AVALIAÇÃO DO IMPACTO DAS HELMINTÍASES INTESTINAIS NA RESPOSTA CLÍNICA, MICROBIOLÓGICA E IMUNOLÓGICA EM PACIENTES COM TUBERCULOSE PULMONAR

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1 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS AVALIAÇÃO DO IMPACTO DAS HELMINTÍASES INTESTINAIS NA RESPOSTA CLÍNICA, MICROBIOLÓGICA E IMUNOLÓGICA EM PACIENTES COM TUBERCULOSE PULMONAR JOAO HUGO ABDALLA SANTOS [Digite texto] MANAUS 2014

2 II JOAO HUGO ABDALLA SANTOS AVALIAÇÃO DO IMPACTO DAS HELMINTÍASES INTESTINAIS NA RESPOSTA CLÍNICA, MICROBIOLÓGICA E IMUNOLÓGICA EM PACIENTES COM TUBERCULOSE PULMONAR Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas. Orientador: Profª Dr. Marcelo Cordeiro dos Santos Co-orientadora: Profª Dra. Valéria Saraceni MANAUS 2014

3 III DEDICATORIA A DEUS, Pelo Dom da Vida, pela faculdade da inteligência, pela presença constante e pela oportunidade de ser útil ao meu próximo. Agradeço-te senhor por guiar meus passos, pelo amparo, proteção, saúde, família e por preencher de sentido minha existência, Agradeço também pelas coisas que eu ainda não sou capaz de enxergar. AOS MEUS PAIS IVONILCE E CAIRO, A quem devo o meu crescimento profissional e moral, me estimulando sempre com amor e carinho para que eu pudesse atingir esta conquista. Por me apoiarem nas minhas decisões e me ensinarem os verdadeiros valores da vida, sendo exemplos de perseverança, dignidade e honestidade. Dedico este trabalho com toda minha devoção e agradecimentos. A MINHA ESPOSA, Pela alegria constante, pelo incansável incentivo, companherismo, pelo conforto nas horas tristes e pela vibração nas minhas vitórias. E simplesmente... por me amar e por acreditar em nós. Sem você nada disso seria possível! AOS MEUS FILHOS ISABELLA E JOAO HUGO FILHO, Que me ensinaram o amor incondicional, que são a alegria da minha vida e a forca para lutar e seguir sempre sem desistir.

4 IV AGRADECIMENTOS Graças a várias pessoas este projeto se concretizou. Não poderia deixar de agradecer cada uma delas. Ao Dr. Marcelo Cordeiro dos Santos, pela paciência, incentivo, ensinamentos e dedicação como orientador e amigo. À Dra. Valeria Saraceni, pelo apoio, orientações e contribuições neste trabalho como coorientadora. Ào Dr. Marcus Vinicius Guimarães de Lacerda, coordenador do projeto que acreditou, incentivou e apoiou o projeto em todas as suas fases À Dra. Alda Maria Da-Cruz por ter se dedicado insensantemente juntamente comigo na conclusão do artigo a Senhora este mestrado!!! Às Dras. Rocicleia Lins, Joelma Martins, Marilaine, por terem contribuido na realização dos exames. A Enfermeira Celiana e Valda por terem contribuido na coleta dos dados. Meus sinceros agradecimentos

5 V "Há pessoas que transformam o sol numa simples mancha amarela,mas há aquelas que fazem de uma simples mancha amarela o próprio sol." Pablo Picasso

