Anais do IV Simpósio do Programa de Pós- Graduação em Biologia Molecular da Universidade de Brasília

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1 Anais do IV Simpósio do Programa de Pós- Graduação em Biologia Molecular da Universidade de Brasília

2 Índice APRESENTAÇÃO... 2 PALAVRA DA COMISSÃO ORGANIZADORA DO SIMPÓSIO... 3 INFORMAÇÕES IMPORTANTES... 4 COMISSÃO ORGANIZADORA... 5 CRONOGRAMA... 6 PALESTRAS APRESENTAÇÕES ORAIS APRESENTAÇÕES ORAIS RESUMOS ALUNOS DO PROGRAMA PPG-BIOMOL REALIZANDO DOUTORADO SANDUÍCHE NO EXTERIOR PROGRAMAÇÃO: APRESENTAÇÕES DE PAINÉIS DIA: 19/11/ DIA: 20/11/ APOIO

3 SEJAM BEM VINDOS AO IV SIMPÓSIO DO PROGRAMA DE PÓS- GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA MOLECULAR DA UNB! O programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular (PPG BioMol) teve inicio em 1973, com a criação do curso de mestrado em Biologia Molecular, composto por orientadores do Departamento de Biologia Celular da Universidade de Brasília, um grupo recém chegado à então jovem Universidade, que trazia uma abordagem científica voltada às bases Moleculares e Celulares dos processos biológicos. Com o crescimento do corpo docente e a criação do curso de Doutorado em 1992, novas áreas foram adicionadas, destacando-se Genética Molecular de Plantas e Controle Biológico. As principais áreas de pesquisa do programa de Pós-Graduação hoje incluem: Biologia Molecular, Bioquímica, Microbiologia Molecular, Estrutura de Proteínas, Modelagem e Simulação de Biomoléculas, Biologia Estrutural, Virologia Molecular, Genômica, Proteômica e Bioinformática. Desde a sua implantação, o Curso de Mestrado/Doutorado em Biologia Molecular já formou mais de 560 alunos (202 de doutorado e 358 de mestrado), com aproximadamente 70 alunos de doutorado e 30 de mestrado desenvolvendo as suas teses e dissertaçoes em Realizado anualmente no Instituto de Biologia da Universidade de Brasília, o Simpósio PPG-BioMol é um evento organizado por alunos do Programa de Pós- Graduação em Biologia Molecular em conjunto com docentes. Acreditamos que seja uma ótima oportunidade para aproximar e apreciar as diversas pesquisas acadêmicas desenvolvidas na Universidade de Brasília e região. Prof. Robert Neil Gerard Miller, Ph.D. Coordenador do PPG-BioMol-UnB 2

4 PALAVRA DA COMISSÃO ORGANIZADORA DO SIMPÓSIO O nosso simpósio teve início em 2011 e chegou à sua quarta edição no ano O evento está sendo realizado anualmente graças ao empenho dos alunos envolvidos na organização. A novidade deste ano foi a publicação dos trabalhos em Anais disponível na página da PPG-BioMol. Para este evento, preocupamos-nos em buscar assuntos e temas atuais, diretamente relacionados às atividades de pesquisa que os alunos vêm desenvolvendo para a sua formação. A lista de convidados foi grande e o cronograma foi organizado da melhor maneira possível a fim de atender a disponibilidade dos palestrantes. Agradecemos a todos que contribuíram para a realização do IV Simpósio do Programa de Pós-graduação em Biologia Molecular da UnB. Agradecimento em especial à comissão avaliadora pelo esforço em selecionar os melhores trabalhos, não é uma tarefa fácil; aos professores do programa pela orientação, apoio e incentivo, à secretária Ana Tiberti pelas orientações e sugestões, ao coordenador do curso, prof. Robert N. G. Miller, pelo apoio inesgotável, à BD Biosciences pelo patrocínio do material, à CAPES pelo apoio financeiro e ao Instituto de Biologia, pelo espaço utilizado. Mais do que uma obrigação, a oportunidade de organizar um evento como este faz parte da nossa formação como pesquisadores e foi muito gratificante. Venha fazer parte da próxima comissão organizadora!!! Sugestões para melhorarmos o nosso simpósio são bem vindas, por meio do endereço eletrônico Da esquerda para a direita: Valquíria Lacerda, Débora Torres, Robert Miller, Fabrício Morgado, Thiago Oliveira, Polynne Almeida, Henrique Veras, Samuel Mandacaru. 3

5 Informações Importantes Alunos selecionados para apresentação oral também devem apresentar seus painéis, pois os seus tutores irão ao seu encontro. Haverá premiação para os três melhores painéis. A avaliação será feita por uma comissão avaliadora que estará presente nas seções de painéis. O encontro com os tutores será no mesmo dia da avaliação dos painéis. Fique atento ao dia da sua apresentação! A entrega das premiações ocorrerá no dia 21/11 durante a seção de premiações e encerramento. Os certificados serão enviados posteriormente via endereço eletrônico. 4

6 Comissão Organizadora Ana Hilda Tiberti Débora Torres A. Figueiredo Fabricio da Silva Morgado Henrique César T. Veras Pollyne Borborema A. Almeida Samuel Coelho Mandacaru Thiago Rodrigues de Oliveira Valquíria Alice Michalczechen Lacerda Ildinete Silva Pereira Marcelo de Macedo Brígido Robert Neil Gerard Miller Comissão Avaliadora* Claudio Afonso Pinho Lopes Diana Mendoza Gomez Galina Gulis Gláucia Emy Okida Midorikawa Juliana Davis Oliveira Kelly Barreto Rodrigues Leonora Rios de Souza Moreira Leandro Ambrósio Cantos Marciano Regis Rubini Marcus de Melo Teixeira Rafael Trindade Burtet Rosana Blawid Simone Nardin Túlio César Viviane Reis * Todos são integrantes de pós-doutorado do PPG-BioMol 5

7 Cronograma 6

8 19/11 Quarta-feira Local 08:00 09:00h Credenciamento Balcão de entrada 9:00-9:30 Abertura 09:30 10:30h Fenótipos complexos: explicar ou predizer? Evoluindo da inferência de genes individuais para a predição genômica total em Eucalyptus Dário Grattapaglia (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia) Stress tolerance in peanuts: a genomic approach using wild 10:30 11:15h Arachis Ana Cristina Miranda Brasileiro (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia) Estratégia genômica para o entendimento da produção de 11:15 12:00h celulases pelo fungo Trichoderma reesei Roberto do Nascimento Silva (USP) 12:00 12:30h Discussão Auditório 1 12:30 14:00h ALMOÇO Da descoberta de novos vírus à caracterização funcional de 14:00 14:40h genes virais Fernando Lucas de Melo (IB-UnB) 14:40 15:20h Metagenômica funcional da microbiota em solos tropicais Tsai Siu Mui (USP) O Microbioma Intestinal Humano: estrutura, funções e 15:20 16:00h modificações Christian Hoffman (USP/UnB) 16:00 16:30h Mesa Redonda Análise genômica e microbiologia ambiental 16:30 18:00h Coffee Break + Sessão de Painéis Auditório 1 Térreo do prédio azul 7

9 20/11 Quinta-feira Local Mini curso 1: Preparação de amostras para NGS Daniel Paiva Agustino (Visiting PhD student at Karl Kuchler Group- Áustria) Auditório 1 08:30 10:30 11:00 12:00 h Mini curso 2: Espectrometria de massa Top-down no estudo de complexos proteicos nativos Luis Henrique Ferreira do Vale (UnB) Mini curso 3: Biologia Sintética e Nanotecnologia Cintia Marques Coelho e Luciano Paulino da Silva (EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia) Sequence and pattern based characterization of insect viromes via small RNA metagenomics João Trindade Marques (UFMG) Auditório 4 Auditório 3 Auditório 1 12:00 14:00h ALMOÇO 14:00 15:00h 15:00 16:30h Ferramentas de bioinformática aplicados a analise de dados omics Gabriel da Rocha Fernandes (UCB) Apresentação oral (Alunos selecionados) Mayara Simonelly Santos - Entrega de Azul de Metileno mediada por Nanofolha de Óxido de Grafeno para Terapias Fotodinâmica e Fototérmica Combinadas no Tratamento de Carcinoma Mamário Humano In Vitro e In Vivo Muhammad Faheem - Initial characterization and crystallization of a novel bacterial protease selected in a metagenomic approach Caio Silva Souza - The Electric Fingerprint of Voltage Sensor Domains Valquíria Alice Michalczechen Lacerda - Escherichia coli engenheirada metabolicamente aumentam a produção de proteínas recombinantes de teia de aranha e origina fibra sintética Auditório 1 16:30 18:00h Coffee Break + Sessão de Painéis Térreo do prédio azul 8

10 21/11 Sexta-feira Local 08:30 9:10 Role of conformational equilibrium in molecular recognition: regulation of catalysis, defensins and virus assembly Fábio Ceneviva Lacerda Almeida (UFRJ) Auditório 1 09:10 9:50 Intracellular trafficking mediated by actin-based molecular motors: The myosin V family Mário Tyago Murakami (LNBio) Auditório 1 09:50 10:30 A espectrometria de massas como ferramenta de biologia estrutural Fábio Cesar Gozzo (Unicamp) Mesa redonda: Atualidades/tendências e integração de dados de diferentes técnicas no estudo da biologia estrutural. Fábio Ceneviva Lacerda Almeida (UFRJ), Mário Tyago Murakami 10:30 11:30 (CNPEM), Fábio Cesar Gozzo (Unicamp), Marcelo Valle de Sousa (UnB), João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa (IB-UnB), Aline Lima de Oliveira (IQ- UnB). Auditório 1 Auditório 1 12:00 14:00 ALMOÇO 14:00 15:30 15:00 16:30 16:30 17:00 Apresentação oral (Alunos selecionados) Elias Ferreira Sabiá Júnior - Detecção e Caracterização de Proteínas Parasporina em Isolados de Bacillus thuringiensis Citotóxicas a Células de Câncer Humano. Raquel das Neves Almeida - The role of type VI secretion system of gram-negative bacteria in lipid antigen presentation through CD1 molecule. Clara Wandenkolck Silva Aragão - Genome sequence and analysis of a medical interest baculovirus isolated from Lonomia obliqua (Lepidoptera:Saturniidae) reveals a new transcription terminator factor possibly acquired from the host. Rayssa Almeida Garcia - Validação da estabilidade de estruturas de RNA fita dupla para uso no silenciamento gênico de insetos praga: avaliação na planta e no inseto alvo. RECOBIO: Rede Centro-Oeste de formação e pesquisa em BIOlogia computacional Werner Treptow (UnB) Homenagem prêmio CAPES Mecanismo de ativação de canais iônicos dependentes de voltagem, Kv e Nav, e a interação com anestésicos gerais Cristiano Guimarães Pinheiro (UnB) Auditório 1 Auditório 1 17:00 17:30 Premiação Apresentação oral e painéis. Auditório 1 18:00 Fechamento e Premiação Auditório 1 9

11 Palestras 10

12 P01- Fenótipos complexos: explicar ou predizer? Evoluindo da inferência de genes individuais para a predição genômica total em Eucalyptus Dario Grattapaglia EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia, PqEB Final W5 Norte , e Programa de Ciências Genômicas e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília, SGAN 916, , Brasília, DF. A perspectiva de explicar a arquitetura genética de fenótipos complexos e com isso acelerar a seleção direcional no melhoramento de plantas tem sido uma justificativa comum de projetos genômicos e de biologia molecular. Pensou-se que seria possível descobrir, "visualizar" e entender a função de alelos e genótipos aos locos controladores de características quantitativas (QTLs) ou até mesmo, para os mais otimistas (ou incautos) diretamente dos "genes" (conceito cada vez mais elusivo nestes últimos anos post-encode). Isto envolvia a suposição implícita de que seria possível explicar a função e os efeitos de todos ou pelo menos a maioria dos genes envolvidos no controle da variação quantitativa durante o desenvolvimento da planta, em cada população e ambiente. No entanto, apesar dos avanços realizados com o mapeamento de QTLs, genética de associação (GA) e genética reversa a inferência destes efeitos tem se revelado muito mais incerta do que se pensou inicialmente. A incapacidade de se chegar a uma explicação causal precisa dos efeitos e interações de genes individuais, tem causado uma mudança de paradigma nas perspectivas de incorporar a genômica na prática do melhoramento de fenótipos complexos. Estamos migrando da tentativa de descobrir genes ou regiões genômicas individuais e voltando a lidar com o agregado do genoma, assim como a genética quantitativa classicamente faz, porém utilizando a genotipagem ou sequenciamento denso de todo o genoma. Isto permite evoluir do modelo infinitesimal para a estimação da contribuição de cada um dos segmentos cromossômicos para a variação observada. Isto por sua vez torna possível predizer fenótipos futuros de um indivíduo com base em modelos construídos com dados genômicos e fenotípicos passados, em uma abordagem denominada Seleção Genômica (SG). Esta tecnologia já é realidade no melhoramento de animais domésticos e vem sendo rapidamente incorporada no melhoramento de plantas. Com base em uma série de experimentos realizados e o desenvolvimento de uma plataforma de alto desempenho de genotipagem de SNPs estamos iniciando a implementação operacional da SG no melhoramento intensivo de eucalipto no Brasil. 11

13 P02- Stress tolerance in peanuts: a genomic approach using wild Arachis Brasileiro, ACM 1 ; Ana CG Araujo 1 ; Guimarães, LA 1 ; Williams, CCV 1 ; Vidigal, BS 1 ; Silva, M 1 ; Martins, ACQ 1 ; Silva, AK 1 ; Nicolini, T 1 ; Bonfim, O 1 ; Togawa, RC 1 ; Saraiva, MAP 1 ; Fonseca, LN 1 ; Bertioli, D 2 ; Leal-Bertioli, SCM 1 ; Guimarães, PM 1 1 Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Parque Estação Biológica, CP 02372, CEP , Brasília, DF, Brazil 2 Universidade de Brasília, Campus Universitário Darcy Ribeiro, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Asa Norte, CEP , Brasília, DF, Brazil Cultivated peanut (Arachis hypogaea) is morphologically diverse but has a narrow genetic base due to its origin. The understanding of its genetic processes has been hindered so far by the non-availability of a fully sequenced genome and limited genomic resources. Due to the higher genetic diversity and adaptation to a range of environments throughout the evolution course, peanut wild relatives (Arachis spp.) constitute a rich source of alleles for resistance to abiotic and biotic stresses. In particular, A. duranensis and A. stenosperma harbor high adaptability to limited water environments and root-knot nematode resistance, respectively. In order to identify genes in these wild Arachis species that are differentially expressed in response to drought stress and to nematode (Meloidogyne arenaria) challenge we conducted comprehensive transcriptome analyses using sequencing data obtained with Sanger, 454 and Illumina HI-SEQ technologies. In silico analysis revealed that several genes were significantly modulated (up- or down-regulated) in stressed or control conditions. Differentially expressed candidate genes related to abiotic and biotic stresses were further selected for validation through qrt-pcr. Among these, expansin, aquaporin, dehydrin, chaperone, nitrilase, transcription factors, resistance protein MG13, resveratrol synthase coding genes revealed high levels of differential expression in stressed plants, validating the relationship of these genes with drought responses or nematode resistance. The identification of candidate genes for resistance to abiotic and biotic stresses can provide additional resources for peanut breeding and transgenic approaches. 12

14 P03-Estratégia genômica para o entendimento da produção de celulases pelo fungo Trichoderma reesei Roberto N. Silva Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Dept. Bioquímica e Imunologia O fungo filamentoso Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) produz um grande número de celulases e hemicelulases que podem ser usadas na degradação de componentes da biomassa com aplicação na produção de bicombustível. A transcrição da maioria dos componentes do complexo de celulases é induzida não apenas por celulose, mas também por uma variedade de dissacarídeos incluindo lactose, celobiose e soforose e antagonizado por glicose. Entretanto, nem a natureza do indutor nem as vias de sinalização celular são totalmente conhecidas. Nesse estudo investigamos a expressão gênica diferencial de T. reesei crescido em celulose, soforose e glicose. Nossos dados revelaram novos componentes na degradação da celulose, tais como proteínas acessórias com funções não catalíticas, transportadores, fatores de transcrição, e CAZymes, que respondem especificamente resposta quer a celulose ou soforose. Além disso, foi possível a identificação de novos transportadores de açúcares e fatores de transcrição associados exclusivamente a degradação da biomassa vegetal. Com os dados obtidos, será construído um modelo relacionado ao papel desses transportadores e fatores de transcrição no metabolismo de diferentes fontes carbono, possibilitando uma melhor compreensão do comportamento das enzimas celulolíticas produzidas por T. reesei e contribuindo para a aplicação desse fungo na indústria de bioetanol. 13

15 P04- Da descoberta de novos vírus à caracterização funcional de genes virais Melo, FL 1,, Ardisson-Araujo, DMP 1, Ribeiro, BM 1, Ribeiro, S 2, Nagata, T 1, Resende, RO 1, Souza, M 2 1 Universidade de Brasília, Campus Universitário Darcy Ribeiro, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Asa Norte, CEP , Brasília, DF, Brazil 2 EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia, Parque Estação Biológica, CP 02372, CEP , Brasília, DF, Brazil A descrição da biodiversidade viral tem despertado a atenção da comunidade cientifica em todo o mundo e estudos metagenômicos virais de diferentes organismos e amostras ambientais de diferentes regiões do planeta sugerem que grande parte da biodiversidade viral ainda permanece desconhecida e deverá ser caracterizada no futuro. O conhecimento da composição e dinâmica de comunidades virais tem implicações importantes em diversas áreas visto que: (i) os vírus têm sido envolvidos em diferentes processos biológicos/ecológicos (ciclagem de nutrientes, indução de resistência ao frio em plantas, etc.), (ii) apresentam um enorme potencial biotecnológico (controle biológico, vetores de expressão heteróloga de proteínas em animais e plantas, vetores de silenciamento gênico em plantas, etc.) e (iii) são responsáveis pela maioria das doenças emergentes em animais e plantas. A importância desses estudos cresce na medida em que a pressão antrópica nos ecossistemas aumenta, pois a dinâmica acentuada de desmatamento e de alteração no uso do solo pode favorecer a emergência de patógenos virais de importância para saúde publica e sanidade animal/vegetal, e acelerar a perda da biodiversidade e de serviços ambientais importantes. Neste contexto, serão apresentados resultados preliminares da Rede Centro-Oeste de Pesquisa em Biodiversidade Viral referentes à descoberta de novos vírus em diferentes espécies de insetos, plantas e amostras ambientais. Além disso, resultados de estudos genômicos e funcionais de representantes da família Baculoviridae serão apresentados. 14

16 P05- Metagenômica funcional da microbiota em solos tropicais S.M. Tsai, A.A. Navarrete, L.W. Mendes, F.S. Cannavan, C.D. Borges. Laboratório de Biologia Celular e Molecular, Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de São Paulo, Av. Centenário-303, Piracicaba-SP, CEP Uma suposição frequentemente feita é que a perda da biodiversidade está acontecendo mais rapidamente em regiões tropicais devido à expansão das atividades agrícolas. O processo de conversão de terra e intensificação da agricultura é uma das mais importantes causas de perda de biodiversidade, com efeitos negativos, tanto sobre o ambiente, assim como na sustentabilidade da produção agrícola. A consequente redução da diversidade da comunidade do solo pode causar uma perda de função, reduzindo a capacidade dos ecossistemas para suportar os períodos de estresse, levando a efeitos indesejáveis. Os cientistas começaram a quantificar as relações causais entre (i) a composição, diversidade e abundância de organismos do solo, (ii) a fertilidade do solo e produção sustentável de culturas associadas, e, (iii) os efeitos ambientais, incluindo as emissões de gases de efeito estufa e sequestro de carbono do solo. Consequentemente, as ações que visam diretamente a conservação de componentes da diversidade microbiológica trarão benefícios ambientais em escala do ecossistema, da paisagem assim como em níveis globais. Nosso objetivo é integrar dados físicos, químicos e microbiológicos do solo, assim como de bioinformática, em um esforço para detectar, quantificar e correlacionar os processos microbianos envolvidos nos processos biogeoquímicos dos ciclos do C e N em solos sob cultivo da soja e cana. Usando estimadores de diversidade, sequenciamento de DNA em larga escala e inferência estatística, avaliou-se as diversidades avaliadas em filos de Bacteria e Archaea, assim como quantificar genes funcionais associados à produção de gases de efeito estufa nos solos. Os dados revelaram que mudanças no uso da terra alteram claramente a estrutura das comunidades e abundância de domínios de Bacteria e Archaea em solos, destacando alguns grupos envolvidos no funcionamento do ecossistema e manutenção de processos biogeoquímicos. Assim, variações temporais e espaciais na estrutura da comunidade microbiana e de genes funcionais associados ao consumo/emissão de GHG podem ser utilizadas como dados adicionais no monitoramento da microbiota em solo ou na rizosfera das culturas de plantas [FAPESP, CNPq, CAPES]. 15

17 P06- O Microbioma Itestinal Humano: estrutura, funções e modificações. Hoffmann, C. 1,2 1 Universidade de São Paulo, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Dep de Nutrição Eperimental, Av. Prof. Lineu Prestes, 580 Bloco 14, Cidade Universitária, CEP , São Paulo, SP, Brazil 2 Universidade de Brasília, Campus Universitário Darcy Ribeiro, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Asa Norte, CEP , Brasília, DF, Brazil O organismo humano, composto de cerca de 10 trilhões de células, abriga entre 10 e 100 vezes mais células microbianas no seu interior e superfície. O genoma combinado dessa comunidade microbiana, composta de Bactérias, Arqueas, Fungos e Bacteriófagos, supera o tamanho do genoma humano em pelo menos duas ordens de magnitude. Quando consideramos essas informações, é difícil descartar o fato de que esses microrganismos devam ser intimamente relacionados ao funcionamento correto do corpo humano, e em nenhuma parte do mesmo isso é mais evidente do que no sistema gastrointestinal. Aqui estão abrigados inúmeros grupos de microrganismos, compondo uma diversidade que é sem precedentes. Somente em grupos bacterianos estima-se que estejam presentes mais de gêneros e entre e espécies, das quais a maioria é desconhecida e até hoje não cultivável. Exemplos de funções da microbiota intestinal, e de sua relação mutualistica com o oganismo humano, incluem a fermentação de carbohidratos não digeríveis, síntese de certas vitaminas essenciais, degradação de oxalatos, desenvolvimento do sistema imune e a estimulação da angiogênese intestinal. Alterações nessa relação podem levar a um estado patogênico, seja pela introdução de um organismo estranho ao sistema, pela desregulação da comunidade microbioma autóctone, ou por efeitos oriundos do hospedeiro humano (por exemplo, processos inflamatórios). Exemplos da disrupção entre o microbioma e o organismo humano que induzem estados patológicos incluem a obesidade, o diabetes, a arteriosclerose e diversas doenças inflamatórias intestinais. Entre os fatores humanos que influenciam a microbiota estão a idade, o genótipo, e a dieta humana, sendo a dieta o fator de acesso mais fácil quanto a à sua utilização em intervenções terapêuticas. A estrutura do microbioma intestinal é uma característica de cada individuo, e o microbioma é adaptado a hábitos alimentares de longo prazo de cada individuo, com pouca influência de intervenções alimentar de curta duração. Se mudanças a longo prazo nos hábitos alimentares poderão mudá-lo ou não ainda é uma questão aberta, e o quão essa interação dieta/microbioma afeta quadros clínicos ainda requer um conhecimento mais profundo da composição e da dinâmica presente na microbiota. 16

18 M01- Mini curso: Preparação de amostras para NGS Daniel Paiva Agustino Universidade de Brasília, Campus Universitário Darcy Ribeiro, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Asa Norte, CEP , Brasília, DF, Brazil In the dawn of Next Generation Sequencing (NGS) technologies, they have become essential tools for most Biology laboratories interested in genomic, epigenomic and transcriptomic approaches. They allow samples to be sequenced, producing massive amounts of data in the scale of hours or days. Everyday new uses for these technologies arise, thus creating new specific protocols for more specific approaches. In this Minicourse, the context of NGS technologies in biological research will be studied, focusing in RNAseq methodologies. The RNAseq pipeline of sample preparation from bench to sequencer will be analyzed. This includes the comparison of RNA extraction protocols, RNA quality control methodologies, library preparation techniques and experimental design for RNAseq experiments. 17

19 M02- Mini curso: Espectrometria de massa top-down no estudo de complexos proteicos nativos Luis Henrique Ferreira do Vale Proteômica é definida como o estudo em larga escala do conjunto de proteínas contidas em uma amostra biológica, sejam células, tecidos ou fluídos biológicos. A velocidade, a especificidade e a sensibilidade atual, em particular, da espectrometria de massas, a tem tornado especialmente atraente para uso em estratégias que requeiram rápidas identificações e caracterizações proteicas. Atualmente, existem duas abordagens gerais para a análise proteômica: bottom-up e top-down.os processos bottom-up tem sido a abordagem da pesquisa proteômica mais utilizada nas últimas duas décadas. Basicamente, nesta abordagem, as proteínas são digeridas com proteases e os correspondentes peptídeos são analisados em espectrômetro de massas. Proteômica top-down envolve medições em alta resolução e acurácia de massa moleculares de proteínas intactas e a fragmentação direta de íons dessas proteínas na fase gasosa de espectrômetros de massa de alto desempenho. A abordagem top-down permite caracterizações acuradas de interações proteína-proteína, de interações proteína-ligante, de modificações proteicas pós-traducionais, de proteoformas, com a possibilidade real de elucidação completa de sequências de aminoácidos em muitos casos. Por sua vez, a espectrometria de massas (MS) é uma ferramenta de química analítica que determina razões massa/carga (m/z) de átomos e compostos químicos ionizadas em fase gasosa. Para tanto, um espectrômetro de massas deve ser composto basicamente de quatro partes principais: uma fonte ionizante, um analisador de massas, um detector e um sistema de aquisição de dados. Seguindo estas abordagens, o minicurso tem como objetivo principal uma introdução `as duas técnicas princiapis de proteômica levando em conta as teorias de espectrometria de massas que são fundamentais para o desenvolvimento destas. 18

20 M03- Mini curso: Biologia sintética e Nanotecnologia Biologia sintética Cíntia Marques Coelho Professora no Departamento de Genética e Morfologia da Universidade de Brasília (UnB) e pesquisadora colaboradora no Laboratório de Biologia Sintética da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Cenargen). A biologia sintética é uma área emergente que abrange diferentes campos de conhecimento da ciência e pode ser amplamente descrita como um desenho e construção de processos biológicos não existentes em um organismo específico ou re-desenho daqueles já existentes. Esse mini curso terá como objetivo a apresentação e discussão de vantagens e desvantagens de ferramentas de edição de genoma que são utilizadas na biologia sintética. Zinc finger nucelases (ZFNs), transcription activator like effector nucleases (TALENS) e "clustered regulatory interspaced short palindromic repeats" (CRISPRs) tem sido as tecnologias usadas para edição de genoma. As três baseiam-se no sistema de reparo NEHJ (nonhomologous end-joing), induzido após a quebra da dupla fita da molécula de DNA para produção de mutações do tipo inlserção e/ou deleção (indel). Se após a quebra da dupla fita de DNA ocorrer o reparo através de recombinação homóloga genes de interesse podem ser inseridos nesses locais. ZFNs e TALENs são proteínas recombinantes que possuem um domínio de ligação ao DNA alvo e um domínio de clivagem proveniente da enzima de restrição FokI. Já o CRISPR constitui um loci que contêm várias repetições diretas curtas, e fornecem imunidade adquirida para bactérias e archaea. Sistemas CRISPR são baseados em crrna e tracrrna para silenciamento específico de seqüência do genoma alvo. Existem três tipos de sistemas de CRISPR/Cas e o sistema de tipo II foi utilizado para o desenvolvimento da ferramenta de edição do genoma, onde Cas9 é utilizada como uma endonuclease de DNA-RNA que cliva DNA, guiada sobre crrna-tracrrna de reconhecimento do alvo. 19

21 Nanotecnologia Luciano Paulino da Silva Pesquisador no Laboratório de Espectrometria de Massa da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (Cenargen) e professor nos Programas de Pós-graduação em Nanociência e Nanobiotecnologia e de Biologia Animal na Universidade de Brasília (UnB). A nanotecnologia é uma área do conhecimento que integra várias ciências como a física, a química, a biologia e a ciência dos materiais. Os sistemas nanoestruturados, devido ao seu tamanho em nanoescala (em geral com pelo menos uma das dimensões entre 1 a 100 nm) apresentam propriedades novas ou aprimoradas baseadas nas suas características especificas (tamanho, forma, carga de superfície, composição, entre outras) quando comparadas a estruturas de dimensões maiores provenientes do mesmo material. Duas abordagens principais são utilizadas para síntese de nanossistemas as quais são conhecidas em nanociência e nanotecnologia como top-down (de cima para baixo) e bottom-up (de baixo para cima). A estratégia top-down consiste na desconstrução de material macroestruturado, geralmente por técnicas de nanolitografia ou por moagem de alta energia, até a obtenção do produto final nanoestruturado. Essa abordagem é comumente utilizada para produção em escala, mas são observadas dificuldades para obtenção de uma homogeneidade nas características do produto final. A outra abordagem, bottom-up, segue o caminho oposto no qual a nucleação de crescimento ocorre a partir de átomos e/ou moléculas individuais para a formação das nanoestruturas. Essa abordagem permite controlar diversos parâmetros, como a distribuição de tamanho e forma das nanoestruturas, sendo a mais utilizada atualmente. Diversos avanços vêm sendo demonstrados nos últimos anos por meio da aplicação de estratégias para produção de nanossistemas, sobretudo por rotas sustentáveis as quais serão discutidas nesse mini curso. 20

22 P07- Sequence and pattern based characterization of insect viromes via small RNA metagenomics Aguiar, ERGR 1, Olmo, RP 1, Vianna, FF 1, Paro, S 2, Lobo, FP 3, Drumond, BP 4, Gontijo, NF 5, Sant Ana, MRV 5, Moreira, LA 6, Meignin, C 2, Imler, JL 2, Marques, JT 1 1-Department of Biochemistry and Immunology, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil 2- UPR9022 Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Strasbourg, France 3- EMBRAPA-Campinas, Brazil 4- Department of Parasitology, Microbiology and Immunology, Universidade Federal de Juiz de Fora, Minas Gerais, Brazil 5-Departament of Parasitology, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil. 6- Centro de Pesquisas René Rachou - Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil Arthropod-borne viruses (arboviruses), such as dengue virus (DENV), infect millions of people annually and have great impact on public health. Incidence of arboviral diseases has been steadily rising and, at the same time, discovery of new arboviruses has stagnated since the mid-60s. Most arboviruses lack specific and effective treatment or vaccines. Surveillance strategies to monitor and discover new arboviruses are important to help design public health policies. Here we developed and applied a broad metagenomics strategy for the identification of the virome in three different dipteran insects. We deep sequenced small RNA libraries from wild vector insects, Aedes aegypti mosquitoes and Lutzomyia longipalpis sand flies, and the laboratory model organism Drosophila melanogaster. We found two mosquito viruses that includes a new virus most similar to the Luteoviridae family and a new strain of Phasi Charoen virus previously identified as a Bunyavirus present in mosquitoes from 21

23 Thailand. We also identified three new viruses in sand flies, two of which show similarity to members of the Reoviridae family and one with the Nodaviruses. In fruit flies, we found two new viruses that were most similar to Reoviridae and Caliciviridae families. Apart from the new strain of PhasiCharoen virus, all other six viruses likely represent new species. Viral contigs obtained from our metagenomic approach were confirmed by RT-PCR and sequencing. In some cases, SNPs between contigs and PCR products but all of them represented polymorphisms present in small RNA reads suggesting they represent the genetic diversity naturally found in the viral population. Small RNA size and density profiles for all viral contigs were characteristic for each virus and could indicate differences in infection strategies such as tissue tropism and RNAi pathway inhibition. Although most viruses we identified were at very high prevalence in insect populations, one of the reoviruses was at very low prevalence in the sand fly population. Nevertheless, our approach was still sensitive enough to detect this virus. Following our initial strategy based on sequence similarity we also applied a pattern-based approach to identify viral sequences. We searched for contigs presenting small RNA profiles consistent with other viruses and were able to detected additional contigs that likely represent other segments from the two reoviruses in sand flies. These contigs have small RNA profiles and expression that perfectly mimic the other reovirus sequences we identified. Importantly, they do not show significant similarity to any sequence in genbank. We also validated the strength of our approach by applying it to other previously published small RNA datasets. In every library analyzed from adult mosquitoes or Drosophila and mosquito cell lines, we were able to identify viruses that had not been detected before. Utilizing our pattern-based approach, we detected a contig with virus-consistent small RNA profile that is completely uncharacterized. Together, our results show the power of our approach to reliably identify and characterize new viruses in insects without any prior information. 22

24 P08- Ferramentas de bioinformática aplicadas às análises de dados OMICS Fernandes, GR. Universidade Católica de Brasília UCB - Campus Avançado Asa Norte - SGAN 916 Módulo B Avenida W5 - CEP: Brasília/DF Em uma era pós-genômicas, quando a geração de dados guia as pesquisas científicas, é cada vez mais importante o uso e desenvolvimento de ferramentas capazes de extrair o máximo de informação dos dados produzidos. Dados genômicos, transcritômicos e metagenômicos podem ser utilizados para diversas finalidades desde que sejam acoplados a um fluxo de trabalho com ferramentas que deem ao pesquisador a resposta para uma pergunta objetiva. A chamada "data driven science", ao contrário do que sugere, exige planejamento para que os experimentos sejam desenhados de modo que possam responder a uma determinada pergunta biológica. No presente trabalho, serão apresentadas alternativas e aplicações de dados de NGS para estudos de associação, anotação de genomas, análises de expressão de genes, assim como as condições que devem ser consideradas para a geração desses dados. 23

