Estudo imunohistoquimico do infiltrado de linfócitos T e da proliferação tumoral nos tumores de mama da cadela: implicações clínicas

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1 Mestrado Integrado em Medicina Veterinária Ciências Veterinárias Estudo imunohistoquimico do infiltrado de linfócitos T e da proliferação tumoral nos tumores de mama da cadela: implicações clínicas Maria Isabel da Silva Carvalho Orientador: Professora Doutora Felisbina Luísa Pereira Guedes Queiroga Co-orientador: Professora Doutora Isabel Cristina Ribeiro Pires UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO VILA REAL, 2009

2 Mestrado Integrado em Medicina Veterinária Ciências Veterinárias Estudo imunohistoquimico do infiltrado de linfócitos T e da proliferação tumoral nos tumores de mama da cadela: implicações clínicas Maria Isabel da Silva Carvalho Orientador: Professora Doutora Felisbina Luísa Pereira Guedes Queiroga Co-orientador: Professora Doutora Isabel Cristina Ribeiro Pires UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO VILA REAL, 2009

3 Dedico este trabalho a todos os animais da espécie canina, acometidos por tumores mamários, que me proporcionaram um extenso crescimento na compreensão desta enfermidade, com todos os processos patológicos que lhe são inerentes, despertando-me, a cada dia, uma vontade incessante de aprimorar conhecimentos, com o intuito de contribuir para a sua qualidade de vida e avanço da ciência. Cooperar de algum modo para o bem-estar destes animais é a minha realização.

4 Se quisermos encontrar alguém que nos diga em realidade o que são as neoplasias, não creio que encontraríamos um só homem sobre a terra capaz de dizê-lo. RUDOLPH VIRCHOW, 1863

5 Resumo Resumo Os tumores mamários estão entre os neoplasmas mais comuns nas cadelas inteiras. Apesar da intensa investigação clínico-patológica, pouco se conhece acerca do prognóstico e da etiologia destes tumores. Deste modo, o objectivo do nosso estudo foi determinar o índice de proliferação (IP) e o infiltrado de linfócitos T, em 57 tumores mamários caninos (21 benignos e 36 malignos), pela detecção imunohistoquimica dos antigénios Ki-67 e CD3 respectivamente. Os nossos resultados revelaram uma associação estatística significativa do Ki-67 intratumoral com diversas variáveis clínico-patológicas que reflectem a agressividade do tumor e com a sobrevida total dos animais. Apesar dos linfócitos T CD3+ de todas as áreas de contagem se mostrarem associados a características de maior malignidade tumoral, apenas os linfócitos T CD3+ da glândula mamária não-tumoral anexa ao tumor revelaram associação estatística significativa com a sobrevida total. Assim, neste estudo, o Ki-67 do tumor e os linfócitos T CD3+ da mama anexa evidenciaram valor prognóstico. v

6 Abstract Abstract Mammary tumors are among the most common neoplasms in intact female dog. Despite of the intensive clinico-pathological investigation, very little is known about the prognosis and etiology of these tumors. This way, the objective of our study was to determine the proliferation index (PI) and the T-lymphocytes infiltrate, in 57 canine mammary tumors (21 benign and 36 malign), by immunohistochemical detection of Ki-67 and CD3 antigens respectively. Our results revealed a significant statistic association of the intratumoral Ki-67 with several clinico-pathologic characteristics that reflect the tumor aggressiveness and with overall survival of animals. In spite of CD3+ T-lymphocytes of all counting areas show an association with characteristics of high tumoral malignancy, just CD3+ T-lymphocytes in adnexal non-tumoral mammary gland revealed a significant statistic association with overall survival. So, in this study, the Ki-67 of the tumor and the CD3+ T-lymphocytes in adnexal nontumoral mammary gland evidenced prognostic value. vi