6 VI RESUMO A Organização Mundial de Saúde estimou, em 2011, 8,7 milhoes de casos novos de tuberculose no mundo, com um total de 1,4 milhoes de óbitos. O controle imunológico dessa infecção é baseado na resposta imune celular, mediada predominantemente por células CD4 + Th-1. A presença de células T reguladoras está associada com uma supressão da atividade das células T CD4 + efetoras, e conseqüentemente com uma incapacidade em eliminar o Mycobacterium tuberculosis do local da infecção. Outro mecanismo capaz de mediar a supressão da resposta imune observada na tuberculose é a pré-existência de infecção por helmintos intestinais, parasitas indutores de uma forte resposta imune do tipo Th-2. O objetivo foi avaliar o fenótipo celular e o perfil de citocinas em pacientes com diagnóstico recente de tuberculose pulmonar co-infectados ou não por helmintos intestinais e avaliar o impacto da helmintíase intestinal na resposta clínica durante o tratamento da Tb. Trata-se de um estudo analítico, de prognóstico, observacional e longitudinal, no qual foram arrolados 99 pacientes HIV-negativos, com idade igual ou superior a 18 anos, divididos em quatro grupos, atendidos no ambulatório de tuberculose da Policlínica Dr. Comte Telles e Cardoso Fontes. Os quatros grupos foram assim divididos: 1) 15 pacientes sintomtomas respiratório, com baciloscopia positiva, e helmintos intestinais presentes nas fezes, 2) 38 pacientes sintomático respiratório, com baciloscopia positiva, e helmintos intestinais ausentes nas fezes, 3) 34 pacientes sem sintomas respiratório, helmintos intestinais ausentes nas fezes, 4) 12 pacientes sem sintomas respiratório, helmintos intestinais presentes nas fezes. Amostras de sangue periférico e fezes foram obtidas de todos os participantes do estudo. As amostras de sangue foram utilizadas para avaliação da resposta imune inata e celular e as de fezes, para o diagnóstico de infecção por helmintos intestinais e como critério de cura pós-tratamento específico das helmintoses. Palavras-chave: Mycobacterium tuberculosis. Tuberculose pulmonar. infecções helmínticas. Fenótipo celular. Perfil de citocinas.

7 VII ABSTRACT The World Health Organization estimated in 2011, 8.7 million new cases of tuberculosis worldwide, with a total of 1.4 million deaths. The immune control of this infection is based on the cellular immune response mediated primarily by CD4+ Th-1 cells. The presence of regulatory T cells is associated with suppressive activity of CD4+ effectors cells and consequently to a failure to eliminate the Mycobacterium tuberculosis infection. Another mechanism to mediate the suppression of the immune response observed in tuberculosis is the pre-existence of infection by intestinal helminthes, parasites induce a strong immune response of Th-2 type. The objective was to evaluate the cellular phenotype and cytokine profile in patients with newly co-infected or not by intestinal helminthes diagnosis of pulmonary tuberculosis and evaluate the impact of intestinal helminthiasis in clinical response during treatment of Tb. This is an analytical study of prognosis, observational, longitudinal, in which 99 HIV-negative patients, aged over 18 years, divided into four groups, treated at the outpatient clinic of the Polyclinic Dr. Comte Telles and Cardoso Fontes. The four groups were divided as follows: 1) 15 symptomatic respiratory patients, smear positive and intestinal helminthes present in the stool, 2) 38 symptomatic respiratory patients, smear positive, and absent intestinal helminthes in feces, 3) 34 patients without respiratory symptoms absent intestinal helminthes in feces, 4) 12 patients without respiratory symptoms, intestinal helminthes present in the stool. Peripheral blood samples and feces were obtained from all study participants. The blood samples were used for evaluation of innate and cellular immune response and fecal for the diagnosis of infection by intestinal helminthes as a criterion and specific post-curing treatment of helminthiasis

8 VIII LISTA DE FIGURAS Figura 1: Média de hemoglobina entre pacientes com tuberculose (Tb) com ou sem Ascaris lumbricoides (Al) ao longo dos três meses de seguimento clínico Figura 2: Perfil fenotípico de leucócitos mononucleares de indivíduos com tuberculose (Tb) co-infectados por Ascaris lumbricoides (Al) Figura 3: Perfil de citocinas séricas (Th-1 e Th-17 Th-2) de indivíduos com tuberculose (Tb) co-infectados por Ascaris lumbricoides (TbAl)

9 IX LISTA DE TABELAS Tabela 1: Comparação da frequência dos dados demográficos, características clínicas, exames laboratoriais e de imagens dos pacientes com tuberculose apenas (Tb) ou coinfectados com Ascaris lumbricoides (TbAl), no momento da inclusão Tabela 2: Características gerais dos pacientes com Tb e co-infectado por Ascaris lumbricoides (TbAl). Tabela 3: Análise comparativa da porcentagem de subpopulações de células mononucleares sanguíneas em pacientes com Tb, TaAl, Al, e em indivíduos saudáveis. Tabela 4: Análise comparativa das citocinas plasmáticas em pacientes com Tb, TbAl, Al, e em indivíduos saudáveis