25 Apresentações orais P09 - Mayara Simonelly Santos - Entrega de Azul de Metileno mediada por Nanofolha de Óxido de Grafeno para Terapias Fotodinâmica e Fototérmica Combinadas no Tratamento de Carcinoma Mamário Humano In Vitro e In Vivo. P10- Muhammad Faheem - Initial characterization and crystallization of a novel bacterial protease selected in a metagenomic approach P11- Caio Silva Souza - The Electric Fingerprint of Voltage Sensor Domains. P12- Valquíria Alice Michalczechen Lacerda - Escherichia coli engenheirada metabolicamente aumentam a produção de proteínas recombinantes de teia de aranha e origina fibra sintética. O conteúdo destas apresentações encontra-se na seção de resumos. 24

26 P13- Role of conformational equilibrium in molecular recognition: regulation of catalysis, defensins and virus assembly Fabio C. L. Almeida Biomolecular NMR Laboratory, National Center of Nuclear Magnetic Resonance, Institute of Medical Biochemistry and Nucleus for Structural Biology and Bioimaging, Federal University of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil. Proteins are dynamic entities able to move in a wide range of timescales that goes from picoseconds to seconds. Motions that occur in microseconds to seconds define biologically relevant events that are frequently involved in binding, allostery and catalysis. We measured relaxation parameter, relaxation dispersion experiments and molecular dynamic simulation in order to correlate conformational equilibrium with membrane interface recognition. We probed the dynamics of plant defensins from sweet peas (Psd1) and sugar cane (SD5) and correlated to their ability to specifically bind a glucosylceramide at the target membrane. In spite of the great similarity in folding, their binding site is remarkably different, and highly dependent on the dynamics. Using CPMG relaxation dispersion methods we characterized the structural property of the excited state conformation of sugar cane defensin 5 and observed that for Cys-stabilized folding conformational equilibrium is mainly regulated by polar contacts, enabling this kind of folding to successfully insert hydrophobic residues facing that protein surface. These finding are essential to understand evolution of cysstabilized folding, which includes several protein families. We will also show how Dengue virus capsid protein (DENVC) recognizes lipid droplets (LD) inside the cells. LDs recognition is essential for virus assembly. The understanding of the participation of the intrinsically disordered N-terminal region and its dynamics helped us to develop an inhibiting peptide. ACKNOLEDGEMENTS: FAPERJ, CAPES, CNPq, INBEB-CNPq, Program Science Without Borders-CNPq 25

27 P14- Intracellular trafficking mediated by actin-based molecular motors: The myosin V family Mario T. Murakami Laboratório Nacional de Biociências (LNBio) - Centro Nacional de Pesquisas em Energia e Materiais (CNPEM). Unconventional myosins are actin-based molecular motors ubiquitous in eukaryotic cells, which participate in a multitude of intracellular processes including cell division, cell movement, intracellular transport and signal transduction. Mutations or defects in myosin genes are related to a variety of human diseases such as Griscelli syndrome that is characterized by hypopigmentation and neurological disorders and some types of cancer promoting proliferation, invasion and motility. The goal of this research line is shed light on the sophisticated molecular mechanisms involved in the signaling, regulation and selectivity of these essential molecular motors for eukaryotes. In this presentation, our recent findings regarding the functional differentiation and overlapping in the Myosin V family will be discussed. Acknowledgements: FAPESP, CNPq and CAPES. 26

28 P15- A espectrometria de massas como ferramenta de biologia estrutural Fabio Cesar Gozzo Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química. Instituto de Química - Unicamp Cidade Universitária Campinas, SP Brasil Nos últimos anos, a espectrometria de massas (MS) tem avançado no campo de suas aplicações e uma das áreas de grande desenvolvimento é a aplicação da técnica no estudo das estruturas e interações de proteínas e complexos proteína-proteína. Para se obter informações estruturais, três técnicas baseadas em MS tem se destacado: mobilidade iônica, troca H/D e ligação cruzada (cross-linking). Através do uso combinado dessas três técnicas, pode-se obter um conjunto complementar de informações estruturais de proteínas e complexos, em especial para aquelas que não são passíveis de serem analisadas por métodos de alta resolução. Essas informações estruturais compreendem dados sobre a dinâmica das proteínas, a determinação de parceiros de interação, mapeamento das regiões de interação proteína-proteína, além de fornecer dados para guiar a modelagem molecular de proteínas. Neste seminário essas técnicas serão apresentadas assim como aplicações recentes em sistemas biológicos de interesse. 27

29 P16- Atualidades/tendências e integração de dados de diferentes técnicas no estudo da biologia estrutural Fabio C. L. Almeida (UFRJ) Mario T. Murakami (CNPEM) Fabio Cesar Gozzo (Unicamp) Marcelo Valle de Sousa (UnB) João Alexandre R. G Barbosa (IB-UnB) Aline Lima de Oliveira (IQ- UnB) Proteínas são polipeptídeos compostos de aminoácidos e estão envolvidos na maior parte dos processos biológicos. Nos últimos 50 anos, o estudo de estruturas a nível molecular revolucionou a visão da biologia. A análise da estrutura tridimensional de proteínas, complexos proteicos bem como suas redes de interações são fundamentais, uma vez que quase todos os processos biológicos envolvem uma regulamentada cooperação entre várias subunidades de proteínas em termos de tempo e espaço. Igualmente importante estão as interações de proteínas com outras biomoléculas, tais como DNA, cofatores e moléculas mensageiras, que também contribuem para a complexidade da regulação. Identificação, caracterização estrutural e funcional dos componentes envolvidos nestes mecanismos e como eles interagem para desempenhar suas funções biológicas é a chave para a compreensão dos processos biológicos a nível molecular. Há várias abordagens experimentais para se investigar estes aspectos da biologia estrutural. Nesta mesa redonda, será abordado os principais avanços, perspectivas e integração de informações entre a espectrometria de massas, cristalografia e ressonância magnética nuclear na biologia estrutural. 28

30 Apresentações orais P17- Elias Ferreira Sabiá Júnior - Detecção e Caracterização de Proteínas Parasporina em Isolados de Bacillus thuringiensis Citotóxicas a Células de Câncer Humano. P18- Raquel das Neves Almeida - The role of type VI secretion system of gramnegative bacteria in lipid antigen presentation through CD1 molecule. P19 - Clara Wandenkolck Silva Aragão - Genome sequence and analysis of a medical interest baculovirus isolated from Lonomia obliqua (Lepidoptera:Saturniidae) reveals a new transcription terminator factor possibly acquired from the host. P20- Rayssa Almeida Garcia - Validação da estabilidade de estruturas de RNA fita dupla para uso no silenciamento gênico de insetos praga: avaliação na planta e no inseto alvo. O conteúdo destas apresentações encontra-se na seção de resumos 29

31 P21- RECOBIO: MidWest Network to education and research on computational biology Brígido, M 1, Treptow, W 1, Montera, L 2, Pereira, M 3 1 Universidade de Brasília, Campus Universitário Darcy Ribeiro, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Asa Norte, CEP , Brasília, DF, Brazil 2 Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Faculdade de Computação, CEP , Campo Grande, MS, Brazil 3 Universidade Federal de Goiás, Laboratório de Biologia Molecular, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, CEP , Goiânia, GO, Brazil A Rede Centro-Oeste de Formação e Pesquisa em Biologia Computacional foi criada visando ao desenvolvimento de projetos de pesquisa e à formação de recursos humanos em Biologia Computacional, bem como a nucleação de equipes acadêmicas das grandes áreas Ciências Biológicas, Exatas e da Terra. É composta atualmente por sete Programas de Pós-graduação das Universidades Federais de Goiás, Mato Grosso do Sul e Brasília e suas áreas temáticas e linhas de pesquisa da Rede abrangem: (a) análise computacional de dados de alto desempenho, (b) biologia estrutural computacional e (c) biologia de sistemas. Buscando atingir os objetivos propostos, estão previstas ações das seguintes categorias: (i) integração de grandes áreas; (ii) formação de recursos humanos; e (iii) atividades de extensão. Nessa palestra serão apresentadas as bases desse projeto, suas realizações e perspectivas. 30

32 P22- Mecanismo de ativação de canais iônicos dependentes de voltagem, Kv e Nav, e a interação com anestésicos gerais* Cristiano Guimarães do Amaral Pinheiro, Sonia Maria de Freitas, Werner Treptow. Homenagem à Cristiano Guimarães do Amaral Pinheiro. * Prêmio CAPES de Tese - Edição 2014, teses defendidas em O papel fundamental dos canais catiônicos dependentes de voltagem (VGCC) nos mais diversos organismos baseia-se no seu complexo mecanismo de ativação, i.e a transição entre dois estado fisiológicos funcionais desses canais: ativado/aberto (AT) e desativado/fechado (RT). Logo após a publicação da primeira estrutura cristalográfica do canal de mamífero Kv1.2 na conformação AT, alguns modelos do estado RT tem sido propostos na literatura para este canal. Para todos esses modelos, análises estruturais tem sugerido um consenso com os dados experimentais, destacando portanto a natureza inequívoca dessas estruturas RT. Tomados em conjunto, os estudos estruturais sobre o Kv1.2 são até agora o único conjunto de dados disponível, no nível das interações atômicas, para o entendimento sobre o mecanismo de ativação da superfamília VGCC. Recentemente, a estrutura cristalográfica de um canal de sódio de procarioto, dependente de voltagem (NavAb), foi resolvida numa conformação interpretada como estado pré-ativado do canal. Como um possível ancestral da superfamília dos canais de sódio e cálcio dependentes de voltagem de vertebrados, o surgimento da estrutura atomística do NavAb nos proporciona a primeira, e até então a única, estrutura de alta resolução para estender nossa compreensão sobre outros membros da superfamília VGCC. Dessa forma, de modo a contribuir com o referido tema, consideramos as estruturas AT e RT do Kv1.2, equilibradas na membrana, como guias estruturais em uma série de simulações de dinâmica molecular no intuito de investigar o processo de ativação do canal NavAb. Além de identificar a estrutura cristalográfica do NavAb como um estado intermediário dentro do caminho de ativação, nosso trabalho permitiu determinar conformações relacionadas aos estados fisiológicos funcionais estruturalmente relacionados às estruturas AT e RT. De maneira geral, os resultados suportam a ideia de um mecanismo de ativação altamente conservado ao longo de toda a superfamília de VGCC. 31

33 Resumos 32

34 R00-Entrega de Azul de Metileno mediada por Nanofolha de Óxido de Grafeno para Terapias Fotodinâmica e Fototérmica Combinadas no Tratamento de Carcinoma Mamário Humano in vitro e in vivo Mayara Simonelly Costa dos Santos; Leonardo Giordano Paterno; Paulo Eduardo Narcizo De Souza; Ricardo Bentes De Azevedo; Sônia Nair Báo. Microscopia Eletrônica As terapias fotodinâmica (TFD) e fototérmica (TFT) destacam-se como alternativas terapêuticas aos métodos convencionais para o tratamento de carcinoma mamário. A TFD envolve: agente fotossensibilizante (FS), luz de comprimento de onda específico e oxigênio. O produto dessa reação são espécies reativas de oxigênio capazes de induzir efeitos tóxicos a células e tecidos-alvo. Na TFT, um agente fototérmico absorve luz, a qual induz o aumento da temperatura localmente, causando dano celular, desnaturação das proteínas, DNA e coagulação do tecido. O FS azul de metileno (AM) possui forte absorção de luz de comprimento de 660 nm e alta eficiência fotodinâmica. O grafeno, composto derivado do grafite, tem sido proposto com um bom material para a associação e entrega de drogas. Além de possuir alta eficiência fototérmica, absorção em 808 nm. A associação do grafeno ao AM possibilitaria o uso de um dispositivo de efeito sinérgico, aonde o agente fotossensibilizante e fototérmico estão em uma única nanoestrutura para o tratamento de carcinomas. As nanofolhas de óxido de grafeno e azul de metileno (NanoGO-AM) foram produzidas a partir de reação de carboxilação de óxido de grafeno, sonicação e adsorção do tensoativo Pluronic F127 e do fotossensibilizante AM. As nanofolhas apresentaram diâmetro hidrodinâmico médio de 110 nm, índice de polidispersão de 0,3 e potencial zeta de -46,2 mv. A ultraestrutura das nanofolhas, em característico formato de folhas, pode ser observada em microscopia eletrônica de transmissão. Foram construídos dispositivos de LED (660 nm, AM) e laser (808 nm, NanoGO) para irradiação do fármaco. Após a irradiação do NanoGO-AM com o LED 660 nm, podese observar produção de espécies reativas de oxigênio em espectrofotômetro. Durante a irradiação de NanoGO-AM com o laser 808 nm (densidade de energia 2 W/cm2) por 3 minutos, houve a variação de temperatura da amostra de 28 C para 53 C. Mostrando assim, o potencial da NanoGO-AM em produzir dano celular irreversível. 33

35 R01-Síntese racional de análogos de toxinas escorpiônicas com ação em canais KV1.3 visando uma abordagem terapêutica contra a esclerose múltipla Solange Cristina Rego Fernandes; Carlos Bloch Jr.; Elisabeth Schwartz. Laboratório De Toxinologia Canais Kv1.3, membros da família de canais de K+ voltagem-dependentes, são expressos predominantemente em linfócitos T humanos, e têm sido amplamente utilizados como alvos farmacológicos em terapias imunossupressoras, principalmente no tratamento da Esclerose Múltipla (EM). O bloqueio in vitro e in vivo desses canais tem demonstrado um papel crucial na patogenicidade da doença, levando à melhoria da encefaliomielite autoimune experimental (EAE) em ratos. Bloqueadores peptídicos têm mostrado alta potência e especificidade para os canais Kv1.3 e, até o momento, os mais potentes e seletivos foram isolados da peçonha de escorpiões. Neste campo, o desenho racional de peptídeos tem grande valor: por meio de mutações e alterações pontuais, a potência e seletividade dos peptídeos podem ser grandemente influenciadas. Os peptídeos serão sintetizados em sintetizador automático pela estratégia Fmoc/t-butila em suporte sólido utilizando as resinas de Wang apropriadas; purificados por RP-HPLC e analisados por espectrometria de massa MALDI-TOF. A atividade bloqueadora será testada em diferentes linhagens celulares expressando canais de potássio por meio de patch-clamp. Para o modelo da EAE, a fase de sensibilização será realizada in vitro pela apresentação de auto-antígenos às células T, seguida pela fase in vivo, onde linfócitos autorreativos serão transferidos a fim de causar a doença. Serão realizados ensaios de prevenção e tratamento. O peptídeo Tc32, isolado a partir da peçonha do escorpião amazônico Tityus obscurus, foi escolhido como modelo no presente estudo por ser um potente bloqueador de canais Kv1.3 (Kd de 10 nm). Foram sintetizados quatro peptídeos, um com sequência primária idêntica à Tc32 e outros três análogos variando quanto à ausência das regiões N- e C-terminais. A massa teórica experimental foi confirmada e, posteriormente, o processo de oxidação foi realizado com a finalidade de fechar as pontes dissulfeto. A partir da obtenção e purificação dos peptídeos em sua conformação ativa, serão realizados experimentos eletrofisiológicos para registros dos canais Kv1.3 em patch-clamp, além de outros canais da família Kv1. Os peptídeos bloqueadores de Kv1.3 mais potentes e específicos serão testados in vivo utilizando o modelo da encefalomielite autoimune experimental para esclerose múltipla. 34

36 R02-Engenharia metabólica de soja e edição de genoma de genes associados a ácidos graxos Débora Torres Alves Figueiredo, Cíntia Coelho, Marly Coelho, André Melro Murad, Nicolau Cunha, Giovanni Vianna, Elíbio Rech. Laboratório De Biologia Sintética Embrapa O biodiesel vem se destacando como uma importante fonte de energia renovável e sustentável. Dentre as matérias-primas utilizadas para a produção do biodiesel, a soja (Glycine max) se destaca pelo alto teor e qualidade do óleo de suas sementes, domínio do sistema de produção em larga escala e custo reduzido quando comparado a qualquer outro óleo. Sementes de soja apresentam um perfil de ácidos graxos composto principalmente de 13% de ácido palmítico (16:0), 4% de ácido esteárico (18:0), oléico 18% ácido (18:1), ácido linoléico 55% (18:2) e 10% de ácido linolênico (18:3). Devido a essa alta proporção de poliinsaturados ácidos graxos, o óleo de soja é oxidativamente instável e oxidado, fato que pode comprometer o desempenho do motor e utilização como opção viável de biocombustível. Para maximizar as características de um bom biodiesel, tem-se sugerido o desenvolvimento de um óleo rico em ácido oléico e com baixo teor de ácidos graxos saturados. Os genes FAD2-1A e FAD2-1B são importantes na conversão do óleo monoinsaturado (oléico) em óleo poliinsaturado (linoléico). Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) foram desenhados a fim de se obter mutações tipo nula em dois genes importantes da via metabólica de ácidos graxos e gerar linhagens com maior teor de ácido oléico. Neste trabalho através de cromatografia gasosa, foram obtidas três linhagens independentes com o conteúdo de ácido oleico aumentado, variando 31-66%. 35

37 R03-Genome sequence and analysis of a medical interest baculovirus isolated from Lonomia obliqua (Lepidoptera:Saturniidae) reveals a new transcription terminator factor possibly acquired from the host Clara Wandenkolck Silva Aragão; Fernando Lucas Melo; Daniel Ardisson Araújo; Miguel Andrade; Bergmann Morais Ribeiro. Virologia Lonomia obliqua (Lepidoptera: Saturniidae) is a poisonous larvae of medical importance due to the severity of accidents occurred in Brazil caused by the contact of these larvae with the human skin. The possibility of controlling these populations is being evaluated by using pathogens such as a nucleopolyhedrovirus isolated from L. obliqua. In this work, we have sequenced the genome of the baculovirus LoobMNPV and analyzed its genomic composition and evolutionary history. The genome is bp long, comprising 135 putative ORFs. Furthermore, in an evolutionary context, based on analysis that include the core gene from 93 sequenced baculovirus, LoobMNPV fell into a basal position related to the Alphabaculovirus group I (lepidopteran-infective NPV). Interestingly, one ORF showed significant identity (evalue equals to 3e10-11) to a eukaryotic transcription terminator factor (TTF2) from the lepidoptera Danaus plexippus (GenBank: EHJ ). On the other hand, when restricting this search only to baculoviruses, this ORF also demonstrated identity (evalue of 1e10-6) to the Global Transactivator (GTA) gene from Antheraea pernyi nucleopolyhedrovirus (Genbank:YP_ ). Phylogenetic analysis were performed with the TTF2 gene from various organisms, as well as with the GTA from baculovirus. These results indicated two hypothesis: (i) this gene may have been independently acquired from the host through horizontal transfer, acting as an inhibitor of the host s transcriptional machinery in order to benefit viral translation; (ii) or it is a divergent variation of the GTA gene that has undergone positive selection. 36

38 R04-Análise estrutural da proteína PPARγ in silico e por difração de raios x Jônatas Cunha Barbosa Lima; Erika Sampaio, Kelly Grace Magalhães, Luiz Romeiro; João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa. Laboratório De Biofísica Estrutural Os receptores PPAR são importantes em tecidos como o adiposo e muscular por estarem relacionados ao metabolismo glicose e lipídeos, dessa forma, sua alteração está relacionada a doenças. Os PPAR heterodimerizam com a RXR para se associar ao DNA, e possuem alguns domínios como o de ligação ao ligante (LBD). Os receptores distribuem-se em subtipos: α, β/δ e γ, que possui as isoformas γ1 e γ2, onde cada um possui funções específicas sendo encontrados em diferentes tecidos. O PPARγ tem sido alvo de moléculas contra diabete, com ação anti-inflamatória, entre outros. Algumas dessas podem interagir de modo full agonist, levando a respostas mais fortes, e em consequência também mais efeitos colaterais, e partial agonist, com respostas mais brandas. Neste trabalho usa-se o AutoDock Vina para analisar a afinidade de interação dos ligantes com o PPARγ através de dois métodos de docking: com a proteína rígida e com alguns resíduos de aminoácidos flexíveis. Até o momento, os resultados mostram que nenhum ligante interagiu como full agonist, nos dois tipos de docking executados todos se ligam em posições características de partial agonist. No docking rígido, os ligantes LDT28, LDT29, LDT30 e LDT208 ocuparam duas posições durante a interação, mas o LDT13 ocupou somente uma dessas. Um dos posicionamentos se encontrava mais no interior da proteína e apresentou, em geral, maiores afinidades, o que era esperado, pois o ligante é semelhante a um ácido graxo, sendo mais termodinamicamente favorável se posicionar onde poderia realizar o maior número de interações hidrofóbicas. O LDT13 não foi encontrado no interior, mas, apresentou afinidades semelhantes aos lá localizados, o que pode indicar maior afinidade. Serão realizados experimentos para expressão e purificação da região LBD do PPARγ, com o objetivo de conseguir cristais da interação deste com ligantes selecionados por estes resultados de docking e ensaios celulares in vitro. 37

39 R05-Caracterização físico-química e molecular da enzima bifuncional Fosfatase/Fitase produzida por Trichoderma harzianum ALL42 Amanda Araújo Souza, Viviane Castelo Branco Reis, Marcelo Henrique Soller Ramada, Vanessa Oliveira Leitão, Fernando Araripe G. Torres, Raphaela De Castro Georg, Cirano José Ulhôa, Sonia Maria De Freitas. As fosfatases ácidas (ACP) são enzimas produzidas por plantas e microrganismos que hidrolisam ligações monoéster, liberando fósforo (Pi). Fitases são fosfatases que degradam ácido fítico em mio-inositol e Pi. Estas enzimas apresentam aplicações biotecnológicas como, enriquecimento de ração para animais, aumento de Pi no solo e biorremediação; tratamento de efluentes contaminados com organofosfato. Neste trabalho uma fosfatase ácida/fitase de T. harzianum ALL 42 foi purificada e caracterizada fisicoquimicamente. Análises moleculares, clonagem do gene e identificação da região codante desta proteína foram realizados. A proteína foi purificada por exclusão molecular (Superdex-200) e sequenciada por espectrometria de massa (MALDI-TOF/TOF). Os sete peptídeos obtidos foram comparados com sequências do GenBank. O nível de expressão RT-PCR, tamanho da ORF, presença de íntrons e análise de cdna por PCR semi-quantitativa foram realizados. O gene e cdna da enzima foi clonado em PCR Blunt, replicado em Escherichia coli (XL 10-Gold) e sequenciados pelo método de Sanger. A produção enzimática foi de11,33 ± 0,10 U/mg e massa molecularde 95 KDa, com 30% de glicosídeo. A enzima apresentou capacidade de degradar fenil fosfato de sódio, D-glicose-1-fosfato e ácido fítico, em ph de 3 a 6, temperatura ótima 60oC, Km µm e Vmáx 5.02 µm.min- 1. Em solução, a ACP apresentou-se monodispersa, compatível com a forma monomérica. Os peptídeos obtidos no sequenciamento são similares a fitase de T. harzianum, histidina fitase ácida de Trichoderma pleuroticola e uma proteína de Trichoderma virens. A enzima foi parcialmente inibida por Pi e altamente inibida por tungstato de sódio. Os ensaios qpcr revelaram alto nívelde expressão em meio contendo apenas glicose. Fragmentos de 2.200pb, 1.843pb e de 1.570pb foram amplificados, correspondendo ao gene completo, DNA genômico e cdna da ACP, respectivamente. Análise das sequências mostrou que o DNA genômico da ACP apresenta íntrons. A sequência do gene e da ORF estão sendo analisadas, e o DNA plasmidial preparado para expressão heteróloga em Pichia pastoris. Após a expressão dessa enzima, a análise estrutural e ensaios de cristalização serão realizados. 38

40 R06-Estudo da Capacidade Evolutiva de Tospovirus via Rearranjo Genético e Sua Implicação na Epidemiologia Viral Mariana Martins Severo de Almeida; Melo, Fernando Lucas; Martinez, Reina Teresa; Renato De Oliveira Resende. Virologia Vegetal Viruses in the genus Tospovirus (family Bunyaviridae) are plant pathogens transmitted by insects known as thrips, with a trisegmented single-stranded ambisense RNA (S, M and L) genome and the ability to replicate in vector too. The diversity of the genus comprises 8 recognized species with a variable host range and geographic distribution. Tospovirus are widespread in the Americas, where Tomato chlorotic spot virus (TCSV), Tomato spotted wilt virus (TSWV), Groundnut ringspot virus (GRSV), Chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV), Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV), Impatiens necrotic spot virus (INSV), Iris yellow spot virus (IYSV), Alstroemeria necrotic streak virus (ANSV), Melon severe mosaic virus (MeSMV) and Bean necrotic mosaic virus (BeNMV) have been reported. TCSV was first noticed in Brazil in the early 1990's, with GRSV. Nowadays, GRSV is present in both new world and the old world, whereas TCSV is find only in the Americas. A phylodinamic study was conducted to infer the TCSV spread. Thirty-three sequences corresponding to RNA S with coding (N protein) and no-coding regions were downloaded from GenBank. The alignment was carried out using MUSCLE software. The phylogenetic and phylodinamic relationships were inferred by BEAST package using Bayesian Evolutionary Analysis. According to the sampling year, the spatial phylogenetic reconstruction and the dynamic evolution were determined by SPREAD program. Probably, TCSV has two different origins in South America, one in Brazil (S45325) and the other in Argentina (U49709, U49707), in Brazilian lineage spread to the country to North America and Caribe. Once in Caribe, it was introduced back in North America. The first introduced in North America most likely in 1994, led to the first reassortant intra-species isolates. This new isolate has the S and L RNAs from GRSV and the M RNA from TCSV. The isolates originated from the second introduction in the North America around the year 2006 are so close related to Caribbean isolates, at least 97% identical. Comparing the first report of TCSV in Brazil with the last (JQ034525) sampled in 2009, the nucleotide sequence accumulated modifications resulting in 93% identity each other. That isolate is more related to Argentine lineage sharing 99% identity, with a clearly well supported phylogenetic reconstruction. There is not an updated information about the strain that are present nowadays in Brazil. 39

41 R07-Produção de novos anticorpos Anti-CD20 na forma de FvFc em células de mamíferos Juan Fernando Riasco; Marcelo Macedo Brigido; Andréa Queiroz Maranhão Laboratorio De Imunologia Molecular Os anticorpos monoclonais são glicoproteínas especializadas, produzidas pelas células B, que fazem parte do sistema imunitário, com a capacidade de reconhecer as moléculas específicas (antigénios). Os anticorpos monoclonais são ferramentas essenciais na clínica e biotecnologia e provaram ser úteis no diagnóstico e tratamento de doenças infecciosas, imunológicas e neoplásicas, bem como no estudo das interações patógeno-hospedeiro e de marcação. Os anticorpos hoje disponíveis no mercado apresentam parte de suas seuqencias de origem murina, o que pode levar a respostas imunológicas adversas. Nesse sentido, obter sequências mais próximas a de anticospos humanos pode minimizar os efeitos colaterais de sua utilização terapêutica. Esse projeto tem como objetivo a produção de novas versões humanizadas para anticorpos monoclonais que reconhecem o antígeno linfocitário CD20 a partir da sequencia murina obtida do anticorpo comercialmente disponível rituximabe. Utilizando-se a técnica de seleção de bibliotecas apresentadas na superfície de em fagos (phage display), a seleção será feita a partir da sensibilização de placas de microtitulação com a porção extracelular do antígeno CD20, O DNA plasmidial dos ciclos zero e quatro serão extraídos e submetidos ao sequenciamento de alto desempenho em plataforma 454 da Roche. Os dados gerados serão disponibilizados em formato FASTAQ, As sequêencias geradas serão filtradas para termos apenas aquelas com alto grau de qualidade A partir daí serão propostas sequêencias para serem testadas nas etapas subsequentes do projeto na forma de scfv, Os genes de scfvs selecionados serão redesenhados e sintetizados quimicamente, buscando-se a otimização de códons para a expressão heteróloga em células CHO e a sua posterior conversão na forma de FvFc, A atividade biológica será testada in vitro por imunoensaio enzimático (ELISA). Além disso. Será testada a capacidade de ligação das novas proteínas na superfície de células humanas de linfoma por citometria de Fluxo. A fim de minimizar os efeitos adversos de antirituximab usando humanizado anti-cd20 tem sido proposto para avaliar a acção molecular deste anticorpo no fundo genético das células, este estudo tem por objectivo contendo Ac domínios humanos variáveis e menos imunogênica, que mais tarde serão testados para a atividade biológica. 40

42 R08-Cultivo e caracterização de membros do domínio Archaea a partir de sedimentos lacustres do Cerrado Deborah Vasconcellos Ambrósio; Kruger, Ricardo Henrique; Kyaw, Cynthia Maria. Microbiologia O avanço das técnicas de Biologia Molecular mostrou uma nova maneira de estudar os organismos, em especial os procariotos. A classificação dos três domínios, proposta por Woese e colaboradores em 1990, revelou a importância do domínio Archaea e desde então vários trabalhos têm sido realizados a fim de melhor entender este grupo. Os primeiros trabalhos descreviam o domínio Archaea como organismos que viviam somente em ambientes extremos, hoje se sabe que as archaeas possuem uma ampla diversidade e distribuição no nosso planeta, sendo importantes para vários processos ecológicos incluindo a ciclagem do Carbono e Nitrogênio. A maior parte do conhecimento deste domínio, incluindo a sua diversidade no bioma Cerrado, está descrita apenas por métodos independentes de cultivo devido a grande dificuldade de obtenção de culturas em laboratório. Tendo em vista um melhor entendimento sobre o metabolismo e funções desses organismos, este trabalho propõe o cultivo em laboratório e posterior caracterização de archaeas mesófilas do Cerrado a partir de sedimentos de um córrego da reserva ecológica do IBGE localizada em Brasília, DF. Os microrganismos foram cultivados em meios sólido e líquido, confeccionados a partir da mistura de água e sedimentos deste córrego. A mistura foi adicionada de cloreto de amônio, para favorecer o crescimento de oxidantes de amônia, e de agentes antimicrobianos adequados. As amostras foram incubadas em estufa a 28ºC e analisadas semanalmente quanto ao crescimento, sendo realizados repiques quando necessário. As colônias obtidas em meio sólido tiveram seu DNA extraído e submetidos a ensaios de PCR com iniciadores específicos para o gene que codifica o rrna 16S de Archaea e Bacteria e o gene amoa de Archaea. Os amplicons foram sequenciados e o resultado revelou um cocultivo entre archaeas oxidantes de amônia pertencentes ao filo Thaumarchaeota e bactérias de 4 gêneros diferentes, pertencentes as famílias Brucellaceae e Burkholderiaceae. Análises morfológicas estão sendo realizadas a fim de se caracterizar as archaeas obtidas neste co-cultivo. Ainda não foi possível analisar as culturas em meio líquido devido à dificuldade de se estabelecer um crescimento destes organismos neste modelo de cultivo. 41

43 R09-Estudo da interação da cadeia variável pesada de imunoglobulina associada a cadeia VpreB com ssdna Ronny Petterson dos Santos Araujo; Marcelo De Macedo Brígido Laboratório De Imunologia Molecular Os anticorpos são moléculas proteicas do sistema imune humoral dos vertebrados imprescindíveis para a defesa do organismo. As regiões determinantes complementariedade (CDRs) dos anticorpos são fundamentais na determinação da interação com o antígeno. Os anticorpos ligantes ao DNA são ferramentas importantes no estudo do desenvolvimento de linfócitos B e de algumas doenças autoimunes, como lúpus eritematoso sistêmico. Em estudos anteriores de nosso grupo, uma análise de sequências da cadeia variável pesada (VH) de anticorpos em banco de dados indicou que um grupo específico da cadeia variada pesada, VH10, apresenta uma característica intrínseca de ligação ao DNA. Na direção contrária, a família VH4 não apresenta nenhuma sequência com afinidade a ácidos nucléicos, por esse motivo essa família vem sendo utilizada como controle nas pesquisas do grupo. Comparações das sequências primárias de VH10 e VH4 mostram diferenças significativas na região da CDR H2, além disso, essa região se mostrou fundamental para ligação ao DNA em modelos de BV Pretende-se, portanto, construir quatro scfvs com as cadeias pesadas VH4 e VH10 com modificações nas CDR H2, conjugada com a cadeia leve característica de células B em desenvolvimento (SLC) e testar a afinidade dessas moléculas ao DNA fita simples (ssdna). Essas moléculas serão sintetizadas por expressão heteróloga em bactérias. Para mensurar a afinidade das moléculas ao ssdna serão realizados experimentos de ressonância plasmônica no equipamento Biacore (GE) e ELISA. Esse conhecimento deve propiciar insights sobre as forças que regem essa interação, além de informações sobre os processos de desenvolvimento de células B e o surgimento de algumas doenças autoimunes. 42

44 R10-Análise molecular/evolutiva do processo de envelopamento múltiplo em baculovírus Miguel de Souza Andrade; Fernando Lucas Melo; Daniel Ardisson-Araújo; Bergmann Morais Ribeiro Laboratório Do Baculovírus Baculoviridae é uma família de vírus de DNA fita dupla (80 a 180 kpb), que infectam insetos da ordem Diptera, Hymenoptera e Lepidoptera e são classificados em 4 gêneros: Alphabaculovirus, Betabaculovirus, Gamabaculovirus e Deltabaculovirus. Baculovírus apresentam duas formas infectivas distintas: os vírions derivados de oclusão (ODV, do inglês occluded derived virus ) e os vírions brotados (BV, do inglês budded virus ). Os primeiros são responsáveis pela infecção inicial no intestino do inseto, enquanto que os BVs são responsáveis pela transmissão de célula a célula (infecção sistêmica). Os baculovírus do gênero Alphabaculovírus podem possuir ODVs com apenas um capsídeo por envelope, chamados de single nucleopolyhedrovirus (SNPV) ou ODVs com vários capsídeos por envelope, multiple nucleopolyhedrovirus (MNPV). Duas hipóteses podem explicar uma possível vantagem dos vírus MNPVs: (i) a presença de mais de um capsídeo por envelope pode proporcionar a recuperação de genomas danificados ou defectivos por meio de recombinação; (ii) a entrada de mais de um capsídeo na célula intestinal simultaneamente pode favorecer um espalhamento mais rápido da infecção. Neste trabalho, a partir da análise dos genomas de baculovirus sequenciados, nós propusemos a hipótese de que o gene ac134 (94k) é provavelmente, o responsável pelo fenótipo MNPV. Construímos um baculovírus recombinante que expressa a 94k fusionada a um peptídeo marcador (HA) para citolocalização da proteína e, também outro recombinante com o gene ac134 deletado, com o objetivo modificar o fenótipo para SNPV. Além disso, construímos um vetor de expressão do gene ac134, que foi transfectado em células infectadas com um vírus SNPV com o intuito de alterar o fenótipo deste para MNPV. Atualmente, amostras de células infectadas com ambos os vírus estão sendo processadas para observação em microscópio eletrônico de transmissão para confirmação da hipótese proposta. 43

