de CTMs autólogas é um processo relativamente demorado o que inviabilizaria a utilização das mesmas em grandes queimados. Com isto, faz-se necessário a utilização de culturas de CTMs alogênicas, previamente estabelecidas de outros doadores saudáveis. Dessa forma, o objetivo do presente foi avaliar o potencial terapêutico das CTMs xenogênicas no tratamento de úlceras ocasionadas por queimaduras extensas e graves em ratos. Para isto, CTMs foram isoladas a partir da medula óssea (MO) de camundongos FVB GFP+ e expandidas in vitro. Ratos Wistar foram submetidos à queimadura experimental através do contato de chapa de metal aquecida a 200 C por 25 segundos em contato com o dorso tricotomizado dos mesmos, esse procedimento originou queimaduras extensas e graves. As CTMs foram aplicadas pela via intradérmica (ID) nos animais pertencentes ao grupo tratado CTM-ID, enquanto foi aplicado PBS via ID nos animais pertencentes ao grupo controle (PBS- ID). Uma diminuição da taxa de mortalidade pós-queimadura foi observada nos animais CTM-ID (23.81%) quando comparada aos animais PBS-ID (39.14%). A partir do quadragésimo quinto dia após injúria térmica uma melhora do processo de cicatrização foi observada nos animais CTM-ID (72.95 ± 5.170) em comparação aos animais PBS-ID (57.74 ± 2.016) p= Análises microbiológicas revelaram que o principal tipo de microorganismo encontrado na pele dos animais de ambos os grupos foi o gênero Staphylococcus sp. Foram acompanhadas as alterações das populações celulares TCD4+ e CD8+ no baço e na região das feridas dos animais, bem como a porcentagem de neutrófilos na região da pele lesada pela queimadura. Durante a avaliação final do processo de cicatrização, no período referente ao sexagésimo dia após injúria térmica a porcentagem de cicatrização dos animais CTM-ID (90.81 ± 5.054) foi maior que a porcentagem de cicatrização dos animais PBS-ID (76.11 ± 3.457), p = , evidenciando o recobrimento mais rápido da ferida nos animais CTM-ID. Dessa forma, esse estudo mostrou resultados positivos, encorajando o uso das CTMs no tratamento de queimaduras extensas e profundas em modelo animal. O potencial terapêutico das CTMs na regeneração de úlceras da pele é interessante não só para o tratamento de pacientes com queimaduras, mas também para o tratamento de pacientes com outras doenças que acometem a pele. Os resultados desse trabalho de pesquisa poderão embasar a terapia regenerativa com CTMs para que a mesma possa se tornar uma alternativa terapêutica rápida e eficaz para o tratamento de pacientes com queimaduras extensas e graves que necessitam de cuidados imediatos. Palavras chave: Queimaduras, células-tronco mesenquimais, terapia celular, cicatrização de feridas.

10 ABSTRACT Caliari-Oliveira, C. Evaluation of the mesenchymal stem cells therapeutic potential in rat burn wounds p. Medicine Faculty of Ribeirão Preto, São Paulo University, SP. Burns in the skin are difficult to treat, once they lead to an impairment of the immune system and other organs, leading the patient to death in a few days. Patients with deep burn require special care and long periods of hospitalization. A recent therapeutic alternative to treat skin ulcer is the use of mesenchymal stem cells (MSC) to accelerate the process of wound healing. Several factors are favorable to the use of MSCs in the treatment of deep burn, such as their properties of angiogenesis, regeneration and immunoregulatory function. However, patients with deep burns need urgent treatment and the expansion of autologous MSCs is a relatively lengthy process, becoming unfeasible its use in full thickness thermal burns. Thus it is necessary the use of allogeneic MSCs, previously established from other healthy donors. Therefore the objective of this study was to evaluate the therapeutic potential of xenogeneic MSCs in the treatment of ulcers caused by deep burn in mice. MSCs were isolated from the bone marrow (BM) of FVB GFP+ mice and expanded in vitro. Wistar rats were submitted to experimental burn through the contact with brass bar to 200 C for 25 seconds in contact with dorsal shaved, this procedure originated deep burn. MSCs were given by via intradermal (ID) in animals belonging to the treated group MSC-ID, and PBS was given via ID in animals belonging to the group control (PBS-ID). A decrease in the post burning mortality rate was observed in animals MSC-ID (23.81%) when compared to the animals PBS-ID (39,14%). From the 45 th day after thermal injury, an improvement in the healing process was observed in animals MSC-ID (72.95 ± 5.170) in comparison to the animals PSB-ID (57.74 ± 2.016) p= Microbiological analyses showed that the main type of microorganism found in the animal skin of both groups was the genus Staphylococcus sp. Alterations in the cell population T CD4 + and CD8 + in spleen and in the area of damaged skin, as well as the percentage of neutrophils in the damaged area by burn were observed. During the final evaluation of healing process, period concerning the 60 th day after the thermal injury, the percentage of healing in animals MSC-ID (90.81 ± 5.054) was bigger than the healing percentage in animals PBS-ID (76.11 ± 3.457), p = , evidencing a faster in the healing of animals MSC-ID. This way, this study indicated the effectiveness of MSCs in the treatment of deep burn in animal model. The therapeutic potential of MSCs in wound healing is interesting for the treatment of patients with burns, as well as for the treatment of patients with other diseases related to skin. The results of this study may serve as a base for regenerative therapy with MSCs in order to become a fast and effective therapeutic alternative for the treatment of patients with deep burn in need of immediate care. Key words: Burns, mesenchymal stem cell, cellular therapy, wound healing.

11 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 01: Determinação da superfície corporal total queimada. Regra dos nove para medida de área corporal queimada Figura 02: Determinação da profundidade das queimaduras. Classificação da queimadura de acordo com sua profundidade Figura 03: Esquema de quadrantes utilizado para realização da queimadura Figura 04: Histogramas representativos da população de CTMs de camundongos FVB GFP Figura 05: Avaliação da multipotencialidade das CTMs isoladas de medula óssea de camundongos FVB GFP Figura 06: Análise da sobrevida dos animais submetidos ao procedimento de injúria térmica experimental Figura 07: Análise da massa corporal dos animais submetidos ao procedimento de injúria térmica experimental por um período de sessenta dias Figura 08: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura nos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID no início do experimento (0d) Figura 09: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID no início do experimento Figura 10: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura nos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID no sétimo dia após o início do experimento Figura 11: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID no sétimo dia do início do experimento Figura 12: Área da queimadura, em pixels, no sétimo dia após o início do experimento Figura 13: População de linfócitos T CD4 + no baço dos animais sete dias após o início do experimento Figura 14: População de células CD8 + no baço dos animais sete dias após o início do experimento Figura 15: População de linfócitos T CD4 + na pele dos animais sete dias após o início do experimento Figura 16: População de células CD8 + na pele dos animais sete dias após o início do experimento Figura 17: Cortes histológicos da pele dos animais no 7d após a injúria térmica... 68

12 Figura 18: Número de neutrófilos na região da ferida ocasionada por queimadura nos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, no sétimo dia após início do experimento Figura 19: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura nos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID no décimo quinto dia após o início do experimento Figura 20: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID no décimo quinto dia após o início do experimento Figura 21: Área da queimadura, em pixels, no décimo quinto dia após o início do experimento Figura 22: População de linfócitos T CD4 + no baço dos animais quinze dias após o início do experimento Figura 23: População de células CD8 + no baço dos animais quinze dias após o início do experimento Figura 24: População de linfócitos T CD4 + na pele dos animais quinze dias após o início do experimento Figura 25: População de células CD8 + na pele dos animais quinze dias após o início do experimento Figura 26: Número de neutrófilos na região da ferida ocasionada por queimadura nos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, no décimo quinto dia após início do experimento Figura 27: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura nos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID no trigésimo dia após o início do experimento Figura 28: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID no trigésimo dia após o início do experimento Figura 29: Porcentagem de cicatrização trinta dias após injúria térmica experimental Figura 30: População de linfócitos T CD4 + no baço dos animais trinta dias após o início do experimento Figura 31: População de células CD8 + no baço dos animais trinta dias após o início do experimento Figura 32: População de linfócitos T CD4 + na pele dos animais trinta dias após o início do experimento. População Figura 33: População de células CD8 + na pele dos animais trinta dias após o início do experimento Figura 34: Cortes histológicos da pele dos animais corados por HE... 87

13 Figura 35: Número de neutrófilos na região da ferida ocasionada por queimadura nos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, no trigésimo dia após início do experimento Figura 36: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura nos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID no quadragésimo quinto dia após o início do experimento Figura 37: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID no quadragésimo quinto dia após o início do experimento Figura 38: Porcentagem de cicatrização quarenta e cinco dias após injúria térmica experimental Figura 39: População de linfócitos T CD4 + no baço dos animais quarenta e cinco dias após o início do experimento Figura 40: População de células CD8 + no baço dos animais quarenta e cinco dias após o início do experimento Figura 41: População de linfócitos T CD4 + na pele dos animais quarenta e cinco dias após o início do experimento Figura 42: População de células CD8 + na pele dos animais quarenta e cinco dias após o início do experimento Figura 43: Número de neutrófilos na região da ferida ocasionada por queimadura nos animais dos subgrupos PBS-ID e CTM-ID, no quadragésimo quinto dia após início do experimento Figura 44: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura nos animais pertencentes ao subgrupo PBS-ID no sexagésimo dia após o início do experimento Figura 45: Aspecto das feridas ocasionadas por queimadura dos animais pertencentes ao subgrupo CTM-ID no sexagésimo dia após o início do experimento Figura 46: Porcentagem final de cicatrização após injúria térmica experimental Figura 47: Cortes histológicos da pele dos animais corados por HE sessenta dias após injúria térmica experimental

14 LISTA DE TABELAS Tabela 01: Associação entre a superfície corporal total queimada e o número de mortes no Hospital das Clínicas da faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Tabela 02: Terapia celular experimental com CTMs Tabela 03: Distribuição dos animais utilizados nos experimentos Tabela 04: Microorganismos colonizadores da pele dos animais submetidos à injúria térmica no dia Tabela 05: Microorganismos colonizadores da pele dos animais submetidos à injúria térmica no terceiro dia após o início do experimento Tabela 06: Microorganismos colonizadores da pele dos animais submetidos à injúria térmica no sétimo dia após o início do experimento Tabela 07: Avaliação histopatológica da interface entre pele normal e úlcera no sétimo dia após injúria térmica Tabela 08: Microorganismos colonizadores da pele dos animais submetidos à injúria térmica quinze dias após o início do experimento Tabela 09: Avaliação histopatológica da interface entre a pele normal e a úlcera no décimo quinto dia após a injúria térmica Tabela 10: Microorganismos colonizadores da pele dos animais submetidos à injúria térmica no trigésimo dia após o início do experimento Tabela 11: Avaliação histopatológica da interface entre a pele normal e a úlcera no trigésimo dia após injúria térmica Tabela 12: Microorganismos colonizadores da pele dos animais submetidos à injúria térmica no quadragésimo quinto dia após o início do experimento Tabela 13: Avaliação histopatológica da interface entre pele normal e a úlcera no quadragésimo quinto dia após injúria térmica Tabela 14: Microorganismos colonizadores da pele dos animais submetidos à injúria térmica no sexagésimo dia após o início do experimento Tabela 15: Avaliação histopatológica da interface entre pele normal e a úlcera no quadragésimo quinto dia após injúria térmica