10 X LISTA DE ABREVIATURAS E SIMBOLOS AIDS BCG DC HIV HELM IL INF LPS μm MTB mabs NK Tb TLR TNF Síndrome da Imunodeficiencia Adquirida Bacilo Calmette Guerin Células Dendríticas - Virus da Imunodeficiencia humana Helmintos Interleucina Interferon Lipopolissacarides micrometro Micobacteryum tuberculosis Anticorpos monoclonais Natural killer Tuberculose Toll like receptors Fator de Necrose Tumoral

11 XI SUMARIO 1. INTRODUCAO Dados Epidemiológicos Agente Etiológico e Contágio Aspectos clínicos e diagnóstico da tuberculose Exames bacteriológicos Exame radiológico Aspectos Imunológicos na Tuberculose Resposta Imune contra Helmintos Impacto da Infecção Helmíntica na Resposta Th OBJETIVO Objetivo Geral Objetivos Específicos MATERIAIS E METODOS Pacientes e indivíduos controles Amostras Descrição das metodologias e estratégia Análise Estatística Calculo de Amostras RESULTADOS CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS... 51

12 1 1. INTRODUÇÃO 1.1 Dados Epidemiológicos Embora a tuberculose possa ser considerada um problema mundial, atingindo as pessoas indistintamente, ela guarda importantes características sociais, intimamente associadas à transmissão e à evolução da doença (1). A Organização Mundial de Saúde estimou, em 2011, 8,7 milhões de casos novos de tuberculose no mundo, com um saldo de 1,4 milhões de óbitos (2). Países em desenvolvimento, concentram mais de 95% de todos os casos e 98% das mortes devidas à tuberculose (3). Por outro lado, em países industrializados da Europa e na América do Norte, onde a incidência é muito menor, a maioria dos casos ocorre entre os imigrantes de países com alta prevalência de tuberculose (4). Dentre os vinte e dois países responsáveis por cerca de 80% de todos os casos de tuberculose no mundo, o Brasil ocupa a décima sétima posição. Em 2012, foram diagnosticados 70 mil novos casos, cuja mortalidade, relatada neste mesmo período, foi de aproximadamente óbitos (5). Segundo dados do Ministério da Saúde o Amazonas é hoje o estado da federação com a maior incidência, 68,3/ , dos casos de Tuberculose (5). Aproximadamente, 66% dos casos de tuberculose notificados são do sexo masculino. Para os homens, a doença é mais frequente na faixa etária entre 25 a 34 anos e a maior taxa de incidência ocorre na faixa entre 45 a 54 anos de idade. Para o sexo feminino, tanto o volume de casos quanto a taxa de incidência são maiores entre os 25 e 34 anos de idade (6). As populações mais vulneráveis são moradores de rua, a população privada de liberdade, a população indígena e as pessoas que vivem com HIV/Aids. Mas a condição determinante para a tuberculose, comprovada cientificamente, é a pobreza (6).