45 R11-Análise e comparação de duas β-glicosidases no sinergismo de enzimas celulolíticas microbianas na degradação da fração de celulose de bagaço de cana de açúcar Amanda Gregorim Fernandes, Gregorim Amanda Fernandes; Lorena Cardoso Cintra; Paula Fabrícia Fonseca De Faria; José Márcio Poças. Lignocelulose é o principal componente estrutural da parede celular de plantas. Ela é composta por três principais componentes: celulose, hemicelulose e lignina. As celulases constituem um complexo de enzimas envolvidas na conversão da celulose a glicose. O custo elevado dessas enzimas é um obstáculo para que o processo de produção de bioetanol se torne economicamente viável. Para a conversão de celulose a glicose três enzimas são requeridas: endoglucanases (EGs), celobiohidrolases (CBHs) e β-glicosidases (BGLs). Uma das enzimas produzidas pelo fungo Humicola grisea var. thermoidea, a BGL4, além de ser termoestável, possui alta atividade para celobiose e não é reprimida por seu produto no meio reacional, a glicose. A linhagem 9A02S1 de Penicillium echinulatum produz altos níveis de β-glicosidases com potencial uso na transformação da celulose a glicose. Este trabalho tem como objetivo produzir, expressar e purificar as enzimas recombinantes HgBGL4 e PeBGL1 na levedura metilotrófica Pichia pastoris. Para o isolamento do gene HgBGL4 foi realizado uma indução da produção de celulases pelo fungo em diferentes fontes de carbono. A partir da indução foram coletados micélios para uma posterior extração de RNA totais e amplificação do cdna por RT-PCR com primers específicos utilizando farelo de trigo a 2% (FT 2%) como indutor, e em seguida, clonado em vetores de expressão de P. pastoris. Enquanto isso, o cdna PeBGL1 foi sintetizado quimicamente de acordo com os dados obtidos na biblioteca em situação de indução de celulases desse fungo e posteriormente clonado em vetor de expressão de P. pastoris. Os vetores produzidos foram transformados nas linhagens GS115 e SMD1168 de P. pastoris. Análises dos melhores transformantes produtores das enzimas recombinantes estão sendo avaliados. Após análises das características bioquímicas iremos propor a viabilidade de comporem misturas enzimáticas para hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar. 44

46 R12-Study of the Lignocellulosic Potential in the Fungus Aspergillus terreus Grown on Agro-industrial residues. Camila Louly Corrêa; Edivaldo Ximenes; Eliane Noronha; Robert Miller Microbiologia Increased demands in global energy consumption, together with concerns over environmental pollution are driving the development of new energy sources to meet future energy demands. Aspergillus terreus is a filamentous fungus producing enzymes with a wide range of technological applications in textile, food and biofuel industries. This study aims to characterize lignocellulolytic enzyme production in A. terreus grown on culture media containing agro-industrial residue (sugarcane bagasse, soy and cotton) and analyse differential gene expression in response to growth on these carbon sources. Enzymatic production in A. terreus grown at 280C in minimal liquid medium supplemented with yeast extract was evaluated for each carbon source (1% concentration) over a nine day period. Enzyme assays for xylanase, endoglucanase, mannanase, pectinase and FPase were conducted according to the DNS method. Whilst xylanase enzyme activity reached a plateau at 48 hours for all three carbon sources, xylanase production was more significant for the media containing sugarcane bagasse and soybean hulls, reaching 1.0 (IU ml-1). The production of pectinase and FPase was more prominent in the medium containing soybean hulls, reaching 0.5 and 2.0 (IU ml-1), respectively. Isolation of total RNA from A. terreus was performed according to the method of Brasileiro & Carneiro, cdna library preparation in ongoing for fungal mrna from A. terreus cultured under three carbon sources using the kit RNA TruSeq Sample preparation v2 Kit (Illumina, Inc.) according to manufacturer's instructions. Characterization of the transcriptome of this fungus offers promise for gene discovery applicable in second generation biofuel development. 45

47 R13-Interações Tospovírus-Planta: Caracterização estrutural de proteínas de tospovírus e identificação de interações entre proteínas virais e celulares Rayane Nunes Lima; Faheem, Muhammad; Barbosa, João Alexandre Ribeiro Gonçalves ; Melo, Fernando Lucas; Resende, Renato De Oliveira. Virologia Vegetal Uma infecção viral eficiente requer interações entre proteínas virais e proteínas do hospedeiro. Essas interações proteína-proteína alteram a rotina da célula para promover todos os eventos do ciclo infectivo de um vírus. As proteínas virais são multifuncionais e também interagem entre si formando oligômeros, como no caso de algumas proteínas dos tospovírus. Tospovirus (ssrna, trissegmentado) é o único gênero da família de arbovírus animais, Bunyaviridae, que infectam vegetais, e é o segundo grupo de vírus mais importante para a agronomia mundial, causando prejuízos econômicos em hortaliças, grãos e plantas ornamentais. Ao contrário dos vírus animais da família Bunyaviridae e de outros vírus vegetais, pouco ainda se sabe a respeito das interações entre as proteínas dos tospovírus com seus vetores e seus hospedeiros, e a ausência de um sistema de genética reversa para tospovírus é um fator limitante para o avanço de estudos relacionados ao processo infectivo desses vírus. Portanto, é importante o estudo de suas estruturas, seus domínios funcionais e suas interações com as proteínas das plantas hospedeiras, para elucidar os mecanismos envolvidos na infecção viral e os mecanismos de interação planta-vírus. Não existe nenhuma informação estrutural dessas proteínas para nenhuma espécie desse gênero. Com esse propósito, o presente projeto visou elucidar as estruturas tridimensionais por modelagem teórica e analisar os possíveis domínios funcionais da proteína NP de GRSV, uma proteína estrutural que forma oligômeros que circundam o RNA para compor o ribonucleocapsídeo (RNP). O alinhamento das sequências de aminoácidos das NPs de GRSV e de La Crosse virus (LACV), um Orthobunyavirus, mostrou que elas possuem uma identidade de aproximadamente 17%, fornecendo evidências para a montagem da estrutura tridimensional e análises dos domínios funcionais da NP de GRSV a partir da NP de LACV. A partir do modelo tridimensional da NP de LACV, foi possível construir um modelo tridimensional para NP de GRSV pela técnica de modelagem estrutural por homologia. A NP de GRSV possui quatorze alfa-hélices e uma folha beta. O braço N-terminal é composto pelos aminoácidos 1 a 32 e o braço C-terminal é composto pelos aminoácidos 224 a 258. Os outros aminoácidos (33-223) estão enovelados formando uma estrutura globular com uma cavidade formada por aminoácidos hidrofóbicos e positivos que interagem com o RNA. Os resíduos de aminoácidos F23, Q61, T92, R94, R95, Y184, K192, são candidatos para o domínio de interação com o RNA. Esses estudos resultarão em conhecimentos sobre as funções biológicas da NP e suas implicações para a infecção resultando em progressos para as estratégias aplicadas de controle, atualmente 46

48 limitadas pela escassez de conhecimento científico detalhado sobre as interações tospovírus-planta e tospovírus-inseto. 47

49 R14-A model for the interaction between cadherin-like receptor BT-R1 and three Cry1a family toxins from Bacillus thuringiensis Diogo Martins de Sá; Maria Fátima Grossi De Sá Limpp Embrapa Cry1Ab is widely described as toxic to M. sexta larvae and extensive substitution of loop residues in domain II suggests that this region is responsible for binding to receptor. Cry1Aa, Cry1Ab, and Cry1Ac demonstrate 82 to 90% amino acid identity to one another and the interaction with cadherin-like receptor has been described as an important step for the correct removal of alpha-helix1 in domain I. We used homology modeling, protein docking and molecular dynamics to simulate the interaction between Manduca sexta's cadherin-like receptor BT-R1 and Bacillus thurigiensis' Cry1Ab toxin. For molecular modeling, we used LOMETS and Phyre servers, as well as MODELLER 9.10 program. Docking was performed using ClusPRO Metaserver and molecular dynamics was carried out using Gromacs Analyses using LigPlus program server permitted us to find conserved amino acids and regions, in both BT-R1 and Cry1A family toxins, responsible for receptor-ligand binding. Two models were obtained and seven binding regions have been identified for both Cry1Ab and BT-R1 in each model, with slight diferences. We were able to infer the most important residues participating in hydrogen bonds during receptor-ligand interaction. To further investigate the importance of each binding region and validate our model, we synthesized peptides corresponding to each of these regions. Preliminary result for one model show that loop 3, notorious for receptor recognition, binds a region previously unidentified in Manduca sexta cadherin-like receptor. Most interestingly, binding occurs with over 300-fold less peptide concentration in ph 9.0 than in ph 7.0. The physiological ph in the insect midgut is approximately 9.0, which corroborates that at least one of our models reproduces in-vivo interaction. Ongoing work will show if both models are plausible to occur, or if one of them is preferable to the other. Principal compounds analysis of our model may preview major conformational changes after binding and permit infer why alpha-helix 1 is cleaved. Overall, these models allowed the observation of the toxin's behavior when binding to receptor. Moreover, they help clarify the participation of Ca+ ions and alpha-helix 1 in the interaction between Cadherin and Cry toxins, as well as infer the function and importance of some amino acids present in the binding site and their role in alpha-helix 1 cleavage. 48

50 R15-Validação da estabilidade de estruturas de RNA fita dupla para uso no silenciamento gênico de insetos praga: avaliação na planta e no inseto alvo Rayssa Almeida Garcia; Leonardo Lima Pepino De Macedo, Danila Cabral Do Nascimento; Maria Fátima Grossi De Sá. Interação Molecular Planta Praga A cotonicultura é uma das principais commodities agrícolas, sendo, o Brasil, o quinto maior produtor mundial de algodão. Entre as diferentes pragas da cultura do algodão, o bicudo-do-algodoeiro é o inseto-praga mais destrutivo, sendo de hábito endofítico, o que dificulta seu controle pelo uso de agrotóxicos. Através da biotecnologia, um dos métodos alternativos de controle de insetos é o silenciamento gênico por meio do RNA interferente. Contudo, em insetos-praga, o mecanismo de RNAi não é muito esclarecido e a liberação do RNA dupla fita no inseto não é eficaz, em decorrência da clivagem do dsrna alvo na planta e a ação de nucleases no intestino do inseto. Uma vez expresso na planta, o ideal seria que o inseto assimilasse o dsrna alvo na forma não clivada e que este fosse processado somente nas células do inseto. Visando avaliar a estabilidade das moléculas de dsrna em insetos, foram propostos desenhos de dsrna com estruturas secundárias, baseadas na arquitetura de viróides, para estudar a estabilidade do RNA e foram selecionadas três nucleases intestinais do bicudo para serem validadas. A molécula de dsrna foi tratada com homogenato intestinal do inseto adulto para analisar sua degradação pela ação de nucleases intestinais do inseto. A expressão das nucleases foi analisada em diferentes partes do intestino da larva e do inseto adulto, além da carapaça. As nucleases foram silenciadas nos bicudos adultos, por microinjeção, e sua expressão foi analisada após 48 e 148 horas. A expressão das nucleases diminuiu, consideravelmente, após 48 e 148 horas do silenciamento gênico e o dsrna tratado com homogenato intestinal de insetos silenciados com 48 horas demonstrou alta redução na degradação do RNA. Entre as moléculas de dsrna estabilizado com arquitetura de viróide, uma foi localizada no cloroplasto e outra no núcleo de plantas de Arabidopsis thaliana. Os dados aqui gerados contribuem para o conhecimento do mecanismo de RNAi em insetos e demonstram que as moléculas de dsrna estudadas em plantas de A. thaliana foram estáveis e com potencial de serem aplicadas no controle de insetos-praga, pela tecnologia do RNAi. 49

51 R16-Investigação da Interação do Sevoflurano com o Canal Iônico Kv1.2 Juliana Mayumi Hosoume; Caio Silva Souza; Manuel Covarrubias; Werner Treptow Lbtc - Laboratório De Biologia Teórica E Computacional Os canais iônicos apresentam papel central nas características elétricas celulares. Essas proteínas de membrana são responsáveis pela geração e propagação de potenciais de ação em neurônios. Diversos estudos mostram a suscetibilidade dos canais iônicos das famílias Kv e Nav à modulação por anestésicos gerais. A fim de investigar os detalhes moleculares dos mecanismos de analgesia, é estudada a intricada interação entre moléculas anestésicas e canais iônicos dependentes de voltagem. Para tanto, foram utilizados docking e cálculos de energia livre baseados em dinâmica molecular para investigar sítios putativos de ligação do sevoflurano, em específico. O ligante foi confrontado a um conjunto de estruturas do Kv1.2 e Kv1.2- G329T equilibrados em membrana, tanto na conformação aberta, quanto na fechada. A partir do complexo anestésico-canal, foram realizados cálculos de energia livre para obtenção das afinidades sítios específicas do ligante. Dos resultados obtidos pelo Vina, notou-se a ligação de sevoflurano a quatro diferentes regiões do canal, denominadas sítios 1-4. Os sítios 1, 2 e 3 estão localizados na região transmembrânica do canal no linker S4-S5 e na região de interface S5-S6 de subunidades adjacentes, enquanto o sítio 4 é encontrado na face extracelular do canal, próximo ao filtro de seletividade. Em especial, o sítio 2 é situado ao lado do aminoácido mutado G329T. Pelo método do LIE, foram obtidas energias de interação do sevoflurano com cada um dos sítios. Em especial o sítio 4 apresenta energias favoráveis e, por meio da manutenção do estado ativo, é considerado como sítio putativo responsável pelos efeitos de potenciação no Kv1.2. Em contraste, os dados sugerem o sítio 3 como sítio putativo relacionado à potenciação aumentada no canal mutado, via estabilização da conformação aberta. Por conseguinte, os presentes dados revelam importantes regiões de interação anestésico/proteína, favorecendo futuros estudos experimentais relacionados a este assunto. 50

52 R17-Caracterização lipopeptídeos antimicrobianos produzidos por Paenibacillus sp. Rosiane Andrade da Costa; Ricardo Henrique Kruger; Beatriz Simas Magalhães; Cristine Chaves Barreto. Bactérias do gênero Paenibacillus têm sido isoladas nos mais diversos ambientes e são citadas por sua capacidade de produzir compostos antimicrobianos de amplo espectro. Trabalhos relatam esses compostos como sendo lipopeptídeos de variadas massas moleculares, estáveis e de baixa toxicidade, sendo promissores como novos antibióticos. Uma cepa de Paenibacillus foi isolada do solo do cerrado e experimentos preliminares demonstraram atividade antimicrobiana. O objetivo deste trabalho foi identificar as moléculas responsáveis pela atividade antimicrobiana e avaliar seu potencial. A bactéria foi cultivada em caldo nutriente a 37 C e 200 rpm por 40 horas. As células foram removidas e o sobrenadante foi extraído três vezes com butanol. A fase aquosa foi desprezada e a fase orgânica foi liofilizada e em seguida ressuspendida em água MilliQ e purificada em HPLC. As frações purificadas foram então coletadas e a atividade antimicrobiana avaliada por ensaio de difusão em placas. As frações ativas foram então analisadas por MALDI-TOF/MS e sua concentração inibitória mínima (MIC) foi determinada contra Escherichia coli pelo método de microdiluição. As frações ativas correspondem às massas 1087 e 1101 m/z. Essas massas são consistentes com lipopeptídeos antimicrobianos da família das Pelgipeptinas previamente descritos em P. elgii. Essas frações foram então fragmentadas por MS/MS, obtendo-se a seguinte sequência de aminoácidos: Dab1- X2-Dab3-Phe4-Leu/Ile5-Dab6-Val7-Leu/Ile8-Ser9 ligado ao ácido graxo C7H12O2, onde X representa Val para o lipopeptideo 1087 m/z e Leu/Ile para o Ou seja, as duas frações apresentam praticamente mesma sequência, diferindo apenas pela substituição de Val por Leu/Ile na posição 2 da sequência. Ambos os lipopeptídeos exibiram MIC contra E. coli igual a 29 μm. Paenibacillus sp. produz pelo menos dois lipopeptídeos pertencentes à família das Pelgipeptinas. A diferença nas estruturas desses dois lipopeptídeos não é crucial para a atividade antimicrobiana uma vez que ambos apresentaram o mesmo MIC. Mais estudos devem ser conduzidos a fim de avaliar o potencial antimicrobiano dessas moléculas contra outros patógenos. 51

53 R19- Selection profiles in the recent evolutionary history of baculoviruses. Jhon Eric Alves Fernandes; Miguel De Sousa Andrade; Bergmann Morais Ribeiro; Fernando Lucas Melo Laboratório De Baculovírus The major evolutionary forces underlying the evolution of virus from the family Baculoviridae are both horizontal gene transfer and gene duplication. Such events expose affected genes to new selective pressures that can drive the construction of novel niches by viruses. However, in the case of intraspecific contexts, those events are rarer and mutational change might be the force that drives the virus evolution. Thus, a genome-wide analysis of selection patterns in different isolates of the same virus species may reveal how baculoviruses respond to new environments at nucleotide level, and also, the potential role of mutations on short-term evolution. To achieve this information, we obtained sequences from viruses with more than four isolates completely sequenced and extracted ORFs those are present in all the isolates with at least three substitution. For the trimmed sequences obtained, we calculated the dn/ds ratio by using the CODEML program within the PAML package under six different models of codon evolution and performed likelihood ratio tests for pairs of nested models in order to choose which best fit to the data. Although this assumption is unrealistic, most of genes from all viruses, except BmNPV, fit well in the model of one category of dn/ds for the entire gene. The estimations under this model show differences between virus with a single nucleocapsid per virion (SNPV) and with multiple nucleocapsids per virion (MNPV). The results agree with the hypothesis that SNPV are under a more severe selective pressure, since there is just one copy of the genome per infection, whereas the MNPV carries many copies and thus, new mutations in MNPV genomes have a nearly neutral nature because of the mutational compensation. Moreover, selection analysis reveals that mta-1 and pp-31 in SeMNPV and orf-55 and orf-63 in BmNPV are under positive selection. 52

54 R20-Avaliação do papel de micrornas regulatórios na resposta imune inata à infecção por Paracoccidioides brasiliensis Marco Antônio de Oliveira; Lorena Da Silveira Derengowski; Daniel Paiva Agustinho; Ildinete Silva Pereira. Biologia Molecular Durante o processo de interação patógeno-hospedeiro ambos os organismos envolvidos sofrem uma ampla reprogramação genética, o que vem mostrando ser crucial para o estabelecimento da patogenia. Dentre os inúmeros genes com expressão alterada no hospedeiro encontram-se aqueles que codificam micrornas (mirnas), um grupo de pequenas moléculas de RNA regulatórios atuantes nos mais diversos processos celulares, incluindo a regulação de respostas inflamatórias. Embora vários trabalhos venham mostrando a importância de mirnas na resposta imune de hospedeiros mamíferos a bactérias e vírus, pouco se sabe a respeito do papel desses reguladores em infecções fúngicas. Nesse sentido, buscamos analisar o papel de mirnas na resposta imune inata de hospedeiros murinos suscetíveis e resistentes à infecção por Paracoccidioides brasiliensis, o agente etiológico da Paracoccidioidomicose (PCM), considerada a micose sistêmica de maior prevalência na América Latina. Os ensaios de infecção foram realizados utilizando-se macrófagos peritoneais murinos das linhagens A/J e B10.a, resistentes e suscetíveis à PCM, respetivamente, e leveduras do isolado Pb18 de P. brasiliensis. Células hospedeiras foram cultivadas por 6 horas em presença ou ausência de leveduras na proporção 2:1 (macrófagos:leveduras). Após esse período de interação o sobrenadante das culturas foi coletado para dosagem de citocinas por meio de ELISA e o RNA dos macrófagos foi extraido para avaliação das variações nos níveis de transcritos de cinco mirnas - 125b, 132, 146a, 155 e por RT-qPCR. Os níveis de pri-mir 155 e pre-mir 155, moléculas precursoras desse mirna maduro, também foram avaliados com o objetivo de analisar o efeito da infecção sobre diferentes etapas no processo de biogênese do mirna. Todos os mirnas avaliados mostraram um aumento no acúmulo de transcritos em resposta à infecção fúngica por P. brasiliensis, nas duas linhagens de camundongo utilizadas. Esses resultados sugerem, pela primeira vez, a participação de mirnas na regulação de vias envolvidas na resposta imune inata à P. brasiliensis. Dando continuidade aos estudos serão avaliados os níveis de mrnas alvos dos mirnas selecionados, assim como a realização de ensaios com inibidores de mirnas para avaliação de seu papel funcional na resposta imune inata à paracoccidiodomicose. 53

55 R21-Biologia de sistemas para estudo comparativo de leveduras fermentadoras de xilose Henrique César Teixeira Veras; Gabriel Da R Fernandes; João Ricardo M. Almeida; Nádia Skorupa Parachin. Laboratório De Genética E Biotecnologia - Lgb (Embrapa Agroenergia) O etanol resultante da biomassa lignocelulósica é uma das opções para obtenção de energia renovável. As leveduras que são utilizadas na indústria do bioetanol, têm diferentes capacidades metabólicas para converter açúcares derivados da biomassa. A Saccharomyces cerevisiae, principal levedura utilizada em bioprocessos, apresenta preferência por açúcares hexoses, principalmente glicose. Assim, é especialmente desejado a identificação e/ou modificação de leveduras que realizem fermentação de xilose, a pentose mais abundante presente na biomassa lignocelulósica, segunda maior fonte de carboidrato do planeta. Logo, a fermentação de xilose tem importância tanto para aumentar a produção de etanol, como para diminuir os resíduos da agricultura. Desta forma, a detecção de diferentes características fisiológicas e moleculares relacionados ao metabolismo deste açúcar em diferentes leveduras é de grande relevância. Portanto, nosso objetivo é avaliar a capacidade de fermentação realizadas por diferentes leveduras utilizando xilose como fonte de carbono. As leveduras Scheffersomyces stipitis; Spathaspora passalidarum; Spathaspora arborariae e Candida tenuis foram cultivadas em meio mínimo 2.5X, suplementado com xilose 40g/L e mantidas sob condições de aerobiose e microaerobiose. Os cultivos foram iniciados com OD600 de 0,5. As culturas foram mantidas em agitação (180 rpm) e temperatura (28 C) constantes, em intervalos regulares foram coletados amostras para monitoramento do crescimento e quantificação por HPLC do substrato consumido e formação de produtos. Além disso, durante a fase exponencial de crescimento das leveduras, foram coletadas amostras para extração de RNA para posterior sequenciamento e avaliação das atividades enzimáticas. Paralelamente, as vias metabólicas das leveduras foram montadas com o auxilio da base de dados KEGG e visualizadas através da ferramenta IPATH. Comparando com os cultivos aeróbicos que apresentaram OD final entre 15-20, os bioprocessos em condições microaeróbicas apresentaram OD de 3 a 4 vezes menores. Os resultados observados com menor taxa de crescimento, apresentaram maior formação de etanol e foram vistos principalmente nas leveduras S. stipitis e S. passalidarum. A montagem das vias metabólicas demonstrou que a levedura S. stipitis apresenta enzimas distintas. Isto pode explicar a maior adaptabilidade dessa levedura nos bioprocessos fermentativos de xilose. No entanto, a S. passalidarum apresentou as maiores taxas de formação de etanol. Deste modo, nossas perspectivas são de que com a integração dos dados fisiológicos, de sequenciamento, de atividades enzimáticas e compostos metabólicos quantificados possamos construir modelos matemáticos de 54

56 fluxos metabólicos visando a identificação de novos alvos moleculares que aumente eficiência no consumo de xilose e formação de etanol. 55

57 R22-Perigonia lusca single nucleopolyhedrovirus (PeluSNPV) genome reveals acquisition of a peculiar nucleotide metabolism fused gene that changed a recombinant prototypic baculovirus in vitro infection Daniel Mendes Pereira Ardisson de Araújo; Fernando Lucas Melo; Rollie J. Clem; Daniel Sosa-Gómez; Bergmann Morais Ribeiro Laboratório De Baculovírus Viruses can improve their fitness by acquiring new genes mostly large dsdna viruses whose mutational changes are less usual. In this work, we accessed and described the genome of the baculovirus Perigonia lusca single nucleopolyhedrovirus (PeluSNPV) and we characterized a nucleotide metabolism fused gene (NMG) that was found to be acquired independently by distantly related baculoviruses. The gene was able to accelerate Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) in vitro infection and augment yields of occlusion bodies. PeluSNPV is a novel Group II alphabaculovirus with a genome of 132,924 bp long and a G+C content of 44.1 %. We found 145 putative ORFs coding for polypeptide with at least 50 amino acid residues. Only 18 genes were found to be unique. PeluSNPV is closely related to ClbiNPV, another sphingid-infecting alphabaculovirus. We performed phylogenetic analysis and molecular characterization of the independently acquired NMG, pelu112. The amino-terminal is related to the Orf138 of Lymantria dispar multiple nucleopolyhedrovirus and the carboxy-terminal to a dutpase (dut gene). Both enzymes have separately-encoded homologs in a few other baculovirus species. Therefore, the fact that these viruses acquired the same fused NMG implies it might improve virus fitness. The fused gene is present only in PeluSNPV (pelu112), Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (op031) and Erinnyis ello granulovirus (ErelGV) (erel005). When erel005 and pelu112 genes were cloned into an NGM-lacking baculovirus AcMNPV, the recombinants produced genomic DNA, virus progeny, and two virus genes (IE-1 and GP64) earlier during in vitro infection and the yields of OB were increased when compared to the virus control. ErelGV-derived gene was found to be predominantly cytoplasmic while PeluSNPV-derived gene localized to the nuclear ring zone. These results suggested that decreased dutp levels and dttp production may be beneficial for AcMNPV genome replication and gene expression in cultured cells. Moreover, genome sequencing of new baculovirus species and gene content studies can lead to the understanding of both evolutionary history and strategies to improve baculoviruses as agents for pest management and protein expression. 56

58 R23- Construção e Expressão de Anticorpos que reconhecem o antígeno CD20 humano. Tarcila Zuleica Zaparolli Lopes; Marcelo De Macedo Brígido; Galina Gulis; Andréa Queiroz Maranhão. Imunologia Molecular O trabalho proposto contribui com o projeto ANTI-CD20 - DESENVOLVIMENTO DE TECNOLOGIA DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS PARA O ANTÍGENO LINFOCITÁRIO HUMANO CD20, financiado pelo BNDES e executado em parceria com a empresa: Laboratório Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos Ltda. Nesse trabalho objetiva-se o desenho e a construção de anticorpos humanizados recombinantes específicos para antígeno humano CD20, produzindo-os na forma de fragmentos FvFc (scfv fusionado aos domínios CH2CH3 de IgG1 humana) e testando a sua capacidade de realizar os mesmos mecanismos efetores do anticorpo monoclonal quimérico Rituximabe (MabThera, Rituxan). Resultados: Primeiramente realizamos o desenho gênico de versões humanizadas dos domínios variáveis leve e pesado do Rituximabe, propondo-se a sequência dos genes a serem sintetizados quimicamente no vetor pbsk. Foram selecionadas três versões scfvs e transferidas para o vetor de expressão em células de mamíferos pcomiresdelta600: versão A (Vk A27VH1-46), versão O (V am4/ humanvh1-46) e, versão L (V kl1/ humanvh1-46). Após a finalização das etapas de clonagens, células de ovário de hamster chinês versão K1 foram utilizadas como sistema de expressão e produção de anticorpos. As células foram mantidas na presença do antibiótico geneticina para a seleção da população mista de clones de células CHO-K1 produtores dos FvFcs recombinantes. Os sobrenadantes de cultura foram avaliados quanto á presença de FvFc por meio de imunodetecção ELISA. Posteriormente, foram submetidos a uma cromatografia de afinidade, utilizando a coluna HITRAP protein A HP. Após a purificação, as frações coletadas da coluna, foram analisadas quanto ao grau de pureza destes fragmentos por meio de SDS- PAGE e Wersten-Blot. Perspectivas: Determinar a capacidade de ligação das proteínas recombinantes por meio de citometria de fluxo, e avaliar as funções biológicas dos FvFcs recombinantes: ADCC, CDC e apoptose. 57

59 R24-Inativação do Filtro de Seletividade de um Canal de Potássio Letícia Stock Vieira; Werner Treptow Laboratório De Biologia Teórica E Computacional Canais iônicos (CIs) são proteínas transmembrânicas (TM) que delimitam poros hidratados, conectando meios intra e extracelulares. Fundamentais a uma variedade de fenômenos biológicos, CIs permitem o fluxo de íons segundo um gradiente eletroquímico e são capazes de regular a condução via mecanismos chamados gating. Um dos mecanismos de regulação da condução relaciona-se à flexibilidade do filtro de seletividade (segmento que discrimina íons atravessando o CI). Tal mecanismo é denominado inativação lenta (IL). A IL regula a excitabilidade celular, propriedades de disparo bem como adaptação dos potenciais de ação. Como resultado, defeitos nesse controle implicam em doenças relacionadas à excitabilidade celular. Apesar de a existência de um mecanismo de gating no FS ser corroborada por diversos estudos experimentais de mutagênese e eletrofisiologia, aspectos estruturais atômicos desse mecanismo ainda são pouco caracterizados. Assim, no contexto do projeto aprovado pelo PPG em Biologia Molecular, este trabalho objetiva caracterizar o mecanismo de gating via IL em CIs. Para os fins estabelecidos, simulações de dinâmica molecular e métodos avançados de amostragem (umbrella sampling) são empregados. Transições moleculares envolvendo torções no FS são responsáveis pelo mecanismo de controle da condução IL. Com base em estudos de simulações longas, amostrando diversas conformações do FS, propõe-se aqui um potencial estado inativado para o CI humano seletivo a K, Kv1.2. O estado inativo é estável nas escalas de tempo até então amostradas. Ainda, validação da estrutura proposta é feita via cálculos de energia livre relativos à passagem do íon K pelo CI inativado. De fato, tal estrutura se mostra impermeável. Estudos estão em andamento para K serão estendidos a CIs de Na e Ca. Ainda, conhecimento estrutural atômico da IL de CIs possibilita uma melhor compreensão de disfunções relacionadas ao mau funcionamento desse mecanismo. 58

60 R25-The role of type VI secretion system of gram-negative bacteria in lipid antigen presentation through CD1 molecule Raquel das Neves Almeida; Rafael Corrêa ; Thaís Amanda Pinho-Silva ; Dalila Juliana Silva Ribeiro; Wanderley Dias Da Silveira; Tatiana Amabile De Campos; Kelly Grace Magalhães. Laboratório De Imunologia E Inflamação Type VI secretion systems (T6SS) are multi-component machines encoded within genomes of most gram-negative bacteria and are considered as potential virulence factors. The T6SS is composed of proteins such as Icmf, Hcp and Clvp, which can mediate transport of effector molecules from the bacteria to the host and can enable survival of the pathogen. Therefore, the acknowledgment of this system is important to understand better host pathogen interactions. Moreover recognition and antigen presentation is an important factor in host immunity. The CD1 molecule is involved in the antigen presentation beyond MHC and its discovery provides a new perspective on microbial immunity by showing how T cells can recognize lipid antigens from pathogens as well as self-lipids. Here we have evaluated the modulation of CD1 expression during the infection caused by Escherichia coli 362 and the role of type VI secretion systems in this process by using E. coli knockouts strains for T6SS proteins: Icmf, Hcp and ClpV. In order to verify if the T6SS is involved in lipid antigen presentation through CD1 molecules, human monocytes as wells as murine macrophages were infected with different E. coli strains and CD1 expression were analyzed. The infections were performed with E. coli wild type (362) and knockout strains for the proteins that comprise the T6SS (Icmf-/-, Hcp-/- and ClpV-/-). We analyzed the expression CD1 group I and II by Flow Cytometry. Our data showed that E. coli wild type inhibit the expression of CD1 molecules in both cell types, and consequently the presentation of lipid antigen. In contrast, the knockouts strains Icmf- /-, Hcp-/- and Clvp-/- triggered an up regulation of CD1a and CD1d expression isoforms. Taken together our data demonstrated that T6SS can be used by gramnegative bacteria as a mechanism to evade host immune response by reducing the expression of lipid antigen presentation through CD1 molecules and consequently the lymphocyte TCD8+ activation, which can play an important role in pathogen survival. 59