15 LISTA DE ABREVIATURAS ALFA-MEM: meio essencial mínimo CT: CTH: CTM: DMEM: EAE: EGF: FGF: FITC: GFP: HE: ID: célula-tronco célula-tronco hematopoiética célula-tronco mesenquimal meio essencial modificado encefalomielite autoimune experimental fator de crescimento endotelial fator de crescimento de fibroblastos isotiocianato de fluoresceína proteína verde fluorescente hematoxilina/eosina intradérmico IL-10: interleucina 10 IL-2: interleucina 2 IL-6: interleucina 6 MHC: MMPs: MO: MPO: PBS: PDGF: PE: complexo principal de histocompatibilidade metaloproteases medula óssea mieloperoxidase tampão fosfato tamponado fator de crescimento derivado de plaquetas ficoeritrina PGE 2 : prostaglandina 2 SBF: SIRS: soro bovino fetal síndrome da resposta inflamatória sistêmica

16 SRAC: STC: síndrome da resposta antiinflamatória compensatória superfície corporal total T CD4 + : linfócitos T CD4 + T CD8 + : linfócitos T CD8 + TGF-β: TNF-α: TNF-α: VEGF: Treg: fator transformador de crescimento beta fator de necrose tumoral alfa fator de necrose tumoral alfa fator de crescimento vascular endotelial linfócitos T reguladores

17 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO Paciente queimado Lesão da pele em queimados Terapia celular e células-tronco mesenquimais Terapia com células-tronco mesenquimais na cicatrização de úlceras Terapia com células-tronco mesenquimais em queimaduras OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos MATERIAL E MÉTODOS Considerações gerais Isolamento das células-tronco mesenquimais (CTMs) de medula óssea de camundongos FVB GFP Extração da medula óssea dos camundongos FVB GFP Cultura das células-tronco mesenquimais Tripsinização das células-tronco mesenquimais Imunofenotipagem de MSCs murinas Ensaio de diferenciação in vitro das células CTMs murinas Procedimento experimental Monitoramento fotográfico das lesões obtidas a partir da injúria térmica Cálculo da porcentagem de cicatrização Coleta, processamento e análise de materiais biológicos Obtenção de plasma dos animais Coleta do baço Obtenção de esplenócitos dos animais Imunofenotipagem das subpopulações linfocitárias Coleta de pele Realização da atividade de dosagem de mieloperoxidase (MPO) Análises histológicas... 49

18 Teste microbiológico Análise de dados RESULTADOS Obtenção das células-tronco mesenquimais a partir da medula óssea de camundongos FVB GFP Análise da multipotencialidade das células-tronco mesenquimais Procedimento de injúria térmica experimental Curva de sobrevida dos animas Acompanhamento da massa corporal dos animais Avaliação dos animais no início do experimento Avaliação microbiológica dos animais três dias após o início do experimento Avaliação dos animais sete dias após o início do experimento Grupo GR60d Análise microbiológica das feridas Análise fotográfica das feridas ocasionadas por injúria térmica Grupo GR7d Análise das populações de linfócitos TCD4 + e células CD8 + do baço dos animais por citometria de fluxo Análise das populações de linfócitos T CD4 + e células CD8 + da pele dos animais por citometria de fluxo Análises histopatológicas das lesões Dosagem de MPO da pele da região da ferida dos animais Avaliação dos animais quinze dias após o início do experimento Grupo GR60d Análise microbiológica das feridas Análise fotográfica das lesões por queimadura Grupo GR15d Análise das populações de linfócitos T CD4 + e células CD8 + no baço dos animais por citometria de fluxo Análise das populações de linfócitos T CD4 + e células CD8+ na pele dos animais por citometria de fluxo Análises histopatológicas das lesões Dosagem de MPO da pele da região da ferida dos animais Avaliação dos animais trinta dias após o início do experimento... 80

19 Grupo GR60d Análise microbiológica das feridas Análise fotográfica das lesões por queimadura Grupo GR30d Análise das populações de linfócitos T CD4 + e células CD8 + do baço dos animais por citometria de fluxo Análise das populações de linfócitos T CD4 + e células CD8 + na pele dos animais por citometria de fluxo Análises histopatológicas das lesões Dosagem de MPO na pele da região da ferida dos animais Avaliação dos animais quarenta e cinco dias após o início do experimento Grupo GR60d Análise microbiológica das feridas Análise fotográfica das lesões por queimadura Grupo GR45d Análise das populações de linfócitos T CD4 + e células CD8 + no baço dos animais por citometria de fluxo Análise das populações de linfócitos T CD4 + e células CD8 + da pele dos animais por citometria de fluxo Análises histopatológicas das lesões Dosagem de MPO da pele da região da ferida dos animais Avaliação dos animais sessenta dias após o início do experimento Análise microbiológica das feridas Análise fotográfica das lesões por queimadura Análises histopatológicas das lesões DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS

20 Introdução 1. INTRODUÇÃO 1.1. Paciente queimado Queimaduras na pele o maior órgão do sistema imunológico acarretam prejuízos ao organismo como um todo. Queimaduras na pele são de difícil tratamento, principalmente porque levam ao comprometimento do sistema imunológico e de órgãos, o que pode levar o paciente ao óbito. O paciente queimado requer cuidados especiais e longos tempos de internação. Casos graves de queimaduras podem levar o paciente ao óbito em poucos dias (revisado por ALGÖER et al., 1995). Após internação do paciente queimado a correta determinação da superfície total corporal queimada (STC) é fundamental para que o tratamento possa ser iniciado (figura 01). É considerado grande queimado aquele que apresenta queimadura de extensão igual ou superior a vinte por cento da STC. Figura 01: Determinação da superfície corporal total queimada. Regra dos nove para medida de área corporal queimada, adaptado de Hiettiarathy e Papini,

21 Introdução O paciente queimado desenvolve várias complicações sendo necessária a realização de procedimentos especiais como a transferência de fluídos, o monitoramento do balanço eletrolítico, cuidados sépticos com a ferida, suporte nutricional, respiratório e renal, além do tratamento das infecções, e em casos mais graves, tratamento de sepse e de síndrome de falência de múltiplos órgãos (BISHARA, et al., 2005). Além da correlação com a STC a gravidade da injúria por queimadura está diretamente relacionada à sua profundidade (figura 02). As queimaduras de menor gravidade não atingem todas as camadas da pele, já queimaduras graves danificam não só as camadas da pele como o tecido subcutâneo (revisado por HETTIARATCHY e PAPINI, 2004). Figura 02: Determinação da profundidade das queimaduras. Classificação da queimadura de acordo com sua profundidade, adaptado de Hiettiarathy e Papini, A principal causa de queimaduras é o contato direto com chamas ou líquidos quentes. Já as queimaduras químicas ou ocasionadas por condução elétrica são menos comuns. Vale ressaltar que a fonte de queimadura está relacionada à idade do paciente (revisado por HETTIARATCHY e DZIEWULSKI, 2004). Cerca de sessenta por cento dos pacientes queimados, apresenta idade entre quinze e sessenta e quatro anos, sendo que a maioria das queimaduras em indivíduos com essa faixa etária está relacionada a acidentes ocupacionais, principalmente contato com a chama. Vinte por cento dos pacientes queimados são crianças com idade a cima de quatro anos, sendo que o tipo de queimadura mais comum em indivíduos dessa idade são as queimaduras acidentais por escaldadura. Na faixa etária entre cinco e quatorze anos encontram-se dez por cento dos pacientes queimados, afligidos principalmente por 20

22 Introdução queimaduras por combustíveis ou queimaduras elétricas são as mais representativas (revisado por HETTIARATCHY e DZIEWULSKI, 2004). Alguns fatores como idade avançada, grande STC queimada e a presença de injúria por inalação aumentam o risco de mortalidade em queimados (revisado por HETTIARATCHY e DZIEWULSKI, 2004). Em trabalho publicado a partir de um estudo multicêntrico nos Estados Unidos, Ryan et al., 1998, encontraram maiores taxas de mortalidade em pacientes com idade acima de sessenta anos, com injúria por inalação e queimaduras em quarenta por cento ou mais da STC. Nesse estudo, a associação de, dois ou mais desses fatores aumentaram consideravelmente a morbidade dos pacientes. Em estudo realizado no Brasil De-Souza et al., 1998, apontaram as queimaduras ocupacionais ou decorrentes de acidentes domésticos como a principal causa de internação de pacientes com idade superior a dezoito anos na Unidade de Queimados da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Nesses pacientes a mortalidade foi maior nos indivíduos do sexo masculino. Além disso, a letalidade das injúrias decorrentes de acidentes ocupacionais e domésticos foi menor do que a letalidade observada em pacientes internados em decorrência de tentativa de suicídio. Esse trabalho evidencia que a mortalidade em pacientes queimados pode ser influenciada pelo gênero e intencionalidade da queimadura. Dentre todos os fatores de risco de morte em pacientes queimados a porcentagem corporal queimada e a profundidade dos ferimentos são determinantes cruciais para o prognóstico do paciente. A tabela 01 evidencia a porcentagem de mortalidade observada de acordo com a porcentagem de superfície corporal queimada observada em pacientes da unidade de Queimados da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Tabela 01: Associação entre a superfície corporal total queimada e o número de mortes no Hospital das Clínicas da faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Superfície corporal total Mortalidade queimada (STC) % 1.4% 20-40% 4.3% 40-60% 18.5% 60-80% 78.9% % 100% * Adaptado de De Souza, et al.,