7 Índice geral Índice geral Resumo... v Abstract... vi Índice de figuras... ix Índice de gráficos... x Índice de quadros... xi Siglas e abreviaturas... xii Agradecimentos... xiv Capitulo 1 Introdução As neoplasias mamárias caninas: Uma abordagem geral Os factores predisponentes A etiologia O diagnóstico histopatológico O maneio clínico e o tratamento Os factores associados ao prognóstico Inflamação e cancro de mama: O papel dos linfócitos T... 9 Capitulo 2 Objectivos Capitulo 3 Material e Métodos Descrição do material utilizado e sua proveniência Métodos Avaliação histopatológica Avaliação clínico-patológica Seguimento clínico Avaliação imunohistoquimica Procedimento Métodos de quantificação da imunorreactividade vii

8 Índice geral Análise Estatística Capitulo 4 Resultados Análise descritiva da amostra em estudo Variáveis clínico-patológicas Classificação histológica dos tumores Análise comparativa entre tumores benignos e malignos Índice de proliferação do Ki-67 e comportamento tumoral Infiltrado de linfócitos T CD3+ e comportamento tumoral Análise estatística no grupo dos tumores malignos Índice de proliferação do Ki-67: Relação com variáveis clínico-patológicas Infiltrado de linfócitos T CD3+: Relação com variáveis clínico-patológicas Relação entre o infiltrado de linfócitos T CD3+ e o índice de proliferação do Ki Estudo de prognóstico: Relação entre os marcadores moleculares (Ki-67 e CD3) e a sobrevida total dos animais Capitulo 5 Discussão Capitulo 6 Conclusão Capitulo 7 Estudos Futuros Capitulo 8 Referências Bibliográficas viii

9 Índice de figuras Índice de figuras Figura 1 Tumor da glândula mamária de grandes dimensões, que apresentou um rápido crescimento Figura 2 Tumor mamário maligno, situado nas glândulas mamárias inguinais, que apresentou ulceração cutânea....2 Figura 3 Imunorreactividade para o Ki-67 avaliado no tumor. Notar a marcação ao nível do núcleo e em forma de grumos (Estalão=30 μm)...34 Figura 4 Imunorreactividade para o Ki-67 avaliado na glândula mamária aparentemente nãotumoral anexa ao tumor (Estalão=60μm) Figura 5 Imunorreactividade para o CD3 avaliado num carcinoma tubulo-papilar (Estalão=60μm) Figura 6 Imunorreactividade para o CD3 avaliado num carcinoma sólido (Estalão=60μm) Figura 7 Imunorreactividade para o CD3 avaliado na periferia do tumor. Notar a marcação citoplasmática difusa e homogénea (Estalão=60μm)...35 Figura 8 Imunorreactividade para o CD3 avaliado na glândula mamária aparentemente nãotumoral anexa ao tumor (Estalão=60μm) ix

10 Índice de gráficos Índice de gráficos Gráfico 1 Valores médios do Ki-67 nos tumores benignos e malignos Gráfico 2 Valores médios do CD3 nos tumores benignos e malignos Gráfico 3 Curva de sobrevivência do Ki-67 avaliado no tumor Gráfico 4 Curva de sobrevivência do CD3 avaliado na glândula mamária não-tumoral anexa ao tumor x

11 Índice de quadros Índice de quadros Quadro 1 Avaliação do grau histológico de malignidade segundo Elston e Ellis (1991) Quadro 2 Soros usados, concentrações, tempo e temperatura de incubação e tratamentos efectuados para recuperação antigénica Quadro 3 Síntese das características da amostra em estudo e respectivas frequências absolutas e relativas Quadro 4 Apresentação dos diferentes tipos histológicos benignos e malignos Quadro 5 Imunorreactividade para o Ki-67 entre tumores benignos e malignos Quadro 6 Imunorreactividade para o CD3 entre tumores benignos e malignos Quadro 7 Associação entre o índice de proliferação do Ki-67 e os parâmetros clínicopatológicos Quadro 8 Associação entre os linfócitos T CD3+ e os parâmetros clínico-patológicos Quadro 9 Relação entre os valores médios do Ki-67 e do CD3 Correlações de Spearman s.. 30 Quadro 10 Relação entre os marcadores moleculares e a sobrevida total aos 18 meses xi