61 R26-Estrutura do complexo entre o peptídeo PTRY e tripsina João Paulo Campos Fernandes; Sônia Maria De Freitas; João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa. Biofísica Molecular Estrutura Serino proteases foram classificados em muitas famílias diferentes entre eles pertence a classe de inibidores Bowman-Birk inibidor (BBIs).Os inibidores da família BBI têm sido descritos como agentes supressores de carcinogênese em diversos órgãos e tecidos. Neste estudo foi utilizado o inibidor família dos BBIs extraído de Vigna unguiculata (black-eyed pea trypsin\chymotrypsin inhibitor - BTCI),para estudos estruturais.o BTCI apresenta dois loops reativos que interagem com tripsina e quimotripsina simultaneamente sendo os resíduos Lys26 e Phe53, responsável pela interação com tripsina e quimotripsina,respectivamente. As estruturas cristalográficas do presente inibidor com tripsina no complexo binário e ternário com tripsina e quimotripsina ambos foram cristalizadas e suas estruturas resolvidos e depositada no banco de dados de proteínas (PDB - 2G81 e 3RU4). De acordo com a estrutura resolvida do laço formado pela ponte de ponte dissulfeto Cys24 a Cys32 nos resíduos da sequencia do BTCI, aqui denominado PTRY pode ser claramente identificada como a região responsável pela ligação de alta afinidade e a consequente inibição da tripsina. No presente estudo, utilizamos o peptídeo PTRY sintético em ensaios de cristalização em complexo com a tripsina bovina. Os ensaios de cristalização foram realizados usando o método de difusão de vapor em gota sentada. Os conjuntos de dados de difração de raios-x foram coletados na linha de luz MX2 do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (Campinas, Brasil), em λ = 1,2 Å.O conjunto de dados de difração foi escalona e integrado usando imosflm. A estrutura do complexo do PTRY em complexo foi resolvida por substituição molecular, utilizando a estrutura cristalográfica de tripsina (PDB 4I8H) como modelo de busca. O refinamento da estrutura foi realizado utilizando o programa de software suíte CCP4, PHENIX E COOT. O processamento de dados mostrou uma grupo espacial primitivo P Os valores da célula unitária foram A = 60,39 B = 63,97 C = 69,63. α,β,γ = 90º.A estrutura final foi resolvida a uma resolução de 1,37 Å. 60

62 R27-Desenvolvimento de estratégias baseadas em RNA interferente para resistência ampla a begomovírus em tomateiro (Solanum lycopersicum) Lídia Nascimento Queiroz; Francisco José Lima Aragão Engenharia Genética Aplicada À Agricultura Tropical A cultura do tomate está sujeita a ação de diversos patógenos que afetam a produtividade, sendo que as viroses, especialmente as begomoviroses, são as mais prevalentes na tomaticultura nacional. Os métodos de controle destas viroses envolvem múltiplas aplicações de inseticidas, com o objetivo de eliminar o vetor da doença, a mosca branca. No entanto, esta abordagem de controle possui um custo elevado, além de ser pouco eficiente e poder colocar em risco a saúde tanto de quem manipula os agrotóxicos quanto de quem consome o tomate. As técnicas baseadas na resistência derivada do patógeno têm demonstrado ser uma alternativa eficiente para o controle de viroses em plantas, podendo resultar no silenciamento de um gene importante para o estabelecimento da infecção. O silenciamento gênico pós transcricional (PTGS), desencadeado por moléculas de RNA interferente (RNAi), pode ser induzido por uma construção quimérica contendo fragmento do gene alvo que se deseja silenciar. Neste trabalho objetivamos obter plantas transgênicas de tomate apresentando resistência simultânea a várias espécies de begomovírus por RNAi. Para isso foram construídos cassetes de interferência com sequências conservadas quiméricas do gene rep oriundas de diversas espécies de begomovírus. A proteína REP é essencial para o processo de replicação viral. Estas construções estão sendo validadas em Nicotiana benthamiana, paralelamente ao processo de transformação de tomate cultivar IPA - 6. Os explantes alvo escolhidos para a transformação via Agrobacterium tumefaciens foram cotilédones e hipocótilos provenientes de plântulas de 10 dias germinadas in vitro. Os cassetes contêm o gene marcador de seleção pat, que confere tolerância ao herbicida glufosinato de amônio. A partir da curva de seleção para tolerância ao herbicida foi estabelecida a concentração de 2mg/L para seleção não destrutiva dos genótipos transformados. Até o momento foram obtidas duas plantas putativamente positivas apresentando regeneração parcial in vitro. 61

63 R28-Desenvolvimento de clone infeccioso de Norovírus Humano Layssa Miranda de Oliveira; Tatsuya Nagata Fiocruz (IOC) Virologia Humana Os Norovirus humano (HuNoV) têm sido reportados como os principais causadores dos surtos de gastroenterites de origem viral no mundo. As pesquisas com HuNoV se inserem em um cenário mundial caracterizado por limitações no cultivo desses vírus em cultura de célula e oculta informações essenciais para a elucidação da biologia molecular e estratégias de replicação. As incansáveis tentativas de crescimento em cultura celular têm demonstrado infecção e formação de partículas virais que falham durante a passagem para novas células. Nesse sentido esse trabalho propõem construir um clone infeccioso contendo o genoma inteiro do HuNoV em plasmídeo flanqueado com promotor e terminador eucariótico. O isolado HuNoV GII.4 subtipo 2006b foi cedido pela Fundação Osvaldo Cruz (Dr. Tulio M. Fumian, IOC/FIOCRUZ). Para essa finalidade foram amplificados separadamente com primers específicos as regiões do terminal 5' e do 3'por RT-PCR com a transcriptase reversa Superscript III (Invitrogen) e Phusion High fidelity DNA polimerase (NEB). Os fragmentos de DNA purificados foram clonados em pcr4 TOPO (Invitrogen). O genoma completo foi clonado no pcdna 3.1 (5Kb) utilizando a estratégia do GIBSON ASSEMBLY CLONING (NEB). A transformação com essa construção foi realizada em células de Escherichia coli cepa Stbl4 (Invitrogen) e o seqüenciamento do cdna foi encaminhado para o Macrogen Inc (Coréia do Sul). Para as próximas etapas serão realizados os ensaios de transfecção, bem como as padronizações em células Caco- 2 para a confirmação da infectividade do clone. 62

64 R29-The Electric Fingerprint of Voltage Sensor Domains Caio Silva Souza; Cristiano Amaral; Werner Treptow. Laboratório De Biologia Teórica E Computacional A central paradigm in the subject of cellular excitability is whether or not a dynamic membrane voltage field contributes to the operation of voltage sensing proteins. This issue has challenged an entire generation of scientists because static and dynamic contributions of the field can not be discriminated from electrophysiology measurements. The dilemma imposes that structure-based calculations are required to solve the issue. Here, the dynamic field contribution to the VS energetics was analyzed via electrostatic calculations applied to a number of atomistic structures made available recently. We find that the field is largely static along with the molecular motions of the domain and more importantly, it is minimally modified across VS variants. This implies that sensor domains transfer approximately the same amount of gating charges when moving the electrically charged S4 helix between fixed microscopic configurations. This is a remarkable result meaning that the observed operational diversity of distinct VS domains, including the extension, rate and voltagedependence of the S4 motion, as dictated by the free-energy landscape theory, must be rationalized in terms of dominant variations of its chemical free energy (detailed atom-atom interactions of the domain) rather than modifications of the membrane voltage field. 63

65 R30- Prospecção e caracterização de genes envolvidos na resistência de Arachis stenosperma ao Meloidogyne arenaria Andressa da Cunha Quintana Martins, Larissa Arrais Guimarães; Ana Cristina Meneses Mendes Gomes; Regina Maria Dechechi Gomes Carneiro; Ana Cláudia Guerra De Araújo; Ana Cristina Miranda Brasileiro; Patrícia Messenberg Guimarães; Robert Neil Gerard Miller. O amendoim (Arachis hypogaea L.) é uma cultura alimentar importante, que apesar da grande variabilidade morfológica apresentada entre as suas diferentes cultivares (AABB), apresenta estreita base genética e alta suscetibilidade ao ataque de fitopatógenos. Por outro lado, seus parentes silvestres diploides apresentam maior variabilidade genética, sendo uma potencial fonte de alelos de resistência a doenças e à adaptação a diversos ambientes. Os nematoides das galhas Meloidogyne arenaria raça 1 está dentre as pragas e doenças que acometem e prejudicam a produtividade do amendoim. Em A. stenosperma (V10309) foi observado uma reação de hipersensibilidade (HR) quando o estágio juvenil 2 (J2) de M. arenaria tentou induzir o sítio de alimentação (Proite et al., 2008). Sabe-se que poucos genes dominantes estão envolvidos na HR. E o estudo da expressão gênica tem auxiliado o entendimento dos processos biológicos envolvidos na defesa de plantas, na caracterização de resistências e na identificação de genes que possam estar envolvidos nesses mecanismos de defesa. A tecnologia de microdissecção a laser (LCM - Laser capture microdissection) tem sido utilizada em estudos comparativos de expressão gênica em nível celular, enquanto que sequenciamento massal do transcritoma da interação planta-patógeno, seguido de validação da expressão gênica por qpcr (PCR quantitativo), tem possibilitado a identificação e seleção de novos genes candidatos, os quais serão alvos de estudos posteriores sobre a sua função biológica. Além disso, a produção de plantas transgênicas compostas utilizando Agrobacterium rhizogenes possibilitará a validação da função biológica destes genes, assim como a elucidação das vias metabólicas envolvidas na resistência ao ataque do patógeno. O objetivo deste projeto é identificar, caracterizar e validar in vitro (qpcr) e in planta genes de A. stenosperma envolvidos na resistência a M. arenaria. Para tal, será realizado a LCM de células adjacentes à HR e o sequenciamento do transcritoma desta interação, análise bioinformática dos dados, validação de genes candidatos selecionados in vitro e in planta. Estes genes poderão ser utilizados diretamente para transformação de amendoim e de outras leguminosas, ou serem utilizados como marcadores moleculares em programas de melhoramento genético. 64

66 R31-Caracterização de Anticorpos Humanos Anti- Peçonha de Serpentes do Gênero Bothrops Thompson França Tomatieli; Andrea Maranhão Laboratório De Biologia Molecular Os acidentes ofídicos têm importância médica em virtude da grande frequência e gravidade. Anualmente, ao cerca de 2,5 milhões de pessoas no mundo são vítimas de picadas de serpentes, das quais chegam a perder a vida. Atualmente o principal tratamento em acidentes ofídicos ainda é a soroterapia com antiveneno poliespecífico. A engenharia genética apresenta uma alternativa promissora para criação de novos antivenenos e outros biofármacos. O presente trabalho tem como principais objetivos: Análises das sequencias dos fragmentos de anticorpos a serem produzidos; montagem dos mapas de restrição; envio das sequências para síntese das sequencias propostas; clonagens das sequências dos fragmentos dos anticorpos, murino, humanizado e humano, em vetores de expressão heteróloga de células de mamíferos; Expressão dos Fab s murino, humanizado e humano em uma linhagem de células de ovário de hâmister chinês (CHO-K1); Purificação dos Fab s secretados no sobrenadante de cultura em colunas de purificação específicas e análise da atividade ligante desses fragmentos de anticorpos humanizados à PLA2 de Bothrops atrox. Até o presente momento foram montados dois dos três vetores de expressão propostos (Murino e Humanizado) e confirmadas as clonagens por digestão e perfil de restrição e por PCR, o terceiro vetor (Humano) ainda encontra-se na fase de confirmação da clonagem. Dos dois primeiros encontram-se na etapa de expressão, produção e purificação em células de mamíferos. 65

67 R32-Estudo das teias tróficas do predador Hippodamia convergens (Coleoptera: Coccinellidae) pela análise metagenômica do DNA mitocondrial presente no conteúdo gastrointestinal Renata Velôzo Timbó; Paulo Roberto Queiroz; S. S. Carmen Pires; Edison R. Sujii;, Marcelo M. Brígido; Alfried P. Vogler; Débora P. Paula. O objetivo geral desse trabalho consiste na identificação de presas de agentes de controle biológico para comparação de suas teias tróficas em fazendas em diferentes estágios de manejo agroecológico no Distrito Federal. Desenvolvemos um experimento-piloto para avaliar o potencial de utilizarmos a ferramenta molecular metagenômica para identificação de espécies pela analise do DNA mitocondrial até então ainda não aplicada a esse tipo de estudo ecológico, sendo o coccinelídeo Hippodamia convergens o primeiro predador a ter o DNA do conteúdo gastrointestinal sequenciado, dada a sua abundancia nas áreas. As amostragens ocorreram quinzenalmente entre 10-12/2012 (captura manual entre 9 e 12:00 h) e os espécimens foram imediatamente preservados em etanol 100% e, 4h após a captura, armazenados a -20 C. Fez-se a dissecção do trato gastrointestinal de seis espécimens (de mesma data e local) e a extração do DNA total para construção da biblioteca TruSeq (1ug de DNA) e sequenciamento em Illumina MiSeq (inserto 600 pb, paired-end, 250 bases forward e reverse, 1 lane, cobertura 20 X). Foram obtidas reads (Phred20), as quais fez-se o alinhamento (BLASTn, cut-off: e-value e-100<, identidade 90% em fragmento de b) com o banco de dados contendo 386 mitogenômas da ordem Insecta (GenBank), 7 mitogenômas parciais e genes COI e CtyB de 20 potenciais presas (incluindo predadores intraguilda e H. convergens) do agroecossistema em estudo. Pode-se verificar que 7% do material genético detectado foi mtdna da ordem Insecta, do qual 98,8% correspondeu ao mtdna do próprio predador e 1,2% de 10 espécies pertencentes a quatro ordens (Hemiptera: Aphis sp., Orius sp., Thrips sp., Euschistus sp.; Lepidoptera: Spodoptera sp., Helicoverpa sp.; Coleoptera: Coleomegilla sp., Hippodamia sp., Harmonia sp. e Hymenoptera), incluindo predadores intraguilda. Comprovou-se que a metagenômica do mtdna é uma ferramenta molecular promissora para estudos de Ecologia de Insetos. 66

68 R33-Avaliação dos efeitos imunomodulatório e antiinflamatório de anticorpos monoclonais anti-cd3 e anti-il1β produzidos por Lactococcus lactis em modelo de diabetes autoimune Maria Jose Chiabai; Marcelo Brígido; Anderson Miyoshi; Anamélia Bocca; Andrea Queiroz Maranhao Imunologia Molecular - Lab 1 Os anticorpos monoclonais (mabs) têm se mostrado uma solução tecnológica importante na terapêutica de muitas doenças autoimunes, por meio da geração de anticorpos humanos e humanizados. Anticorpos anti-cd3 parenterais são administrados em humanos desde 1985, quando um anticorpo monoclonal anti-cd3 de camundongo (OKT3) foi aprovado para o tratamento da rejeição aguda de transplante, porém seu uso foi limitado pela resposta antiglobulina e pelo seu potencial de mitogenicidade, que levava à síndrome de liberação de citocinas. Logo, rotas alternativas de administração devem ser investigadas. Assim, o objetivo do projeto é a produção in loco de anticorpos monoclonais com propriedades imunorregulatórias e antiinflamatórias na mucosa intestinal utilizando como veículo cepas de Lactoccus lactis transformantes que poderá ser uma rota terapêutica alternativa de baixo custo com a capacidade de modular o sistema imune ao induzir tolerância de antígenos e controlar processos autoimunes e inflamatórios. Serão sintetizados os genes de fragmentos de dois anticorpos (anti-cd3 e anti-il1β) com papel imunorregulatório e antiinflamatório, e posterior clonagem destes genes em dois sistemas de expressão utilizando um vetor de expressão eucariótico - pvalac - e um vetor de expressão heteróloga - pxies - em L. lactis. A seguir, será administrado L. lactis em camundongos NOD, os quais simulam um modelo de diabetes autoimune e, por fim, serão analisados os efeitos destes dois anticorpos por meio de exames histopatológicos de pâncreas, do perfil da produção de citocinas e da glicemia. Espera-se, por meio de um veículo que utiliza uma bactéria láctica, encontrar uma nova via de administração de anticorpos que serão dados oralmente com ação in loco e que seja clinicamente aplicável para uso crônico por não induzir efeitos colaterais graves, como a síndrome de liberação de citocinas e resposta anti-globulina. 67

69 R34-Desenvolvimento de sistema para a triagem de grande desempenho de compostos com atividade antibacteriana a partir de bibliotecas metagenômicas Samuel Dias Araújo Júnior; Ricardo Henrique Kruger. Biologia Celular - Enzimologia Um dos principais obstáculos em ecologia microbiana é a incapacidade de cultivar a maior parte da diversidade microbiana presente nos ecossistemas sob as atuais condições de laboratório. Desta forma, a abordagem metagenômica é uma opção que permiti o acesso direto aos genomas complexos desses ecossistemas para a expressão heteróloga de genes e exploração funcional de microrganismos ainda não cultiváveis. Nesse projeto será utilizado um novo vetor com características especiais, pbsbac1 (construído durante o mestrado), para a construção de bibliotecas metagenômicas utilizando um método diferenciado para extração de DNA total, com capacidade mais representativa de cobertura da riqueza e abundância da amostra ambiental em relação a outros métodos convencionais e/ou comerciais. Em experimentos anteriores, o vetor pbsbac1 apresentou índices de expressão de genes metagenômicos superiores quando comparados a outros vetores convencionalmente utilizados em estudos semelhantes. Para realizar a triagem funcional de clones com atividade antibacteriana das bibliotecas metagenômicas que serão construídas será utilizado e validado um novo método, desenvolvido também durante o mestrado, denominado Cell-Density-Dependent Expression (CEDDEX). De acordo com os estudos já realizados, o método CEDDEX é pelo menos 50x mais sensível que os métodos atualmente empregados para detecção de clones e compostos com atividade antimicrobiana. Desta forma, a construção de bibliotecas metagenômicas com a utilização de vetores com características adequadas e hospedeiros versáteis associados a metodologias mais sensíveis e robustas de triagem de clones positivos resultará na compreensão e investigação sistemática do reservatório genético de produtos bioativos microbianos. Essa sistemática, juntamente com a exploração contínua da diversidade microbiana, terá potencial para gerar novos compostos químicos e drogas bioativas assim como acelerar a descoberta de novos genes com atividade antimicrobiana. 68

70 R35-Análise da expressão dos genes bbrizgid1 e bbrizipt9 relacionados à síntese de fitohormônios em ovários de Brachiaria brizantha Luciana Gomes Ferreira, André S. Teixeira Irsigler; Júlio Carlyle M. Rodrigues; Lilian H. Florentino; Ana Cristina M. M. Gomes; Diva M.A. Dusi; Vera Tavares C. Carneiro. Laboratório De Reprodução Vegetal _ Apomixia Brachiaria brizantha, forrageira da família Poaceae, com genótipos de reprodução sexual e assexual, por apomixia, e representa um sistema interessante para o estudo das vias moleculares envolvidas em ambos os modos de reprodução. Há evidências de que fitohormônios estejam envolvidos na estruturação de sacos embrionários em plantas sexuais de outras espécies, mas não há na literatura relato de estudos em plantas apomíticas. Resultados obtidos por RNA-seq indicaram genes envolvidos na via de fitohormônios sendo diferencialmente expressos em ovários de B. brizantha sexual e apomítica, entre eles um gene homólogo a GID1 (Gibberellin Insensitive Dwarf1) de Arabidopsis, receptor de giberelina, e outro homólogo ao gene IPT9 (isopentenyltransferase), biossíntese de citocinina. O objetivo deste trabalho foi caracterizar e analisar a expressão de GID1-like e IPT9-like de B. brizantha, nomeados de BbrizGID1 e BbrizIPT9, respectivamente. Dois acessos foram analisados, BRA , diplóide (2n=2x=18) sexual e BRA00591, tetraplóide (2n=4x=36) apomítico facultativo. RT-qPCR foi realizado em ovários nos diferentes estágios do desenvolvimento de ambos os genes. Para análise por Southern blot foi usado DNA dos dois genótipos e um fragmento de 300 pb de BbrizGID1 e outro de 982 pb de BbrizIPT9 como sonda. Para observar o padrão de expressão dos genes, foi realizado hibridização in situ em secções semi-finas de ovários na megasporogênese. Os resultados obtidos por RT-qPCR validaram os dados do RNAseq, BbrizGID1 apresentou alta expressão nos estádios iniciais do desenvolvimento do saco embrionário apomítico, e BbrizIPT9 mostrou alta expressão nas plantas sexuais em todos os estádios. Resultados obtidos por Southern blot sugerem que BbrizGID1 está presente em duas cópias no genoma dos dois genótipos e BbrizIPT9 em pelo menos três cópias. A hibridização in situ em ovários de BbrizGID1 resultou em uma forte marcação nas células nucelares, incluindo o meiócito e a célula-mãe do megásporo (CMM), somente em plantas apomíticas. Já BbrizIPT9 apresentou pouca marcação na célula arqueospórica e forte hibridização na porção superior do estilete de plantas apomíticas e nas plantas sexuais apresentou forte marcação nas células nucelares, incluindo a CMM. Estes resultados sugerem um possível envolvimento dos genes BbrizGID1 e BbrizIPT9 durante o desenvolvimento reprodutivo de B. brizantha. 69

71 R36-Plantas de tabaco resistentes à Sclerotinia mediada por RNAi Cristiana Moura Andrade; Francisco José Lima Aragão. Laboratório De Engenharia Genética Aplicada À Agricultura Tropical/Embrapa-Cenargen Os fungos são um grande e importante grupo de microorganismos que tem um enorme impacto, sendo muitos destes fitopatogênicos causadores de grandes perdas econômicas para a agricultura. Uma maneira de contornar este problema é a obtenção de plantas resistentes. A genética dos fungos patogênicos tem sido estudada de diversas formas e mais recentemente a estratégia de silenciamento gênico por RNA interferente tem sido empregada com sucesso. A possibilidade de silenciamento in trans in vivo por plantas e fungos foi demonstrado por Tinoco et al. (2010). Com o objetivo de gerar o silenciamento de um gene vital para o ciclo de vida de fungos patogênicos, foram obtidas plantas de fumo transformadas capazes de transferir os sinais de silenciamento aos fungos. Bioensaios realizados com confronto de Sclerotinia sp. com plantas transformadas demonstraram que plantas modificadas para expressar dsrnas dos genes-alvo apresentaram uma tolerância maior ao crescimento do fungo. Para comprovar que os sinais de silenciamento estão sendo produzidos nas plantas e passados ao patógeno, reações de Northern Blot foram realizadas, identificando estes sinais nas plantas que apresentaram uma maior tolerância. 70

72 R37-Interfering RNA as a strategy for silencing the rep gene of begomoviruses infecting tomato (Solanum lycopersicum) in Brazil Nayhanne Tizzo de Paula; Francisco José Lima Aragão. Laboratório De Engenharia Genética Aplicada À Agricultura Tropical The Begomovirus (Family Geminiviridae) represents an important group of pathogens that infect a wide range of plant species and cause significant losses in agriculture. These viruses are transmitted to dicotyledonous plants by whitefly Bemisia tabacci, whose control by insecticides is difficult and costly, making genetic control a more promising management. In this study, Nicothiana benthamiana was used as a model to obtain plants with wide resistance to different begomoviruses infecting tomato in Brazil, through the use of molecular mechanism of interfering RNA (RNAi). A chimerical sequence of 1286 nucleotide within the rep gene from four important Brazilian begomovirus species, Tomato leaf distortion virus (ToLDV), Tomato golden vein virus (TGVV), Tomato mottle leaf curl virus (TMoLCV) and Tomato severe rugose virus (ToSRV) was used to generate an intron-hairpin construction. Following ligation of the construct into binary vector pcambia 3300, Agrobacterium tumefaciens cells (strain EHA-105) were transformed. The bar gene was used as selection marker and regenerated plants tested for the presence of PAT protein. A total of 20 N. benthamina plants were selected. Currently, progenies arising therefrom are being challenged with TGVV and ToSRV and degree of resistance are being evaluated. 71

73 R38-Lysophosphatidylcholine induces IL-1β secretion and lipid droplet biogenesis in inflammasome-mediated pathway Rafael Corrêa; Thaís Amanda De Pinho Silva; Raquel Das Neves Almeida; Dalila Juliana Silva Ribeiro; Patrícia Torres Bozza; Kelly Grace Magalhães. Imunologia E Inflamação Lysophosphatidylcholine (LPC) is a major lipid component of plasmatic membrane and has an important role in cell signaling. LPC is a major phospholipids component of oxidized low density lipoprotein (oxldl) and is thus directly implicated as a critical factor in atherogenic activity of oxldl. Furthermore, LPC is also able to induce the formation of foam macrophages, which are key cell components for the setting of atherosclerosis, and leukocyte recruitment to the site of the pathology. Therefore, LPC plays an important role in atherosclerosis, as well as in acute and chronic inflammation. One important pro-inflammatory cytokine is the Interleukin-1beta (IL-1β) which is regulated by inflammasome activation. Our group has previously demonstrated that LPC is a TLR2 ligand and may be involved in modulation of inflammatory responses. However, the role of LPC in modulating inflammasome activation and lipid droplets biogenesis in this process is poorly understood. This study aimed to investigate if LPC is capable of inducing IL-1β secretion, a key marker of inflammasome activation, and verify the foam cell formation by analyzing biogenesis of lipid droplets in this context. Human monocytes were isolated from peripheral human blood of health donors and bone marrow derived macrophages (BMDM) were obtained from C57BL/6 mice. Cells were pre-treated or not with inhibitors of (I) ROS release (NAC), (II) potassium efflux (Glybenclamide), (III) lysosomal damage (CA- 074), (IV) HMG-CoA reductase (atorvastatin), and (V) blocking TLR2 antibody (Anti- TLR2) during one hour and stimulated with different concentrations of LPC. After 24 hours of interaction, the supernatants were collected; IL-1β secretion levels were analyzed by ELISA, and biogenesis of lipid droplets were analyzed by Flow Cytometry. 1μg of LPC induced significant secretion of IL-1β, which was dependent on potassium efflux and TLR-2. Moreover, LPC induced lipid droplet biogenesis in a process dependent on ROS release and lysosomal damage, which mediate the inflammasome activation. In addition, cell treatment with atorvastatin decreased lipid droplet biogenesis induced by LPC. Conclusion: Taken together our data suggests that LPC triggers IL-1β secretion and induces lipid droplet biogenesis in inflammasomemediated pathway. 72

74 R39-Peptídeos antimicrobianos intragênicos de diferentes plantas Marcelo Henrique Soller Ramada; Guilherme Dotto Brand; Fernando Yano Abrão; Karina Peres Gramacho; Carlos Bloch Jr. Laboratório De Espectrometria De Massa Diversos peptídeos bioativos podem estar inseridos em uma estrutura proteica (peptídeos intragênicos) e quando liberados podem exercer sua função biológica. Ex.: encefalina, bradicinina. Alguns peptídeos podem estar presos em uma sequência proteíca e não terem sítios de liberação. Esses peptídeos intragênicos são de interesse também na busca por novas moléculas bioativas como uma alternativa para descoberta de novas drogas e, no caso de peptídeos antimicrobianos, para o controle de diferentes fitopatógenos, que causam diversas perdas em diferentes culturas de interesse no Brasil e no mundo. Neste trabalho, nós apresentamos resultados da busca, síntese e atividade de peptídeos intragênicos antimicrobianos (PIAs) selecionados do genoma Theobroma cacao e Arabidopsis thaliana. Apresentamos também, os resultados da interação desses peptídeos com vesículas unilamelares. A busca por PIAs foi realizada usando as proteínas preditas do genoma de Theobroma cacao Matina 1.6 e Arabidopsis thaliana usando o software Kamal v1.0, com parâmetros definidos pelo usuário. Onze peptídeos de T. cacao e dois peptídeos de A. thaliana foram selecionados para síntese química em fase sólida utilizando a estratégia Fmoc. Dois peptídeos, DS01 e Ascafina-8 foram sintetizados como controles positivos. Os peptídeos foram purificados por HPLC de fase reversa. A pureza, massa molecular e sequência de aminoácidos dos peptídeos foram avaliadas e confirmadas por MALDI-TOF/TOF. As concentrações inibitórias mínimas dos peptídeos sintetizados foram realizadas através do método de microdiluição em caldo de acordo com o CLSI, variando a concentração dos peptídeos entre 256 μM e 0,5 μM contra diversos fungos e bactérias. Termogramas da interação dos peptídeos com as vesículas unilamelares de DMPC ou 2:1 DMPC/DMPG foram obtidos através de experimentos de calorimetria diferencial de varredura (DSC). Todos os peptídeos foram testados contra os seguintes microrganismos: Candida albicans ATCC 90028, Cryptococcus neoformans ATCC 28957, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Trichoderma asperellum CNPAF TR356, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC e Bacillus cereus ATCC Devido a sua importância na cultura cacaueira, os peptídeos de cacau foram testados contra os esporos do fungo causadaor da vassoura-de-bruxa, Moniliophtora perniciosa. Seis dos onze peptídeos de cacau e os quatro peptídeos de A. thaliana foram capazes de inibir o crescimento de, pelo menos, um microrganismo. Dos 6 peptídeos ativos de cacau, 5 foram capazes de inibir a germinação dos basidiósporos de M. perniciosa. As vesículas compostas por 2:1 DMPC/DMPG tiveram alteração em sua transição de fase mesmo com peptídeos que não apresentaram atividade antimicrobiano, não sendo um modelo adequado para análise. Já nas vesículas compostas apenas por DMPC, oito dos dez peptídeos que 73

75 apresentaram atividade antimicrobiana apresentaram algum grau de interação com as mesmas, afetando levemente ou fortemente a transição de fase dessas vesículas. 74

76 R40-Coevolução Molecular em Canais Iônicos e Neurotoxinas Camila Ferreira Thé Pontes; Werner Treptow Laboratório De Biologia Teórica E Computacional Due to their importance in many cellular processes and specially in signal transduction, voltage-gated ion channels (VGICs) serve as molecular targets to a variety of toxins, some of which have an effect on the activation/inactivation kinetics of the channel, known as gating modifier toxins. The gating modifiers α- and β- scorpion toxins (α- and β-sctxs) act on voltage-gated sodium channel (Nav) extracellular sites altering the movement of the voltage sensor through a voltagesensor trapping mechanism. This study is an attempt to elucidate the molecular mechanisms that determine toxin specificity through the investigation of molecular coevolution between these toxins and their respective Nav binding sites using computational methods. Preliminary results concerning the creation of heterogeneous scorpion toxin sequence alignments and the analysis of the structural patterns present in each toxin group are shown here. Multiple sequence alignments (MSAs) of α- and β-sctxs were obtained from UniProtKB using a seed alignment of heterogeneous sequences to train a hidden Markov model. The obtained MSAs were then analyzed using algorithms that calculated the entropy, divergence and mutual information for each position (or pair of positions). The results revealed some positions of interest that are probably related to toxin-channel interaction. The next step is to find via direct coupling analysis pairs of interacting residues relevant to toxin selectivity that will be applied in the generation of atomistic structural models of the complexes receptortoxin, which will be used in Go-type molecular dynamics simulations. It will then be possible to calculate the binding energies using continuous model simulation, based on which a model of interaction between toxins and channels will be proposed. 75

77 R41-Development of whitefly resistant transgenic soybean plants via RNAi Abdulrazak Baba Ibrahim, Ahmadu Bello, Francisco Jose Lima Aragão. Using RNAi based strategies, we developed eight different lines of transgenic soybean plants expressing an RNA hairpin capable of silencing A subunit of vacuolar ATPase gene of Bemisia tabaci. Following the design and construction of a vector using a 576 bp nucleotide sequence from the A subunit of B abaci ATPase gene, the resulting vector, designated pbtatpase, was used to transform zygotic embryos of Soy bean (Glycine max) using particle delivery system. Following selection with imazapyr and regeneration of plants arising therefrom, three distinct putatively transgenic lines (designated 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8 and 11) were successfully acclimatised and grown in the greenhouse. PCR analysis using primers that anneal to specific regions of the pbtatpase revealed that these lines have integrated the insert. The expression of this silencing trait and its expected physiological effect on B abaci will further be evaluated using additional molecular tools and feeding bioassay. 76

78 R42-Estudo da relação entre o estado de diferenciação celular e a hipótese de Warburg José Antonio Fagundes Assumpção; José Raimundo Corrêa Laboratório De Microscopia Eletrônica O desenvolvimento do câncer é marcado pela quebra da defesa dos mecanismos adaptativos existentes para a prevenção da transformação celular. Estudos recentes apontam um modelo de desenvolvimento do câncer baseado em alterações metabólicas. Uma destas alterações é o chamado Efeito de Warburg, ou glicólise aeróbica, na qual o tecido utiliza a glicólise - gerando lactato - como fonte primária de energia. Inicialmente paradoxal, devido à baixa eficiência na geração de ATP, a glicólise pode ser vista como uma estratégia vantajosa para a adaptação celular, produzindo inúmeros compostos intermediários de carbono utilizados em reações anapleróticas para a síntese de ácidos graxos e nucleotídeos e auxiliando a acidificação celular, por meio do acúmulo de piruvato e formação de lactato (favorecendo também a invasão tecidual). O efetio de Warburg tem sido exaustivamente descrito em células de alta capacidade proliferativa, como células tumorais e embrionárias. Alterações no processo de respiração celular alteram também padrões de expressão gênica e induzem características tumorigênicas. Principalmente as chamadas células tronco tumorais (população de células dentro de um tumor com capacidade para restaurar a colônia tumoral), partilham também outras similaridades com células embrionárias, provavelmente por possuírem padrões semelhantes de regulação da expressão gênica. O metabolismo energético alterado de algumas células cancerígenas poderia ser explicado, então, pela desdiferenciação incompleta de células adultas, que confere certas capacidades compartilhadas com células embrionárias (mobilidade, invasão tecidual, proteínas de superfície, receptores) e, ao mesmo tempo, mantem características do tipo celular da qual partiu, como, por exemplo, o metabolismo energético/mitocondrial. A relação de causa ou efeito envolvendo o metabolismo energético e o estado de diferenciação celular é primordial para o melhor entendimento dos processos bioquímicos que regem o estabelecimento e a progressão tumoral. Com a elucidação deste quadro, torna-se possível a identificação de novos alvos terapêuticos para o tratamento do câncer. 77