23 Introdução Jeschke et al., 2007, demonstrou que o aumento da mortalidade de pacientes pediátricos com grande STC está relacionado principalmente ao aumento da inflamação e do hipermetabolismo. A resposta hipermetabólica que segue a injúria térmica é iniciada aproximadamente cinco dias após a injúria podendo persistir por cerca de vinte e quatro meses após a queimadura. O hipermetabolismo do paciente queimado é caracterizado pelo aumento do consumo de O 2 e glicose, aumento da produção de CO 2, aumento da temperatura corporal e exacerbação da gliconeogênese, bem como pelo aumento da proteólise e da lipólise. Esse fenômeno acarreta além de perda de massa corporal a diminuição da densidade óssea e um prejuízo na cicatrização da pele queimada (HERNDON e TOMPKINS, 2004). O súbito aumento da temperatura na região queimada resulta em uma imediata resposta local. Essa resposta promove vasodilatação com o intuito de dissipar o calor proveniente da injúria térmica. Além disso, ocorre um aumento da secreção de mediadores inflamatórios iniciando uma cascata de reações locais (revisado por ARTURSON, 1996). A resposta inflamatória local, caracterizada pela produção exacerbada de mediadores químicos e ativação de leucócitos e células endoteliais pode contribuir para os efeitos sistêmicos observados após o trauma térmico (revisado por ARTURSON, 1996). Em grandes queimados, mediadores inflamatórios liberados podem causar broncoconstrição acarretando insuficiência respiratória. O desenvolvimento de hipermetabolismo e imunossupressão afetando tanto a imunidade mediada por células quanto a imunidade humoral também são comumente observados (revisado por HETTIARATCHY e DZIEWULSKI, 2004). Queimaduras que atingem mais trinta por cento da STC, induzem efeitos sistêmicos consideráveis no organismo. Esses efeitos são desencadeados pela secreção de citocinas e outros mediadores inflamatórios. Nesses pacientes há um aumento da permeabilidade capilar que ocasiona a perda intravascular de proteínas e fluidos para o compartimento intersticial. Paralelamente, a contratilidade do miocárdio é diminuída provavelmente devido à secreção de TNF-α. Essas alterações somadas à perda de fluidos pelo ferimento resultam em hipotenção sistêmica e hipoperfusão em órgãos (HETTIARATCHY e DZIEWULSKI, 2004). A secreção exacerbada de citocinas como a IL-6, IL-1 e TNF-α está relacionada aos efeitos negativos sistêmicos em pacientes queimados. Essas citocinas provavelmente são responsáveis pela manutenção prolongada da ativação 22

24 Introdução de macrófagos e esses, por sua vez, produzem mediadores lipídicos, como prostaglandinas e leucotrienos. Esses mediadores ativam cascatas enzimáticas que conseqüentemente levam à imunossupressão do paciente queimado (revisado por SPARKES, 1997). A injúria grave, especialmente a injúria térmica prejudica os mecanismos de defesa do organismo. A imunossupressão decorrente da injúria térmica causa um aumento da suscetibilidade do paciente a infecções. Em conseqüência, as infecções em pacientes queimados estão associadas a um maior risco de mortalidade. A principal porta de entrada de patógenos em pacientes queimados é o trato respiratório, acarretando principalmente pneumonia nesses pacientes. Por outro lado, as infecções locais nas feridas ocasionadas pela injúria térmica representam uma importante fonte de sepse sistêmica (revisado por O SULLIVAN e O CONNOR, 1997). Além disso, pacientes queimados com má evolução podem freqüentemente apresentar o desenvolvimento de SIRS (síndrome da resposta imune sistêmica), síndrome da angústia respiratória do adulto (SARA) e síndrome da disfunção de múltiplos órgãos (SDMO) que podem ocasionar progressiva falência de órgãos e morte (revisado por ARTURSON, 1996). A introdução do procedimento de reposição de fluidos por Underhill em 1930 representou um ganho para o tratamento de pacientes queimados e esse procedimento continua sendo atualmente o padrão ouro para esse tipo de injúria. A administração adequada de fluidos é crítica para a prevenção de choque e outras complicações decorrentes da injúria térmica (revisado por BENSON et al., 2006). Além disso, nos últimos 50 anos, a menor incidência de infecções das feridas, menor ocorrência de sepse sistêmica e menor taxa de mortalidade dos pacientes queimados têm sido atribuídas aos avanços substanciais no cuidado de queimados, particularmente ao desbridamento precoce (revisado por CHURCH et al., 2006) Lesão da pele em queimados Por um longo período o tegumento foi considerado um órgão de proteção passiva. Porém atualmente a pele tem sido considerada um órgão imunologicamente competente (revisado por ALLGÖWER, 1995). 23

25 Introdução A pele constitui a primeira barreira de defesa do corpo humano, desempenhando importantes funções na proteção contra uma grande variedade de agressões ambientais e na manutenção da homeostasia através da termo-regulação e do balanço de fluidos (revisado por BARTHEL e ABERDAM, 2005). O epitélio cutâneo é composto por três estruturas bem definidas histologicamente: a epiderme, os folículos pilosos e as glândulas sebáceas (revisado por FUCHS e RAGHAVAN, 2002). A epiderme compreende a camada mais externa da pele sendo constituída por um tecido estratificado e escamoso posicionado sobre uma membrana basal que o separa do tecido subjacente, a derme. As células da lâmina basal são mitoticamente ativas, o que confere sua grande capacidade regenerativa (revisado por GHAZIZADEH e TAICHMAN, 2001). A população celular da epiderme é compreendida principalmente por queratinócitos e células de Langerhans. Os queratinócitos que correspondem a aproximadamente 95% da população de células epidérmicas, expressam normalmente em sua superfície antígenos do complexo maior de histocompatibilidade de classe I (MHC-I), mas em algumas situações patológicas passam também a expressar antígenos MHC de classe II. Já as células de Langerhans que compreendem de 3-4% da população das células epidérmicas, expressam em sua superfície principalmente moléculas do tipo CD1, podendo expressar também moléculas MHC de classe II (MHC-II). As principais funções das células de Langerhans são o reconhecimento, captura e apresentação de antígenos para os linfócitos T CD4 + (revisado por ALGÖWER, et al., 1995). Na derme, as células presentes em maior número (cerca de 80% na região papilar) são os dendrócitos. Esse tipo celular encontra-se intimamente associado à microvascularização cutânea, agindo tanto como célula apresentadora de antígenos quanto como célula fagocítica. (ALGÖWER, et al., 1995). A injúria por queimadura, além de lesar o tegumento permitindo a invasão do organismo por agentes externos, pode provocar alterações vasculares como descamação das células endoteliais e trombose microvascular, o que dificulta a chegada de componentes do sistema imune ao local da lesão. Fatores próinflamatórios como o TNF-α, IL-2 e IL-6 são impedidos pela barreira mecânica de chegarem à área queimada, o que diminui consideravelmente a resposta inflamatória e imunológica do organismo (MORAN e MUNSTER, 1987; ONO et al, 1995). 24

26 Introdução Três diferentes zonas são detectáveis no ferimento por queimadura, segundo Jackson, 1947: a zona de coagulação, a zona de estase e a zona de hiperaemia. O dano máximo causado pela injúria térmica é observado na zona de coagulação, onde o dano ao tecido é irreversível devido à coagulação das proteínas constituintes. A região ao redor da zona de coagulação,compreende a zona de estase, onde há uma diminuição da perfusão. Porém esta representa uma área predisposta à recuperação através principalmente do procedimento ressuscitação de fluidos que aumenta a reperfusão local prevenindo danos subseqüentes. A região mais externa, denominada região de hiperanemia é caracterizada por perfusão aumentada, nessa região, o tecido é comumente recuperado (revisado por HETTIARATCHY e DZIEWULSKI, 2004). O processo de cicatrização de úlceras/úlceras de pele compreende três fases distintas: a fase inflamatória, a proliferativa e a fase de remodelamento. Todas essas fases são reguladas pela atuação de diversos fatores de crescimento (revisado por WITTE e BARBUL, 1997). A interrupção vascular seguida pelo extravasamento de plasma ocorrido após a injúria funciona como um sinal para que um coágulo de fibrina temporário seja formado na superfície lesada com o intuito de restabelecer a homeostasia e promover um substrato temporário para que ocorra a agregação plaquetária. As plaquetas aderidas ao coágulo secretam fatores de crescimento, citocinas e componentes da matriz extracelular. Esses mediadores inflamatórios recrutam macrófagos e neutrófilos os quais, por sua vez, secretam outros fatores específicos orquestrando o processo de reepitelização (revisado por SANTORO e GAUDINO, 2005). A fase inflamatória é essencial para o processo normal de cicatrização de úlceras. Essa fase é caracterizada pelo aumento da permeabilidade vascular, liberação de citocinas, óxido nítrico (inos) e fatores de crescimento e conseqüente quimiotaxia das células da circulação para a superfície lesada (revisado por WITTE e BARBUL, 1997). Durante a fase inflamatória, os macrófagos controlam a degradação do tecido conectivo extracelular através da secreção de enzimas e de fagocitose. Além disso, os macrófagos promovem a cicatrização através da produção de fatores de crescimento, tais como o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), o TGF-, o TNF- e outras interleucinas (revisado por STEED, 1997). 25

27 Introdução Fibroblastos e células endoteliais são as primeiras células a iniciarem a fase proliferativa. Tanto a quimiotaxia quanto a proliferação de fibroblastos no local da injúria são reguladas por fatores de crescimento, tais como o PDGF, EGF (fator de crescimento epidermal), FGF (fator de crescimento de fibroblastos) e TGF-. A matriz de fibronectina fornece o substrato para ancoragem das células. Nessa fase proliferativa, as células endoteliais iniciam o processo de angiogênese (revisado por WITTE e BARBUL, 1997). Fibroblastos estimulados por EGF e TGF-β iniciam o processo de síntese de colágeno, característico da fase de remodelamento da cicatrização. A deposição de colágeno representa um ponto crítico do processo à medida que define a qualidade do processo cicatricial (revisado por WITTE e BARBUL, 1997). Além da atuação dos fatores de crescimento, as integrinas e as metaloproteinases são reguladores imprescindíveis para o processo de remodelamento tecidual (SANTORO e GAUDINO, 2005). A perda da integridade do tegumento como ocorre em pacientes queimados é associada à alta morbidade e mortalidade devido à perda de fluidos, proteínas e eletrólitos e ao aumento da susceptibilidade do indivíduo a infecções e a sepse (revisado por FALABELLA, 2001). O rápido recobrimento da área de pele perdida ou danificada representa uma melhora do prognóstico do indivíduo sendo que o padrão ouro para esse tipo de trauma é o auto-enxerto de pele, porém grandes queimados dificilmente apresentam disponibilidade de área não queimada para a realização desses enxertos (BUTLER, 2003) Terapia celular e células-tronco mesenquimais Células-tronco (CT) são células indiferenciadas e não especializadas, capazes de se multiplicar por um longo período de tempo, mantendo-se indiferenciadas, de forma que um pequeno número pode originar uma grande população de células semelhantes, além disso, as CT são capazes de se diferenciar em células especializadas de um tecido particular (ZAGO e COVAS, 2006). As células-tronco mesenquimais (CTMs) foram descritas pela primeira vez por Friedenstein et al., em 1966, que observaram a presença de uma população celular peculiar em células mononucleares da medula óssea de camundongos, essa 26