12 Siglas e abreviaturas Siglas e abreviaturas % Percentagem µl Microlitro µm Micrometro ANOVA Análise de variância ºC Graus Celsius CCL2 Monocyte Chemoattractant Protein-1, MCP-1 (Quimiocina inflamatória, Proteina-1 Quimioatractiva de Monócitos) CCL5 Regulated on Activation T Cell Expressed and Secreted, RANTES (Quimiocina inflamatória regulada na activação das células T, expressa e segregada) CD3 Proteína CD3, que faz parte do agrupamento de diferenciação de imunologia (cluster of differentiation- CD) e que se encontra estritamente associada ao TCR dos linfócitos T CD4 Proteína CD4, que faz parte do agrupamento de diferenciação de imunologia (cluster of differentiation- CD), expressa na superfície das células T-helper CD8 Proteína CD8, que faz parte do agrupamento de diferenciação de imunologia (cluster of differentiation- CD), expressa na superfície das células T citotóxicas cm centímetros DAB Tetra-hidrocloreto de 3,3 -diaminobenzidina dm 3 decímetro cúbico EGF Epidermal growth factor (Factor de crescimento epidermal) g grama GH Growth Hormone (Hormona do crescimento) GHM Histological grade of malignancy (Grau histológico de malignidade) GN Nuclear grade (Grau nuclear) H&E Hematoxilina-Eosina HRP Sistema de detecção Ultravision de volume Anti-Polivalente HVUTAD Hospital Veterinário da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro IGF-I Insuline-like growth factor-i (Factor I de crescimento tipo insulina) IM Mitotic índex (Índice mitótico) IP Proliferation índex (Índice de proliferação) KDa KiloDalton Ki-67 proteína Ki-67 (Clone MIB-1; proteína estritamente associada à proliferação celular) xii

13 Siglas e abreviaturas M Molar M + Presença de metástases à distância M 0 Ausência de metástases à distância MHC Major Histocompatibility Complex (Complexo Principal de Histocompatibilidade) min. minuto ml Mililitro n Número de amostras N + Presença de metástases nos gânglios linfáticos regionais N 0 Ausência de metástases nos gânglios linfáticos regionais OMS Organização Mundial de Saúde OVH Ovariohisterectomia p Significância estatística PBS Phosphate-Buffered Saline (Tampão fosfato salino) PRL Prolactin (Prolactina) r Coeficiente de correlação - Marca registada sd Desvio padrão se Erro padrão seg. segundo SLD Disease free-survival (Sobrevida livre de doença) SPSS Statistical Pachage for the Social Sciences SRD Sem raça determinada ST Overall survival (Sobrevida total) T Tumor size (Tamanho do tumor) TCR T cell receptor (Receptor de superfície próprio dos linfócitos T) TGF Transforming growth factor (Factor transformador do crescimento) Th1 Linfócitos T-helper 1 Th2 Linfócitos T- helper 2 TIL Tumor infiltrating lymphocytes (Linfócitos que infiltram o tumor) TMC Tumores mamários caninos UTAD Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro W Watts x vezes xiii

14 Agradecimentos Agradecimentos Ao terminar este trabalho, desejo expressar o meu sincero reconhecimento pelo apoio e pelas contribuições de diversas pessoas e entidades a quem estou agradecida: Agradeço à Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (UTAD), na pessoa do seu Excelentíssimo Senhor Reitor, Professor Armando Mascarenhas Ferreira, manifestando o meu maior reconhecimento pelo facto de me ter possibilitado a realização desta Tese de Mestrado. Particularmente agradeço à Professora Doutora Felisbina Luísa Pereira Guedes Queiroga, orientadora desta Tese, por toda a ajuda, incentivo e apoio durante a elaboração deste trabalho e por saber dosear na medida certa o estímulo para novos desafios. Obrigado por tudo. Agradeço, de forma especial, à Professora Doutora Isabel Cristina Ribeiro Pires, coorientadora desta Tese, pela ajuda imprescindível, por todo o auxílio e dedicação facultados durante todas as etapas deste trabalho, sempre com boa disposição e amizade. Agradeço à Professora Doutora Mª dos Anjos Clemente Pires, enquanto responsável do Laboratório de Histologia e Anatomia Patologia da UTAD, o facto de ter disponibilizado todos os meios solicitados. Agradeço ainda, as sugestões, a simpatia e a disponibilização de ajuda. Agradeço à Professora Doutora Justina Maria Prada Oliveira por toda a disponibilidade e apoio prestados. Agradeço às Professoras Doutoras, Adelina Gama, Fernanda Seixas, Paula Rodrigues, Rita Payan, Maria de Lurdes Pinto e Anabela Alves pela simpatia e estímulo com que sempre nos receberam. Na generalidade, agradeço a todos os professores que tudo me ensinaram com paciência e exigência e que contribuíram para a minha formação como ser humano. xiv