79 R43-Aproveitamento de licores resultantes de pré-tratamento Liquid Hot Water de resíduos agroindustriais como fonte de carbono para produção de enzimas xilanolíticas por Aspergillus foetidus Caio de Oliveira Gorgulho Silva; Barbara Neumann; Edivaldo Ximenes Ferreira Filho Este trabalho propõe o uso de licores ricos em hemicelulose gerados no prétratamento Liquid Hot Water de diferentes biomassas lignocelulósicas como fonte de carbono para crescimento do fungo filamentoso Aspergillus foetidus e produção de enzimas xilanolíticas. O pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar será otimizado, com uso da ferramenta estatística de planejamento experimental, de modo a gerar licores ricos em hemicelulose que induzam a maior produção de enzimas xilanolíticas por A. foetidus. Em um primeiro delineamento experimental, em que se variou a temperatura do pré-tratamento de 170 a 230 C, o tempo de residência de 10 a 60 minutos, e a concentração de biomassa de 1 a 10% (m/m), foi observado que o fungo não foi capaz de crescer (visivelmente a olho nu) e produzir enzimas na maior parte dos licores gerados. Moléculas inibitórias ao crescimento microbiano, como furfural e hidroximetilfurfural (produtos de degradação de pentoses e hexoses, respectivamente), compostos fenólicos (produtos da modificação e degradação da lignina) e ácidos fracos (como ácido acético, ácido fórmico e ácido levulínico) já são documentadas na literatura como compostos gerados durante pré-tratamentos de alta severidade e podem ser os responsáveis pelos resultados observados acima. Um segundo delineamento experimental foi então realizado, diminuindo a severidade dos tratamentos, utilizando os intervalos de 153 a 187 C, 10 a 50 minutos e 1 e 11%. O fungo foi capaz de crescer e produzir xilanases em todos os licores, exceto no licor gerado no tratamento mais severo (180 C por 45 minutos). Foi observado que em licores resultantes de pré-tratamentos menos severos (160 C por 15 minutos), o fungo secretou xilanases (1,097 UI/mL) já no início do cultivo (2 dia). Já em licores gerados em tratamentos mais severos (por exemplo, 170 C por 30 minutos ou 160 C por 45 minutos), atividades de xilanase similares foram produzidas, porém em estágios mais avançados do cultivo (6 dia em diante). 78

80 R44-Análise do sinergismo de enzimas xilanolíticas microbianas na degradação da fração de hemicelulose de bagaço de cana-de-açúcar Lorena Cardoso Cintra; Cintra, Lorena Cardoso; Oliveira, Izadora Cristina Moreira; Fernandes, Amanda Gregorim; Jesuíno, Rosália Santos Amorim; Faria, Fabrícia Paula; Ulhoa, Cirano José. Enzimologia - Ufg A lignocelulose é o principal componente da biomassa vegetal, sendo constituída por celulose, hemicelulose e lignina. A xilana constitui o principal componente da hemicelulose e sua conversão em unidades de xilose requer a ação cooperativa de um complexo composto por enzimas como: β-xilosidases, endoxilanases, α-larabinofuranosidases, dentre outras. Genes de α-l-arabinofuranosidase de Penicilium purpurogenum (PpABF3) e β-xilosidases Humicola grisea var. thermoidea serão expressos na levedura Pichia pastoris para posterior montagem de um complexo hemicelulolítico versátil. O cdna do gene da PpABF3 foi clonado no vetor de expressão ppicza. Após a transformação foi realizada a PCR de colônia de leveduras e os transformantes foram analisados quanto à capacidade de produzir e secretar a enzima recombinante. O transformante T4 foi o que apresentou a maior atividade 18 ± 0,4 U/mL, após 72 h de cultivo. A enzima PpABF3 apresentou também atividade de β-xilosidase sendo, portanto, uma enzima bifuncional. A purificação da enzima se encontra em andamento. Foi analisado o pico de produção de β-xilosidases pelo fungo H. grisea cultivado em Farelo de trigo 2%, Bagaço de cana de açúcar 2%. O melhor resultado foi obtido quando o fungo foi cultivado em meio mínimo contendo BCA 2% por 216 h de cultivo, apresentando atividade de 3,5 U/mL ± 0,005, seguido pelo FT 2% em 48 h com 1,1 U/mL ± 0,002. Após a análise do pico de produção de β-xilosidases de H. grisea, foi possível determinar os pontos para a extração de RNA total visando à obtenção do cdna. Foram desenhados primers com base em sequencias de β-xilosidades depositadas em banco de dados (Genbank) e foram obtidos dois cdnas de 984pb e 1617pb. Os cdnas foram clonados no vetor pgem - T-Easy (Promega) e utilizados para transformação de células de E. coli eletrocompetentes. Após o sequenciamento foi possível verificar que se tratam de duas β-xilosidades. Os cdnas serão clonados em vetor de expressão para P. pastoris e, posteriormente, será realizada a transformação. Os próximos passos serão a produção das enzimas em P. pastoris, purificação e caracterização enzimática. Posteriormente, as enzimas recombinantes PpABF3 e as β-xilosidades de H. grisea, e uma endo-xilanase recombinante de H. grisea serão utilizadas em testes de sinergismo e hidrólise enzimática de BCA. 79

81 R45-Next-generation sequencing applied for identification of viruses in watermelon (Citrullus lanatus) plants Mariana Senna Quirino; Melo, F.L Aguiar, R.W. de S.; Orilio, A.F.; Ribeiro, B.M. Baculovirus The culture of watermelon (Citrullus lanatus Thunb) belongs to the Cucurbitaceae family and it is susceptible to several viral pathogens. These viral infections do not cause obvious symptoms in its host plants and the viral particles frequently occurs in low concentrations. However, the capacity to analyze asymptomatic viral infections or coinfection events increased with the appearance of high throughput sequencing. Thus, this study has been designed to identify viruses which are present in symptomatic watermelon plants. Watermelon leaves with viral symptoms were collected from September to December 2013 in three producing regions of Tocantins state. The plant material was subjected to virus semi-purification using centrifugation steps through a sucrose cushion. Total RNA was then extracted from this viralenriched fraction using "RNeasy Plant Mini Kit" (Qiagen). Next, the RNAseq library was prepared and sequenced by Illumina HiSeq 2000 platform. Forty million reads were generated, and after quality trimming and de novo assembly using CLC Genomics Workbench software, nearly fifty thousand contigs were obtained. All contigs were submitted to blastx analyses against the viral RefSeq database. 4,912 contigs produced hits with identity to viral sequences publicly available. To further confirm these results, we submitted those selected contigs that matched viral sequences to blastx against the GenBank non-reduntant database (nr database), and only the plant viruses were selected. We were able to identify viral genomes belonging to the families Potyviridae, Partitiviridae, and Bunyaviridae. The largest contig (10,371 bp) showed 91% identity with Papaya ringspot virus. One contig of 1,704 bp contig presented 98% identity with Zucchini yellow mosaic virus. We also found two contigs of 1,575 and 1,606 bp related to the segments 1 and 2 of Partitiviridae. Interestingly, these contigs presented an overall identity of 98% suggesting these contigs represent a new viral species belonging to the Partitiviridae family. Moreover, we found highly divergent contigs (6,596 and 2,674 bp) related to Bunyaviridae L and S segment, respectively. Overall, we were able to identify viruses infecting watermelon already described, as well as both currently circulating in watermelon crops in Brazil, the complete genome of the novel viral specie Groundnut ringspot virus (GRSV) whose presence in Brazil was reported recently and a virus from Partitiviridae family. 80

82 R46-Characterization and biotechnological applications of pectinolytic enzymes secreted by Clonostachys byssicola grown on fruit residues Helder Andrey Rocha Gomes; Edivaldo Ximenes Ferreira Filho Laboratório De Enzimologia Fruit juice production is an important economic activity in Brazil. In 2011, Brazil was the biggest exporter of orange fruit juice. It was sold 1,5 million tons of ready-to-drink juice, and 440 thousand tons of concentrated juice. The yield of juice is estimated in 50%, so there is a huge amount of orange waste that, when it is not well disposed, can produce environmental pollution. Same can be applied to passion fruit juice production, where juice yield is between 35% and 40%. These residues can be used as inducers of the secretion of pectinolytic activity by filamentous fungi. Fruit peels and residues contain significant amounts of pectins, since these polysaccharides play important role on fruit development and ripening process. Additionally, these residues are cheap carbon sources, and are abundant, since fruit processing is an important economic activity in Brazil. Several fungi species are poorly studied for the characterization and potential of application of lignocellulolytic enzymes. Clonostachys byssicola is a well known mycoparasitic fungus, and its potential as biocontrol agent has been evaluated, but the characterization of the enzymes produced by this specie grown on lignocellulosic residues is still not well studied. In this work, pectinolytic enzymes secreted by Clonostachys byssicola grown on passion fruit and orange peels will be purified, characterized and evaluated for biotechnological applications in fruit juice treatment for reduction of viscosity, as well as for cotton biopurge. So far, crude extracts of C. byssicola grown on orange peel and passion fruit peel showed pectinase and pectin lyase activities. These two lignocellulosic substrates were found to be good inducers for the secretion of pectinolytic activity by the fungal strain. The growth curve for C. byssicola grown on orange peel has been done, indicating that from the 5th day on, pectinase levels remain almost constant. 81

83 R47-Identificação de genes cry de Bacillus thuringiensis eficientes no controle de pragas agrícolas Fernanda Guimarães Bernardes; Martins, Érica Soares; Queiroz, Paulo Roberto; Gomes, Ana Cristina Meneses Mendes; Monnerat, Rose Gomes. Bacillus thuringiensis é uma bactéria Gram positiva normalmente presente em solos e, entre os seus genes de interesse, estão os genes cry, responsáveis pela codificação de proteínas tóxicas a diversos insetos-praga da agricultura. Estas toxinas são produzidas durante a esporulação e apresentam forma de cristais, sendo altamente específicas para seus insetos-alvo. Existe uma grande variedade de proteínas Cry. O objetivo do trabalho é selecionar e caracterizar estirpes de B. thuringiensis da Coleção de Bactérias de Invertebrados da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia que sejam tóxicas a pragas agrícolas. Inicialmente as estirpes serão testadas em bioensaios seletivos contra insetos-praga das Ordens Lepidoptera e Coleoptera. Aquelas que provocarem mortalidade acima de 50% a um ou mais insetos, serão submetidas a bioensaios de dose e caracterização molecular com a identificação de genes cry por PCR (Reação em cadeia da polimerase) e com análise do perfil proteico. Até o momento, foram testadas cinco estirpes de B. thuringiensis, sendo que duas provocaram mortalidade acima de 50% no bioensaio seletivo para Anticarsia gemmatalis e Spodoptera frugiperda. Essas estirpes apresentaram resultado positivo para o gene cry1, e perfil de proteínas compatível às proteínas tóxicas a lepidópteras. O próximo passo será realizar o bioensaio de dose das duas estirpes, aperfeiçoar a caracterização molecular destas na busca da identificação da presença de outros genes cry e realizar o bioensaio seletivo com insetos da Ordem Coleoptera. O mesmo procedimento será realizado com diversas estirpes da coleção. 82

84 R48-Effect of histone deacetylases inhibitors on the virulence phenotypes of Cryptococcus neoformans Fabiana Brandão Alves Silva, DERENGOWSKI Lorena; ALBUQUERQUE Patricia; SILA-PEREIRA Ildinete e NICOLA André; FONSECA, Marcio José Poças. Cryptococcus neoformans infection is due to expression of various virulence factors that allow survival under various stress conditions. Inhibitors of histone deacetylases (HDACi) Sodium butyrate (NaBut) and Trichostatin A (TSA) have the ability to affect the profile of chromatin resulting in changes on expression several genes. Objective: Study the effect of HDACi on expression of virulence phenotypes of C. neoformans and the interaction of the fungus with animal hosts. Methods: Different concentrations of the drugs were applied to C. neoformans cultures grown on several conditions in order to analyze the expression of virulence phenotypes. Cell cycle was evaluated by flow cytometry. Survival curve were performed infecting caterpillars of the alternative host Galleria mellonella with C. neoformans cells pretreated with HDACi. Results and Conclusion: HDAC showed ability interfere on major virulence phenotypes described for C. neoformans significantly, even in concentrations subinibitory, such as capsule, melanin, phospholipases and mating type. Solely urease was not affected at any concentration tested by both HDACi. NaBut showed more pronounced and permanent effect that TSA, possibly because TSA is less stable. There is an increase in the population of cells in G2 / M when treated for NaBut. Inhibitory effects observed in the formation of the capsule was not maintained after removed of the drug "in vitro". Although HDACi affect the virulence phenotypes "in vitro", no significant differences were observed in the time of death of caterpillar of species Galleria mellonella between treatments versus controls. Perspectives: Following steps of this work will be to evaluate the synergism of HDACi with other antifungal drugs. We will also construct C. neoformans HDAC mutants and investigate the role of these genes in the regulation of expression of virulence factors by RNA-seq and infection in vivo assays. 83

85 R49-Desenvolvimento de potenciais estatísticos para simulação de enovelamentos proteicos Diogo César Ferreira, Marx Gomes Van der Linden, Antônio Francisco Pereira de Araújo. Laboratório De Biologia Teórica E Computacional Desde a década de 1970, busca-se compreender os mecanismos subjacentes ao processo de enovelamento proteico, uma vez que, em geral, as proteínas necessitam de uma estrutura tridimensional bem definida para exercer seu papel fisiológico. Nosso grupo tem trabalhado com modelos estatísticos de predição de estrutura tridimensional, e optou-se por utilizar um algoritmo baseado em Modelo Oculto de Markov (HMM) para tanto. Além disso, em um trabalho anterior foi proposta uma equação que descreve a probabilidade de um dado átomo apresentar um certo enterramento atômico (sua distãncia até o centro geométrico da estrutura). O presente trabalho visa fazer a transição entre a predição discreta dos enterramentos (agrupados em camadas) vinda do HMM e a predição contínua com base nesta equação, a fim de se aproveitar ao máximo a informação obtida pelo algoritmo. Utilizaram-se dados de cadeias globulares, retiradas do banco de dados PDB- SELECT de Um algoritmo baseado em HMM foi usado para se calcular, para cada átomo, as probabilidades de sua distribuição em camadas de enterramento. Ajusta-se então, à cada um destes conjuntos de probabilidades, um conjunto de parãmetros que leva à função (previamente citada) que melhor descreve tal distribuição. A qualidade do ajuste é estimada pela divergência de informação entre as probabilidades calculadas pelo HMM, e as obtidas da função ajustada. A qualidade final da predição é estimada por uma função de verossimilhança entre os enterramentos observados e preditos. Com este estudo pretende-se a obtenção de potenciais para simulações de enovelamento proteico. é possível ainda otimizar os critérios para o ajuste dos parãmetros da curva para minimizar artefatos decorrentes do método. Como a qualidade deste método é limitada pela qualidade do método da predição discreta inicial, põe-se também como perspectiva a possibilidade fazermos predições contínuas de enterramentos diretamente da sequência primária. 84

86 R50-Escherichia coli engenheirada metabolicamente aumentam a produção de proteínas recombinantes de teia de aranha e origina fibra sintética Valquíria Alice Michalczechen Lacerda, Vianna, Giovanni Rodrigues; Murad, André Melro; Silva, Luciano Paulino; Kaplan, David Lee; Rech, Elíbio Leopoldo.. Laboratório De Biologia Sintética As fibras de teia de aranha são polímeros com propriedades elásticas e de resistência, simultaneamente. Com os avanços da engenharia genética e da biologia sintética, é possível elaborar fibras sintéticas a partir de proteínas recombinantes produzidas em sistemas heterólogos. Esses polímeros apresentam sequências de aminoácidos com alta repetitividade, sendo um fator limitante para o metabolismo de bactéria. O presente estudo concentrou-se em melhorar o metabolismo de Escherichia coli aumentando a disponibilidade de glicil-trna (glyvxy) e aminoácido glicina (glya) para a produção de proteínas da glândula ampolada maior (MaSp2) da aranha Parawixia bistriata com 16 e 32 o módulo inicial (54 e 105 kda), além de caracterizar as fibras produzidas. Para a alteração metabólica realizou-se quatro construções utilizando o plasmídeo pacyc184, enquanto as proteínas MaSp2 foram inseridas no plasmídeo pet19b. As linhagens são derivadas de BL21(DE03) e foram avaliadas com relação à curva de crescimento (24, n=3), quantidade de material biológico após a indução e rendimento de proteína alvo. Essas foram confirmadas por SDS-PAGE, Western blot, espectrometria de massa e caracterizadas por MEV após liofilização. A elaboração das fibras ocorreu em banho de coagulação com isopropanol, podendo ou não ser hidratada e esticada posteriormente (tratada), sendo a morfologia avaliada por MEV e MFA, e a espectroscopia de força e viscoelasticidade topográficas por MFA. Os resultados foram submetidos ao teste t.utilizando o programa Assistat 7.7 Beta. Não houve diferença entre as linhagens para a curva de crescimento, quando induzidas a produzir as proteínas alvo. Quanto à produção de biomassa o rendimento entre as linhagens foi muito próximo, havendo um aumento na produção das proteínas de interesse nas linhagens construídas (P<0,05). Percebeu-se que as fibras apresentam uma topografia não homogênea (MFA) e houve uma diminuição dos valores em Ra (média aritmética) e Rq (média da raiz quadrada) para rugosidade e em Rv (vale mais profundo) no grupo tratado, P<0.05. Além disso, observou-se uma diminuição do diâmetro das fibras para o grupo tratado, mas todas apresentam morfologia lisa (MEV). As análises por espectroscopia de força mostraram que houve um aumento da força atrativa entre a superfície da fibra com a ponteira para o grupo tratado (P<0.01). Sabe-se que após a extrusão, as fibras sintéticas ainda não terminaram de se formar, e a hidratação e o estiramento são passos importantes para o produto final. O estudo realizado obteve sucesso com o rendimento proteico das novas linhagens bacterianas estabelecidas, e os tratamentos são de extrema importância para a formação de uma fibra com qualidade. Esse biomaterial tem aplicação em engenharia de tecidos e na indústria de materiais. 85

87 R51-Characterization and comparison between the cellulosome and the crude extract produced by a new isolate of Clostridium thermocellum Karen Ofuji Osiro, Camargo, Brenda Rabello; Inoue, Rachel Satomi; Sousa, Marcelo Valle; Murad, André Melro; Felix, Carlos Roberto; Noronha, Eliane Ferreira. Enzimologia The anaerobic bacterium C. thermocellum B8 was isolated from rumen goat and secretes enzymatic complexes presenting cellulolytic and xylanolytic activities, called cellulosomes. The present work aimed the purification and characterization of celulossomes produced by the above mentioned bacterium after growth on liquid medium containing cellulose as carbon source. The complexes were eluted from the residual substrate bounded proteins (RSBP) and purified with the aid of a molecular exclusion chromatographic column (Superdex S-200). The main protein peak was eluted on the void volume and presented enzymatic activities of cellulases and xylanases. Through the intensity of dynamic light scattering measurement, two polydisperse populations (64,34 ± 19,17nm and 481,7 ± 186,9nm) were detected at this purified sample, being the first peak predominant in number. In addition of tween 0,1% at the cellulosome sample, a third peak of polydisperse population appears (10,64 ± 2,46 nm) being rife in this condition. As a result of tween 1%, remained only the peak of 10,64 ± 2,46 nm. Suggesting that the detergent outcomes to the dissociation of the complexes on the protein units. A total of 24 proteins of the purified cellulossome were identified by mass spectrometry LC-MS/MS: 4 scaffolding proteins, 1 ABC transporter substrate-binding protein, 19 types of glycoside hydrolase proteins classified on the families 5, 8, 9, 10 and 48. The cellulosome and the RSBP samples were characterized in relation of temperature, thermostability, ph and phenols to evaluate their use on the saccharification of cellulose, sugar cane straw and cotton gin trash. The optimum temperature has a range from 60 C until 70 C and the optimum ph is 5, for both samples. It was observed that the cellulosome is less inhibited than the RSBP during the phenols test in xylanase and CMCase essays. Saccharification experiment was carried during 10 days at 50 C and 60 C, showing a higher amount of sugar released in 50 C, for both samples. Sugars obtained during enzymatic hydrolisis of the substrates were analysed with HPLC technique in first, second and tenth day of experiment. The maximum of total sugar was in the tenth day, and the sugar cane straw was the substrate which was detected a higher diversity of released sugar. However, the higher amount of sugar was found in cellulose for both samples at 50 C. In summary, this reasearch demonstrated the capacity both the cellulosome and the RSBP to hydrolize different sources of biomass, being a interest product to produce the second generation of biofuels. 86

88 R52-Synthesis, purification and characterization of Bioactive Peptides Mariana Magalhães Nóbrega, Felipe Vinecky, Marcelo Ramada, Guilherme Dotto Brand, Karla Graziella Moreira, Marcia Renata Mortari, Carlos Bloch Jr. Bioactive peptides prospection is important for biotechnology field as well as a starting point in many research areas, such as: new drugs development and production of genetically modified plants. In general, bioactive peptides have been identified as candidates for the new drugs development because their intrinsic properties concerning some potential activities, like high specificity, potency, less toxicity, and also chemistry and biological diversity. Peptides can present diverse activities such as antimicrobial, opioids, hypotensive, antithrombotic among others. This study aims to design sequences of synthetic peptides that may have antimicrobial, opioid and hypotensive activity. Peptides primary structure prediction was based on previous work of our group, which focused on prospection and bioactive peptides characterization. These studies were based on the knowledge available on the literature about the biological properties of specific protein domains, molecular targets and drug actions. The peptides were synthesized by solid-phase chemical synthesis using Fmoc strategy followed by purification on high performance liquid chromatography. Purity and confirmation of the primary structure were determined by mass spectrometry, MALDI and ESI. The assay for antimicrobial activity was made in vitro against Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Candida albicans. For opioid activity, the two synthetic peptides, were tested in mice (6-8 per group) intraperitoneally, equimolar to morphine (positive control) in order to assess its possible antinociceptive activity through hot plate and tail flick assays. The hypotensive activity we try to start, but we had difficult in have collaborators with spontaneously hypertensive animals. For antimicrobial activity were synthesized four peptides. It was possible to determine the MIC (minimum inhibitory concentration) for these microorganisms. Some of MIC values were approximately to one micro molar. The opioid activity exhibited pharmacological activity in vivo, which may be denominated opioid receptor agonists, because they promoted antinociception in mice when exposed to thermal stimulation. Thus, it is interesting continue studying therapeutic potential of these peptides to contribute with development for new drug candidates. 87

89 R53-The functional analysis of distinct tospovirus movement proteins (NSm) reveals different behaviors among the tospovirus species Mikhail Oliveira Leastro, Ana Peiró, Vicente Pallas, Jesus Angel Sanchez-Navarro, Renato Resende. Virologia Vegetal Plant viruses have developed a class of proteins responsible for ensuring viral infection and dissemination denoted movement proteins (MPs). For tospoviruses, it was demonstrated that virus movement requires tubules formation driven by its nonstructural movement protein (NSm). Although, it is expected that this mechanism would be conserved among the 28 tospovirus species reported so far within the genus, comparison among them reveals significant differences in amino acid sequences of viral proteins and in their biological features such as host range. Some tospovirus species present a narrow spectrum of host plants, e.g BeNMV, while others such as TSWV, TCSV and CSNV display a broad host range infecting plants from a large number of different botanical families. Due to its main function, the NSm proteins are often assigned as potential determinants of host specificity and/or adaptation. The aim of this study was to evaluate the role and the efficiency of four tospovirus MPs on cellto-cell and systemic movements using the heterologous Alfalfa mosaic virus AMV system, that allows the functional exchangeability of viral movement proteins (MPs) assigned to the â œ30k familyâ. Here, differences in the efficiency in cell-to-cell and systemic movement were observed based on the average sizes of the infected areas supported by the distinct tospovirus MPs tested. Also, we observed that all MPs analyzed were not competent to support the transport of an AMV RNA 3 carrying a CP mutant (CP206) defective in virus particles, indicating the incapacity of the MPs to transport other complexes different than virions in the AMV context. It was also demonstrated that the MPs of the four tospovirus species were similarly efficient to form tubules. However, C-terminal deletion of the MPs revealed that C-terminus of the MP of BeNMV was shown not to be essential for virus movement, in contrast to CSNV, TCSV and TSWV-MPs which required the entire NSm proteins to guarantee the cellto-cell movement. These results confirmed different features and behaviors among the tospovirus movement proteins. We suggest that the NSm protein plays a role in the determination of the viral infection spectrum of host plants based on the differences observed in cell-to-cell and systemic movement patterns among the tospovirus MPs. 88

90 R54-Produção e caracterização de uma endoglucanase da família GH6 proveniente de metagenoma de solo de canavial Antonielle Vieira Monclaro, Fábio Squina, Thabata M Alves, Thiago A. Gonçalves, Edivaldo Ximenes Ferreira Filho. A parede celular é uma rede de fibrilas fortes, composta de celulose, hemicelulose, pectina, proteínas estruturais e lignina, e sua composição varia entre as espécies de plantas e entre os tecidos da própria planta. A celulose representa o principal polissacarídeo presente na biomassa e consiste de um polímero linear não ramificado de resíduos de D-glicose. Vários organismos podem degradar eficientemente a parede celular e usar os próprios produtos de degradação para nutrição, porém a recalcitrãncia à decomposição biológica é um grande limitante para a conversão da biomassa lignocelulósica em produtos finais valiosos. Uma abordagem interessante na procura de novos candidatos na degradação da parede celular é através da metagenômica, análise do genoma das comunidades microbianas complexas encontradas em determinados habitats. O presente trabalho buscou enzimas candidatas que possuíssem características bioquímicas interessantes a partir de uma livraria de metagenoma de solo de cana de açúcar. A amostra de solo de canavial foi coletada na cidade de São Carlos (SP), foi feita extração e purificação do DNA metagenômico e um screening funcional para atividade em β-glucana em placas. Após a identificação do clone positivo para atividade em β-glucana, ela foi sequenciada e identificada tendo um domínio catalítico de GH6. O clone positivo foi clonado em pet28a e transformada em DH5alfa. Após confirmação da colônia transformada, ela foi submetida a miniprep e transformada em ArcticExpress (DE3), inoculada em meio LB e a enzima expressa foi purificada por cromatografia com coluna de niquel e gel filtração. Na caracterização bioquímica da enzima, ela obteve maior atividade em 40 graus, ph 6, apresentou atividade em beta-glucana e liquenana e massa molecular estimada em 27 kda. Através de eletroforese capilar seu produto de hidrólise foi avaliado e confirmou-se que ela é uma endoglucanase da familia GH6. A análise por dicroísmo circular indicou que sua estrutura secundária é composta basicamente por alfa-hélice. 89

91 R55-Estudo do efeito da Metilação do DNA e de Histonas na produção de xilanases por Humicola grisea var. Thermoidea João Heitor Colombelli Manfrão Netto; Márcio José Poças Fonseca Regulação Gênica E Mutagênese Humicola grisea var. thermoidea é um deuteromiceto termofílico com a capacidade de produzir celulases e xilanases e esta característica faz deste fungo um bom candidato para utilização na bioconversão de produtos agrícolas. As xilanases são enzimas com versátil aplicabilidade industrial, tornando atrativo o aumento da expressão de genes de xilanases em fungos, como Humicola grisea. Neste trabalho avaliaremos o efeito de moduladores epigenéticos na expressão de genes de xilanases (celulases também) e na atividade enzimática no fungo Humicola grisea. 106 esporos/ml do fungo serão inoculados por 24 h em 50 ml de meio mínimo de Pontecorvo (MM). Os micélios crescidos serão então filtrados, lavados com água destilada estéril e transferidos para novas alíquotas de 50 ml de MM, suplementados com GLI 1% (p/v) ou bagaço de cana de açúcar explodido a vapor (BCA) 0,1% (p/v) como únicas fontes de carbono, em presença ou não (controle) das diferentes drogas moduladoras epigenéticas. As drogas a serem utilizadas serão 5-aza-2 -deoxicitidina, pargilina e 5 -desoxi-5 metiltioadenosina. A atividade hidrolítica dos sobrenadantes será determinada por ensaio enzimático utilizando o reagente DNS. RT-qPCR será utilizada para determinar os níveis dos transcritos de genes de xilanases (alguns de celulases). Até o presente momento foram realizados apenas os testes com a droga 5-Aza. Nossos primeiros resultados demonstram que a utilização desta droga diminui a atividade enzimática e os níveis dos transcritos da maioria. Esperamos encerrar os demais experimentos com as outras drogas moduladoras para assim avaliarmos os efeitos de mecanismos epigenéticos na regulação de genes de celulase e xilanase. Nossos primeiros resultados demonstraram que o uso de 5-Aza não aumentou a expressão dos genes analisados, porém como as outras drogas ainda não foram testadas, não podemos descartar seu uso como uma possível alternativa para o aumento da expressão destes genes e uma possível solução para acelerar o processo de degradação de resíduos agrícolas e transformação destes subprodutos em produtos com alto valor agregado. 90

92 R56- Engenharia metabólica de Saccharomyces cerevisiae para aproveitamento de xilose na produção de etanol lignocelulósico Bárbara Gomes Paes, Lima, Larissa M, Almeida, João R. M, Pepe, Lídia M. A xilose é o açúcar mais abundante na hemicelulose de várias biomassas. Entretanto a levedura Saccharomyces cerevisiae é incapaz de fermentar pentoses como a xilose. Estratégias para desenvolvimento de linhagens recombinantes de S. cerevisiae capazes de fermentar xilose vem sendo desenvolvidas por expressão de enzimas de vias catabólicas deste açúcar. Neste trabalho, a xilose isomerase (XI) de Piromyces sp. foi usada na a construção de linhagens recombinantes de S. cerevisiae e melhoradas por engenharia evolutiva. Paralelamente, foram identificados e expressos novos genes codificadores de XI. O gene de Piromyces foi amplificado e clonado em plasmídeo multicópia sob expressão de promotor forte. Também foi construído outro plasmídeo multicópia com o gene endógeno de S. cerevisiae para xiluloquinase (XK). Os plasmídeos foram usados para transformar duas linhagens laboratoriais de S. cerevisiae. Os transformantes obtidos foram selecionados e submetidos a evolução adaptativa, que consiste na fermentação continua das linhagens fazendo transferência sucessiva em meio mínimo seletivo (YNB+Xilose). Paralelamente foram identificadas por alinhamento em banco de dados, diferentes genes codificadores de XI. Os genes foram sintetizados e clonados no mesmo vetor escolhido para expressar a XI-Piromyces. Uma mesma levedura laboratorial foi transformada e clones positivos isolados. Linhagens recombinantes de S. cerevisiae capazes de consumir xilose foram obtidas pela expressão da XI de Piromyces juntamente ou não com XK. A evolução adaptativa permitiu o melhoramento das linhagens, as quais apresentaram diferença de crescimento até duas vezes maior que as sem condicionamento. Os novos genes codificadores de XI foram usados na construção de linhagens recombinantes de S. cerevisiae. Todas as linhagens geradas estão sendo caracterizadas fisiologicamente considerando taxa de crescimento, produção de etanol e coprodutos, e consumo de xilose. 91

93 R57-Identificação e caracterização de moléculas microbianas associadas à biodegradação de polietileno Julianna Barbosa Peixoto, Ricardo Henrique Krüger. Enzimologia O polietileno (PE) é o polímero sintético mais largamente produzido e utilizado, cuja produção mundial atinge cerca de 140 milhões de toneladas/ano, de modo que virtualmente todos os produtos modernos apresentam esse polímero em sua constituição. Essa ubiqüidade é justificada pelo baixo custo, alta versatilidade, resistência e durabilidade desse plástico, características promissoras para atender à alta demanda da sociedade. No entanto, esses materiais resistentes e duráveis, ao serem descartados, levam até 500 anos para se decompor em ambientes naturais. Essa recalcitrãncia é consequência das características moleculares e estruturais do PE, um alcano de longa cadeia carbônica e elevadas massa molecular e hidrofobicidade, além da intensa cristalização de seus segmentos moleculares. Nesse contexto, os problemas decorrentes da severa poluição e do grande impacto aos ecossistemas são potencializados pela ineficiência das atuais técnicas de gestão dos plásticos pós-consumo. Diante desse panorama, a biodegradação emerge como alternativa sustentável, consistindo na submissão desses polímeros ao metabolismo microbiano. A fim de explorar o potencial biodegradativo, no presente trabalho foram isolados mais de 800 microrganismos colonizadores de debris plásticos descartados em solos do Cerrado a partir de técnicas de cultivo. Com base em uma estratégia inovadora que visou a selecionar os efetivos biodegradadores de PE, foram identificadas, dentre os isolados, 9 bactérias com grande potencial para esse processo, compreendidas entre os gêneros Delftia, Comamonas e Stenotrophomonas. Esses isolados mostraram-se viáveis mesmo após 3 meses de cultivo com PE como única fonte de carbono e energia. Análises dos filmes de PE por FTIR confirmaram a ocorrência de alterações químicas no polímero após o cultivo com esses isolados. Esses resultados permitiram a seleção de um representante por gênero, dentre os biodegradadores de PE, para posterior análise de seus genomas, transcritomas e secretomas, objetivando o estudo do metabolismo de polímeros sintéticos e a investigação das enzimas envolvidas no processo. Com isso, esperase que esse estudo contribua tanto para a compreensão do processo de biodegradação, como para o provimento de um manejo sustentável e economicamente viável aos plásticos pós-consumo. 92

94 R58-Obtenção de proteínas de camada S de Archaea para possíveis aplicações biotecnológicas Thiago Rodrigues de Oliveira, Silva, Luciano; Freitas, Sonia; Krüger, Ricardo; Cynthia Maria Kyaw Laboratório De Microbiologia O domínio Archaea apresenta características em comum com os domínios Bacteria e Eukarya e, ao mesmo tempo, apresenta características próprias. A presença de uma camada proteica de superfície, denominada camada S, é bastante comum neste domínio. é geralmente composta por uma única proteína e produzida em grandes quantidades na célula. Além disso, essas proteínas apresentam capacidade de se auto-organizarem em arranjos cristalinos. O espaço entre as proteínas que formam a camada S variam de 2,5 a 35 nm. Como camadas S são arranjos monomoleculares de subunidades idênticas, os poros formados apresentam assim tamanhos e morfologias idênticos. Mesmo quando separadas, unidades isoladas da camada S apresentam a capacidade de recristalização em arranjos regulares quando o agente utilizado na separação é removido. A capacidade dessas proteínas de se autoorganizarem, originando estruturas cristalinas homogêneas, conferem enorme potencial nanotecnológico às camadas S, de maneira que o objetivo deste estudo é a obtenção de proteínas de camada S de Archaea para possíveis aplicações biotecnológicas. Os organismos halófilos, Halobacterium salinarum e Haloferax volcanii, os quais apresentam apenas camada S na sua parede, foram cultivados em condições especificas. Iniciadores de PCR foram desenhados para os genes das proteínas S desses organismos. Foram padronizados protocolos de extração de DNA dos mesmos para uso como molde em ensaios de PCR feitos com os iniciadores desenhados. Os fragmentos amplificados foram então clonados em um plasmídeo vetor e aguardam sequenciamento. Foram feitas análises de microscopia eletrônica de varredura para a visualização da camada S desses organismos, mas houve limitações na resolução obtida. Pretende-se isolar o gene da proteína S desses organismos para se construir fusões gênicas com proteínas de interesse, algo que se mostrou bastante interessante em outros estudos. Além disso, pretende-se isolar as proteínas S por protocolos de ultracentrifugação para aplicações biotecnológicas, como produção de nanopartículas ou construção de membranas de ultrafiltração. Por fim, pretende-se fazer uma caracterização estrutural dessas proteínas, a fim de se entender a natureza do seu enovelamento e auto-arranjo. 93