28 Introdução população era representada por células de formato fibroblastóide e apresentava a propriedade de formar colônias in vitro, sendo dessa forma denominadas de unidades formadoras de colônias fibroblástóides. Atualmente, sabe-se que a medula óssea (MO) contém além das célulastronco hematopoiéticas e das células-tronco endoteliais, uma população rara de células-tronco, que corresponde a 0,001% a 0,01% de todas as células nucleadas medulares, constituídas pelas CTMs. Na MO as CTMs são responsáveis por dar suporte à hematopoese (revisado por ZAGO e COVAS, 2006). Segundo a Sociedade Internacional para Terapia Celular (ISTC) a nomenclatura célula-tronco mesenquimal não é a mais adequada para designar essa população celular, sendo mais apropriada a denominação de células multipotentes mesenquimais estromais, (HORWITZ, et al., 2005), porém para efeito didático continuaremos nos referindo a essa população como CTMs. CTMs são rotineiramente isoladas da MO e de tecidos de origem mesodérmica, tais como o tecido adiposo, muscular, ósseo e cartilaginoso. As células estromais multipotentes tem sido isoladas também a partir de outros tecidos, de origem não mesodérmica (PITTENGER et al., 1999; ERICES et al., 2000; BAKSH et al., 2004). Em estudo recente foi demonstrado o isolamento de CTMs a partir de cérebro, baço, fígado, rins, pulmões, MO, músculo, timo e pâncreas de camundongos (da SILVA MEIRELLES et al., 2006). Dessa forma, as CTMs existem virtualmente em todos os órgãos (revisado por da SILVA MEIRELLES, et al., 2008) podendo ser facilmente isoladas a partir de diversos tecidos. Para justificar a vasta distribuição desse tipo celular pelo organismo vários estudos têm sugerido a natureza perivascular das CTMs. Em trabalho realizado em 2003, Shi e Gronthos demonstraram que populações ontogenicamente distintas de CTMs, as células estromais da MO e as células tronco da polpa dentária encontram-se associadas à microvasculatura de seus respectivos tecidos (SHI e GRONTHOS, 2003). Em 2008, Covas et al., propuseram a existência de CTMs e células de pericitos na parede vascular, não só coexistindo como compartilhando características como a diferenciação em outros tipos celulares. Para os autores essa conformação constitui um compartimento de CTMs que se estende por todo o organismo responsável não só pela manutenção de tecidos como também pelo 27

29 Introdução reparo em situações de injúria (COVAS et al., 2008). Posteriormente, foi demonstrada a origem perivascular de CTMs provenientes de múltiplos órgão adultos e fetais. Paralelamente, Crisan et al., 2008, isolaram células perivasculares a partir de tendão adulto, músculo esquelético fetal, pâncreas fetal, placenta, coração fetal, pele fetal, pulmões, cérebro, olhos, intestino, medula óssea, cordão umbilical e observaram que essas células expressavam nativamente marcadores comuns às CTMs, indicando que esses tipos celulares estariam intimamente relacionados em tecidos intactos. Dessa forma, esses trabalhos sugerem a hipótese de que as CTMs estejam distribuídas por todo o corpo como pericitos, estabilizando os vasos sanguíneos e contribuindo para a homeostase de tecidos e do sistema imune sob condições fisiológicas. Em situações de injúria, quando os mecanismos de reparo tecidual são acionados, ocorre um aumento da proliferação e atividade dessas células, que passam secretar fatores bioativos os quais atuam na proteção, reparo e/ou regeneração do tecido em questão; dessa forma os pericitos atuam como uma fonte local de CTMs com finalidade terapêutica (revisado por da SILVA MEIRELLES, 2008). Nos últimos anos, a expansão do conhecimento sobre a biologia das CTMs abriu perspectivas para sua utilização terapêutica, sendo que sua multipotencialidade favorece sua utilização na medicina regenerativa e/ou reconstrutiva. Pittenger, et al., 1999, demonstrou que as CTMs são células multipotentes passíveis de se diferenciarem em células de tecidos mesodérmicos como osso, cartilagem, gordura, tendão, músculo e estroma da MO. Trabalhos posteriores demonstraram que as CTMs são capazes de se diferenciar em tipos celulares como células endoteliais (REYES, et al., 2002), hepatócitos (SATO, et al., 2005) e células neurais (KANG, et al., 2004) e células da epiderme (SASAKI, et al., 2008) in vitro. Adicionalmente as CTMs poderiam se diferenciar in vivo em células tecido-específicas em resposta ao nicho encontrado em diferentes órgãos (revisado por JIANG, et al., 2002). Além do potencial de diferenciação o potencial regenerativo das CTMs devese à secreção de um largo espectro de moléculas bioativas como citocinas e fatores de crescimento que podem estruturar o microdesevolvimento de regiões injuriadas (revisado por CAPLAN, 2007). 28

30 Introdução Além de seu potencial de diferenciação e regenerativo, importantes para o processo de regeneração tecidual, as CTMs apresentam propriedade imunoreguladora. As CTMs apresentam propriedades imunoreguladoras/imunomodulatoras in vitro e in vivo, sendo capazes de modular a função imunológica de várias populações celulares do sistema imune, tais como células apresentadoras de antígenos, células T, células B e células NK (RAMUSSON, 2006). Ademais, por não expressarem moléculas co-estimulatórias, as CTMs apresentam limitada imunogenicidade, sendo fracamente reconhecidas pelo HLA de hospedeiros incompatíveis (UCELLI e PISTOIA, 2006). De acordo com critérios estabelecidos pela ISTC, são características mínimas para a definição de CTMs: a. a propriedade de aderir ao plástico quando mantidas em garrafas de cultura; b. expressão dos marcadores de superfície celular CD105, CD73 e CD90 e a expressão menor que 2% ou ausência de expressão dos marcadores de superfície celular CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79α ou CD19 e HLA classe II e c. a capacidade, se diferenciarem em adipócitos, condrócitos e osteócitos após a indução específica in vitro (DOMINICI et al., 2006). Dessa forma, características como o fácil isolamento, multipotencialidade, potencial regenerativo e imunomodulador favorecem o uso das CTMs para terapia celular de várias patologias (tabela 02) o que é especialmente interessante para a medicina regenerativa e a engenharia de tecidos (KOLF et al., 2007). 29

31 Introdução Tabela 02: Terapia celular experimental com CTMs Doença Co-infusão CTMs e CTHs Modelo animal Órgão alvo Mecanismos ação CTMs Rota administração Ovelha Hematopoéticos Aumento da hematopoese Sistêmica Infarto miocárdio Camundongo Coração Desenvolvimento novos miócitos e estruturas vasculares Local Rejeição enxerto pele Macaco Pele Inibição linfócitos T Sistêmica Derrame Rato SNC Liberação de fatores tróficos e indução de neurogênese Sistêmica Falência renal aguda Rato Rins Inibição citocinas próinflamatórias e liberação fatores tróficos e antiapoptóticos Sistêmica EAE Camundongo SNC Inibição linfócitos mielinaespecífios e indução tolerância periférica Sistêmica Diabetes Camundongo Pâncreas e glomérulos renais Indução céls progenitoras locais e inibição de infiltrado de macrófagos Sistêmica Artrite reumatóide Camundongo Articulações Inibição céls T e geração céls Tregs Sistêmica Degeneração retina Rato Olho Produção de fatores tróficos e antiapoptóticos Local Injúria pulmonar aguda Camundongo Pulmão Inibição citocinas próinflamatórias Sistêmica Falência hepática Rato Fígado Inibição da invasão leucocitária via liberação citocinas Meio condicionado por CTMs *Adaptado de Uccelli, et al., Terapia com células-tronco mesenquimais na cicatrização de úlceras A perspectiva de utilização de CTs no tratamento de úlceras de pele é promissora, uma vez que trabalhos têm mostrado que essas células têm capacidade de acelerar o processo de cicatrização desse tecido via efeito parácrino e transdiferenciação em tipos celulares importantes para a cicatrização. A reepitelização mais rápida impede complicações posteriores como subseqüentes infecções 30

32 Introdução O co-cultivo de queratinócitos com três tipos de tecido de origem mesenquimal: CTMs derivadas da MO, preadipócitos ou fibroblastos dermais em modelo de reconstrução de pele in vitro foi capaz de regenerar a epiderme (AOKI, et al., 2004). Nesse estudo, CTMs foram capazes de diminuir a apoptose dos queratinócitos e de promover a neo-formação organizada dos componentes da epiderme. Mecanismos autócrinos e parácrinos possivelmente estão envolvidos nesse processo, sendo que o contato célula a célula é imprescindível para que ocorresse a regeneração da epiderme nesse modelo (AOKI, et al., 2004). Em modelo de feridas excisionais cutâneas em ratos a infusão única de CTMs alogênicas derivadas da MO, vinte e quatro horas após a excisão, ou múltiplas infusões de CTMs por quatro dias subseqüentes à excisão, não só reduziu o tempo de cicatrização como também aumentou a elasticidade do tecido associada ao aumento da deposição de colágeno na área da lesão. Além disso, nesse modelo a infusão de CTMs alogênicas foi mais eficiente em promover a reepitelização das feridas do que a infusão de fibroblastos singênicos (McFARLIN et al., 2006). No trabalho realizado por Goldenberg et al. (2006) foi avaliada a dinâmica da cicatrização de úlceras provocadas cirurgicamente em camundongos de acordo com a concentração de CTMs aplicadas na superfície da ferida. Goldenberg et al., observaram uma diminuição da quantidade de CTMs na superfície da lesão a partir do 3º dia, devido à possível diferenciação das mesmas no local e um aumento de células precursoras estromais nos tecidos hematopoéticos durante o processo de cicatrização. Com o intuito de avaliar o potencial terapêutico tópico das CTMs em úlceras crônicas isquêmicas e não isquêmicas, Volk et al., 2007, demonstraram que as CTMs foram mais efetivas na promoção da cicatrização das feridas que células mononucleares da medula óssea. As CTMs não só aceleraram a formação de tecido de granulação, como também aumentaram a deposição de colágeno auxiliando a reepitelização através de mecanismos diretos como a diferenciação em miofibroblastos e indiretos ou efeito parácrinos como a produção de fatores, tais como os fatores de crescimento bfgf, VEGF e PDGF (VOLK, et al. 2007). Em estudo clínico Falanga et al. (2007) comprovaram que CTMs contribuem significativamente para a cicatrização de úlceras crônicas de membros inferiores em pés de pacientes que apresentavam insuficiência venosa crônica e neuropatia diabética ou úlceras agudas após a remoção cirúrgica de alguns tipos de cânceres 31