15 Agradecimentos Agradeço à Sra. Dona Lígia Lourenço pelo excelente apoio técnico. Às Sras. Dona Ana e Dona Glória gostaria de agradecer a ajuda sempre que solicitada. Agradeço à Ana Lúcia, à Daniela, à Raquel, à Diana e à Paula pela amizade e bom ambiente de laboratório. Agradeço ao Miguel Ribeiro e à Daniela Ferreira, por todas as conversas esclarecedoras que tivemos e pela disponibilidade que mostraram em prestar ajuda sempre que necessário. Agradeço a todas as pessoas especiais que me acompanharam ao longo destes anos, destacando o meu reconhecimento pela Joana Rocha que, para além de estar presente nos momentos de sucesso, também acompanhou de perto muitas das minhas dúvidas e incertezas. De forma singular, agradeço à Anabela Garcia, pela ajuda, companheirismo e amizade e por aquele ânimo extra que tanta diferença faz quando precisamos. Especialmente agradeço ao Jorge Dinis, por ter sido o meu suporte emocional, que sempre me fez acreditar de forma indubitável nas minhas capacidades e sempre me incentivou, animou, e ajudou desde o início até à conclusão deste trabalho. E como não podia deixar de ser, agradeço aos meus pais, Fernando e Maria José Carvalho, ao meu irmão, Ricardo Carvalho e a toda a minha família, pelo incentivo, pelos conselhos e principalmente por todo o apoio que me deram ao longo de todo este processo. Seria injusto não agradecer, mas, mais injusto ainda seria agradecer só a alguns, neste sentido, agradeço também, a todos aqueles, que de uma forma directa ou indirecta me incentivaram e ajudaram no decorrer do trabalho, o meu muito obrigado. xv

16 Introdução Capitulo 1 Introdução 1.1. As neoplasias mamárias caninas: Uma abordagem geral Os tumores da glândula mamária ocorrem provavelmente em todas as espécies de mamíferos (Schneider, 1970) e são encontrados com frequência na prática Médico-Veterinária (Novosad, 2003). As pesquisas efectuadas nos tumores mamários caninos (TMC) suscitam interesse, não só pela sua importância para a própria espécie, já que são dos tumores que mais frequentemente ocorrem, mas também pelo facto destas neoplasias poderem ser usadas como modelo comparativo para o estudo do cancro de mama Humano (Queiroga e Lopes, 2002; Queiroga et al., 2008). Os tumores mamários dos canídeos e dos Humanos partilham aspectos clínicos, histológicos e epidemiológicos importantes (Sonnenschein et al., 1991). Ambos afectam preferencialmente as fêmeas e, a idade de ocorrência, o efeito benéfico da ovariohisterectomia (OVH), a presença de receptores das hormonas esteróides, assim como os órgãos alvo de metástases são também similares nas duas espécies (Owen, 1979; Shofer et al., 1989; Sonnenschein et al., 1991). Os tumores mamários são extremamente comuns nos animais da espécie canina, representando aproximadamente 25 a 50% de todos os tumores documentados (Millanta et al., 2005; Novosad, 2003). Considerando ambos os sexos, são os segundos tumores mais frequentes, logo após os tumores de pele (Benjamin et al., 1999; Pérez-Alenza et al., 1998a; Queiroga e Lopes, 2002). Nas fêmeas desta espécie, constituem a lesão neoplásica mais comum (Antuofermo et al., 2007; Benjamin et al., 1999; Munson e Moresco, 2007; Queiroga et al., 2005b), encontrando-se descritos em todo o mundo (Queiroga e Lopes, 2002). Os machos, apenas raramente são afectados por esta patologia, sendo o número de casos diagnosticados muito inferior, comparativamente às fêmeas (cerca de 1%) (Pérez-Alenza et al., 1998a; Saba et al., 2007; Todorova, 2006). Aproximadamente 50% dos TMC, diagnosticados histologicamente, são de natureza maligna (Hellmén, 2005; Novosad, 2003; Queiroga et al., 2005b; Sarli et al., 2002; Sorenmo, 2003; Todorova, 2006) e cerca de 50% destes tumores malignos apresentam recorrência ou metastizam no período de 1 a 2 anos após a ressecção cirúrgica (Antuofermo et al., 2007), sendo o pulmão o órgão alvo de eleição para a ocorrência de metástases à distância (Pérez- Alenza et al., 1998a; Pérez-Alenza et al., 2000; Pérez-Alenza e Peña, 2001). 1