95 R59-Mapeamento de sítios de glicosilação de MRJP1 e sua influência nas estruturas terciárias e oligoméricas Samuel Coelho Mandacaru, Rayner Myr Lauterjung Queiroz, Marcelo Valle de Sousa. Laboratório De Bioquímica E Química De Proteinas A abelha (Apis mellifera) se mostra um excelente modelo para estudos bioquímicos de processos neurológicos. MRJPs (Major Real Jelly Proteins) são as principais glicoproteínas encontradas na geleia real. MRJP1 está envolvida também em vários processos como a regulação da diferenciação larval em rainha, e aumento do título do hormônio juvenil e desenvolvimento do ovário. Modificações pós-traducionais são ubíquas nas células e regulam funções de proteínas, frequentemente, pela modulação de suas características biofísicas. As diferentes funções desempenhadas pelos glicanos é determinada pela sua estrutura e a proteína ao qual está ligado. De acordo com isto, eles podem ter diversas funções como: proporcionar o dobramento de proteínas; modificar e regular as funções do esqueleto carbônico. Objetivos: Mapear sítio de glicosilação em MRJP1 e analisar suas influências na formação de oligômeros e estrutura terciária. Estratégias baseadas em gel como BN-PAGE e 2- DE, emissão de fluorescência do triptofano e espectrometria de massas Bottom-up. Observamos que mesmo deglicosilada, a MRJP1 mantém a estrutura terciária. Observamos a formação de vários tamanhos de oligômeros de MRJP1 glicosilada. O mesmo experimento com a proteína deglicosilada não houve a formação dos mesmos oligômeros quando comparado à proteína glicosilada, mostrando a influência dos glicanos na estrutura quaternária da MRJP1. Quando analisados por gel 2-DE, foi observado que a MRJP1 possui 9 diferentes proteoformas. Este mesmo experimento quando realizado com a proteína deglicosilada, foi observado que as mesmas formas se mantiveram, sugerindo que os glicanos presentes não são responsáveis pelas diferentes proteoformas observadas em gel 2-DE. Foram mapeados 2 sítios de glicosilação em MRJP1. 94

96 R60-Genômica aplicada ao cajueiro: tecnologias de genotipagem de alto desempenho para a caracterização de germoplasma e seleção genômica ampla Bárbara Muller Salomão de Faria, Orzenil B. Silva-Junior; Mariana Lira; Glaucia S. C. Buso; Zilneide P. S. Amaral, Dario Grattapaglia. O cajueiro (Anacardium occidentale) é uma cultura nativa do Brasil em um estágio de melhoramento genético com plena condição de ser fortemente potencializado pela aplicação direcionada das novas ferramentas genômicas integradas à fenotipagem de alto desempenho. A possibilidade de executar seleção ultra-precoce de plantas elite ainda em estágio de mudas no viveiro com base na análise genômica, revolucionaria o programa de melhoramento, permitindo reduzir ou mesmo eliminar a etapa de testes de progênie e partir diretamente para testes clonais. O objetivo do projeto de doutorado é desenvolver uma plataforma de genotipagem de SNPs de alto desempenho para aplicações na caracterização genética do banco de germoplasma do cajueiro e no melhoramento acelerado via seleção genômica. Até o momento, foram executados dois experimentos de sequenciamento de nova geração (Illumina HiSeq), de representações de complexidade reduzida do genoma do cajueiro, com o objetivo de identificar marcadores SNPs. O primeiro experimento envolveu a descoberta de SNPs através do método RAD sequencing (Floragenex), sequenciando duas amostras de DNA (sendo uma de um acesso único para gerar um genoma de pseudo-referência e outra constituída por um pool de 12 indivíduos selecionados para maximização da diversidade). O segundo utilizou o método Cornell-GbS de genotipagem por sequenciamento de representações genômicas reduzidas via a enzima de restrição PstI, sendo genotipados 90 indivíduos (com seis replicatas, totalizando assim 96 indivíduos sequenciados). Para o RAD sequencing foram gerados 15,8 milhões de sequências, resultando na identificação de SNPs, sendo SNPs de alta qualidade com pelo menos 60 pb de sequência flanqueante sem SNPs adicionais, efetivamente prontos para a construção de um chip de genotipagem Infinium (Illumina) ou Axiom (Affymetrix). No método Cornell-GbS foram geradas 194,6 milhões de sequências, apresentando SNPs genotipados, sendo SNPs com qualidade e consistência de declaração de genótipo nas replicatas. Em conclusão, estes experimentos iniciais são inéditos para o cajueiro e resultaram na descoberta de mais de SNPs de alta qualidade, que permitem agora o desenvolvimento de um sistema de genotipagem em larga escala para genótipos de cajueiro (previsto para 2015). 95

97 R61-Initial characterization and crystallization of a novel bacterial protease selected in a metagenomic approach Muhammad Faheem, J.F.D., Souto, B.M., Quirino, B.F., Álvares, A.C.M.., Freitas, S.M. de, Barbosa, J.A.R.G. Laboratório De Biofísica In the past decades sophistication in the sequencing techniques has advanced the microbial genomic data collection. Metagenomics technique has also played a very important role in the collection of this significant amount of microbial genomic data. This huge amount of genomic data has a great importance in terms of discovery of new microorganisms, evolutionary studies and their role in a specific environment. One of the current focuses in science is to seek the interpretation and transformation of the collected genomic data into functional proteomics data. The combination of structural biology and genomic data is one way to achieve such goal. Structural biology and X-ray crystallography are now mature fields of science that have evolved a lot in the 20th century. This has led to more than 100,000 biomacromolecular structures available online to the scientific community. Here we have aimed to produce a novel protein crystallographic structure found in a metagenomic approach. This research utilized a DNA library from a previous study consisting of cloned vectors derived from metagenomics of microbial population isolated from the gut of Capra aegagrus hircus. The vectors were sequenced and screened for genes using bioinformatics tools to define Open reading frames (ORF). Initial sequence analysis led to characterize the ORF as an uncharacterized novel bacterial cell-wall modifying enzyme. It carries 2 domains, a peptidoglycan binding domain and protease domain with cysteine protease active site. We have successfully cloned, expressed and purified this gene/protein. Autoproteolytic activity has been observed for the purified protein, which was inhibited with protease inhibitors cocktail. Protein has also shown binding towards ampicillin, which is characteristic of most of the bacterial cell-wall modifying enzymes. This binding was further evaluated with fluorimetric analysis. Crystallization trial has been performed for the purified protein and some initial crystals are obtained. In this study we have successfully expressed, purified and performed a preliminary characterization of a novel bacterial protease selected in a metagenomic approach. Currently, we are screening for specific inhibitor for the protease and optimizing protease assays. The protein crystal refinement experiments are also in progress. Our future aim includes X-ray crystallographic structure solution of this novel protease with and without inhibitors and defining its function. Solution of this novel protease may lead to some novel bacterial cell wall synthesis mechanism. 96

98 R62-Bowman-Birk Protease Inhibitor from Vigna unguiculata Seeds Enhances the Action of Bradykinin Related Peptides Alice da Cunha Morales Álvares, Luciano Paulino da Silva, Gustavo Pedrino, Elisabeth Schwartz, Sonia Maria de Freitas. The hydrolysis of bradykinin (Bk) by different classes of proteases in plasma and tissues leads to a decrease in its half-life. Here, Bk actions on smooth muscle and in vivo cardiovascular assays in association with a protease inhibitor, Black eyed-pea trypsin and chymotrypsin inhibitor (BTCI) and also under the effect of trypsin and chymotrypsin were evaluated. The structural features of BTCI and its inhibitory activity, in the presence of Bk-related, were investigated by spectrophotometry, static fluorescence spectroscopy methods and circular dichroism. The in vitro and in vivo experiments of Bk-related peptides in the presence or absence of BTCI in vivo were performed to assess smooth muscle contraction effects and cardiovascular responses induced by intravenous administration, respectively. BTCI forms complexes with Bk and analogues at ph 5.0, 7.4 and 9.0. Formation of BTCI-Bk complexes is probably driven by hydrophobic forces, coupled with slight conformational changes in BTCI. In vitro assays using guinea pig (Cavia porcellus) ileum showed that Bk retains the ability to induce smooth muscle contraction in the presence of BTCI. Moreover, no alteration in the inhibitory activity of BTCI in complex with Bk and analogous was observed. When the BTCI and BTCI-Bk complexes were tested in vivo, a decrease of vascular resistance and consequent hypotension and potentiating renal and aortic vasodilatation induced by Bk and Bk2 infusions was observed. These results indicate that BTCI-Bk complexes may be a reliable strategy to act as a carrier and protective approach for Bk-related peptides against plasma serine proteases cleavage, leading to an increase in their half-life. These findings also indicate that BTCI could remain stable in some tissues to inhibit chymotrypsin or trypsin-like enzymes that cleave and inactivate bradykinin in situ. Keywords: Black-eyed pea Trypsin and Chymotrypsin Inhibitor, Bradykinin, Hypertension. Supported by UnB, CNPq and CAPES. 97

99 R63-Workflow para reconstrução in silico de redes metabólicas de fungos Waldeyr Mendes Cordeiro da Silva; Maria Emília Machado Telles Walter Bioinformática O metabolismo pode ser classificado em primário e secundário. O metabolismo secundário é abundante em fungos filamentosos que vivem no solo, por influência de competição ambiental e são geralmente produzidos após um crescimento celular ativo. Alguns metabólitos são encontrados em fungos relacionados, enquanto outros são encontrados apenas em uma ou algumas espécies. A reconstrução de redes metabólicas in silico permite identificar importantes interações bioquímicas, bem como porporciona uma visão sistêmica dos processos metabólicos do organismo de interesse. Foram desenvolvidas várias ferramentas e métodos para reconstrução in silico de redes metabólicas em escala genômica. Os métodos disponíveis de reconstrução in silico de redes metabólicas são semi-automatizados e a cura das vias metabólicas preditas é realizada com trabalho manual, baseado na literatura e experimentos laboratoriais. Objetivo: Propor um método automatizado para reconstrução in silico de redes metabólicas, com ênfase no metabolismo secundário de fungos. Estudaremos a expressão gênica de metabolismo secundário em fungos e os métodos e ferramentas para sua predição, afim de integrá-las ao workflow. Criaremos um Pathway Genome Database (PGBD) de reações e vias metabólicas de fungos que inclua metabolismo secundário. Com o workflow definido, reconstruiremos automaticamente as redes metabólicas dos organismos com base no PGDB criado. Geraremos a vizualização das redes reconstruídas. Proveremos acesso web às redes reconstruídas. Esperamos automatizar o processo de reconstrução de redes metabólicas in silico com acurácia nas predições, tendo como base um PGDB especializado em fungos, incluindo seu metabolismo secundário. Construiremos interfaces para manipulação do workflow e para consulta às redes reconstruídas. Esperamos ainda, tornar o processo colaborativo, para que o PGDB base possa ser frequentemente atualizado. 98

100 R64-Seleção in silico de sequências de imunoglobulinas produzidas por tecnologia de phage display Tainá Raiol Alencar, Christiane Nishibe, Andréa Q. Maranhão. Dentre as tecnologias usadas na produção de anticorpos recombinantes, destaca-se a expressão de peptídeos em fagos filamentosos (phage display). Tal método permite produzir bibliotecas de imunoglobulinas específicas para um antígeno de interesse, cujas sequências podem ser obtidas por sequenciamento de nova geração. No entanto, a busca por sequências candidatas à produção em larga escala a partir de dados NGS tem sido um desafio devido ao enorme volume de sequências geradas. Diante disso, o presente trabalho tem por objetivo desenvolver um pipeline computacional para analisar a variabilidade e o enriquecimento de bibliotecas produzidas por phage display bem como para selecionar in silico sequências candidatas. O pipeline desenvolvido segue dois critérios de seleção: as sequências devem ser enriquecidas no round 3 e reconhecidas como domínios variáveis completos. Todos os scritps foram implementados em linguagem perl. Como estudos de caso, estão em processo de análise dois conjuntos de dados, gerados pelas plataformas 454 Roche e Illumina. Em uma análise preliminar dos dados de sequenciamento 454 Roche, observou-se maior riqueza de sequências no round 0, tanto para domínios VH quanto para VL. A partir das bibliotecas dos domínios variáveis, foram selecionadas como sequências candidatas apenas uma sequência VH e uma sequência VL. O trabalho desenvolvido até o momento permitiu identificar pontos a serem aperfeiçoados nos scritps do pipeline, tais como o aumento da sensibilidade do programa de cálculo de sequências únicas, a fim de produzir uma estimativa mais confiável da riqueza das bibliotecas. No que diz respeito aos dados Illumina, os quais possuem reads paired-end, será implementado um script de montagem dos pares R1/R2 para obter uma sequência consenso que possua os domínios variáveis VH e VL completos. Sendo assim, este trabalho demonstra ser de grande relevãncia para o grupo de Imunologia Molecular, pois novos experimentos de phage display poderão ser realizados visando testes biológicos, num conjunto mais restrito de sequências de imunoglobulinas com expectativas de especificidade pelo antígeno de interesse. 99

101 R65-Papel de antioxidantes endógenos como parte do sistema adaptativo de um anfíbio para sobrevivência nas secas da Caatinga Daniel Carneiro Moreira, Marcelo Hermes Lima. Laboratório De Radicais Livres Pleurodema diplolistris é um anuro que estiva durante a seca na Caatinga e como estratégia de sobrevivência enterra-se no solo a profundidades que podem chegar a um metro. A fisiologia e ecologia da estivação de P. diplolistris é bem conhecida, entretanto pouco se sabe sobre o papel do sistema de defesa antioxidante e proteínas de choque térmico na estivação de P. diplolistris. Diferentemente de estudos nos quais a depressão metabólica é induzida em laboratório este projeto analisará animais em seus ambientes naturais e todas as variáveis associadas. Desta forma, pretendese entender os mecanismos de regulação de componentes citoprotetores durante a depressão metabólica em condições naturais. Os objetivos gerais deste projeto são: identificar ajustes do sistema antioxidante, avaliar o estado redox intracelular e elucidar os mecanismos moleculares pelos quais o sistema antioxidante é regulado em diferentes órgãos do anuro P. diplolistris durante a depressão metabólica na estivação. São objetivos específicos do projeto: (a) analisar e identificar diferenças qualitativas e quantitativas dos perfis proteicos; (b) obter sequências parciais de genes e determinar níveis de RNAm de proteínas do sistema antioxidantes ou relacionadas a ele (catalase, Se-GPX, GST, GCL, PRXs, Mn-SOD e CuZn-SOD); (c) determinar a atividade de enzimas antioxidantes e enzimas relacionadas ao sistema antioxidante (catalase, G6PDH, GPX, Se-GPX, GR, GST, Mn-SOD e CuZn-SOD); (d) determinar as concentrações dos antioxidantes não-enzimáticos ácido ascórbico, ácido úrico e glutationa; (e) quantificar e localizar os fatores de transcrição Nrf-2 e FoxOs; (f) quantificar heat shock proteins (Hsp10, Hsp40, Hsp70 e Hsp110); (g) medir marcadores de dano oxidativo a diferentes biomoléculas (proteínas carboniladas, TBARS, hidroperóxidos lipídicos, 4-hidroxinonenal e 8-oxo-7,8-dihidrodesoxiguanosina); (h) relacionar condições ambientais e aspectos fisiológicos das alterações do sistema antioxidante. 100

102 R66-Procurando para um peptídeo sinal para expressar proteínas em diferentes tipos de células de mamíferos Carolina Veónica Attallah; Ricardo Kratje; Marina Etcheverrigaray; Marcos Oggero Laboratorio De Cultivos Celulares. Facultad De Bioquímica Y Ciencias Biológicas. Universidad Nacional Del Litoral. Ciudad Universitaria. Paraje  Œel Pozoâ S/N Cc Santa Fe. Argentina. A maioria dos bioterapêuticos à base de glicoproteínas é produzida em linhagens celulares de mamíferos, porque as modificações pós-traducionais devem ser idênticas ou, pelo menos, semelhantes às obtidas em humanos. Embora as células de ovário de hamster chinês (CHO) são as mais prevalentes para produzi-los, também as células de rim embrionário humano (HEK)-293, e mieloma de camundongo (NS0) estão a ser utilizadas como linhagens celulares de alta produtividade. Por outro lado, os peptídeos sinal capazes de dirigir eficazmente a secreção de proteínas em mamíferos, são elementos chave na produção de proteína recombinante. A fim de estudar a eficácia de diferentes peptídeos sinal para dirigir a secreção da proteína verde fluorescente (GFP) e uma proteína de fusão scfv-fc, as linhagens celulares CHOâ K1, HEK293 e NS0 foram transfectadas de forma transiente e estável. Os peptídeos sinal derivados da azurocidina humana (AZ), albumina humana (msa), da região V MOPC-63-III da cadeiakappa de uma Ig decricetulus griseus (migkc) e da região VG V-III da cadeiakappa de uma Ig humana (migkh), foram avaliados. A eficácia dos peptídeos sinal foi medida por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo para a GFP, e a eficiência da secreção da proteína de fusão foi analisada por ELISA indireto específico a partir do sobrenadante de cultura de cada linhagem celular. Embora a secreção seja um gargalo na expressão da proteína, o peptídeo sinal msa é capaz de dirigir a proteína para a via de secreção em diferentes tipos de células de mamíferos. Neste trabalho, nós designamos este peptídeo sinal como uma boa sequência para a expressão de proteínas recombinantes, inclusive anticorpos recombinantes, em diferentes linhagens de células de mamíferos, em ambas as condições de transfecção transiente e estável. 101

103 R67-Validação funcional de neuropeptídeos de Anthonomus grandis via silenciamento gênico Ana Gabriela Borges Leite, Roberta Ramos Coelho, José Dijair Antonino de Souza Junior Alexandra Augusto Pereira Firmino, Maria Fátima Grossi de Sá. O algodão é uma das principais commodities no Brasil e alvo de uma grande variedade de insetos praga, que causam perdas significativas à produção. A principal praga do algodão no Brasil é o Anthonomus grandis (bicudo-do-algodoeiro) e seu principal método de controle inclui o uso de inseticidas, contribuindo para o aumento nos custos de produção. Devido a esta demanda, a biotecnologia vem sendo aplicada ao desenvolvimento de novas ferramentas de controle. Entre as diferentes abordagens biotecnológicas, a técnica do silenciamento gênico por RNA interferente vem sendo utilizada como potencial de ser aplicada ao controle desta praga. A atual disponibilidade do banco de dados do transcritoma de A. grandis é uma fonte de genes que podem ser validados por esta técnica. Neuropeptídeos são moléculas alvo em potencial, já que atuam no sistema nervoso dos insetos e são importantes em processos como metamorfose e metabolismo. Assim, o objetivo do estudo é realizar a validação funcional de três neuropeptídeos, NP1, NP2 e NP3 no desenvolvimento de A. grandis via RNA interferente. Os perfis de expressão dos neuropeptídeos durante o desenvolvimento de A. grandis foram avaliados por RT-qPCR utilizando cdnas de ovo, larvas de 1, 2 e 3 instares, pré-pupa, pupa e adultos machos e fêmeas. Os fragmentos gênicos de aproximadamente 200pb de cada neuropeptídeo foram clonados no vetor pcr2.1 TOPO TA em Escherichia coli cepa XL1-Blue para NP1 e NP2. NP3 foi subclonado no vetor pdonr 221, utilizando a enzima BP clonase, transferido por recombinação para o vetor pl4440gtwy e utilizada Escherichia coli cepa OmniMAX2-T1R. As clonagens foram confirmadas através de digestão do vetor e sequenciamento. O acúmulo de transcritos de NP1, NP2 e NP3 foi maior em adultos. No momento, está em andamento o estudo do silenciamento destes neuropeptídeos para validar sua importância no desenvolvimento deste inseto e a possibilidade do uso para o desenvolvimento de novas ferramentas no controle desta praga. 102

104 R68-Caracterização dos principais mecanismos fisiopatológicos envolvidos com a sintomatologia dos acidentes gerados pelo peixe Pimelodus maculatus e avaliação da atividade proteolítica do extrato proteico de sua peçonha. Beatriz Elena Sarmiento Certuche, Elisabeth F. Schwartz Os acidentes gerados pelos animais aquáticos, marinhos e fluviais são muito comuns, e a maioria deles ocorre de maneira incidental gerando processos dolorosos como necroses, mutilações, perda de movimento e até mortalidade. A sintomatologia dos acidentes gerados por peixes marinhos é amplamente conhecida; entretanto, os estudos de caracterização dos acidentes provocados por peixes de água doce ainda são poucos. Dentre os acidentes causados por animais aquáticos no Brasil, a maioria dos casos são causados por bagres marinhos e de água doce.pimelodus maculatus é um peixe de água doce muito comum nas bacias brasileiras, responsável pela a maioria dos acidentes com esses animais, principalmente entre os pescadores, e cujas características e mecanismos patológicos do veneno são pouco conhecidos. No presente estudo, foram caracterizados os principais mecanismos fisiopatológicos associados com a manifestação clínica (dor, inflamação local e edema) dos acidentes gerados pelo extrato proteico da peçonha do peixe P. maculatus. Os espécimes usados neste trabalho foram coletados no alto curso do Rio Paraná, no município de Três Lagoas, Mato Grosso do Sul, sob licença do Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade ICMBio no Os ferrões foram extraídos e raspados, estimando-se que o extrato proteico bruto de um ferrão de P. maculatus (EPBF) contém aproximadamente 100 µg de proteína, provavelmente a quantidade de material proteico envolvido no envenenamento. Durante todas as fases do experimento os procedimentos foram realizados de acordo com as normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal, e autorizado pelo Comitê de ética em Uso Animal da Universidade de Brasília sob licença no.(63468/2014). O EPBF gerou um marcado efeito nociceptivo e edematogênico. As alterações na permeabilidade vascular foram evidentes caracterizando assim o efeito inflamatório gerado pelo EPBF. Além disso, o EPBF induziu uma ligeira diminuição na força de contração no coração in situ em rã, não provocou hemorragia ou alterações nos tempos de coagulação (tempo de protrombina e tromboplastina parcial ativada), mas induziu alterações significativas nos níveis de CK e CK-MB em camundongos. A atividade proteolítica gerada pelo EPBF foi observada sob caseína, elastina e colágeno, evidenciando a presença de proteases no veneno que favorecem sua difusão no tecido e, em decorrência favorecendo o envenenamento. Por tanto, neste estudo, se apresenta a correlação entre os efeitos obtidos experimentalmente e os principais sintomas observados nos acidentes com o peixe P. maculatus. 103

105 R69-Detecção e Caracterização de Proteínas Parasporina em Isolados de Bacillus thuringiensis Citotóxicas a Células de Câncer Humano Elias Ferreira Sabiá Júnior; Érica Soares Martins; José Raimundo; Rose Gomes Monnerat. Laboratório De Bactérias Entomopatogênicas (Embrapa Cenargen) A bactéria Gram-positiva Bacillus thuringiensis (Bt) é amplamente conhecida devido a sua grande importãncia no controle biológico, graças a sua capacidade de produzir inclusões cristalinas formadas por proteínas inseticidas (Cry e Cyt), ativas contra algumas espécies de insetos. Recentemente, uma nova atividade, a citotoxicidade contra células cancerosas humanas foi relatada para cristais sem atividade inseticida. Essas proteínas citotóxicas, chamadas de Parasporinas, não são hemolíticas e são estruturalmente diferentes das proteínas Cry e Cyt. Esse trabalho teve como objetivo identificar genes da família de parasporina através de diferentes marcadores moleculares, analisar o perfil proteico dessas estirpes e avaliar sua toxicidade para linhagens de células tumorais. Foram desenhados iniciadores específicos para identificação dos genes dos grupos de Parasporina a partir de dados depositados no GenBank. O perfil proteico foi analisado através de SDS-PAGE, e a toxicidade das proteínas foram analisadas através de ensaio de MTT. 270 estirpes foram selecionadas aleatoriamente do banco de bactérias entomopatogênicas da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. 36 estirpes apresentaram padrões de amplificação para os genes deparasporina 1 e 3. O perfil proteico sugere que as proteínas secretadas por algumas estirpes possuíam o tamanho esperado para o grupo de Parasporina (aproximadamente 81 e 88 kda). As proteínas das estirpes testadas não mostraram toxicidade contra as linhagens tumorais DU-145 e HeLa. Proteínas de duas estirpes mostraram toxicidade a células tumorais de mama MCF- 7. Tanto as provas bioquímicas quanto moleculares mostraram a presença de estirpes de Bt que possuem e expressam o gene deparasporina, o qual se mostraram tóxicos para linhagens específicas de cãncer. A próxima etapa do trabalho inclui o sequenciamento do gene das proteínas Parasporina, a purificação, avaliação do tipo de morte celular induzido por essas toxinas e a possível utilização como marcador tumoral. 104

106 R70-Desenvolvimento de Bioprocesso para a Produção de Álcoois por Linhagem de Clostridium acetobutylicum Modificada Geneticamente Myrna Barbosa Gomes, Luiz André Felizardo Schlittler, Fernando Araripe. Biotecnologia De Levedura A produção de energia usando recursos naturais renováveis é uma das mais urgentes tarefas de nosso tempo. Fontes limitadas de combustíveis fósseis, instabilidade no preço do petróleo e a necessidade de reduzir as emissões de dióxido de carbono na atmosfera estimulam a necessidade de se explorar novas tecnologias na produção de combustíveis líquidos usando matéria-prima renovável. Entre os biocombustíveis produzidos atualmente o butanol (1-butanol, n-butanol), desperta particular interesse, devido a características energéticas que o tornam um combustível promissor para motores de combustão. Entretanto, a engenharia metabólica em Clostridium acetobutylicum para a produção de butanol é particularmente difícil de ser realizada uma vez que as vias fermentativas são bastante ramificadas e não há conhecimento detalhado dos seus circuitos regulatórios. O objetivo desse trabalho é desenvolver um bioprocesso envolvendo modificações genéticas em cepas dec. acetobutylicum para o aumento da produção industrial de álcoois a partir de sacarose. Escherichia coli K12 foram transformadas com o plasmídeo contendo o gene da metiltransferase. O DNA metilado foi testado por digestão com Fnu4HI (isoesquisômero de Cac184). AsE. coli foram testadas quanto à metilação no DNA exógeno e os resultados indicaram que a cepa mutante é capaz de metilar qualquer material genético. A otimização da produção de álcoois a partir do caldo de cana será realizada através de modificações genéticas, de deleção dos genesbuk epta e inserção do genesadh, que resultarão na alteração das características fisiológicas do micro-organismo, influenciando significativamente a concentração final dos produtos de interesse. Entre os resultados esperados estão: o aumento da produção de butanol e etanol, aumento da tolerãncia aos álcoois pelos clostrídios modificados e a otimização do bioprocesso de produção. As perspectivas são seleção de linhagem dec. acetobutylicum com maior tolerãncia a butanol; deleção do gene de interesse da linhagem resultante; construção de vetor para expressão do gene transformação dec. acetobutylicum; seleção de clones produtores de álcoois; avaliar a produção de álcoois em escala laboratorial em meio contendo sacarose. 105

107 R71-Desenvolvimento de uma linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae para fermentação de amido Daniel Pereira de Paiva, Lidia Maria Pepe de Moraes. Biotecnologia De Leveduras O amido é o carboidrato com maior abundância de biomassa depois da celulose e é a principal forma de armazenamento energético em plantas vasculares, sendo encontrado em sementes de cereais como cevada, trigo, milho e arroz, e em tubérculos e raízes como batata, batata-doce, mandioca e sorgo sacarino. A levedura Saccharomyces cerevisiae, tradicionalmente utilizada para produção de etanol em escala industrial, é incapaz de metabolizar amido. O desenvolvimento de uma levedura recombinante capaz de coproduzir glicoamilase e α-amilase, tornando-a capaz de hidrolisar o amido e utilizar o açúcar obtido para produção de etanol em apenas uma etapa, tornaria este processo mais economicamente viável. Com a perspectiva de aplicação comercial da linhagem JP1 amilolítica, modificações genéticas são necessárias para atender questões de biossegurança exigidas pela CTNBio. Para isso, o gene STE5, cujo produto pertence à via de sinalização do ferôrmonio e é essencial para o funcionamento desta, foi deletado; e o gene IME1, cujo produto é o principal indutor de meiose em leveduras ativando a transcrição dos genes meióticos iniciais, também será deletado. As linhagens industriais são geneticamente e fisiologicamente mais adaptadas ao processo estressante de fermentação, tendendo a dominar o processo. Ademais, é sabido que alguns promotores de linhagens de laboratório não funcionam da mesma maneira em linhagens industriais. Para determinar quais promotores serão utilizados para produção das enzimas, foram construídos 16 plasmídeos usando egfp como gene reporter sob controle de oito diferentes promotores amplificados de linhagens laboratorial (S288c) e industrial (JPU, linhagem JP1 auxotrófica). A força dos promotores foi comparada em duas linhagens (CEN.PK2 e JPU). Resultados preliminares demonstraram que os promotores TEF1, HXT7, PGI1 e ADH1 de diferentes origens possuem diferença significativa quando expressos em JPU. Portanto selecionamos o promotor PGK1 por não apresentar diferença significativa e por estar no cassete contendo a glicoamilase; e o cassete ADH1 oriundo de JPU para construção do cassete contendo a α-amilase por já ter sido demonstrado em trabalhos anteriores que essa é a combinação mais apropriadas para os genes das enzimas que serão utilizadas. 106

108 R72-Análise comparativa do genoma e caracterização do gene DNA photolyase de isolados de Pseudoplusia includens SNPV Saluana Rocha Craveiro, Zilda Maria Araújo Ribeiro, Peter Ward Inglis, Roberto Goti Togawa, Priscila Grynberg, Fernando Lucas Melo, Bergmann Morais Ribeiro, Maria Elita Batista de Castro. Lab. Virologia De Inseto - Embrapa Cenargen A família Baculoviridae compreende um grupo de vírus artrópodes específico com DNA fita-dupla circular. A família Baculoviridae é formada pelos gêneros Alphabaculovirus (NPVs específicos de lepidópteros), Betabaculovirus (GVs específicos de lepidópteros), Gammabaculovirus (NPVs específicos de himenópteros) e Deltabaculovirus (NPVs específicos de dípteros). Os Alphabaculoviruses estão divididos nos Grupos I e II, com base nas suas proteínas de fusão do envelope viral, proteína F e GP64, respectivamente. A função do gene p26 não está bem definida, mas acredita-se que a proteína P26 é necessária para a ótima oclusão dos vírions no poliedro. O gene p26 foi identificado no genoma dos NPVs até o momento sequenciados e foi utilizada ferramentas de bioinformática a fim de caracterizar a proteína P26 e elucidar a evolução deste gene na família Baculoviridae. As cópias do gene p26 encontradas nos baculovírus estão conservadas na posição adjacente ao gene p10 (P1) em todos os NPVs contendo uma única cópia, adjacente ao gene iap-2 (P2) em todos os NPVs do Grupo II contendo a segunda cópia do gene p26 e adjacente ao os genes ptp1 e ptp2 (P3) nos NPVs do Grupo I com a segunda cópia do gene p26. A árvore filogenética Bayesiana obtida a partir das cópias da protéina P26 encontradas no genoma dos NPVs mostrou quatro clados claramente definidas (IA, IB, IIA e IIB) suportando a hipótese da ocorrência de três eventos independentes de captura do gene p26 pelos baculovírus. A presença de sítios de clivagem dos peptídeos sinal nas sequências de aminoácidos da proteína P26 foi analisada e apenas no clado IB foi observada a presença de peptídeo sinal. Embora a função da proteína P26 não é bem conhecida, o peptídeo sinal pode provocar diferenças na atividade das proteínas do clado IB indicando sua possível função distinta das de outras classes de proteínas P26. No entanto, novos estudos são necessários para uma melhor compreensão da função dessa proteína nos baculovírus. 107

109 R73-Genome sequencing and comparative analysis of the biocontrol agent Trichoderma harzianum Andrei Stecca Steindorff, Igor Grigoriev, Eliane Ferreira Noronha. Biological control is a complex process which requires many processes. The species f T. harzianum are well known for their biocontrol activity against many plant pathogens. To gain new insights into the biocontrol mechanism used by T. harzianum, we sequenced the isolate TR274 genome using a combination of 2x100bp and 2x250bp Illumina reads. The assembly was performed using AllPaths-LG with a maximum coverage of 100x. The assembly generates 2282 contigs with a N50 of The genome size generated was 40.8 Mb and the GC content was 47.7%, an expected value when compared with other Trichoderma genomes. The mitochondrial genome was assembled and generate a contig with 27.7 Kb. The genome annotation pipeline, using a combination of ab initio and homology methods, modeled genes (74.6% spliced genes) with a high transcriptome support. To check the genome reliability, CEGMA analysis was performed showing a 100% coverage. The phylogenetic comparison using orthologous proteins with all Trichoderma genomes sequenced at JGI, corroborates the Trichoderma (T. asperellum and T. atroviride), Longibrachiatum (T. reesei and T. longibrachiatum) and Pachibasium (T. harzianum and T. virens) section division described previously. The comparison between two Trichoderma harzianum species suggests a high genome similarity, in contrast with the harzianum complex concept. The secondary metabolites and glycoside hydrolases contraction and expansion were analysed. The Pachybasium section expanded its secondary metabolites arsenal compared with the other sections. Glycosyde hydrolases also expanded in Pachybasium section, as well as the Pectate lyases and Carbohydrate esterases categories. These results suggests that these proteins families has an important role on mycoparasitism and plant interaction. Future analysis will improve the understanding of this complex genus and give some insights about its lifestyle and the interactions with the environment. 108