33 Introdução de pele. Em ambos os casos os pacientes foram tratados com aplicação tópica de CTMs autólogas e um spray de fibrina foi utilizado como veículo. Os pacientes do grupo portador de úlceras crônicas apresentavam um histórico prévio de insucesso dos tratamentos de rotina para cicatrização de úlceras e todos os indivíduos tinham úlceras persistentes por mais de um ano. Nesse grupo, o decréscimo do tamanho das úlceras ou a cicatrização completa puderam ser observados em torno de semanas. Destacou-se o caso de uma paciente portadora de artrite reumatóide com úlcera venosa existente há mais de 10 anos, cuja ferida cicatrizou completamente nesse período. No caso das úlceras agudas, o tratamento com CTMs autólogas foi iniciado logo após a cirurgia. Para isso foi realizada uma aspiração da MO dos pacientes, duas semanas antes do procedimento cirúrgico e essas células foram cultivadas em meio de cultura seletivo para CTMs. Foram aplicadas 2 x 10 6 cels/cm² entre as 2ª e 4ª passagens. Nesse grupo, as CTMs foram efetivas na cicatrização das lesões desses pacientes. Os autores demonstraram a formação de novas fibras elásticas, cerca de oito dias e a cicatrização total das úlceras oito semanas após o início do tratamento com CTMs (FALANGA et al., 2007). Úlceras crônicas acometem cerca de 25-50% dos indivíduos diabéticos, o que representa um custo anual para os sistemas de saúde de todo o mundo em cerca de 8-9 bilhões de dólares (JAVAZON, et al., 2007). Dessa forma, é um problema de saúde que têm despertado o interesse de vários grupos de pesquisa. A cicatrização em diabéticos é prejudicada entre outros fatores devido ao aporte sanguíneo local ineficiente e a capacidade de recrutamento de células inflamatórias reduzida para o local da lesão cutânea. Javazon et al. (2007) demonstraram que a aplicação tópica de CTMs da MO em úlceras de camundongos diabéticos db/db, diferentemente do observado nos grupos que receberam células da MO e PBS, aumentou a reepitelização, a formação de tecido de granulação e a neovascularização através de mecanismos indiretos (efeito parácrino). Com o objetivo de definir se as CTMs persistem no local da lesão após o tratamento e se a mesmas teriam capacidade de originar novas estruturas, Falanga et al. (2007) utilizaram um modelo animal de ferida cirúrgica em camundongos diabéticos db/db e CTMs que expressavam GFP. Nesse experimento, pôde-se observar que as CTMs foram capazes de penetrar na ferida por volta do 5º dia, 32

34 Introdução porém, poucas células GFP + foram encontradas na lesão cicatrizada e as mesmas pareceram não ter se diferenciado em queratinócitos. Vale ressaltar o aparecimento de estruturas endoteliais, como vasos sanguíneos marcados positivamente por GFP, evidenciando a possível diferenciação das CTMs nessas estruturas e seu importante papel para o processo de neo angiogênese (FALANGA et al., 2007). A injeção de CTMs GFP + derivadas da MO de camundongos ao redor das úlceras foi capaz de acelerar o processo de proliferação celular, angiogênese e reepitelização tanto em camundongos normais, quanto em camundongos diabéticos db/db, quando comparada à aplicação de fibroblastos dermais alogênicos neonatais ou de veículo controle (WU et al., 2007). Os pesquisadores demonstraram ainda a possível diferenciação das CTMs GFP + em queratinócitos na derme do tecido cicatrizado. Além disso, em um período mais tardio, foram observadas estruturas glandulares GFP +. Wu et al. (2007) constataram ainda um aumento significativo da expressão gênica de fatores de crescimento vasculares e endoteliais e de angiopoetina-1, evidenciando o potencial pró-angiogênico das CTMs. Badillo et al. (2007) trataram úlceras de camundongo diabético (db/db) com CTMs isoladas a partir de fígado fetal e observaram ao 7º dia uma diminuição significativa do espaçamento entre as bordas da úlcera, além do aumento da formação de tecido de granulação e da presença de células CD31 + no local. Foi observado um aumento da expressão dos genes EGF, TGF-β1, VEGF e SDF1-α em biópsias das úlceras. Badillo et al. (2007) também observaram no grupo de animais tratado com CTMs um aumento da contractilidade do tecido neo-formado, característico de um processo de deposição de colágeno eficiente durante o processo cicatricial. Kwon et al., 2008, trataram úlceras em ratos diabéticos com CTMs isoladas de MO. O diabetes foi induzido nos ratos pela aplicação de estreptozotocina e foram testadas duas vias de aplicação das CTMs, a infusão intravenosa e a aplicação local. Os autores observaram uma melhor reepitelização nos animais tratados associada ao aumento da dos níveis de colágeno do tipo I e V no leito da ferida, bem como o aumento da expressão de fatores solúveis como TGF-β, KGF, EGF, VEGF e PDGF. Recentemente, foi demonstrado que o efeito parácrino das CTMs derivadas da MO de camundongos é capaz de aumentar a proliferação de macrófagos, progenitoras endoteliais e a secreção de diversos fatores de crescimento importantes para o processo de cicatrização em modelo de ferida excisional em camundongos. A aplicação 33

35 Introdução tópica do sobrenadante concentrado das culturas de CTMs nas lesões foi mais eficiente que a aplicação tópica do sobrenadante das culturas de fibroblastos dermais aumentando não só o número de macrófagos e células progenitoras endoteliais no local da lesão, mas também a quantidade de fatores de crescimento tais como VEGF, EGF, SDF-1 e angiopoetina-1 secretadas (CHEN, et al., 2008). A maioria dos trabalhos realizados utilizando CTMs na cicatrização de feridas têm destacado seu potencial parácrino, sendo que poucos trabalhos demonstraram a transdiferenciação das mesmas em outros tipos celulares capazes de promover a cicatrização cutânea. Nesse contexto, Sasaki e et al., 2008, demonstraram que CTMs isoladas da MO de camundongos GFP + são capazes de se diferenciar em queratinócitos e células endoteliais in vitro. Além disso, os pesquisadores infundiram CTMs GFP + intravenosamente em camundongos submetidos à realização de ferida cirúrgica. Foi observado através de imunohistoquímica que uma pequena porcentagem de CTMs GFP + foi capaz de se diferenciar em queratinócitos in vivo (0,14%), enquanto 13,2% das células endoteliais no leito da ferida eram GFP+. Uma porcentagem relativamente maior de células GFP + (33%) estava localizada na parede de capilares e foram positivas para o marcador α-sma e negativas para CD31, sendo identificadas como pericitos. Os autores descartaram a possibilidade da ocorrência de fusão entre as células GFP+ e as células da pele pela técnica de hibridização in situ por fluorescência, onde os mesmos observaram que todas as células GFP + continham cromossomos XY, enquanto os animais recipientes eram XX. Sasaki, et al., (2008) demonstraram também que a aplicação intradérmica da quimiocina SLC/CCL21 aumentou a migração de CTMs para o local da lesão e contribuiu para o processo de cicatrização via transdiferenciação Terapia com células-tronco mesenquimais em queimaduras Em um modelo experimental de queimaduras em camundongos, Shumakov et al. (2003) mostraram que a utilização de CTMs autólogas ou alogênicas e de células fibroblastóides embrionárias acelerou o processo de regeneração da pele quando comparados aos controles que não receberam tratamento com células. Os 34

36 Introdução resultados mostraram uma diminuição da infiltração de células imunocompetentes nas úlceras e aceleração do processo de formação de vasos e de tecido de granulação no local afetado pelas queimaduras profundas. Em outro estudo, Fu et al. (2006) mostraram que CTMs alogênicas isoladas de mini-porcos e induzidas em cultura com VEGF ou cultivadas em meio de cultura epitelial suplementado com EGF, foram capazes de se transdiferenciar em células com fenótipo epidermal e endotelial. Quando associadas à um selante de fibrina e implantadas ex vivo em queimaduras no dorso de mini-porcos, as CTMs foram capazes de acelerar o processo de regeneração originando células especializadas como células endoteliais, células epidermais e células do ducto sebáceo (FU et al., 2006). Rasulov et al. (2006) compararam o potencial terapêutico do transplante de fibroblastos fetais e de CTMs alogênicas na cicatrização de queimaduras em ratos. Esse estudo demonstrou que ambas as CTs utilizadas topicamente nas lesões reduziram a quantidade de infiltrado inflamatório na superfície lesada, bem como promoveram a formação de novos vasos sanguíneos e de tecido de granulação. Em humanos, Rasulov et al. (2005) mostraram a possibilidade de tratamento de queimaduras utilizando CTMs alogênicas. Neste caso, uma paciente com 45 anos apresentando queimaduras de I, II, III A-B em 40% da área corporal foi tratada com as técnicas habituais em casos de queimaduras graves, incluindo o procedimento de auto-enxertos de pele que foram rejeitados. Após 20 dias de internação foi observada a ausência de pega dos enxertos e a piora do estado clínico da paciente, com progressão da insuficiência cardiovascular, hepática e respiratória. Neste momento foi introduzida a terapia células utilizando CTMs alogênicas. Três dias após implante de pele com CTMs alogênicas houve um aumento da angiogênese nas regiões queimadas, e após oito dias, foi observada a normalização dos valores bioquímicos sanguíneos da paciente, aceleração do processo de reepitelização e conseqüente recobrimento da ferida. Aparentemente não houve rejeição dos enxertos quando estes foram implantados concomitantemente às CTMs alogênicas, o que possibilita a utilização deste tipo celular associada a implantes de enxertos no período inicial do tratamento (RASULOV et al., 2005). Em um estudo recente, Liu et al., 2008, demonstraram que a utilização de CTMs alogênicas isoladas de MO e adicionadas à matriz de colágeno foi eficiente 35

37 Introdução para promover a reepitelização de queimaduras dérmicas superficiais em mini porcos. Quatro semanas após a queimadura, foi observada uma maior densidade de vasos sanguíneos nos animais que receberam a matriz colágena contendo as CTMs. Nesse período também foi observado no grupo tratado uma maior queratinização e a migração das CTMs da matriz colágena para tecidos subjacentes compreendidos pela neo-epiderme e neo-derme (LIU, et al., 2008). 36