13 2 Os helmintos intestinais são causa de significativa morbidade em humanos, estima-se que um terço da população mundial estejam infectadas por pelo menos uma espécie de helminto, dados apontam que infecção isoladamente por Ascaris lumbricoides afeta mais de um bilhão de pessoas com morbidade significativa (7,8). Segundo alguns autores, em alguns países em desenvolvimento, é mais comum estar infectado do que não estar infectado (9). A prevalência real das infecções helmínticas no Brasil e no Amazonas não é conhecida, visto que estas parasitoses não são de notificação obrigatória. Portanto, os dados aqui apresentados sobre a prevalência de infecção por helmintos são oriundos de estudos realizados isoladamente. Em um estudo conduzido com amostras de uma população urbana de São Paulo, foi observada uma prevalência de 24% de infecção pelo A. lumbricoides (10). Tavares-Dias & Grandini (1999) em um estudo no interior de São Paulo também observaram uma prevalência elevada de enteroparasitoses, incluindo 13,9% de positividade para o A. lumbricoides, 8,3% de Strongyloides. stercoralis e 3,7% de Trichuris. trichiura. Na África, a tuberculose é também fortemente associada com infecções intestinal por helmintos. As probabilidades de infecção tuberculosa aumentam quanto maior for o número de espécies diferentes de helmintos, com que uma pessoa é infectada. Pacientes com tuberculose que têm infecções helmínticas apresentam manifestações pulmonares mais grave, deficiência na resposta imuni contra a tuberculose e resposta prejudicada a terapia anti-tb (11) Agente Etiológico e Contágio O gênero Mycobacterium é composto por microrganismos em forma de bastão, aflagelados, com dimensões de 0,2-0,7 x 1,0-10 µm, que não formam esporos e não possuem cápsula. Uma série de aspectos torna esses microrganismos distintos dos demais gêneros bacterianos, muitos dos quais relacionados à composição de sua parede celular (ácidos micólicos e ceras), a qual confere resistência ao tratamento com álcool-ácido, facilmente evidenciada pela

14 3 técnica de coloração de Ziehl-Neelsen, bem como resistência a álcalis, ácidos, antisépticos e a um amplo espectro de antibióticos (12). O M. tuberculosis é um bacilo aeróbio estrito, considerado intracelular facultativo por sua capacidade de multiplicar-se e sobreviver no interior de células fagocitárias. Possui predileção pelos pulmões devido, tanto à tensão de oxigênio existente nestes órgãos, quanto à temperatura ideal para seu crescimento (13, 3). O crescimento lento, característico do M. tuberculosis, é um dos fatores responsáveis pela demora normalmente observada em sua detecção em meios de cultura e na ação das drogas utilizadas no tratamento (13, 3). O contágio na tuberculose se dá mediante a inalação de partículas microscópicas de 1 a 5µm, constituídas de dois ou três bacilos viáveis envolvidos por secreção pulmonar desidratada, os chamados núcleos de Wells. Estes são eliminados a partir das lesões pulmonares de um doente através da tosse, espirro, riso ou fala (13, 3) Aspectos clínicos e diagnóstico da tuberculose Clinicamente a tuberculose pulmonar não apresenta nenhum sinal ou sintoma específico. Tem como característica principal a tosse, seca ou produtiva, podendo ser a expectoração purulenta ou mucóide, com ou sem sangue (13). Observa-se, normalmente, comprometimento do estado geral, febre baixa vespertina, não costuma ultrapassar os 38,5º C, com sudorese, mas sem calafrios. Anorexia, inapetência e emagrecimento são comuns (3,13). Laboratorialmente o giagnóstico da Tb pulmonar é fundamentado, nos seguintes métodos (3,13): 1. bacterioscópico baciloscopia e cultura; 2. radiológico rx de tórax e tomografia computadorizada do tórax; 3. outros prova tuberculínica; anátomo-patológico (histológico e citológico); sorológico; bioquímico; biologia molecular.

15 Exames bacteriológicos A pesquisa bacteriológica é método de importância fundamental em adultos, tanto para o diagnóstico como para o controle de tratamento (3). 1. Baciloscopia direta do escarro É o método prioritário, porque permite descobrir a fonte mais importante de infecção, que é o doente bacilífero. Executado corretamente, permite detectar de 70-80% dos casos de tuberculose pulmonar em uma comunidade. Por ser um método simples e seguro, deve ser realizado por todos os laboratórios (13, 3). A baciloscopia direta deve ser solicitada aos pacientes que apresentem: Critérios de definição de sintomático respiratório (indivíduo com tosse e expectoração por três semanas e mais); Suspeita clínica e/ou radiológica de Tb pulmonar, independentemente do tempo de tosse; Também é utilizada para acompanhar a evolução bacteriológica do paciente pulmonar, inicialmente positivo, durante o tratamento. O controle bacteriológico deve ser de preferência mensal e, obrigatoriamente, ao término do segundo, quarto e sexto mês de tratamento. Recomenda-se, para o diagnóstico, a coleta de duas amostras de escarro: uma por ocasião da primeira consulta, e a segunda na manhã do dia seguinte, ao despertar. Nos casos em que há indícios clínicos e radiológicos de suspeita de Tb e as duas amostras de diagnóstico apresentem resultado negativo, podem ser solicitadas amostras adicionais.(13) 2. Cultura de escarro ou outras secreções Indicada para suspeitos de tuberculose pulmonar negativos ao exame direto do escarro, e para o diagnóstico de formas extrapulmonares, como meníngea, renal, pleural, óssea e ganglionar, e também para o diagnóstico de tuberculose em pacientes HIV positivo (3,13).