17 Introdução A apresentação clínica dos TMC é muito variável: podem ser nódulos únicos ou múltiplos, e os últimos podem ser do mesmo tipo histológico, ou então de tipos histológicos diferentes. O comportamento clínico varia desde nódulos bem circunscritos, com um crescimento estacionário e aparentemente benignos, até nódulos de grande tamanho, com sinais evidentes de malignidade (Figuras 1 e 2), tais como, ulceração cutânea, rápido crescimento com aderência a planos profundos, metastização ganglionar e/ou metastização à distância (Pérez-Alenza et al., 2000). Figura 1 Tumor da glândula mamária de grandes dimensões, que apresentou um rápido crescimento. Figura 2 Tumor mamário maligno, situado nas glândulas mamárias inguinais, que apresentou ulceração cutânea Os factores predisponentes A incidência dos tumores mamários na cadela aumenta com a idade (Egenvall et al., 2005; Mulligan, 1975; Sonnenschein et al., 1991; Taylor et al., 1976), sendo as cadelas de meia-idade e idosas as maioritariamente afectadas (Hellmén, 2005). A idade média de maior incidência é aproximadamente 10 anos, contudo, o risco de surgirem tumores de mama experimenta um acréscimo a partir dos 6 anos de idade (Benjamin et al., 1999; Pérez-Alenza et al., 2000). Animais com idade inferior a 4 anos, raramente são atingidos por esta afecção (Lana et al., 2007; Todorova, 2006). Não existe consenso da comunidade científica relativamente à predisposição racial. No entanto, alguns autores defendem uma maior predisposição de cães de raça pura, relativamente aos de raça indeterminada (Pérez-Alenza et al., 1998a; Shofer et al., 1989) e parece existir uma maior incidência de tumores malignos em animais de raças de grande porte, comparativamente aos de raça pequena (Itoh et al., 2005). Contudo, as raças descritas 2