110 R75-Uso do gene amds (acetamidase) como uma marca de seleção dominante e reciclável em Pichia pastoris Luíza Cesca Piva, Viviane Castelo Branco Reis, Fernando Araripe Gonçalves Torres. Biotecnologia De Leveduras A levedra Pichia pastoris foi estabelecida como sistema de produção de proteínas heterólogas graças a vantagens como: altas densidades celulares, padrão de glicosilação semelhante ao de mamíferos e secreção eficiente de proteínas. Para que diversas modificações sejam introduzidas na levedura, faz-se necessário o uso de múltiplas marcas de seleção ou de estratégias que permitam a sua reutilização. O gene amds de Aspergillus nidulans permite a seleção de leveduras em meio de cultura contendo acetamida como única fonte de nitrogênio e a contra-seleção em meio contendo a droga fluoroacetamida. Neste trabalho, o uso da marca amds será testado em P. pastoris e, como prova de conceito, serão feitas deleções sequenciais dos genes ADE2 e URA5, reciclando a marca com o sistema Cre-lox de recombinação sítio-específica. A análise do genoma de Pichia pastoris revelou a presença do gene de uma proteína hipotética da família das amidases. A expressão desse gene em meio complexo foi demonstrada por experimentos de RT-PCR. Para evitar sua interferência na seleção baseada no crescimento em acetamida, foi criada a linhagem LA1 na qual o gene hipotético foi interrompido com a marca de seleçãosh ble (resistência à droga zeocina). Paralelamente, a partir do vetor comercial ppic9 (Invitrogen) foi construído o vetor ppic9amds contendo o gene amds e um gene repórter (GFP). Tanto a linhagem LA1 quanto X33 foram transformadas com o vetor ppic9amds sendo que a primeira forneceu 100% de clones positivos e a segunda 26% de falsos positivos. Em seguida, o gene ADE2 foi deletado da linhagem LA1, utilizando um cassete com a marca amds flanqueada por sequências loxp. A excisão tanto da marca Sh ble quanto da marca amds foi feita utilizando um plasmídeo replicativo contendo a recombinase CreA. A excisão será feita também utilizando a contra-seleção com fluoroacetamida para selecionar células que excisaram a marca por recombinação. A seguir será feita a deleção do gene URA5 utilizando a mesma estratégia. A integração do vetor contendo o geneamds mostrou que esta nova marca de seleção é aplicável em P. pastoris, especialmente na linhagem LA1. Essa nova ferramenta traz alternativas na manipulação genética da levedura, reduzindo problemas como a expressão de diversos marcadores dominantes. 109

111 R76-Detecção de genes de enterotoxinas STX-1 e STX-2 em Escherichia coli pertencentes ao banco de germoplasma do Laboratório de Microbiologia Médico Veterinária da Universidade de Brasília Yara Cavalcante Vieira, Simone Perecmanis, Ana Paula Paiva de Faria, Simone Perecmanis. Laboratório De Microbiologia Médico Veterinária Escherichia coli é um importante patógeno para animais sendo que as colibaciloses suínas são ocasionadas principalmente por cepas enterotoxigênicas e representam as principais causas de mortes em plantéis suinícolas, englobando doenças como a colibacilose neonatal, a colibacilose da terceira semana, a diarréia pós-desmame e a doença do edema. As Verotoxinas ou Toxinas de Shiga (Stx-1 e Stx-2) são produzidas por E. coli Enterohemorrágicas (EHEC) que causam a doença conhecida como colite hemorrágica, com quadro severo de diarreia sanguinolenta. Neste trabalho foram estudadas 127 cepas de Escherichia coli pertencentes ao Banco de Germoplasma do Laboratório de Microbiologia Médica Veterinária da Universidade de Brasília e isoladas de suínos hígidos escolhidos aleatoriamente em rebanhos do Distrito Federal, com o objetivo de detectar a presença dos genes codificadores das enterotoxinas Stx-1 e Stx-2 através da técnica de PCR. Do total de amostras analisadas, duas (1,6%) apresentaram-se positivas para Stx-2 e nenhuma positiva para Stx-1, podendo-se verificar a presença de genes codificadores da enterotoxina Stx-2 em suínos sem sinais clínicos de diarreia, o que demonstra um risco para o desenvolvimento de doença entérica e consequente disseminação pelo plantel além de representar riscos ao consumidor humano. 110

112 R77-Análise da diversidade de Archaea em solos de Cerrado sensu stricto submetidos ou não a queimadas bienais Aline Belmok de Araújo Dias, Thiago Rodrigues De Oliveira, Heloísa Sinatora Miranda, Ricardo Henrique Krüger, Cynthia Maria Kyaw. Embora a proposta de classificação dos seres vivos em três Domínios tenha ocorrido há quase 25 anos, ainda são escassos os estudos sobre Archaea nos diferentes ambientes naturais do Brasil. O Cerrado é um extenso e importante bioma de nosso país. No entanto, existem poucos trabalhos que descrevem a diversidade e filogenia do domínio Archaea nos solos das diferentes fitofisionomias deste bioma. Além disso, queimadas são eventos ecológicos naturais do Cerrado e não existem estudos sobre o seu efeito na população de archaeas de solos deste ambiente. Este trabalho tem como objetivo avaliar e comparar a diversidade de Archaea em solos de cerrado sensu stricto que não sofrem queimada há aproximadamente 30 anos e solos que são queimados em regime bienal. Também foram feitas análises para a detecção do gene que codifica a subunidade A da enzima amônia monooxigenase de Archaea (amoa), de maneira a avaliar a ocorrência de archaeas oxidantes de amônia nas condições estudadas, tendo em vista sua importãncia no ciclo biogeoquímico do nitrogênio.amostras de solo coletadas na Reserva Ecológica do IBGE foram submetidas à extração de DNA total, que foi utilizado em ensaios de PCR com iniciadores específicos para os genes do rrna 16s e amoa do domínio Archaea. Os fragmentos amplificados foram clonados e transformados em Escherichia coli. O DNA plasmidial dos clones recombinantes foi extraído e submetido ao sequenciamento automático. Foram obtidas oito bibliotecas genômicas para os genes do rrna 16s e amoa de Archaea, com 288 e 187 sequências respectivamente. As análises do 16s mostraram que a grande maioria das sequências pertence ao filo Thaumarcheota e estão distribuídas entre os grupos I.1b e I.1c deste filo. Apesar da semelhança encontrada na riqueza de archaeas nos solos em ambas condições, as amostras de solo queimado bienalmente apresentaram maior abundância de thaumarchaeotas do grupo I.1b. Pode-se detectar a presença do gene amoa em ambas as condições, sugerindo a ocorrência da oxidação de amônia tanto em solos queimados bienalmente quanto no controle. Esses resultados fornecem informações acerca da diversidade de Archaea em solos de cerradosensu stricto e a detecção de genes amoa nas amostras indica a provável ocorrência da oxidação de amônia nesses solos, ressaltando a importãncia das archaeas na ciclagem do nitrogênio em solos. 111

113 R78-Desenvolvimento e validação de métodos inovadores para a garantia da qualidade do biodiesel e de suas misturas ao diesel Paula Marcela Duque Jaramillo; Léia Fávaro. Embrapa Agroenergia Depois da autorização de sua comercialização no país, o biodiesel assume importante papel na matriz energética nacional, chegando ao final de 2012 com produção anual de m3. No entanto, para garantia de sucesso do programa que o instituiu é fundamental conhecer os problemas técnicos da introdução desse combustível para que sejam propostas medidas que possam mitigar ou amenizar tais problemas. Atualmente, o monitoramento da qualidade do biodiesel é feito apenas na usina e nos postos de combustíveis, quando em mistura com o diesel. Nesse contexto, esse projeto propõe o desenvolvimento de metodologias inovadoras, com abordagem química e microbiológica, a partir do monitoramento do combustível em sua cadeia produtiva. O monitoramento químico será realizado segundo as Resoluções da ANP e com análises químicas complementares, ou seja, serão desenvolvidas metodologias com o objetivo de identificar produtos de degradação, contaminantes e adulterantes do combustível e detectar o estabelecimento de processos corrosivos na estocagem de interesse das cadeias de produção e comercialização do biodiesel. O monitoramento microbiológico será realizado por técnicas convencionais baseadas em cultivo microbiano e, adicionalmente, também por técnicas independentes de cultivo, tais como sequenciamento de genes ribossômicos e abordagem metatranscriptômica. Com a comparação de resultados utilizando técnicas tradicionais e avançadas será possível caracterizar qualitativa e quantitativamente a população microbiana, além de conhecer a atividade desses micro-organismos no processo de degradação deste combustível. Conhecendo a população microbiana e relacionando sua presença ou atividade fisiológica com os produtos de degradação do biodiesel, serão propostos e validados aditivos multifuncionais que possam inibir os processos degradativos. Esses aditivos podem vir a ser utilizados por usinas e distribuidoras de combustíveis, após regulamentação da Agência Nacional de Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis. 112

114 R79-Construção e caracterização de nanosensor para o monitoramento do influxo de xilose em Saccharomyces cerevisiae Christiane Ribeiro Janner; Viviane Castelo Branco Reis; Sônia Maria De Freitas; Fernando Araripe Torres. Biotecnologia De Leveduras Sensores fluorescentes têm sido utilizados para o monitoramento de íons e moléculas, permitindo a resolução temporal e espacial in vivo assim como sua quantificação. Nanosensores que possuem propriedades de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) permitem que mudanças conformacionais em uma molécula sejam detectadas por fluorimetria. Dentre os açúcares que poderiam ser detectados por nanosensores destaca-se a xilose, principal constituinte da hemicelulose e que não é naturalmente fermentada por Saccharomyces cerevisiae. Todavia, para tornar o etanol lignocelulósico viável, é necessária a cofermentação de glicose e xilose. Para tanto, várias modificações genéticas são necessárias, como a expressão de transportadores de xilose. O objetivo deste trabalho é a construção e a caracterização de um nanosensor de xilose para avaliar a eficiência de transportadores deste açúcar em S. cerevisiae. Primeiramente, foi desenhado um gene sintético que codifica para o nanosensor. Este é constituído por um domínio de ligação à xilose flanqueado por dois fluoróforos variantes da GFP (Green Fluorescent Protein). Uma versão do nanosensor com uma deleção parcial do domínio de ligação à xilose foi construída por meio de PCR. Os dois genes foram clonados e expressos com sucesso em Escherichia coli Rosetta. As proteínas foram purificadas a partir da fração solúvel por meio de cromatografia de afinidade em coluna de níquel. Seguiram-se ensaios de fluorimetria para verificar a ocorrência do FRET e a determinação da constante de dissociação (Kd). Também foram realizados ensaios em diversas temperaturas (25 C a 40 C) para a definição dos parãmetros termodinãmicos da interação do nanosensor com a xilose. Os ensaios demonstraram a ocorrência do FRET para o nanosensor intacto, mas não para o truncado, sendo necessários mais estudos estruturais para este. Para o nanosensor intacto, a Kd foi determinada entre 0,031 µm (25 C) e 0,022 µm (40 C). Os parãmetros termodinãmicos da interação foram: H = 4,118 kcal/mol; deltas = 20,696 cal/molk; deltag = -2,050 kcal/mol; determinando a interação como espontãnea. Ainda serão realizados ensaios com outros açúcares para verificar a afinidade do nanosensor somente por xilose. Além disso, o nanosensor será expresso em S. cerevisiae para analisar o influxo de xilose in vivo. 113

115 R80- Caracterização do resistoma do solo de Cerrado strictu sensu e potencial biotecnológico na biorremediação de amostras ambientais contaminadas com resíduos aromáticos Débora Farage Knupp dos Santos; Eliane F. Noronha; Georgios J. Pappas; Betania F. Quirino; Paula Istan; Ricardo Henrique Kruger. Enzimologia O estudo da resistência antimicrobiana vem priorizando cepas patogênicas clínicas. Assim, a diversidade ambiental dos genes de resistência é subestimada, apesar do conhecimento de que, no meio ambiente, microrganismos ainda não cultiváveis são maioria. Atualmente a metagenômica vem ao encontro desta necessidade. Na triagem de 2 bibliotecas metagenômicas de solo de Cerrado stricto sensu, isolou-se 62 clones resistentes dos quais 4 apresentam ORF com funções não relacionadas à resistência antimicrobiana clássica destacam-se as dioxigenases (DO). Então, propõe-se testar a ação simultãnea destas enzimas na resistência antimicrobiana e na degradação de aromáticos. O subclone CRB2(1) foi construído em pet24a, cuja indução foi otimizada com IPTG e lactose. A proteína foi purificada utilizandobeads magnéticos com Ni2+. Realizou-se ensaios fenotípicos para testar a resistência e viabilidade celular em carbenicilina e fenol e ensaios enzimáticos com a enzima purificada para classificá-la na família de DO. Ainda, realizou-se análises de bioinformática como a predição de estrutura secundária para identificação do domínio conservado, alinhamento com enzimas caracterizadas para construção de árvores filogenéticas e identificação de sítios de ligação ao metal. Os ensaios fenotípicos provam a dupla função na resistência antimicrobiana e ao fenol. Análises de sequência indicam presença de domínio bicupina, confirmado pela predição de estrutura secundária. Tais domínios estão presentes em diversas famílias enzimáticas, incluindo as DO. Nesta família, todas as gentisato 1,2-dioxigenases (GDO) são bicupinas. Os alinhamentos com outras GDO mostram os sítios de ligação ao metal, comum às extradiol-dioxigenases. Essas evidências estimularam a caracterização de CRB2(1) como uma DO especificamente uma GDO. O ensaio enzimático com o substrato ácido gentísico revelou atividade pela quebra à maleilpiruvato, quantificada pela absorbãncia a 330nm. Constatou-se que CRB2(1) é uma dioxigenase, a primeira DO metagenômica a ter atividade confirmada. Os próximos passos incluem acessar atividade em outros aromáticos, elucidar o mecanismo das resistências observadas e caracterizar a enzima quanto à temperatura e ph ótimos, reação a solventes e metais. 114

116 R81-Estratégias para Integração Múltipla de Vetores no Genoma de Pichia pastoris Maritza Ocampo Betancur; Viviane Castelo Branco Reis; Fernando Araripe Uma das abordagens empregadas no melhoramento genético de P. pastoris como sistema de expressão envolve o aumento dos níveis de transcrição do gene heterólogo, o que pode ser obtido aumentando-se o número de cópias do mesmo. O uso de marcas auxotróficas defectivas é uma estratégia para a obtenção de integrantes multicópia. Estas marcas consistem em genes com o promotor truncado o que diminui a taxa de transcrição e somente transformantes contendo alto número de cópias do vetor podem recuperar a prototrofia em meio seletivo. Ainda, para aplicações industriais, é importante que o cassete de expressão seja mitoticamente estável o que pode ser obtido por integração cromossômica do vetor de expressão. Contudo, como em Pichia a integração se dá por recombinação homóloga, é necessário haver no vetor sequências genômicas que propiciem esses eventos de integração múltipla. O foco deste projeto é identificar e comparar sítios repetitivos para integração no genoma em combinação com o uso da marca auxotrófica defectiva leu2-d, para aumentar os níveis de expressão de proteínas heterólogas em P. pastoris. Como alvos para integração múltipla serão avaliados os seguintes loci: PGK1, 28 S rdna, 5S rdna e regiões repetitivas dos cromossomos. O alelo leu2-d foi obtido por PCR a partir do genoma de S. cerevisiae e foi clonado no vetor ppick2. O gene repórter GFP foi clonado em seguida sob o controle do promotor PGK e P. pastoris M12 (Leu2-) foi transformada com o vetor resultante. Este vetor servirá como plataforma para clonar as diversas sequências repetitivas. Clones transformantes serão avaliados com relação à produção intracelular de GFP por citometria de fluxo para identificar clones que hiperexpressam o gene. O número de cópias integradas será avaliado por PCR em tempo real. Para validar a estratégia selecionada, será testada a expressão de um biofármaco, o fator de crescimento epidermal humano (hegf). Para produzir hegf intacto é preciso deletar o gene KEX1 na levedura. A deleção na linhagem M12 foi feita usando um cassete de deleção contendo sequências 5 e 3 do locus KEX1 flanqueando a marcable (resistência a zeocina) e contendo sítios loxp para remoção posterior da marca. Após transformação e identificação de clones kex1 por PCR a marcable foi eliminada usando-se a recombinase CreA. 115

117 R82-Estratégias de engenharia de leveduras para super produção de L-ácido lático Pollyne Borborema Alves de Almeida; Virgilio Hipólito Lemos De Melo; Nadielle Thamires Moreira Castro; Jéssica Carvalho Bergmann; Lucas Silva Carvalho; Beatriz Simas Magalhães; Nadia Skorupa Parachin. Biotecnologia De Leveduras Recentemente, a procura por materiais plásticos tem crescido exponencialmente. No entanto a maior parte dos plásticos produzidos nos dias atuais são originados de fontes petroquímicas, ou seja, não reciclável. Gerando acúmulo no meio ambiente de 140 milhões de toneladas por ano com expectativa de degradação estimada de um milhão de anos (1). Biomateriais são produtos naturais sintetizados e catabolizados por diferentes organismos e que têm encontrado amplas aplicações biotecnológicas. Os bioplásticos, também conhecidos como plástico-verde, são um tipo especial de biomaterial feito de matéria-prima de fontes renováveis, como biomassa de milho e cana-de-açúcar (2), além de serem biodegradáveis, facilitando a reciclagem. L-lactato (2-hidróxi ácido - propiônico) é amplamente utilizado em alimentos, produtos químicos, cosméticos e indústrias farmacêuticas. Além disso, é o monômero do Poli ácido lático (PLA), um bioplástico com amplas aplicações que vão desde embalagens de fibras a espumas (4).Atualmente, a produção de ácido lático é feita principalmente a partir de amido (6). No entanto, com o aumento da produção de biodiesel existe uma superprodução de glicerol, principal resíduo produzido durante a conversão do óleo vegetal em biodiesel. Sendo, o uso de glicerol considerado vantajoso por agregar valor à cadeia produtora deste biocombustível (7). Diferentes microrganismos foram geneticamente modificados para produzir ácido lático, mas na maioria dos casos, o açúcar é utilizado como substrato. Pichia pastoris, uma levedura metilotrófica, pode atingir uma elevada densidade celular usando glicerol bruto como fonte de carbono, sobreviver em níveis de ph baixo, embora não seja capaz de produzir ácido láctico. A engenharia genética pode tornar possível esta produção, a partir de super-expressão do gene que codifica a enzima Lactato desidrogenase (LDH) capaz de catalisar a conversão de piruvato em lactato. Neste estudo, pelo menos quatro genes diferentes que codificam para LDH serão testados para a produção de ácido L-lático em P. pastoris, de modo a permitir um rendimento elevado e produtividade de ácido lático a partir de glicerol bruto. Após obtenção das cepas modificadas geneticamente, serão realizadas fermentações em batelada para determinar quais as cepas recombinantes resultam em maior rendimento e produtividade do ácido L-lático. 116

118 R83- Desenvolvimento de um sistema de genética reversa para Tospovírus baseado em replicação de RNAs defectivos-interferentes (DIs) André Gustavo Machado Bertran, Anelise Orílio; Massimo Turina; Marina Ciuffo; Ricardo Lenzi; Filipe Leite, Renato De Oliveira Resende. Embora sejam vírus relatados desde o fim do século XIX e de causarem doenças de grande severidade em diversas variedades de plantas cultivadas em larga escala para fins alimentícios ou ornamentais, não existe ainda para os Tospovirus um clone infeccioso. Neste trabalho, a partir de moléculas sintéticas idênticas aos RNAs defectivos interferentes mais prevalentes e persistentes de Tomato spotted wilt virus (TSWV) e Groundnut ringspot virus (GRSV) foram produzidos cassetes de expressão contendo ribozimas ativas in cis no 5' e 3' das moléculas para transcrição in vitro e transfecção mediada por agrobactéria. Foram produzidas também versões modificadas dos DI RNAs contendo GFP fusionado ao interno da fase de leitura aberta (ORF) de modo a manter a fase (in frame) e alterando-a (disrupted frame). A expressão mediada por agrobactérias foi testada em diferentes ordens (2 e 4 dias pré e pós tratamento em relação a um tospovírus auxiliar) e com ou sem coinfiltração de supressores de RNAi (p19 e NSs). Foi possível detectar a expressão do transcrito dos DIs mas não a sua replicação pelo vírus auxiliar. Para os transcritos in vitro foi possível realizar detecção por meio de RT-qPCR de RNA dos DIs após 4 dias de inoculação, um tempo muito longo para um RNA sem CAP 5' e poli-a permanecer em uma folha sem estar sendo replicado ou ao menos protegido contra degradação pelo nucleocapsídeo viral. No momento, as construções contendo GFP estão em fase de conclusão para continuidade dos experimentos incluindo o sistema de culturas vegetais em protoplastos. Foram realizados também ensaios de indução de reassortment por meio de forte pressão seletiva para a manutenção de isolado recombinado partindo de um isolado mutante de TSWV que produz uma proteína NSs não-funcional e transcritos in vitro de S RNA tipo-selvagem provenientes de outro isolado de TSWV (BR20). 117

119 R84- Sw-5 gene cluster: understanding tomato resistance and susceptibility to Tomato spotted wilt virus Athos Silva de Oliveira, Richard Kormelink, Renato De Oliveira Resende Tomato spotted wilt virus (TSWV) is the runner-up of most economically/scientifically important plant virus since it causes significant losses on vegetable production. Up to now there are only two natural resistance sources against TSWV. One of them is the Sw-5b gene, a paralog of the Sw-5 gene cluster which was firstly reported in Solanum peruvianum and has been introgressed in many commercial cultivars of tomato (Solanum lycopersicon). The Sw-5 gene cluster codify putative Resistance (R) proteins, cellular receptors able to identify directly or indirectly the Avirulence (Avr) determinants from pathogens. In this study, we show that the cell-to-cell movement protein of TSWV (NSm) is the Avr of the Sw-5b-mediated resistance. In addition, high accumulation of Sw-5b upon its co-expression with RNA silencing suppressors (RSS) leads to auto-immunity in Nicotiana benthamiana. These two observations allowed us to analyze the Sw-5 homologs from resistant and susceptible tomatoes for Avr recognition and HR activation as uncoupled events. Truncated versions of the Sw-5 homologs were also analyzed, indicating the role of each main domain in such events. Finally, a single mutation has been found to be associated with loss-of-function in a Sw-5 homolog from susceptible tomato. 118

120 R85- Produção, purificação e caracterização de xilanases de Aspergillus foetidus e sua aplicação no aproveitamento de resíduos agroindustriais Bárbara Calheiros Neumann, Edivaldo Ximenes A conversão de biomassa em etanol tem um grande potencial econômico a baixos custos, e consiste na desconstrução da lignocelulose, que pode ser realizada através de hidrólise enzimática. A hidrólise enzimática da xilana, presente na parede celular da planta, é feita por um arsenal de enzimas cujo o principal componente é a xilanase. Os objetivos desse trabalho são: determinar a atividade de xilanase de Aspergillus foetidus crescido em meio líquido e sob agitação e na presença de bagaço de canade-açúcar (SCB) como fonte de carbono, purificação e caracterização físico-química e bioquímica dessa enzima. O fungo foi cultivado em frascos Erlenmeyer contendo meio de cultura líquido e SCB a 1%, em ph 7,0, durante 7 dias a 28 C sob agitação de 120 rpm. O Extrato Bruto obtido foi ultra-filtrado com membranas de 30 e 10 kda. A determinação da atividade de xilanase (expressa em UI/mL) foi realizada depois de cada etapa pela adição de 10μl de solução enzimática e 20μl de solução 1% (p/v) de xilana; a reação foi conduzida a 50ºC, durante 30 min e interrompida pela adição de 60μl de ácido dinitrosalicílico (4, 16) à temperatura de 97ºC durante 10 minutos em termociclador. A quantidade de açúcar redutor foi medida espectrofotometricamente a 540nm. O efeito da temperatura foi determinado através de ensaios enzimáticos no intervalo de C, e efeito do ph a 50ºC em valores de ph entre 2,5 e 8,0. A quantidade de proteínas foi determinada pelo Método de Bradford. As amostras enzimáticas foram submetidas a procedimentos de purificação por filtração em gel e troca iônica, com produção de zimogramas. O Extrato Bruto apresentou atividade de xilanases de 0,87 UI/mL. Após ultrafiltração em membrana de 30 kda, o ultrafiltrado teve 0,26 UI/mL. Após ultrafiltração em membrana de 10 kda, o concentrado (fração entre 10 e 30 kda) apresentou atividade de 0,73 UI/mL e concentração de proteínas de 0,234 mg/ml As maiores atividades de xilanases foram encontradas a 40ºC e em ph 7,0. Nos testes de termoestabilidade, a amostra reteve 74% da atividade a 40ºC após 96h. A filtração em gel dessa amostra com resina Sephadex G-50 e tampão Fosfato de Sódio 50 mm de ph 7,0 e NaCl 0,15 M foi capaz de separar a enzima do pigmento. Após essa etapa foi feita cromatografia de troca aniônica com coluna HiTrap DEAE Sepharose FF de 1 ml. Com o total de 34 tubos, foi encontrada atividade de xilanases nos tubos 1 a 6 e 10 a 12. O perfil encontrado em zimograma indica 2 xilanases parcialmente purificadas. Em continuidade a esse estudo, esperase obter amostras totalmente purificadas e analisar sua interação com alguns íons. Em paralelo, serão realizados estudos de pré-tratamento do bagaço de cana em diversas condições de temperatura, concentração e duração. 119

121 R86- Análise proteômica e genômica funcional de Clostridium thermocellum (Isolado B8) em diferentes fontes de carbono Brenda Rabello de Camargo; Karen Ofuji Osiro; André Murad; Jéssica Pinheiro; Eliane Noronha Ferreira. Clostridium thermocellum é uma bactéria gram positiva anaeróbica que produz um complexo enzimático composto de enzimas hidrolíticas e uma proteína estrutural CipA que sinergicamente degradam desde celulose cristalina e amorfa até estruturas mais complexas envoltas por lignina. Sua alta eficiência de degradação de materiais lignocelulósicos devida ao conjunto de classes diferentes de glicosil hidrolases e a presença de um módulo de ligação à celulose nomeado CBM tem proposto muitos estudos a respeito de sua modelagem e regulação. Perguntas sobre como essas enzimas são enviadas, e como o complexo é formado ainda não foram totalmente elucidados, principalmente o comportamento em fontes de resíduos agroindustriais encontradas no Brasil. Dessa forma esse presente estudo utiliza uma linhagem de Clostridium thermocellum isolada de rúmen de caprinos e biomassa de rejeitos da produção de bioetanol de primeira geração. Dados proteômicos a priori foram realizados do crescimento da linhagem B8 crescidos nos resíduos palha e bagaço de cana revelaram a identificação de glicosil hidrolases de atividades celulolíticas endo e exo e atividades hemicelulolíticas, demonstrando uma xilanase exclusiva em relação ao crescimento em celulose de fibra longa. As enzimas encontradas em maior porcentagem relativa à Cip A foram a Cel S ( exoglucanase) seguidas pela Cel J e Cel K também encontradas em trabalhos anteriores. Proteinas de estresse oxidativo como por exemplo a peroxirredoxina e proteínas de transporte de membrana e transporte de açúcar como Proteína de ligação ao soluto extracelular e ABC transporter foram encontradas associadas ao celulossoma podendo indicar relação na função ou montagem do complexo. Enzimas de síntese de etanol, acetato e lactato foram encontradas no sobrenadante demonstrando a utilização da biomassa pela bactéria chegando a esses produtos de interesse biotecnológico. Posteriormente a esses dados e tentando chegar á expressão diferencial dessas enzimas e sua regulação, as culturas da linhagem B8 foram crescidas em meio anaeróbico redutor em estufa a 60 C para realizar uma curva de crescimento e definir sua fase log para análise de RNAseq. Os substratos utilizados como fonte de carbono foram: celulose, palha de cana e bagaço de cana. Após realizacão da curva e visualizacão da fase exponencial em horas avaliado por OD a 600 nm e baseados em estudos anteriores foi definido que o tempo definido para coleta de células seria de 37 horas. Para extração de RNA, foram testados protocolos de extração utilizando RNA wizard(ambion), trizol (Invitrogen) e Invisorb (invitrogen). Para realizar a lise da bactéria foi testado o uso de beads, sonicação e lisozima (10 mg/ml). A extração que gerou melhores resultados foi com a utilização de beads e lisozima para a lise da parede bacteriana seguido por extração com Trizol. As amostras foram enviadas para sequenciamento em plataforma Illumina e os resultados serão analisados e validados 120

122 por PCR em tempo real para os transcritos selecionados de interesse. A parir desses dados gerados esperamos conseguir relacionar as enzimas de interesse com a biomassa utilizada, e como essas enzimas e proteínas estão reguladas dentro do metabolismo. 121

123 R87- Película de amido de milho no controle pós-colheita da antracnose em frutos tropicais Bruno Ferreira de Oliveira ; Luiz Eduardo Bassay Blum Diversas são as causas pelas perdas das frutas, e, dentre elas, principalmente as doenças. A antracnose, causada pelo fungo Colletotrichum complex. gloeosporioides (PHOULIVONG et al., 2010; DAMM et al, 2010; SUTTON, 1980) é a principal doença pós-colheita em frutas tropicais (PERES et al 2002) e vários métodos de controle são usados, porém, com altos custos de implantação, gasto de energia, ineficiência de controle e impacto negativo ao ambiente. Por isso, a presente pesquisa tem como objetivo determinar um método alternativo e eficiente de controle, utilizando uma película de amido de milho para cobrir as superfícies das frutas manga, mamão e banana após a colheita. Após análise filogenética do patógeno da antracnose e testes de patogenicidade em frutos de mamoeiro, mangueira e bananeira, suspensões nas concentrações de 0,5%, 1%, 1,5% e 2% de amido de milho serão testadas.com os conhecimentos obtidos nesta pesquisa, espera-se elucidar este patossistema e determinar um método promissor de controle da antracnose em pós-colheita dos frutos. 122

124 R88- Caracterização biológica de um peptídeo inibidor de protease isolado da peçonha do escorpião Tityus obscurus Caroline Barbosa Farias Mourão; Maura V. Prates.; Carlos Bloch Jr; Graziella Joanitti; Sônia Freita; Cristiane Ano Bom; Elisabeth Ferroni Schwartz. Laboratório De Toxinologia Ltx Inibidores de protease (PIs) participam da regulação de diversos processos metabólicos, apresentando potencial uso na prevenção de patologias humanas, como câncer e hemorragia. Além disso, em animais peçonhentos, tem-se mostrado PIs que também bloqueiam canais Kv. A partir da construção da biblioteca de cdna da glândula de peçonha e da análise proteômica da peçonha do escorpião Tityus obscurus (Buthidae) por nosso grupo de pesquisa, obteve-se a sequência primária do peptídeo denominado ToPI1. Com 33 resíduos de aminoácidos, três pontes dissulfeto e 3806,8 Da, ToPI1 não apresenta similaridade significativa com nenhuma toxina descrita até o momento. Os objetivos desse estudo são: obter o peptídeo ToPI1 a partir da peçonha de T. obscurus e por síntese química; caracterizar sua estrutura e atividade inibidora de proteases; avaliar sua ação em diferentes subtipos de canais Kv; e caracterizar sua possível atividade antitumoral. Até o momento, ToPI1 foi obtido a partir do fracionamento por RP-HPLC da peçonha bruta de T. obscurus e por síntese química automática em fase sólida. Assim como o peptídeo nativo, ToPI1s (sintético) apresentou atividade inibidora de tripsina (IC50 de ~110 nm), e não inibiu quimotripsina. A atividade citotóxica está sendo avaliada por ensaio de viabilidade celular pelo método MTT. O peptídeo reduziu a viabilidade de células tumorais HeLa (IC50 de ~90 µm), sendo a resposta dependente de dose e tempo. A viabilidade celular da linhagem tumoral B16F10 também foi reduzida, embora doses maiores precisam ser testadas. A ação do peptídeo nas linhagens equivalentes de células saudáveis será avaliada em seguida. Posteriormente, ensaios antitumorais in vivo serão realizados em camundongos, e a ToPI1 será testada em diferentes subtipos de canais Kv. Adicionalmente, a estrutura secundária da ToPI1s será avaliada por espectroscopia de Dicroismo Circular em diferentes valores de ph e temperatura. A análise da estrutura tridimensional por RMN está em andamento. 123

125 R89- Diferentes isotipos IgG de região variável idêntica apresentam distintos padrões de ligação a Cryptococcus neoformans Diane Sthefany Lima De Oliveira; Andre Moraes Nicola, Arturo Casadevall; Maria Sueli Soares Felipe. Biologia Molecular Acredita-se que sítio de ligação dos anticorpos ao antígeno seja formado por domínios variáveis. No entanto, evidências sugerem que diferenças relacionadas ao isotipo em CH podem afetar a especificidade e afinidade do anticorpo, mostrando que não apenas os domínios VH e VL determinam a ligação ao antígeno. Estudos têm sugerido que o padrão anular é protetor em modelos animais, enquanto que mabs que se ligam de forma puntiforme são pouco protetores ou agravantes de doença. Para estudar o mecanismo pelo qual o domínio constante altera o paratopo, IgG3 recombinante foi produzido usando domínio variável de mab 2H1, um IgG1 que se liga a C. neoformans em padrão anular. Fragmentos codificando VH e VL de 2H1 foram sintetizados e clonados em pfuse-chig-mg3 e pfuse-clig-mk, respectivamente. Os plasmídeos foram co-transfectados em NSO e IgG3 recombinante foi colhido do sobrenadante. A concentração foi determinada por ELISA foi de 0.4 mg/ml. A ligação de 2H1-IgG3 foi examinada por microscopia de fluorescência com deconvolução e mostrou padrão puntiforme. No ensaio de fagocitose com macrófagos, 2H1-IgG3 promoveu internalização em 15% dos fagócitos. O anticorpo 2H1-IgG3 mostrou padrão de fluorescência puntiforme, diferente do padrão anular observado com 2H1 IgG1. Desta forma, temos mostrado que o resultado único encontrado na literatura é reprodutível. Recombinações entre sequências CH1 de 2H1IgG3 e CH1 de 2H1IgG1 serão realizadas para identificar como a estrutura de CH1 interfere com a de domínio variável levando a diminuição da eficácia imune. 124