16 5 Solicitação desse exame também está indicada a acompanhado do teste de sensibilidade, nos casos de suspeita de resistência bacteriana às drogas, ou ao final do segundo mês de tratamento quando a baciloscopia se mantem positiva, retratamento após falência ao esquema básico ou reinício após abandono.(13) A cultura é um método de elevada especificidade e sensibilidade no diagnóstico da Tb. Nos casos pulmonares com baciloscopia negativa, a cultura do escarro pode aumentar em até 30% o diagnóstico bacteriológico da doença. Os métodos clássicos para cultura de micobactérias utilizam a semeadura da amostra em meios de cultura sólidos. Os meios mais comumente utilizados são meios sólidos a base de ovo, Löwenstein-Jensen e Ogawa-Kudoh. Têm a vantagem de serem os de menor custo e de apresentarem um índice de contaminação menor. A desvantagem é o tempo de detecção do crescimento bacteriano que varia de 14 a 30 dias podendo se estender por até 8 semanas. 3. Diagnóstico molecular Um novo teste de diagnóstico molecular chamado Xpert MTB / RIF detecta M. tuberculosis complex dentro de 2 horas, com a sensibilidade muito maior do que a de microscopia esfregaço (14) Exame radiológico É auxiliar no diagnóstico da tuberculose, justificando-se sua utilização, se possível, nos casos suspeitos. Permite a identificação de pessoas portadoras de imagens sugestivas de tuberculose, ou de outras patologias. Importante lembrar que até 15% dos casos de Tb pulmonar não apresentam alterações radiológicas, principalmente pacientes imunodeprimidos. O exame radiológico, em pacientes com baciloscopia positiva, tem como função principal, a exclusão de outra doença pulmonar associada (exemplo câncer de pulmão em fumantes com alta carga tabágica com idade superior a 40 anos), que necessite de tratamento concomitante, além de permitir avaliação da evolução

17 6 radiológica dos pacientes, sobretudo daqueles que não responderam à quimioterapia. Os resultados das radiografias de tórax deverão obedecer à seguinte classificação: Normal não apresentam imagens patológicas nos campos pleuropulmonares; Sequela apresentam imagens sugestivas de lesões cicatriciais; Suspeito apresentam imagens sugestivas de processo tuberculoso ativo; Outras doenças apresentam imagens sugestivas de pneumopatias nãotuberculosas (infecções bacterianas, micoses, abscessos ou neoplasias). Quando suspeita as principais alterações são: Tb primária - Pode apresentar-se radiologicamente como um foco pulmonar e/ou um foco linfonodal. No pulmão pode ser representado por pequena opacidade parenquimatosa acometendo mais os lobos superiores na infância e os lobos médio e inferior nos adultos, com preferência ao pulmão direito. A linfonodomegalia é observada na maioria das crianças e em até metade dos adultos. É mais comumente unilateral, embora possa ser bilateral. As regiões mais comprometidas são hilar e paratraqueal direita, sobretudo em crianças abaixo dos dois anos de idade. Pode ocorrer compressão extrínseca de via aérea pela linfadenomegalia com conseqüente atelectasia (epituberculose). Os segmentos mais comprometidos são o anterior dos lobos superiores e o medial do lobo médio (síndrome do lobo médio). Ocasionalmente o foco pulmonar primário pode drenar o cáseo liquefeito causando uma cavitação semelhante a um abscesso bacteriano. Pode ocorrer ainda disseminação broncógena grosseira ocasionando uma consolidação pneumônica indistinguível de uma pneumonia bacteriana