18 Introdução como detentoras de um maior risco de tumores mamários tendem a variar de acordo com o estudo e a localização geográfica (Egenvall et al., 2005). Segundo alguns autores, tal como se verifica nos Humanos, a obesidade e o tipo de dieta, influenciam, do mesmo modo, o risco de desenvolver tumores mamários nos cães (Antuofermo et al., 2007). Na mulher, sobretudo no período da menopausa, a obesidade está associada a um aumento do cancro de mama (Sonnenschein et al., 1991; Sorenmo, 2003; Stephenson e Rose, 2003) e estudos epidemiológicos têm evidenciado que o consumo de dietas ricas em gordura está correlacionado positivamente com as taxas de mortalidade devido a este tipo de cancro (Shofer et al., 1989). A baixa prevalência de cancro mamário nos herbívoros, deixa-nos tentados a supor que, uma dieta pobre em gordura e rica em fibras vegetais é benéfica, contrariamente ao que acontece nos cães, cuja dieta é baseada principalmente em carne (elevada quantidade de gordura e diminuta quantidade de fibra) e onde a prevalência de cancro de mama é elevada (Munson e Moresco, 2007). Nos cães, a obesidade a um ano de idade, assim como uma dieta baseada maioritariamente em carne vermelha e comida caseira, parecem constituir factores potencialmente associados a um risco superior no desenvolvimento de tumores mamários e displasias (Pérez-Alenza et al., 1998b) A etiologia O desenvolvimento do cancro é um processo complexo que resulta do efeito de inúmeros agentes carcinogénicos, tais como as radiações ionizantes, alguns químicos e vírus oncogénicos. O impacto de diversos factores endógenos genéticos, imunes e hormonais, ostenta uma importância irrefutável e merece especial consideração (Todorova, 2006). Os factores hormonais são os mais amplamente estudados e têm um papel fundamental na carcinogénese mamária na espécie canina (Novosad, 2003; Queiroga et al., 2005a; Queiroga et al., 2008). O desenvolvimento e crescimento da glândula mamária encontram-se sob influência de hormonas ováricas (estrogénio e progesterona) e a participação destas hormonas, tem sido notada em numerosos contextos, tanto fisiológicos, como patológicos (Munson e Moresco, 2007). Na génese das neoplasias da glândula mamária dos canídeos, o papel destas hormonas está bem estabelecido (Munson e Moresco, 2007; Rutteman, 1990; Van Garderen et al., 1997). Esta hipótese é sustentada pelo facto da OVH manifestar um efeito protector na formação de tumores de mama, especialmente quando esta é executada a idade precoce, uma vez que a fonte hormonal é removida cirurgicamente (Novosad, 2003; Sonnenschein et al., 1991; Todorova, 2006). A incidência destes tumores 3

19 Introdução aumenta de forma pronunciada quando a OVH se efectua após o 2º ciclo éstrico. Quando as cadelas são ovariohisterectomizadas antes do 1º cio, o risco de desenvolverem tumores de mama é de 0,5%. Se a OVH é efectuada após o 1º cio, o risco é de 8%, aumentando para 26% se a OVH só é levada a efeito após o 2º ciclo éstrico (Egenvall et al., 2005; Munson e Moresco, 2007; Schneider, 1970). No entanto, a realização da OVH como tratamento, após o desenvolvimento de tumores mamários, não parece ter um efeito significativo na progressão da doença neoplásica (Fergunson, 1985; Taylor et al., 1976; Yamagami et al., 1996a). De facto, os TMC parecem ser claramente dependentes das hormonas esteróides (estrogénio e progesterona) e a presença de receptores para estas hormonas constitui uma evidência adicional da componente hormonal nesta enfermidade (Geraldes et al., 2000; Nieto et al., 2000). No desenvolvimento dos TMC, as anomalias na produção de determinadas hormonas pituitárias, como a prolactina (PRL) (Queiroga et al., 2005a) e a hormona do crescimento (GH) (Queiroga et al., 2008), parecem possuir um papel próprio, mostrando que, as hormonas sexuais não são as únicas implicadas na tumorigénese mamária nesta espécie animal. Os tumores malignos manifestam maior quantidade de prolactina, quando comparados com os tumores benignos e estes últimos, também apresentam maior quantidade desta hormona, relativamente aos tecidos mamários normais (Queiroga et al., 2005a). Em relação à GH, o seu excesso, induzido pelos progestagénios (exógenos e endógenos), pode promover a tumorigénese mamária, pela estimulação da proliferação de células epiteliais mamárias susceptíveis e por vezes transformadas (Van Garderen et al., 1997) e o nível tecidular desta hormona parece aumentar drasticamente nos tumores de mama malignos (Queiroga et al., 2008). Nos últimos anos, algumas investigações indicam a existência de outros factores que parecem intervir na carcinogénese mamária dos canídeos. São exemplos o factor transformador do crescimento (TGF) (Pérez-Alenza e Peña, 2001), o factor I de crescimento tipo insulina (IGF-I) (Queiroga et al., 2008; Sorenmo, 2003) e mais recentemente o factor de crescimento epidérmico (EGF) (Queiroga et al., 2009) O diagnóstico histopatológico A elevada variabilidade de comportamentos clínicos manifestada pelos TMC, é acompanhada por uma idêntica inconstância a nível histológico. 4