126 R90- Effect of histone deacetylases inhibitors on the virulence phenotypes of Cryptococcus neoformans Fabiana Brandão Alves Silva; Lorena Derengowski; Patricia Albuquerque ; Ildinete Sila-Pereira; André Nicola; Marcio José Poças Fonseca Biologia Molecular Cryptococcus neoformans infection is due to expression of various virulence factors that allow survival under various stress conditions. Inhibitors of histone deacetylases (HDACi) Sodium butyrate (NaBut) and Trichostatin A (TSA) have the ability to affect the profile of chromatin resulting in changes on expression several genes. Objective: Study the effect of HDACi on expression of virulence phenotypes of C. neoformans and the interaction of the fungus with animal hosts. Methods: Different concentrations of the drugs were applied to C. neoformans cultures grown on several conditions in order to analyze the expression of virulence phenotypes. Cell cycle was evaluated by flow cytometry. Survival curve were performed infecting caterpillars of the alternative host Galleria mellonella with C. neoformans cells pretreated with HDACi. Results and Conclusion: HDAC showed ability interfere on major virulence phenotypes described for C. neoformans significantly, even in concentrations subinibitory, such as capsule, melanin, phospholipases and mating type. Solely urease was not affected at any concentration tested by both HDACi. NaBut showed more pronounced and permanent effect that TSA, possibly because TSA is less stable. There is an increase in the population of cells in G2 / M when treated for NaBut. Inhibitory effects observed in the formation of the capsule was not maintained after removed of the drug "in vitro". Although HDACi affect the virulence phenotypes "in vitro", no significant differences were observed in the time of death of caterpillar of species Galleria mellonella between treatments versus controls. Perspectives: Following steps of this work will be to evaluate the synergism of HDACi with other antifungal drugs. We will also construct C. neoformans HDAC mutants and investigate the role of these genes in the regulation of expression of virulence factors by RNA-seq and infection in vivo assays. 125

127 R91- Seleção in silico de sequências de imunoglobulinas produzidas por tecnologia de phage display Heidi Muniz Silva; Tainá Raiol Alencar; Christiane Nishibe ; Andréa Q. Maranhão; Marcelo De Macedo Brígido. Laboratório De Bioinformática Dentre as tecnologias usadas na produção de anticorpos recombinantes, destaca-se a expressão de peptídeos em fagos filamentosos ( phage display). Tal método permite produzir bibliotecas de imunoglobulinas específicas para um antígeno de interesse, cujas sequências podem ser obtidas por sequenciamento de nova geração. No entanto, a busca por sequências candidatas à produção em larga escala a partir de dados NGS tem sido um desafio devido ao enorme volume de sequências geradas. Diante disso, o presente trabalho tem por objetivo desenvolver um pipeline computacional para analisar a variabilidade e o enriquecimento de bibliotecas produzidas por phage display bem como para selecionar in silico sequências candidatas. O pipeline desenvolvido segue dois critérios de seleção: as sequências devem ser enriquecidas no round 3 e reconhecidas como domínios variáveis completos. Todos os scritps foram implementados em linguagem perl. Como estudos de caso, estão em processo de análise dois conjuntos de dados, gerados pelas plataformas 454 Roche e Illumina. Em uma análise preliminar dos dados de sequenciamento 454 Roche, observou-se maior riqueza de sequências no round 0, tanto para domínios VH quanto para VL. A partir das bibliotecas dos domínios variáveis, foram selecionadas como sequências candidatas apenas uma sequência VH e uma sequência VL. O trabalho desenvolvido até o momento permitiu identificar pontos a serem aperfeiçoados nos scritps do pipeline, tais como o aumento da sensibilidade do programa de cálculo de sequências únicas, a fim de produzir uma estimativa mais confiável da riqueza das bibliotecas. No que diz respeito aos dados Illumina, os quais possuem reads paired-end, será implementado um script de montagem dos pares R1/R2 para obter uma sequência consenso que possua os domínios variáveis VH e VL completos. Sendo assim, este trabalho demonstra ser de grande relevãncia para o grupo de Imunologia Molecular, pois novos experimentos de phage display poderão ser realizados visando testes biológicos, num conjunto mais restrito de sequências de imunoglobulinas com expectativas de especificidade pelo antígeno de interesse. 126

128 R93- Expressão heteróloga de rim8 visando a caracterização do gene como alvo molecular de novas drogas antifúngicas Lucas Luiz Vieira; Ana Karina Rodrigues Abadio; André Moraes Nicola; Fabiana Freire Mendes Oliveira; Maria Sueli Soares Felipe. Laboratório De Biologia Molecular A paracoccidioidomicose (PCM) é uma Infecção Fúngica Invasiva (IFI) considerada problema de saúde pública no Brasil visto que tem elevado o tempo de internação e gerado o maior índice de mortalidade entre as micoses sistêmicas. O Paracoccidioides brasiliensis é um dos agentes etiológicos mais frequentes de IFI e apresenta diferentes isolados caracterizados, como o P.lutzii. Devido à necessidade de se obter novos alvos terapêuticos, o gene rim8 foi identificado por genômica comparativa como uma sequência ortóloga importante no genoma de fungos patogênicos humanos e ausente no genoma humano. O rim8 codifica uma proteína envolvida na ativação proteolítica de um fator transcricional em resposta ao ph alcalino, esta tem sido considerada uma via aparentemente conservada entre os fungos e envolvida na patogênese e interação patógeno-hospedeiro. O gene rim8 de P. lutzii foi sintetizado quimicamente com uma cauda de seis histidinas e foi clonado em vetor pet-21a. A expressão heteróloga do gene foi padronizada usando duas estirpes de E. coli. A proteína heteróloga RIM8 foi purificada usando cromatografia por afinidade em coluna de níquel. Os resultados da expressão e purificação foram analisados em eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS e, em alguns casos, confirmados por Western blot. Visando a imunocitolocalização, foi realizada a imunização de camundongos Swiss com a proteína purificada e a presença de anticorpos anti-rim8 foi confirmada por ELISA. Resultados: Através da padronização da expressão do gene rim8, as melhores condições identificadas foram com a linhagem de E. coli BL21 (ï DE3) e o uso de meio LB com 0,5% de glicose a 37Â C por 4 horas e a indução realizada com 0,5 mm de IPTG. Através da análise de resultados de SDS-PAGE, foi obtida a purificação da proteína heteróloga. Conforme resultados de ELISA, houve a produção de anticorpos anti-rim8 pelo camundongo em títulos de 1:8100. Por imunocitolocalização evidenciou-se o aumento de fluorescência tanto na superfície quanto no interior celular. Os resultados sugerem que foi possível expressar o gene heterólogo rim8 e que certo grau de purificação foi alcançado, tendo em vista as análises de SDS-PAGE e Western blot. A imunização de camundongos levou a produção de anticorpos anti-rim8, que puderam ser usados na imunocitolocalização da proteína em P. lutzii, demonstrando um duplo padrão de fluorescência. Sendo assim, pode-se inferir que o projeto apresentou contribuição para o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas, porém ainda deve passar por mais etapas de produção e purificação da proteína para ser capaz de realizar a caracterização estrutural e funcional da proteína heteróloga RIM8. 127

129 R96- Prospecção de transcritos relacionados à olfação em percevejos-praga da soja Luciana R. Farias1, Débora P. Paula2, Roberto C. Togawa R.2, Marcos M. C. Costa2, Priscila Grynberg2, Miguel Borges2, Maria Carolina B. Moraes2, Raul A. Laumann2, Sonia N. Báo1 1Laboratório de Microscopia Eletrônica, Departamento de Biologia Celular, Universidade de Brasília 2Embrapa Recursos Genético e Biotecnologia Em insetos, a olfação é de fundamental importância para sua sobrevivência, localização de recursos, reprodução e comunicação. Percevejos representam uma das principais pestes da região neotropical e o desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas que interferem no processo de olfação parece ser uma alternativa viável ao controle desses insetos. Neste trabalho, foram prospectadas e caracterizadas, através do transcriptoma das antenas, proteínas relacionadas à olfação em três espécies de percevejos pragas da soja no Brasil, entre eles: Euschistus heros, Chinavia ubica e Dichelops melachantus. Entre as proteínas relacionadas à olfação anotadas nas análises estão as proteínas ligantes de odorantes (OBPs), proteínas quimiossensoras (CSPs) e receptores de odorantes (ORs). Contudo, este estudo teve como principal alvo as OBPs, uma vez que essas proteínas desempenham papel fundamental na comunicação química de insetos. A partir dos contigs anotados após análise de similaridade no BLASTx, foram identificadas 64 potenciais OBPs, 38 CSPs e 23 ORs nas três espécies de percevejo (não foram identificadas ORs em D. melacanthus), das quais foram obtidas quatro potenciais OBPs com sequência completa em E. heros e C. ubica, e uma em D. melacanthus. Todas as potenciais OBPs com sequência complete apresentam as propriedades fisico-químicas preditas para essa classe de proteínas (pequeno tamanho, pi ácido, domínio PBP/GOBP, seis resíduos de cisteína em posição conservada, peptídeo sinal na região amino terminal e alfa-hélice como estrutura secundária predominante. Análises filogenéticas e de similaridade revelaram baixa similaridade intraespecífica das sequências deduzidas de aminoácidos. Entretanto, uma alta similaridade interespecífica foi observada entre algumas OBPs de E. heros e C. ubica. Estes resultados indicam que os insetos com OBPs similares podem reconhecer o componente do feromônio uma da outra, evitando a competição por recurso com outras espécies ou melhorando a localização da planta hospedeira ao utilizar as pistas de outras espécie se a OBP detectar seu perfume. Palavras-Chave: RNA-Seq, proteína ligante à odorante, quimiorrecepção. 128

130 Alunos do Programa PPG-BioMol Realizando Doutorado Sanduíche no Exterior 129

131 Genome sequencing and comparative analysis of the biocontrol agent Trichoderma harzianum Andrei Stecca Steindorff, Igor Grigoriev, Eliane Ferreira Noronha. Biological control is a complex process which requires many processes. The species f T. harzianum are well known for their biocontrol activity against many plant pathogens. To gain new insights into the biocontrol mechanism used by T. harzianum, we sequenced the isolate TR274 genome using a combination of 2x100bp and 2x250bp Illumina reads. The assembly was performed using AllPaths-LG with a maximum coverage of 100x. The assembly generates 2282 contigs with a N50 of The genome size generated was 40.8 Mb and the GC content was 47.7%, an expected value when compared with other Trichoderma genomes. The mitochondrial genome was assembled and generate a contig with 27.7 Kb. The genome annotation pipeline, using a combination of ab initio and homology methods, modeled genes (74.6% spliced genes) with a high transcriptome support. To check the genome reliability, CEGMA analysis was performed showing a 100% coverage. The phylogenetic comparison using orthologous proteins with all Trichoderma genomes sequenced at JGI, corroborates the Trichoderma (T. asperellum and T. atroviride), Longibrachiatum (T. reesei and T. longibrachiatum) and Pachibasium (T. harzianum and T. virens) section division described previously. The comparison between two Trichoderma harzianum species suggests a high genome similarity, in contrast with the harzianum complex concept. The secondary metabolites and glycoside hydrolases contraction and expansion were analysed. The Pachybasium section expanded its secondary metabolites arsenal compared with the other sections. Glycosyde hydrolases also expanded in Pachybasium section, as well as the Pectate lyases and Carbohydrate esterases categories. These results suggests that these proteins families has an important role on mycoparasitism and plant interaction. Future analysis will improve the understanding of this complex genus and give some insights about its lifestyle and the interactions with the environment. 130

132 Desenvolvimento de um sistema de genética reversa para Tospovírus baseado em replicação de RNAs defectivos-interferentes (DIs) André Gustavo Machado Bertran, Anelise Orílio; Massimo Turina; Marina Ciuffo; Ricardo Lenzi; Filipe Leite, Renato De Oliveira Resende. Embora sejam vírus relatados desde o fim do século XIX e de causarem doenças de grande severidade em diversas variedades de plantas cultivadas em larga escala para fins alimentícios ou ornamentais, não existe ainda para os Tospovirus um clone infeccioso. Neste trabalho, a partir de moléculas sintéticas idênticas aos RNAs defectivos interferentes mais prevalentes e persistentes de Tomato spotted wilt virus (TSWV) e Groundnut ringspot virus (GRSV) foram produzidos cassetes de expressão contendo ribozimas ativas in cis no 5' e 3' das moléculas para transcrição in vitro e transfecção mediada por agrobactéria. Foram produzidas também versões modificadas dos DI RNAs contendo GFP fusionado ao interno da fase de leitura aberta (ORF) de modo a manter a fase (in frame) e alterando-a (disrupted frame). A expressão mediada por agrobactérias foi testada em diferentes ordens (2 e 4 dias pré e pós tratamento em relação a um tospovírus auxiliar) e com ou sem coinfiltração de supressores de RNAi (p19 e NSs). Foi possível detectar a expressão do transcrito dos DIs mas não a sua replicação pelo vírus auxiliar. Para os transcritos in vitro foi possível realizar detecção por meio de RT-qPCR de RNA dos DIs após 4 dias de inoculação, um tempo muito longo para um RNA sem CAP 5' e poli-a permanecer em uma folha sem estar sendo replicado ou ao menos protegido contra degradação pelo nucleocapsídeo viral. No momento, as construções contendo GFP estão em fase de conclusão para continuidade dos experimentos incluindo o sistema de culturas vegetais em protoplastos. Foram realizados também ensaios de indução de reassortment por meio de forte pressão seletiva para a manutenção de isolado recombinado partindo de um isolado mutante de TSWV que produz uma proteína NSs não-funcional e transcritos in vitro de S RNA tipo-selvagem provenientes de outro isolado de TSWV (BR20). 131

133 Sw-5 gene cluster: understanding tomato resistance and susceptibility to Tomato spotted wilt virus Athos Silva de Oliveira, Richard Kormelink, Renato De Oliveira Resende Tomato spotted wilt virus (TSWV) is the runner-up of most economically/scientifically important plant virus since it causes significant losses on vegetable production. Up to now there are only two natural resistance sources against TSWV. One of them is the Sw-5b gene, a paralog of the Sw-5 gene cluster which was firstly reported in Solanum peruvianum and has been introgressed in many commercial cultivars of tomato (Solanum lycopersicon). The Sw-5 gene cluster codify putative Resistance (R) proteins, cellular receptors able to identify directly or indirectly the Avirulence (Avr) determinants from pathogens. In this study, we show that the cell-to-cell movement protein of TSWV (NSm) is the Avr of the Sw-5b-mediated resistance. In addition, high accumulation of Sw-5b upon its co-expression with RNA silencing suppressors (RSS) leads to auto-immunity in Nicotiana benthamiana. These two observations allowed us to analyze the Sw-5 homologs from resistant and susceptible tomatoes for Avr recognition and HR activation as uncoupled events. Truncated versions of the Sw-5 homologs were also analyzed, indicating the role of each main domain in such events. Finally, a single mutation has been found to be associated with loss-of-function in a Sw-5 homolog from susceptible tomato. 132

134 Early proteomic changes of adherent cervical adenocarcinoma cells (HeLa) induced by the treatment with a snake venom derived catalytically inactive phospholipase A2 Jéssica Kele Arruda; Joanitti, G.A., Azevedo, R.B., Pires Júnior, O.R.; Fontes, W., Sherman, N.E., Shannon, J. D., Castro. M.S.;Fox, J.W. Bioquímica The emergence of resistance by cancer cells to chemotherapeutic drugs available makes the development of new agents of great importance and urgency. Toxins isolated from animal venoms, including snake venoms has been the subject of numerous studies due to their potential biotechnological and medical applications. We have demonstrated with a Lys49 phospholipase A2 recently isolated from Bothrops marmoratus venom (BmPLA2) that it is capable to induce the apopotic death of diverse cell lines such as cervical cancer (HeLa), skin cancer (B16F10). In this study we investigate a subpopulation of HeLa tumor cells which demonstrate resistance to apoptosis by virtue of their maintaining cell adhesion following treatment with BmPLA2 for 24h at the IC50 concentration. We hypothesize that these cells would not demonstrate typical proteomic changes associated with apoptosis and cell death and perhaps yield insight into apoptosis-resistance mechanisms. The experimental approach was to lyse the treated, adherent cells followed by decomplexation of the cellular lysates using SDS-PAGE and then analyze by LC/MS/MS using a LC-MS/MS Thermo Electron Orbitrap Velos. From these studies, BmPLA2 can be efficiently purified from crude venom with only one chromatographic step, without loss in its biological activity. This PLA2 is able to decrease cell viability in HeLa cells 24 hours following treatment, showing an IC50 of 8,78 µm and induces cell death through apoptosis. Furthermore, the subpopulation of cells that remain adherent after the treatment, despite the presence of apoptotic signals, also present a slight change of protein expression related with the normal death pathway caused by PLA2s, including p38 MAPK pathway proteins, Bcl-2 and Bax, which could be associated with the increased resistance. In addition to apoptosis, this approach allowed the identification of other pathways that may be altered which requires confirmation. The snake venom phospholipase BmPLA2 causes tumor cell death via the extrinsic apoptotic pathway; The proteomic analysis of tumor and normal cells treated with BmPLA2 suggests potential mechanisms for enhanced tumor cell sensitivity to the phospholipase. 133

135 Display de proteínas imunogênicas do vírus da Febre amarela na superfície de Baculovírus Lorena Carvalho De Souza Chaves, Anamélia L. Bocca; Gary W. Blissard A prevenção contra Febre Amarela se dá através de vacinação utilizando vacina de vírus atenuado. Porém, vacinas de vírus atenuado podem ser perigosas para pessoas com sistema imune comprometido. Como alternativa vacinal, vacinas que contenham apenas regiões imunogênicas, capazes de desencadear a resposta imune, são eficazes, seguras e econômicas. O genoma do vírus da febre amarela codifica três proteínas estruturais (Pr/M, C e E) e sete proteínas não estruturais (NS1, NS2A e B, NS3, NS4A e B e NS5). A proteína de Envelope (E) é responsável pela entrada da partícula viral na célula hospedeira e o principal alvo da resposta imune. A proteína E é dividida em três domínios, I, II e III. O domínio III (EDIII) possui os epítopos que são reconhecidos pelos anticorpos neutralizantes. A proteína NS1 é uma proteína essencial para replicação viral, e é encontrada tanto no interior quanto na superfície celular, sendo também altamente secretada. O Display de proteínas heterólogas na superfície de baculovírus é uma alternativa eucariótica importante para a expressão de proteínas com fins biotecnológicos. Foram selecionados os genes que codificam as proteínas E, NS1, EDIII e ESRH (E sem regiões hidrofóbicas) para serem fusionados a uma forma truncada e funcional do gene da proteína de envelope GP64 de dois diferentes baculovírus, AcMNPV (Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus) e AgMNPV (Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus). Dessa forma, as proteínas recombinantes foram expressas, (juntamente com a proteína GP64) na superfície de novas partículas virais. As partículas virais recombinantes foram produzidas utilizando o sistema Bac-to-Bac (Invitrogen), e estão sendo purificadas por centrifugação em colchão de sacarose. A expressão de cada proteína será confirmada porwestern Blot e seu potencial imunogênico será avaliado em camundongos. No caso do EDIII, todo esse processo já foi realizado e as partículas virais recombinantes (expressando EDIII e GP64 fusionadas) foram purificadas e testadas em camundongos. Um dos testes imunológicos avaliados foi o de proliferação de linfócitos que indicou uma maior proliferação em camundongos inoculados com o vírus recombinante contendo o EDIII fusionado à proteína GP64 do baculovírus AgMNPV quando comparados com o controle LPS, entretanto, não foi observado a produção de citocinas específicas da resposta imune adaptativa. Porém, o teste de proliferação de linfócitos pode ser uma pista de que o sistema imune esteja sendo ativado de forma diferente. Testes complementares serão feitos, agora para avaliar se a resposta imune esta sendo ativada através de células B. 134

136 PROGRAMAÇÃO: Apresentações de Painéis 135

137 Dia: 19/11/2014 R3- Clara Wandenkolck Silva Aragão - Genome sequence and analysis of a medical interest baculovirus isolated from Lonomia obliqua (Lepidoptera:Saturniidae) reveals a new transcription terminator factor possibly acquired from the host. R5- Amanda Araújo Souza - Caracterização físico-química e molecular da enzima bifuncional Fosfatase/Fitase produzida por Trichoderma harzianum ALL42. R6- Mariana Martins Severo de Almeida - Estudo da Capacidade Evolutiva de Tospovirus via Rearranjo Genético e Sua Implicação na Epidemiologia Viral. R8- Deborah Vasconcellos Ambrósio - Cultivo e caracterização de membros do domínio Archaea a partir de sedimentos lacustres do Cerrado. R12- Camila Louly Corrêa - Study of the Lignocellulosic Potential in the Fungus Aspergillus Terreus Grown on Agro-industrial residues. R13- Rayane Nunes Lima - Interações Tospovírus-Planta: Caracterização estrutural de proteínas de tospovírus e identificação de interações entre proteínas virais e celulares. R15- Rayssa Almeida Garcia - Validação da estabilidade de estruturas de RNA fita dupla para uso no silenciamento gênico de insetos praga: avaliação na planta e no inseto alvo. R17- Rosiane Andrade da Costa - Caracterização lipopeptídeos antimicrobianos produzidos por Paenibacillus sp. R19- Jhon Eric Alves Fernandes - Selection profiles in the recent evolutionary history of baculoviruses. 136

138 R22- Daniel Mendes Pereira Ardisson de Araújo - Perigonia lusca single nucleopolyhedrovirus (PeluSNPV) genome reveals acquisition of a peculiar nucleotide metabolism fused gene that changed a recombinant prototypic baculovirus in vitro infection. R24- Letícia Stock Vieira - Inativação do Filtro de Seletividade de um Canal de Potássio. R25- Raquel das Neves Almeida - The role of type VI secretion system of gramnegative bacteria in lipid antigen presentation through CD1 molecule. R26- João Paulo Campos Fernandes - Estrutura do complexo entre o peptídeo PTRY e tripsina. R27- Lídia Nascimento Queiroz - Desenvolvimento de estratégias baseadas em RNA interferente para resistência ampla a begomovírus em tomateiro (Solanum lycopersicum). R31- Thompson França Tomatieli - Caracterização de Anticorpos Humanos Anti- Peçonha de Serpentes do Gênero Bothrops. R33- Maria Jose Chiabai - Avaliação dos efeitos imunomodulatório e antiinflamatório de anticorpos monoclonais anti- CD3 e anti-il1β produzidos por Lactococcus lactis em modelo de diabetes autoimune. R34- Samuel Dias Araújo Júnior - Desenvolvimento de sistema para a triagem de grande desempenho de compostos com atividade antibacteriana a partir de bibliotecas metagenômicas. R35- Luciana Gomes Ferreira - Análise da expressão dos genes bbrizgid1 e bbrizipt9 relacionados à síntese de fitohormônios em ovários de Brachiaria brizantha. 137

139 R39- Marcelo Henrique Soller Ramada - Peptídeos antimicrobianos intragênicos de diferentes plantas. R40- Camila Ferreira Thé Pontes - Coevolução Molecular em Canais Iônicos e Neurotoxinas. R41- Abdulrazak Baba Ibrahim - Development of whitefly resistant transgenic soybean plants via RNAi. R46- Helder Andrey Rocha Gomes - Characterization and biotechnological applications of pectinolytic enzymes secreted by Clonostachys byssicola grown on fruit residues. R47- Fernanda Guimarães Bernardes - Identificação de genes cry de Bacillus thuringiensis eficientes no controle de pragas agrícolas. R48- Fabiana Brandão Alves Silva - Effect of histone deacetylases inhibitors on the virulence phenotypes of Cryptococcus neoformans. R50- Valquíria Alice Michalczechen Lacerda - Escherichia coli engenheirada metabolicamente aumentam a produção de proteínas recombinantes de teia de aranha e origina fibra sintética. R52- Mariana Magalhães Nóbrega- Synthesis, purification and characterization of Bioactive Peptides. R54- Antonielle Vieira Monclaro - Produção e caracterização de uma endoglucanase da família GH6 proveniente de metagenoma de solo de canavial. R56- Bárbara Gomes Paes - Engenharia metabólica de Saccharomyces cerevisiae para aproveitamento de xilose na produção de etanol lignocelulósico. 138

140 R59- Samuel Coelho Mandacaru - Mapeamento de sítios de glicosilação de MRJP1 e sua influência nas estruturas terciárias e oligoméricas. R60- Bárbara Muller Salomão de Faria - Genômica aplicada ao cajueiro: tecnologias de genotipagem de alto desempenho para a caracterização de germoplasma e seleção genômica ampla. R61- Muhammad Faheem - Initial characterization and crystallization of a novel bacterial protease selected in a metagenomic approach. R63- Waldeyr Mendes Cordeiro da Silva - Workflow para reconstrução in silico de redes metabólicas de fungos. R65- Daniel Carneiro Moreira - Papel de antioxidantes endógenos como parte do sistema adaptativo de um anfíbio para sobrevivência nas secas da Caatinga. R67- Ana Gabriela Borges Leite. - Validação funcional de neuropeptídeos de Anthonomus grandis via silenciamento gênico. R68- Beatriz Elena Sarmiento Certuche - Caracterização dos principais mecanismos fisiopatológicos envolvidos com a sintomatologia dos acidentes gerados pelo peixe Pimelodus maculatus e avaliação da atividade proteolítica do extrato proteico de sua peçonha. R79- Christiane Ribeiro Janner - Construção e caracterização de nanosensor para o monitoramento do influxo de xilose em Saccharomyces cerevisiae R81- Maritza Ocampo Betancur - Estratégias para Integração Múltipla de Vetores no Genoma de Pichia pastoris. R82- Pollyne Borborema Alves de Almeida - Estratégias de engenharia de leveduras para super produção de L-ácido lático. 139

141 R85- Bárbara Calheiros Neumann - Produção, purificação e caracterização de xilanases de Aspergillus foetidus e sua aplicação no aproveitamento de resíduos agroindustriais. R86- Brenda Rabello de Camargo - Análise proteômica e genômica funcional de Clostridium thermocellum (Isolado B8) em diferentes fontes de carbono. R87- Bruno Ferreira de Oliveira - Película de amido de milho no controle pós-colheita da antracnose em frutos tropicais. R88- Caroline Barbosa Farias Mourão - Caracterização biológica de um peptídeo inibidor de protease isolado da peçonha do escorpião Tityus obscurus. R89- Diane Sthefany Lima De Oliveira - Diferentes isotipos IgG de região variável idêntica apresentam distintos padrões de ligação a Cryptococcus neoformans. R90- Fabiana Brandão Alves Silva - Effect of histone deacetylases inhibitors on the virulence phenotypes of Cryptococcus neoformans. R91- Heidi Muniz Silva - Seleção in silico de sequências de imunoglobulinas produzidas por tecnologia de phage display. R93- Lucas Luiz Vieira - Expressão heteróloga de rim8 visando a caracterização do gene como alvo molecular de novas drogas antifúngicas.. R96- Luciana R. Farias - Prospecção de transcritos relacionados à olfação em percevejos-praga da soja. Dia: 20/11/2014 R0- Mayara Simonelly Costa dos Santos - Seleção in silico de sequências de imunoglobulinas produzidas por tecnologia de phage display. 140

142 R1- Solange Cristina Rego Fernandes - Síntese racional de análogos de toxinas escorpiônicas com ação em canais KV1.3 visando uma abordagem terapêutica contra a esclerose múltipla. R2- Débora Torres Alves Figueiredo - Engenharia metabólica de soja e edição de genoma de genes associados a ácidos graxos. R4- Jônatas Cunha Barbosa Lima - Análise estrutural da proteína PPARγ in silico e por difração de raios X. R7 - Juan Fernando Riasco - Produção de novos anticorpos Anti-CD20 na forma de FvFc em células de mamíferos. R9 - Ronny Petterson dos Santos Araujo - Estudo da interação da cadeia variável pesada de imunoglobulina associada a cadeia VpreB com ssdna. R10 - Miguel de Souza Andrade - Análise molecular/evolutiva do processo de envelopamento múltiplo em baculovírus. R11- Amanda Gregorim Fernandes - Análise e comparação de duas β-glicosidases no sinergismo de enzimas celulolíticas microbianas na degradação da fração de celulose de bagaço de cana de açúcar. R14- Diogo Martins de Sá - A model for the interaction between cadherin-like receptor BT-R1 and three Cry1a family toxins from Bacillus thuringiensis. R16- Juliana Mayumi Hosoume - Investigação da Interação do Sevoflurano com o Canal Iônico Kv1.2. R20- Marco Antônio de Oliveira - Avaliação do papel de micrornas regulatórios na resposta imune inata à infecção por Paracoccidioides brasiliensis. 141

143 R21- Henrique César Teixeira Veras - Biologia de sistemas para estudo comparativo de leveduras fermentadoras de xilose. R23- Tarcila Zuleica Zaparolli Lopes - Construção e Expressão de Anticorpos que reconhecem o antígeno CD20 humano. R28- Layssa Miranda de Oliveira - Desenvolvimento de clone infeccioso de Norovírus Humano. R29- Caio Silva Souza, Barbara Neumann - The Electric Fingerprint of Voltage Sensor Domains. R30- Andressa da Cunha Quintana Martins - Prospecção e caracterização de genes envolvidos na resistência de Arachis stenosperma ao Meloidogyne arenaria. R32- Renata Velozo Timbó - Estudo das teias tróficas do predador Hippodamia convergens (Coleoptera: Coccinellidae) pela análise metagenômica do DNA mitocondrial presente no conteúdo gastrointestinal. R36- Cristiana Moura Andrade - Plantas de tabaco resistentes à Sclerotinia mediada por RNAi. R37- Nayhanne Tizzo de Paula - Interfering RNA as a strategy for silencing the rep gene of begomoviruses infecting tomato (Solanum lycopersicum) in Brazil. R38- Rafael Corrêa - Lysophosphatidylcholine induces IL-1β secretion and lipid droplet biogenesis in inflammasome-mediated pathway. R42- José Antonio Fagundes Assumpção - Estudo da relação entre o estado de diferenciação celular e a hipótese de Warburg. 142

144 R43- Caio de Oliveira Gorgulho Silva - Aproveitamento de licores resultantes de prétratamento Liquid Hot Water de resíduos agroindustriais como fonte de carbono para produção de enzimas xilanolíticas por Aspergillus foetidus. R44- Lorena Cardoso Cintra - Análise do sinergismo de enzimas xilanolíticas microbianas na degradação da fração de hemicelulose de bagaço de cana-de-açúcar. R45- Mariana Senna Quirino - Next-generation sequencing applied for identification of viruses in watermelon (Citrullus lanatus) plants. R49- Diogo César Ferreira - Desenvolvimento de potenciais estatísticos para simulação de enovelamentos proteicos. R51- Karen Ofuji Osiro - Characterization and comparison between the cellulosome and the crude extract produced by a new isolate of Clostridium thermocellum. R53- Mikhail Oliveira Leastro - The functional analysis of distinct tospovirus movement proteins (NSm) reveals different behaviors among the tospovirus species. R55- João Heitor Colombelli Manfrão Netto - Estudo do efeito da Metilação do DNA e de Histonas na produção de xilanases por Humicola grisea var. Thermoidea. R57- Julianna Barbosa Peixoto - Identificação e caracterização de moléculas microbianas associadas à biodegradação de polietileno. R58- Thiago Rodrigues de Oliveira - Obtenção de proteínas de camada S de Archaea para possíveis aplicações biotecnológicas. R62- Alice da Cunha Morales Álvares- Bowman- Birk Protease Inhibitor from Vigna unguiculata Seeds Enhances the Action of Bradykinin Related Peptides. R66- Carolina Veónica Attallah - Procurando para um peptídeo sinal para expressar proteínas em diferentes tipos de células de mamíferos. 143

145 R69- Elias Ferreira Sabiá Júnior- Detecção e Caracterização de Proteínas Parasporina em Isolados de Bacillus thuringiensis Citotóxicas a Células de Cãncer Humano. R70- Myrna Barbosa Gomes- Desenvolvimento de Bioprocesso para a Produção de Álcoois por Linhagem de Clostridium acetobutylicum Modificada Geneticamente. R71- Daniel Pereira de Paiva- Desenvolvimento de uma linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae para fermentação de amido. R72 - Saluana Rocha Craveiro-, Análise comparativa do genoma e caracterização do gene DNA photolyase de isolados de Pseudoplusia includens SNPV. R75- Luíza Cesca Piva- Uso do gene amds (acetamidase) como uma marca de seleção dominante e reciclável em Pichia pastoris. R76- Yara Cavalcante Vieira- Detecção de genes de enterotoxinas STX-1 e STX-2 em Escherichia coli pertencentes ao banco de germoplasma do Laboratório de Microbiologia Médico Veterinária da Universidade de Brasília. R77- Aline Belmok de Araújo Dias- Análise da diversidade de Archaea em solos de Cerrado sensu stricto submetidos ou não a queimadas bienais. R78- Paula Marcela Duque Jaramillo- Desenvolvimento e validação de métodos inovadores para a garantia da qualidade do biodiesel e de suas misturas ao diesel. R80- Debora Farage Knupp dos Santos - Caracterização do resistoma do solo de Cerrado strictu sensu e potencial biotecnológico na biorremediação de amostras ambientais contaminadas com resíduos aromáticos 144

146 145

147 APOIO 146

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