38 Objetivos 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral Estabelecer modelo de queimadura grave em ratos Wistar e avaliar o potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais nesse modelo experimental Objetivos específicos Estabelecer e caracterizar um modelo de queimadura experimental grave e extensa em ratos Wistar; Avaliar a freqüência das subpopulações de células T CD4 + e CD8 + no baço dos animais, em vários períodos após a queimadura experimental; Avaliar a freqüência das subpopulações de células T CD4 + e CD8 + na região da ferida ocasionada pela queimadura nos animais, em vários períodos após a queimadura experimental; Avaliar a quantidade de neutrófilos presentes na região da ferida ocasionada pela queimadura nos animais em vários períodos após a queimadura experimental; Avaliar os achados histopatológicos encontrados na pele dos animais em vários períodos após a queimadura experimental; Determinar os microorganismos colonizadores da região da ferida ocasionada pela queimadura nos animais, em vários períodos após a queimadura experimental; Estabelecer uma cinética dos acontecimentos observados durante a evolução das queimaduras graves e extensas por período total de sessenta dias, relacionando a freqüência de linfócitos T CD4 + e células CD8 + no baço e na região da ferida, a quantidade de neutrófilos presentes na região da ferida e os achados histopatológicos e microbiológicos das feridas. 37

39 Material e Métodos 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Considerações gerais Para a realização deste estudo foram utilizadas como fonte de células-tronco mesenquimais (CTMs) medulas ósseas de camundongos da linhagem FVBGFP+ machos. As matrizes dos camundongos FVBGFP+ foram adquiridas do laboratório de criação The Jackson Laboratory (http://jaxmice.jax.org) e foram mantidas pelo biotério de criação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Para a realização do experimento de injúria térmica foram utilizados ratos Wistar machos fornecidos pelo Biotério Central da Universidade de São Paulo do Campus de Ribeirão Preto. Esses animais foram aclimatados por um período aproximado de uma semana antes da realização dos experimentos. A aclimatação foi feita no Biotério de Experimentação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, após o procedimento de injúria térmica experimental, os ratos Wistar foram mantidos no Biotério de Experimentação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo até o final dos experimentos. Os animais dos quais foram retirados materiais biológicos (sangue, baço e pele) durante o experimento foram sacrificados por decapitação, enquanto os animais que foram avaliados no período máximo estipulado no experimento, equivalente há sessenta dias após o início do experimento, foram sacrificados em câmara de CO 2. Os procedimentos experimentais utilizando animais estão de acordo com as normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), e o presente trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal (CETEA) da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (Processo número: 115/2007). 38

40 Material e Métodos 3.2. Isolamento das células-tronco mesenquimais (CTMs) de medula óssea de camundongos FVB GFP Extração da medula óssea dos camundongos FVB GFP+ Camundongos FVB GFP + foram sacrificados e submetidos à remoção cirúrgica dos fêmures e tíbias, dos quais foi extraída a medula óssea (MO). Os ossos foram mantidos em placa de Petri contendo PBS. Em seguida, as epífises (extremidades) dos fêmures e das tíbias foram retiradas com o auxílio de uma tesoura. Em uma das extremidades do orifício do osso foi acoplada uma agulha de 0.3cc fixa à seringa de 1mL contendo PBS. Em seguida, a extração da MO foi realizada através do procedimento de lavagem do osso (conhecido por flushing ) com PBS. Durante o flushing os ossos foram posicionados sobre o tubo coletor em posição vertical, com o auxílio de uma pinça. O procedimento foi repetido até que a ausência dos componentes da medula óssea no interior do fêmur fosse visualmente perceptível. Após a coleta, as células mononucleares da medula óssea foram centrifugadas por 10 minutos à 1200rpm. O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspenso em 1mL de meio de cultura RPMI (Gibco, USA) 10%SFB para a contagem das células obtidas. Cada animal forneceu cerca de 7 x 10 7 células totais da medula óssea. Todos esses procedimentos foram realizados em capela de fluxo laminar em condições estéreis, utilizando material cirúrgico esterilizado e seringas e tubos descartáveis. Cerca de 7 x 10 7 células mononucleares da MO foram plaqueadas em meio de cultura -MEM (Gibco, USA) com baixa concentração de glicose contendo 15% de soro fetal bovino (SFB), em garrafas de cultura (75cm 2 ) para isolamento das CTMs pela propriedade de aderência ao plástico. 39

41 Material e Métodos Cultura das células-tronco mesenquimais Garrafas de cultura de 75cm 2 contendo as células mononucleares da MO dos camundongos FVB GFP+ foram mantidas em 20mL de meio de cultura -MEM contendo baixa concentração de glicose (Gibco, USA) acrescido de 15% SFB, em estufa contendo 5% de CO 2, à temperatura de 37 C em atmosfera umidificada. Após setenta e duas horas as células não aderentes foram retiradas através da troca de todo o meio de cultura, em seguida 20mL de meio de cultura -MEM 15%SFB foram adicionados à garrafa de cultura e a mesma foi mantida por mais setenta e duas horas nas condições especificadas anteriormente. Nesse momento foi realizada a primeira troca de metade do meio de cultura (10mL) e esse procedimento foi realizado a cada setenta e duas horas até que a cultura primária de CTMs atingisse cerca de 80% de confluência. Ao atingir em torno de 80% de confluência, a cultura primária passou pelo procedimento de tripsinização para que as células aderentes fossem desprendidas e o primeiro repique fosse feito. A tripsinização foi realizada toda vez que a confluência de 80% foi atingida, de modo que a cada passagem a população de CTMs foi tornando-se mais homogênea e pura. As culturas de CTMs foram mantidas até a terceira ou quarta passagens e em seguida usadas nos experimentos Tripsinização das células-tronco mesenquimais Ao atingirem cerca de 80% de confluência as culturas de CTMs foram tripsinizadas. A tripsinização foi feita após a retirada de todo o meio de cultura da garrafa e da lavagem cuidadosa das células aderidas com 10mL de PBS por três vezes. Após a retirada do PBS, 5mL de solução de tripsina/edta (0,05% Tripsina/0,53 mm EDTA, Gibco, USA) foram adicionadas à garrafa de cultura. Após cinco minutos a solução de tripsina foi inativada através da adição de 10mL de RPMI 10%SFB. A suspensão celular foi centrifugada por 10min à 1200rpm, o sobrenadante foi descartado e o pellet foi ressuspenso em PBS e centrifugado 40

42 Material e Métodos novamente por 10min à 1200rpm. Esse procedimento de lavagem das células em PBS foi repetido por mais uma vez. Imediatamente após a segunda lavagem das células em PBS as mesmas foram ressuspensas em meio de cultura α-mem 15%SFB e contadas. Após a contagem das células, alíquotas das mesmas foram destinadas ao requipe para expansão, e/ou à imunofenotipagem por citometria de fluxo, e/ou diferenciação in vitro e/ou procedimento experimental de terapia celular em modelo de queimadura experimental Imunofenotipagem de MSCs murinas Alíquotas de 100 l de contendo 1x10 6 células/ml foram incubadas por 20 minutos a TA no escuro com 5 l de anticorpos monoclonais ou isotipos controles diretamente conjugados ao fluorocromo ficoeritrina (PE). Foram feitas marcações simples para a análise dos diversos marcadores. Após a incubação, as células foram centrifugadas por cinco minutos a 1800rpm, lavadas duas vezes com PBS, ressuspensas em 200 L de PBS e analisadas imediatamente no citômetro de fluxo FACSort (Becton-Dickson). Foram adquiridos eventos/amostra com base nos parâmetros de tamanho (FSC) por granularidade (SSC). As análises foram realizadas utilizando-se o software Cellquest (BD). Para a caracterização imunofenotípica das MSCs murinas foram utilizados os anticorpos monoclonais contra os marcadores CD45, CD34, CD105, CD31 e CD73 (ebioscience, EUA) Ensaio de diferenciação in vitro das células CTMs murinas Para avaliar a multipotencialidade das CTMs murinas, uma alíquota das células expandidas foi reservada no momento do processamento para utilização na terapia célular (3ª passagem). As CTMs foram plaqueadas em placas de 24 poços contendo lamínulas previamente esterilizadas na concentração de 1,0 x

43 Material e Métodos células/poço. A avaliação do potencial de diferenciação das CTMs em adipócitos e osteócitos in vitro foi realizada. Nos poços destinados a diferenciação em adipócitos foi adicionado o meio indutor de adipogênese (meio α-mem suplementado com 15% de soro fetal bovido, 1 µm de dexametasona, 10 µg/ml de insulina e 100 µm de indometacina) e nos poços para osteócitos o meio indutor de osteogênese (meio α-mem suplementado com 7,5% de soro fetal bovino, 0,1 µm de dexametasona, 200µM de ácido ascórbico e 10 mm de β-glicerolfosfato). O acompanhamento das mudanças morfológicas ao longo do cultivo foi feito por meio de um microscópio invertido com contraste de fase (Zeiss, modelo Axioskop. 2.0., Alemanha). Após quinze dias do início do processo de indução de diferenciação das CTMs, as lamínulas foram retiradas, lavadas três vezes em PBS. As células diferenciadas em adipócitos e os seus controles foram fixados em paraformaldeído (Electron Microscopy Science, EUA) a 4% por 15 minutos a TA, em seguida lavadas em água destilada e incubadas em álcool 70% por 2 a 3 minutos. Posteriormente, as células foram coradas com a solução de sudan II-escarlate por 2 a 5 minutos, lavadas em álcool 70% em água corrente e contra-coradas com hematoxilina de Harris por 2 minutos. O material foi montado em glicerina. As células diferenciadas em osteócitos e os seus controles foram fixados em paraformaldeído a 4% por 15 minutos a TA, lavadas em água destilada e coradas com solução de nitrato de prata a 5% no escuro por 30 minutos. Em seguida, foram lavadas em água destilada, expostas a lâmpada de 100W por 60 minutos (coloração Von Kossa) e então lavadas rapidamente com tiossulfato de sódio a 5%. Posteriormente, as células foram contra-coradas com hematoxilina de Harris, submetidas ao processo de diafinização e montadas em Permout SP Procedimento experimental Ratos Wistar pesando em torno de 250g foram fornecidos pelo Biotério Central da Universidade de São Paulo Campus Ribeirão Preto e aclimatados no Biotério de Experimentação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da mesma Universidade antes da realização do experimento. Os animais foram mantidos em 42

44 Material e Métodos temperatura e ciclos claro/escuro controlados e com água e alimentação ad libtum, durante todo o período do experimento. Os animais foram divididos aleatoriamente em grupos e subgrupos mostrados na Tabela 03. Todos os animais utilizados no experimento foram anestesiados, por via intraperitoneal, com 400μL de solução na concentração de 1:1 de quetamina 10% (Agener União, Brasil) e xilazina 20mg/mL (Dopaser-Calier, Espanha). Após anestesia, os animais foram tricotomizados. A tricotomia foi realizada em duas etapas, em um primeiro momento os pêlos dos animais foram removidos com o auxílio de máquina elétrica (PHILIPS, Brasil), em um segundo momento, o mesmo animal teve a região dorsal recoberta por creme depilatório (Depilart, Brasil) por 5 minutos, esse creme foi removido com auxílio de gaze úmida. A pele recém tricotomizada foi seca com auxílio de papel toalha e em seguida foi realizada a queimadura experimentalutilizando um aparelho com controle digital de temperatura confeccionado pela Oficina de Precisão da Universidade de São Paulo. O aparelho consiste basicamente em um resistor que aquece uma placa de metal de tamanho aproximado de 2cm x 3cm. Com a chapa de metal a uma temperatura de 200 C foram realizadas quatro queimaduras de duração de 25 segundos cada uma. As queimaduras foram realizadas na região dorsal do animal formando um retângulo de tamanho correspondente a quatro vezes o tamanho da chapa de metal como evidenciado na Figura 04 A e B. Figura 03: Esquema de quadrantes utilizado para realização da queimadura. A. Aparência final da queimadura. B. Estabelecimento dos quadrantes e dos pontos da aplicação intradérmica de PBS ou CTMs. 43