20 Introdução Os TMC consistem em tumores de grande complexidade, em parte devido à estrutura histológica heterogénea do próprio tecido mamário, podendo ser oriundos das células epiteliais ductais e/ou alveolares, das células mioepiteliais e/ou das células do tecido conjuntivo intersticial (Lana et al., 2007; Misdorp et al., 1999). Deste modo, podemos afirmar que estas neoplasias desafiam os clínicos e patologistas, devido tanto ao seu inesperado comportamento biológico como também à sua diversidade morfológica (Zuccari et al., 2004b). Assim, torna-se estritamente necessária a adopção de um sistema de classificação universal, para que diversas equipas de investigação possam comparar resultados entre si. Os estudos mais recentes, realizados em tumores de mama de cadela, têm-se baseado na classificação proposta pela Organização Mundial de Saúde (OMS) (Gama et al., 2008; Peña et al., 2003; Pinho et al., 2007; Queiroga et al., 2005b; Queiroga et al., 2008). O diagnóstico definitivo dos TMC, só é alcançado após um estudo histopatológico da amostra obtida por biopsia. A citologia por aspiração com agulha fina, apesar de ser um meio pouco invasivo e de fácil execução, não é fiável no diagnóstico dos tumores mamários em cadelas e este facto prende-se com o elevado pleomorfismo e variabilidade histológica que um mesmo tumor pode apresentar. Contudo, apesar das limitações no diagnóstico, a citologia tem-se revelado um bom método para descartar alguns diagnósticos diferenciais, bem como para determinar a afecção ganglionar (Pérez-Alenza e Peña, 2001). Com o advento de métodos imunohistoquimicos, diversos anticorpos, produzidos e testados, estão entre os mais usados em estudos Médico-Veterinários com a finalidade de prognóstico mas também de diagnóstico em patologia mamária. De entre eles, constam mais frequentemente os seguintes: os anticorpos monoclonais que reconhecem especificamente algumas citoqueratinas, a desmina, e a vimentina (Desnoyers et al., 1990; Zuccari et al., 2004a); o anticorpo para a actina, assim como a proteína S100 (Hellmén, 2005); o anticorpo para a E-caderina (Gama et al., 2007; Reis et al., 2003), bem como os receptores para as hormonas esteróides (receptor de estrogénios) (Nieto et al., 2000) e a determinação do índice de proliferação celular do Ki-67 (Löhr et al., 1997; Peña et al., 1998). Contudo, apesar dos métodos moleculares possuírem valor considerável em determinados casos, não constituem, rotineiramente, a modalidade primária associada ao diagnóstico morfológico (Desnoyers et al., 1990). 5

21 Introdução O maneio clínico e o tratamento Perante um animal com um tumor mamário, o tratamento de eleição é ainda a cirurgia (Fergunson, 1985; Novosad, 2003; Pérez-Alenza et al., 2001; Queiroga e Lopes, 2002;), exceptuando os casos de animais que apresentam tumores da glândula mamária inflamatórios (como o carcinoma inflamatório), ou metástases à distância (Lana et al., 2007; Pérez-Alenza et al., 2001; Pérez-Alenza et al., 1998a). O tipo de cirurgia a ser realizada nodulectomias, mastectomias simples, parciais e radicais dependerá do tamanho do tumor, do número de lesões e da probabilidade de cura local (Lana et al., 2007). Ainda não se encontram estabelecidas directrizes de tratamento para além da cirurgia (Sorenmo, 2003) e o recurso a tratamentos como a quimioterapia ou a radioterapia é demarcado pelos seus elevados custos, o que torna imprescindível determinar de entre os animais com tumores mamários, aqueles que podem auferir de benefício efectivo com a aplicação destes tratamentos (Queiroga e Lopes, 2002). Apesar da quimioterapia adjuvante ser um tratamento padronizado no cancro de mama Humano, apenas uma escassa informação existe acerca da sua eficiência nos tumores de mama na espécie canina (Lana et al., 2007) e o seu uso rotineiro no tratamento destes tumores não está recomendado, dada a escassa eficácia que parece existir, comparativamente a outros tipos de neoplasias (Pérez-Alenza e Peña, 2001). Existem alguns estudos em tumores mamários de canídeos, que indicam a relação de certos tipos de agentes quimioterápicos (combinação de 5-fluoroucil e ciclofosfamida; doxorrubicina) com um incremento da sobrevivência dos animais (Hershey et al., 1999; Karayannopoulou et al., 2001). Apesar do impacto destes estudos ser relativamente baixo, uma vez que são baseados numa pequena amostra de animais, eles são uma prova que o uso da quimioterapia adjuvante poderá ser necessário em alguns casos. Contudo, estudos adicionais bem controlados devem ser efectuados de forma a determinar os agentes quimioterápicos mais adequados ao tratamento dos tumores malignos da glândula mamária canina (Lana et al., 2007) Os factores associados ao prognóstico Devido à heterogeneidade de tipos histopatológicos e de apresentações clínicas dos TMC, a evidência histológica de malignidade, não implica necessariamente um curso clínico maligno da doença (Okamura et al., 2004), deste modo, em Medicina Veterinária, a procura diligente de prognósticos fiáveis, em tempo útil, é uma tarefa que urge ser cumprida. Neste 6