18 7 comum. A Tb primária pode ainda se apresentar sob a forma de derrame pleural (raro na infância). Tb pós-primária - Pequenas opacidades de limites imprecisos, imagens segmentares ou lobares de aspecto heterogêneo, pequenos nódulos e/ou estrias, são aspectos sugestivos de Tb pós-primária ou secundária. A evolução das imagens é lenta e a localização típica é nos segmentos posteriores dos lobos superiores e nos segmentos superiores dos lobos inferiores de um ou ambos os pulmões. Cavitação única ou múltipla, geralmente sem nível hidroaéreo, com diâmetro médio de 2 cm e que não costuma ultrapassar 5 cm é muito sugestiva, embora não exclusiva, detb. Outras formas menos comuns de apresentação radiológica de Tb pulmonar são: forma nodular (única ou múltipla) que simula a doença maligna, e a cavitação localizada atipicamente em lobo inferior simulando abscesso pulmonar. Assim como na Tb progressiva primária, também na Tb secundária pode ocorrer uma consolidação pneumônica simulando pneumonia bacteriana, com broncograma aéreo. Na Tb secundária não há linfonodomegalia hilar satélite Aspectos Imunológicos na Tuberculose Aproximadamente cerca de 30% das pessoas expostas ao bacilo irão adquirir a infecção. Desse total, apenas 10% irão evoluir para alguma forma clínica da doença ao longo da vida. Os 90% dos indivíduos restantes, desenvolvem uma resposta imune suficientemente eficaz para eliminar o bacilo ou pelo menos conter a infecção, conhecida como tubrculose latente (15). Estima-se que 2 bilhões de pessoas em todo o mundo têm a infecção latente e correm o risco de reativação (2). Em recente estudo, foi descrito a possibilidade de que algumas pessoas com tuberculose latente tem 79% menos risco de evoluir para

19 8 tuberculose após reinfecção que indivíduos não infectados. Este mesmo levanta a possibilidade de que algumas pessoas adquirem e eliminam a infecção aguda (16). Acredita-se que a susceptibilidade à infecção pelo M. tuberculosis, seja resultante de uma interação complexa entre fatores ambientais, microbiológicos, imunológicos e genéticos (17). Dentre esses fatores, a presença de uma resposta imune eficaz contra o bacilo, parece ser fator crucial para o desenvolvimento de um resistência à infecção. Nos últimos anos, muitos estudos vêm sendo conduzidos com objetivo de elucidar os mecanismos da resposta imune necessários em uma resposta eficaz contra o M. tuberculosis. Apesar de toda a complexidade ao redor do tema, é consenso entre os pesquisadores que uma interação eficiente entre macrófagos infectados e linfócitos Th1 é a base para uma imunidade celular protetora na tuberculose (18, 19). O primeiro evento ocorrido após a entrada do M. tuberculosis no pulmão é a fagocitose do bacilo pelos macrófagos alveolares. Sabe-se que células dendríticas (DC) e os macrófagos derivados de monócitos também podem participar deste processo (20). Estas células do sistema imune inato utilizam vários receptores para o reconhecimento, fagocitose e ativação imune, incluindo receptores de manose, de complemento, tipo scavengers e os receptores toll-like (TLR) (20,21), além de DC-SIGN ( DC-specific ICAM-3 grabbing non-integrin ) em células dendríticas (21). Sendo uma provável etapa crucial para o desenvolvimento de uma resposta imune eficaz contra o bacilo, o reconhecimento do M. tuberculosis ou de produtos micobacterianos pelos macrófagos através de receptores toll-like (TLR), mediadores da resposta imune inata essenciais para o reconhecimento da micobactéria pelos macrófagos e células dendríticas. Estes receptores, em sua maioria utilizam a molécula adaptadora MyD88, a qual participa da ativação de fatores transcricionais, como o NF- B, na sinalização para a produção de citocinas (20,21).