45 Material e Métodos Aproximadamente 30 minutos após a realização da queimadura experimental os animais ainda encontravam-se anestesiados quando foram submetidos à aplicação intradérmica (ID) de PBS ou de CTMs, em volume total de 2000μL aplicado em 10 doses de 200μL em pontos pré-estabelecidos (Figura 04 B). Tabela 03: Distribuição dos animais utilizados nos experimentos. Grupo n Procedimento Subgrupos n Aplicação ID de PBS PBS-ID 7 GR60d 14 Aplicação ID de CTMs CTM-ID 7 Aplicação ID de PBS PBS-ID 5 GR45d 10 Aplicação ID de CTMs CTM-ID 5 Aplicação ID de PBS PBS-ID 5 GR30d 10 Aplicação ID de CTMs CTM-ID 5 Aplicação ID de PBS PBS-ID 5 GR15d 10 Aplicação ID de CTMs CTM-ID 5 Aplicação ID de PBS PBS-ID 5 GR7d 10 Aplicação ID de CTMs CTM-ID 5 Os animais foram mantidos em gaiolas individuais com água e alimentação ad libtum e sem a utilização de antibióticos durante o período de realização do experimento. 44

46 Material e Métodos 3.6. Monitoramento fotográfico das lesões obtidas a partir da injúria térmica A avaliação clínico-fotográfica das lesões foi realizada pela porcentagem de cicatrização das ulcerações, observado a partir da captura e análise de imagens pelo programa Image J. O Image J Image Processing and Analysis in Java (Bethesda, Maryland, EUA) é um programa de análise de imagem de domínio público desenvolvido por Wayne Rasband do National Institutes of Health (NIH), é um sucessor do NIH Image possuindo a vantagem de ter aplicação multidisciplinar, na pesquisa e na prática clínica. A captura de imagens foi realizada imediatamente após a queimadura experimental (0d) e nos períodos de 7, 15, 30, 45 e 60 dias após o início do experimento. No momento da captura das imagens os animais foram anestesiados por via intraperitoneal com 200μL de solução na concentração de 1:1 de quetamina 10% (Agener União, Brasil) e xilazina 20mg/mL (Dopaser-Calier, Espanha). Utilizando o programa Image J, a mensuração dimensional de imagens constitui um método de análise não-invasivo importante para o acompanhamento do dinamismo da cicatrização de úlceras cutâneas. Foi acompanhado fotograficamente um grupo composto por 14 ratos Wistar (n=14), sendo que sete animais foram submetidos à aplicação intradérmica de PBS (PBS-ID) e sete ratos foram submetidos ao tratamento intradérmico (ID) com CTMs (CTM-ID). No momento da captura da imagem uma régua foi colocada ao lado de cada animal fotografado o que permitiu a calibração do programa e posterior análise computacional. As imagens foram capturadas por uma câmera fotográfica digital Fuji Film Finepix S2000HD com resolução de 10.0 megapixels, nos períodos acima citados e analisadas pelo software Image J (versão 1.40g para Windows TM ), disponível gratuitamente na internet Cálculo da porcentagem de cicatrização A porcentagem de cicatrização foi avaliada através dos dados fornecidos pelo programa Image J. A medida da área da lesão em pixels fornecida, pelo programa 45

47 Material e Métodos Image J, foi aplicada à uma fórmula para cálculo da porcentagem de cicatrização. A fórmula em questão considera a área inicial da lesão bem como a área final e está demonstrada abaixo: Porcentagem de cicatrização = Área final da úlcera (pixels) x 100 Área inicial da úlcera (pixels) 3.7. Coleta, processamento e análise de materiais biológicos Obtenção de plasma dos animais Nos períodos que equivalentes aos 7º, 15º, 30º e 45º dias após o procedimento experimental, cerca de 10 animais submetidos ao tratamento com CTMs ID ou não, foram sacrificados por decaptação. O sangue desses animais foi colhido em tubos contendo solução anticoagulante. O sangue foi centrifugado por 15min a 1800rpm e o plasma contido no sobrenadante foi coletado e armazenado à - 80 C para possíveis análises posteriores Coleta do baço Após o sacrifício dos animais os baços dos mesmos foram removidos cirurgicamente, pesados e mantidos em placas de Petri estéreis contendo 2-3mL de meio de cultura RPMI incompleto (sem adição de soro fetal bovino) a 4 C. Um pequeno fragmento foi separado e pesado para ser submetido à análise das subpopulações de linfócitos por citometria de fluxo, o restante do órgão foi imediatamente congelado à -80 C para possíveis análises futuras. 46

48 Material e Métodos Obtenção de esplenócitos dos animais O fragmento extraído do baço total foi divulsionado até obtenção de uma suspensão celular turva. Essa suspensão foi centrifugada a 400g durante 10 min, a 4 o C, o sobrenadante foi descartado e o pellet foi ressuspenso em 4 ml de tampão de lise de hemáceas (Tris 0,17M e NH 4 Cl 0,16M) por 4 minutos. Para inativação do tampão de lise foram acrescentados 5 ml de RPMI completo (10% SFB). As células foram centrifugadas a 400g durante 10 min a 4 o C e posteriormente a concentração celular foi ajustada para o experimento de imunofetipagem das células por citometria de fluxo Imunofenotipagem das subpopulações linfocitárias Alíquotas de 100 l de solução de esplenócitos, contendo 2 x 10 6 células/ml, foram incubadas por 20 minutos a TA, no escuro, com 2 l de anticorpos monoclonais diretamente conjugados ao fluorocromo isotiocianato de fluoresceína (FITC) ou ficoeritrina (PE) ( ebioscience, EUA). Foram feitas marcações duplas para a análise das subpopulações linfocitárias. Todas as incubações foram realizadas no escuro para evitar perda de fluorescência. As células foram centrifugadas por 5 minutos a 500g, lavadas duas vezes com PBS, ressuspensas em 200 l de PBS e analisadas imediatamente no citômetro de fluxo FACSort (BD). As seguintes subpopulações linfocitárias foram analisadas: CD3 + (linfócitos T totais), CD3 + CD4 + (linfócitos T helper ou auxiliares) e CD8 + (linfócitos T citotóxicos e NK). Durante a aquisição das células, foi desenhada uma gate na população de linfócitos (R1), estabelecida com base nos parâmetro de tamanho (FSC) por parâmetros de granularidade (SSC). Foram adquiridos eventos/amostra. As análises foram realizadas utilizando-se o software Cellquest (BD). Os eventos da gate de linfócitos (R1) foram analisados para marcação com os diferentes anticorpos por dot plots de fluorescência 1 (FL1, FITC), por fluorescência 2 (FL2, PE). 47

49 Material e Métodos Coleta de pele Após o sacrifício, nos períodos que equivalentes ao 7º, 15º, 30º e 45º dia após o procedimento experimental, foram extraídas cirurgicamente amostras de pele de aproximadamente 1cm 2, contendo a região da borda da lesão cutânea compreendida por um pequeno fragmento de pele saudável e pela área da lesão propriamente dita. As amostras foram armazenadas em formaldeído 10% ou congeladas em Tissue Tek para realização de análises histológicas (HE) e por imunohistoquímica (IH), respectivamente. Outras amostras de pele foram pesadas e acondicionadas em tubos contendo 200 μl de tampão contendo NaCl 0,1M, NaPO4 0,02M, NaEDTA 0,015 M gelado. Os fragmentos de pele foram homogeneizados em POLITRON PT 3100 a 13000rpm. O homogeinato foi congelado à -80 C para a realização do ensaio de produção de mieloperoxidase (MPO), o qual quantifica a atividade de neutrófilos no local da lesão. Um terceiro grupo de amostras de pele, coletadas nos respectivos períodos, foi destinado à quantificação da porcentagem de células T CD4 + e T CD8 + por citometria de fluxo. Essas amostras foram pesadas, dilaceradas em placa de Petri e mantidas em 1mL de meio de cultura RPMI incompleto onde foram tratadas com 10% Liberase Blendzyme 2 (Roche) por 1 hora. Após esse período foi realizada a inativação da liberase através da adição do mesmo volume de meio RPMI contendo 10% SFB. Essa solução foi passada por uma peneira de nylon para a retirada dos fragmentos de pele e centrifugada por 10min a 400g. O pellet contendo células foi ressuspenso em PBS para ser feita a análise das subpopulações de linfócitos da região da lesão por citometria de fluxo Realização da atividade de dosagem de mieloperoxidase (MPO) Para a realização da dosagem de mieloperoxidase (MPO), enzima produzida através da atividade de neutrófilos (explicar, fragmentos de pele foram colhidos e acondicionadas em tubos eppendorfs com 200 μl de tampão 1 (NaCl 0,1M, NaPO4 48

50 Material e Métodos 0,02M, NaEDTA 0,015 M; ph 4,7) gelado, a -70ºC até a dosagem. Os fragmentos foram homogeneizados em POLITRON PT 3100 a 13000rpm. Em seguida, o homogeinato foi centrifugado em 3000rpm por 15 minutos a 4 C. Foi realizado então um choque hipotônico no pellet de células com 600 μl de NaCl 0,2%, seguido de 600μL de uma solução de NaCl 1,6% e glicose 5%. Depois de uma nova centrifugação a 3000rpm por 15 minutos a 4 C, o pellet celular foi ressuspenso em tampão 2 (NaPO4 contendo 0,5% de brometo de hexadeciltrimetilamônio; ph 5,4) e novamente homogeneizado. A seguir, o homogeinato foi submetido a um procedimento de choque térmico que consiste no congelamento em nitrogênio líquido e descongelamento, por três vezes, para lise dos neutrófilos e liberação do conteúdo (MPO) de seus grânulos. Em seguida, o homogeinato foi centrifugado à 20000rpm por 15 minutos a 4 C. Após centrifugação, 5μL do sobrenadante das amostras foram colocadas em placa de 96 poços para o ensaio. Em cada poço foram adicionados 25μL de TMB ( 3, 3, 3, 3 - tetramethylbenzidine 1,6 mm final na placa) e a placa foi incubada por 5 minutos a 37º C. Logo após, 100μL de H 2 O 2 (concentração final de 0,5 M l) foram adicionados aos poços e a placa foi incubada por mais 5 minutos a 37º C. A seguir, a reação foi interrompida com ácido sulfúrico 4 M. A quantificação dos neutrófilos foi feita a partir de uma curva padrão de neutrófilos obtidos da cavidade peritoneal, 6 horas após os camundongos serem injetados com carragenina. Os neutrófilos foram diluídos seriadamente em tampão NaPO4 0,08M (1 x 10 5 neutrófilos/poço em 50μL de tampão). Foi determinada a absorbância em leitor de ELISA (SPECTRA MAX 250; Molecular Devices) em comprimento de onda de 450nm. Os resultados foram expressos em número de neutrófilos x 10 6 /mg de tecido Análises histológicas Amostras de pele da região da queimadura foram colhidas dos animais de todos os grupos. As amostras foram retiradas da interface queimadura e pele saudável e mantida em formaldeído 10% por no mínimo quarenta e oito horas antes de serem processadas para a histologia. 49