22 Introdução sentido, podem ser iniciadas modalidades terapêuticas adequadas, sem demoras, quando a situação em causa o justifica, ou, por seu lado, pode não se levar a efeito qualquer tratamento, quando a situação se mostra grave e sem desfecho positivo aos olhos do clínico, evitando assim custos dispensáveis ao proprietário (Queiroga e Lopes, 2002). Uma determinada característica ou variável do paciente ou do próprio tumor é considerada como factor de prognóstico, quando é capaz de aportar informação fiável que permita predizer o aparecimento de recidivas e de metástases, após remissão clínica. Por esta razão, nos estudos clínicos prospectivos, as características com valor prognóstico devem ser avaliadas em função da sua capacidade para predizer a sobrevida livre de doença (SLD, tempo que decorre desde a cirurgia, até ao aparecimento de recidivas e/ou metástases) e a sobrevida total (ST, tempo que decorre desde a cirurgia, até à morte do animal) (Pérez-Alenza et al., 2001; Pérez-Alenza e Peña, 2001). Como já foi referido anteriormente, a presença de variações consideráveis no comportamento biológico, dentro do grupo de tumores considerados malignos histologicamente, não permite chegar a um prognóstico preciso, com o auxílio apenas do exame microscópico (Sarli et al., 2002). O prognóstico deve firmar-se em parâmetros que sejam indicadores válidos e eficazes (Queiroga e Lopes, 2002) e, nos TMC, têm sido reveladas várias características clínico-patológicas como indicadoras do comportamento biológico destas neoplasias. A idade do animal no momento da cirurgia surgiu associada à sobrevida livre de doença e à sobrevida total em alguns estudos, com os animais mais velhos a apresentarem uma sobrevida inferior, em relação a animais de menor idade (Hellmén et al., 1993; Peña et al., 1998; Pérez-Alenza et al., 1997; Pérez-Alenza et al., 2000; Sorenmo, 2003). O ritmo de crescimento rápido e o crescimento invasivo do tumor, assim como um maior tamanho, constituem parâmetros clínicos, classicamente associadas a um pior prognóstico, em canídeos com tumores de mama malignos (Misdorp e Hart, 1976; Pérez- Alenza et al., 1997; Pérez-Alenza et al., 2001; Pérez-Alenza e Peña, 2001). A presença de ulceração na superfície da neoplasia oferece uma informação valiosa, pois trata-se de uma lesão que se relaciona significativamente com a malignidade tumoral e uma pior sobrevida (Hellmén et al., 1993; Peña et al., 1998; Pérez-Alenza et al., 1997; Pérez- Alenza et al., 1998a; Queiroga e Lopes, 2002). O valor prognóstico do envolvimento dos gânglios linfáticos regionais, no momento da cirurgia, já foi confirmado por diversos investigadores (Hellmén et al., 1993; Pérez-Alenza et al., 1997; Queiroga e Lopes, 2002; Yamagami et al., 1996b) e, de acordo com Queiroga e 7

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