20 9 Por meio dos TLR, antígenos do M. tuberculosis induzem a produção de IL- 12, importante citocina pró-inflamatória, pelos macrófagos e células dendríticas (22) e uma das responsáveis pelo desencadeamento de uma resposta do tipo Th1, considerada como a principal para o controle da infecção e eliminação do bacilo. Por outro lado, ainda é controverso o papel de TLR individuais na resposta ao M. Tuberculosis. Animais deficientes em TLR2, TLR4, TLR6 ou TLR9 apresentam várias alterações de resposta ao M. tuberculosis, porém pouco aumento de suscetibilidade a pequenas doses do patógeno em aerossol (15, 23). Possívelmente múltiplos TLRs atuem em conjunto no controle do patógeno, como demonstrado pelo aumento de suscetibilidade em camundongos deficientes em TLR9 e TLR2 (23), embora animais deficientes em TLR 2 e TLR4 não apresentem diminuição da resistência ao M. tuberculosis ou bacilo Calmette Guerin (BCG) (24, 25). É interessante que camundongos TLR2-/- ou TLR9-/- (25), mas não aqueles TLR4-/- (26), apresentam maior suscetibilidade a altas doses de M. tuberculosis (23). Já o reconhecimento de M. tuberculosis via molécula DC-SIGN induz a produção de IL-10 por células dendríticas. DC-SIGN e provavelmente outros receptores de LAM (lipoarabinoman), como o receptor de manose (27), podem contrapor a ativação mediada por TLR, como p. ex: a produção de IL-12 pelo reconhecimento de CpG por TLR9, ou LPS por TLR4 (28). Subpopulações de DC humanas podem ser distingüidas pela expressão diferencial de CD11c, TLR e receptores lectina tipo-c, como DC-SIGN (CD209), receptor de manose (CD206) e ainda BDCA-2, dentre outros (29). Em humanos, DCs convencionais ou mielóides (mdcs) recém-isoladas expressam TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7 e TLR8, CD11c e DC-SIGN, enquanto DCs linfóides ou plasmacitóides (pdcs) expressam TLR7 e TLR9, BDCA-2, BDCA-4 e CD123 (30, 31). Os pdcs são a principal fonte de IFN- e INF- no sangue humano (32). Em pacientes com tuberculose ativa, números de ambas subpopulações de DCs circulantes diminuíram significativamente em relação aos controles, bem como

21 10 a produção de IFN-. Após terapia anti-tuberculose, pacientes com sucesso apresentaram aumento de contagem de pdcs e de produção de IFN- e INF- (33). A queda de DCs na circulação possivelmente esteja relacionada à migração destas células para tecido inflamatório, pois mdcs CD11c+ foram encontradas infiltrando áreas linfocíticas de granulomas tuberculosos associadas a células Th1 produtoras de IFN- (34). Modelo experimental, revelaram que a depleção de DCs CD11c+ leva a um retardo no início da resposta antígeno-específica de células T CD4 + e a um prejuízo no controle da replicação de M. tuberculosis em camundongos infectados (35). Também durante a progressão da infecção pelo HIV-1, ocorre um progressivo declínio nos números de mdc e pdc, sendo o declínio de pdcs inversamente proporcional à carga viral e associado à queda de células CD4 + e produção de IFN- /célula (36, 30). É interessante que a produção de IL-12 mediada por estímulo de TLR9 em resposta a CpG parece ser iniciada por ação de IL-15, envolvendo interação entre pdc e mdc (37). Camundongos knockout para IL-15 tratados com CpG apresentam produção defeituosa de IL-12 e IFN- e sucumbem à infecção por L. monocytogenes. Em camundongos, mdcs são as principais produtoras de IL-15 e IL-12, porém mdcs não produzem IL-12 em ausência de pdcs (38). IL-15 promove também a produção de IL-12 por DCs e monócitos, em resposta ao LPS ou à ligação ao CD40, e ainda, co-estimula a produção de IFN- por células NK e T quando em sinergia com IL-12, assim como, de TNF- e GM-CSF (39). Em um modelo murino de infecção por M. tuberculosis, foi também demonstrado que a produção de IL-15 antecede à de IL-12 (40). Em três fases da doença, IL-15 teve seu nível de expressão significativa e progressivamente aumentado, enquanto que as outras citocinas (IL-10, IL-12, IFN- ) apresentaram aumento somente nas fases 2 e 3, nos pulmões dos murinos infectados (40). O incremento de expressão dessas citocinas foi associado com a progressão ativa da doença, porém, IL-15 decresce consideravelmente durante a tuberculose latente nos pulmões e baço dos camundongos infectados (40). O conhecido efeito próinflamatório de IL-15, junto com o seu aumento de expressão durante a progressão