51 Material e Métodos Após serem retirados do formaldeído, os tecidos foram incluídos em parafina líquida e cortados em micrótomo com espessura 5μm. Em seguida foram montadas lâminas contendo os cortes histológicos de pele que foram corados por hematoxilina e eosina (HE). As lâminas foram observadas sob microscópio ótico para a análise morfológica das estruturas da pele. As análises histológicas foram realizadas no laboratório de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, sob a responsabilidade da médica patologista Prof. Dra. Leandra Naira Zambeli Ramalho. Foram determinadas duas regiões a serem analisadas nos cortes histológicos da pele: a região da borda e a região da úlcera propriamente dita. Foram observadas em ambas as regiões as características do epitélio, presença de inflamação, presença de colágeno, presença de tecido de granulação e de vasos sanguíneos. Para a análise dessas características foi estabelecido um esquema de pontuação variando de 0 a 3, onde: 0, corresponde a achado histopatológico ausente; 1, achado histopatológico pontual; 2, achado histopatológico moderado; e 3: achado histopatológico considerável Teste microbiológico Após o procedimento de queimadura, fez-se a coleta de material microbiológico passando uma haste de algodão estéril sobre uma área de aproximadamente 1cm 2 da ferida. Este procedimento foi repetido duas vezes mais, tomando-se o cuidado de girar a haste de algodão em sentido horário para que toda sua superfície entrasse em contato com a ferida. Como recomendado pela ANVISA, a coleta foi feita em regiões significativas (LEVY, 2004), onde era mais provável o aparecimento de infecções. Terminada a coleta, as hastes de algodão foram introduzidos em tubos contendo 1mL de soro fisiológico estéril em capela de fluxo laminar (LEVY, 2004). Em seguida, as amostras foram encaminhadas imediatamente para o laboratório de análises clínicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (LAC-FCFRP), sob responsabilidade da microbiologista Maria Emília Nadaletto Bonifácio da Silva, para análise microbiológica. 50

52 Material e Métodos No LAC-FCFRP, o material foi semeado em ágar CLED (Cystine Lactose Electrolyte Deficient Agar) e o crescimento dos microorganismos foi avaliado após 48 horas de incubação Análise de dados Para determinação da curva de sobrevida dos animais submetidos às queimaduras foi utilizada uma análise exploratória dos dados, composta de estatísticas descritivas, seguida de estimativas, gráficos de Kaplan-Meier e para os resultados foi utilizado o teste não paramétrico com modificação Peto & Peto (Gehan- Wilcoxon) para se ter uma idéia do comportamento das variáveis em estudo. As outras análises estatísticas realizadas no trabalho basearam-se na comparação de uma variável entre dois grupos experimentais, dessa forma foi utilizado somente o Teste t não paramétrico para determinar as diferenças existentes entre os grupos experimentais. As diferenças foram consideradas estatisticamente significantes quando p valor foi menor que 5% (p <0,05). Esses testes foram realizados com auxílio do programa estatístico PRISMA

53 Resultados 4. RESULTADOS 4.1. Obtenção das células-tronco mesenquimais a partir da medula óssea de camundongos FVB GFP+ As células-tronco mesenquimais (CTMs) isoladas a partir da medula óssea (MO) de camundongos machos FVB GFP+ foram mantidas em cultura em meio α- MEM até atingirem a 3ª-4ª passagem. Nessas passagens as CTMs foram imunofenotipadas, submetidas à análise de multipotencialidade e utilizadas na terapia celular das feridas de pele por queimadura. A Figura 04 mostra uma caracterização imunofenotípica representativa, por citometria de fluxo, da população de CTMs cultivadas e utilizadas nos experimentos. Figura 04: Histogramas representativos da população de CTMs de camundongos FVB GFP +. Histogramas obtidos por citometria de fluxo, representativos da população de CTMs de camundongos FVB GFP+ em quarta passagem. 52

54 Resultados 4.2. Análise da multipotencialidade das células-tronco mesenquimais Para testar a multipotencialidade das CTMs utilizadas no experimento, as mesmas foram induzidas à diferenciação in vitro em adipócitos e osteócitos por 15 dias, conforme descrito em Material e Métodos. A Figura 05 mostra uma fotomicrografia representativa de CTMs diferenciadas em adipócitos e osteócitos. Figura 05: Avaliação da multipotencialidade das CTMs isoladas de medula óssea de camundongos FVB GFP+ A. Fotomicrografia em contraste de fase de CTMs na segunda passagem (40X). B. CTMs submetidas à diferenciação adipogênica; A adipogênese demonstrada pela formação de vacúolos lipídicos corados com Sudan II-escarlate (aumento 40X). C. CTMs submetidas à diferenciação osteocítica; osteogênese demonstrada pela deposição de matrix mineralizada revelada pela coloração de von Kossa (aumento 40X) Procedimento de injúria térmica experimental Ratos Wistar submetidos à queimadura experimental foram previamente aclimatados no biotério de experimentação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto. Após o período de aclimatação esses animais foram pesados, depilados e submetidos à queimadura experimental com auxílio de chapa de metal com controle de temperatura a 200 C. A realização das queimaduras foi padronizada utilizando-se a placa de metal aquecida à 200 C em contato com o dorso do animal depilado por um período de 25 segundos. A pressão aplicada pela placa ao dorso dos animais foi mínima 53

55 Resultados correspondendo apenas ao peso da própria placa. A queimadura realizada nos animais ocupou uma extensa superfície do dorso dos mesmos, com área de aproximadamente 24cm 2, sendo que essa área corresponde a aplicação da chapa de metal por quatro vezes, em quatro quadrantes não sobrepostos. Posteriormente à injúria térmica, os animais foram subdivididos em cinco grupos experimentais de acordo com o período em que foram sacrificados: 7, 15, 30, 45 ou 60 dias pós-injúria. Além disso, os animais foram subdivididos em dois subgrupos, de acordo com o tratamento a que foram submetidos: o subgrupo controle (PBS-ID) que recebeu aplicação intradérmica (ID) de PBS e o subgrupo tratado (CTM-ID) que recebeu aplicação intradérmica de 5 x 10 6 CTMs. Os animais foram mantidos em gaiolas individuais Curva de sobrevida dos animas Para a avaliação da sobrevida dos animais após o procedimento experimental de injúria térmica, foram analisados um total de cinqüenta e seis animais (n=56), sendo que trinta animais pertenciam ao subgrupo PBS-ID (n=30) e vinte e seis animais pertenciam ao subgrupo CTM-ID (n=26). A sobrevida dos animais foi observada diariamente em ambos os subgrupos e a Figura 06 representa as curvas de sobrevida dos animais pertencentes ao grupo PBS-ID e ao grupo CTMs-ID nos primeiros nove dias após início do experimento. 54

56 Resultados Figura 06: Análise da sobrevida dos animais submetidos ao procedimento de injúria térmica experimental. Curvas de sobrevida de ratos Wistar submetidos à queimadura experimental e tratados com PBS (grupo controle PBS-ID; N=30; linha cinza) ou com CTMs (grupo tratado ou CTM-ID; N=26; linha preta). No dia 0, referente ao dia em que foi realizado o experimento nenhum animal morreu. O subgrupo CTM-ID não apresentou óbitos até o dia 3 após início do experimento, já o subgrupo PBS-ID apresentou o seu primeiro óbito vinte e quatro horas após o início do experimento. O período mais crítico durante a realização do experimento para os animais do subgrupo PBS-ID ocorreu entre os dias 2 e 3 pós-injúria, nos quais morreram 19,57% dos animais. No dia subseqüente morreram mais 13,04% dos animais submetidos ao experimento, totalizando 32,61% de óbitos no grupo controle até o quarto dia pós-injúria. Já para o subgrupo CTM-ID o período mais crítico observado ocorreu entre os dias 3 e 4, nos quais 11,91% dos animais tratados foram a óbito. Entretanto, entre os dias 4 e 5 houve uma taxa de mortalidade baixa nesse grupo (4,76%), ao contrário do observado no subgrupo PBS-ID que apresentou uma alta taxa de mortalidade nesse período A partir dos períodos críticos poucos animais morreram, sendo que a partir do dia 7 da curva de sobrevida não foram observados mais óbitos significativos em ambos os subgrupos. Dessa forma, ao final de sete dias o subgrupo PBS-ID apresentou uma taxa de sobrevida de 60,86%, enquanto o subgrupo CTM-ID apresentou uma taxa de sobrevida de 76,19%. Essa diferença da taxa de sobrevivência dos animais não foi estatisticamente significativa (p=0,07). 55

57 Resultados 4.5. Acompanhamento da massa corporal dos animais Os animais pertencentes aos subgrupos PBS-ID e CTM-ID foram avaliados no período referente ao início do experimento (0d) e nos períodos subseqüentes: sete dias (7d), quinze dias (15d), trinta dias (30d), quarenta e cinco dias (45d) ou sessenta dias (60d) após início do experimento de injúria térmica. Nesses períodos, foram observadas características como a variação da massa corporal, presença de alterações comportamentais e presença de infecção nas feridas. A Figura 07 demonstra a variação da massa corporal dos animais PBS-ID e dos animais CTM-ID durante o período de acompanhamento. Os animais pertencentes aos subgrupos PBS-ID e CTM-ID que foram acompanhados por um período igual ou maior que sessenta dias fizeram parte do grupo denominado GR60d. Dias Figura 07: Análise da massa corporal dos animais submetidos ao procedimento de injúria térmica experimental por um período de sessenta dias. Massa corporal de ratos Wistar (em gramas) submetidos à queimadura experimental. Subgrupo controle ou PBS-ID (n=7; linha preta) e subgrupo tratado ou CTM-ID (n=7; linha cinza). 56

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