22 11 da doença, sugerem que IL-15 aumenta a presença de citocinas pró-inflamatórias (IL-12, IFN- e, em menor proporção, TNF), determinando o curso da infecção por M. tuberculosis (40). A IL-15 parece ser importante para o controle da infecção por M. tuberculosis. Macrófagos infectados com M. tuberculosis secretam IL-7 e IL-15, e ambas citocinas aumentam a sobrevivência de camundongos infectados pelo patógeno (41). Além das células fagocíticas, outras células da resposta imune inata estão envolvidas na resposta inicial na tuberculose, dentre elas, as células NK ( natural killer ), as células NKT e as células T. Estas células podem estar envolvidas com a produção não-específica de IFN-, citocina chave na resposta imune da tuberculose, como veremos adiante (18, 22). Em 2002, Chackerian e colaboradores (42) sugeriram a participação de células NKT na tuberculose. Essas células podem participar da resposta imune protetora pela rápida produção de IFN-, pela sua atividade citolítica ou pela ativação de células NK (43). O M. tuberculosis é um exemplo clássico de patógeno cuja resposta protetora é dependente de uma resposta imune eficiente. O controle imunológico dessa infecção é baseado na resposta imune celular, mediada predominantemente por células CD4 + Th-1. A produção de IL-12 por macrófagos e células dendríticas é induzida após a fagocitose do bacilo por essas células e direciona o desenvolvimento da resposta Th-1 com produção de IFN-, que é a citocina crucial para o controle da infecção (44). Na tuberculose, o IFN- é produzido por linfócitos T CD4 +, linfócitos T CD8 +, células NK bem como por macrófagos (45, 46, 47, 48, 49). O papel fundamental dessa citocina na resposta imune ao M. tuberculosis tem sido demonstrado por vários autores, os quais demonstraram que camundongos knockout para gene do IFN- são altamente susceptíveis à infecção pelo M. tuberculosis (50, 51, 52, 53). Fenômeno semelhante foi observado em indivíduos com deficiência nos genes do IFN- ou de seu receptor, os quais são mais susceptíveis a infecções micobacterianas, incluindo o M. tuberculosis (54). A função principal do IFN- é ativar

23 12 o macrófago infectado e dessa maneira, induzir que esta célula exerça seu papel microbicida, pela ativação da produção de reativos de oxigênio e de nitrogênio, necessários para a eliminação do bacilo (55). Além disso, o IFN- estimula o macrófago a liberar TNF, citocina importante para a formação do granuloma e para o controle da extensão da infecção (56, 57). Apesar de evidências de uma ativação crônica da resposta imune contra o bacilo serem observadas durante a tuberculose ativa, tais como a presença de hipergamaglobulinemia policlonal, aumento de níveis séricos de TNF e um aumento na expressão de marcadores de ativação nas células T circulantes. como o HLA-DR (58, 59, 60). Paradoxalmente, apesar das evidências de ativação das células T e monócitos, uma supressão significativa desta resposta também é encontrada. A diminuição da produção de citocinas características da resposta imune Th-1, tais como IFN- e IL-2, normalmente acompanhadas por um aumento de IL-10 e TGF- levando a uma supressão da resposta linfoproliferativa bem como da produção de citocinas tem sido amplamente descritas na literatura (59, 60, 61, 62, 63, 64,). Supressão esta confirmada experimentalmente, utilizando-se células obtidas de pacientes com tuberculose pulmonar as quais, após estimulação com antígenos micobacterianos (derivado protéico purificado PPD e antígeno 30Kd), apresentavam uma diminuição tanto na produção de IL-2 e IFN-, quanto na resposta linfoproliferativa antígeno-específica, quando comparados à indivíduos saudáveis (61, 62, 64, 65). Apesar desta supressão da função das células T na tuberculose, evidenciada pela diminuição da produção de citocinas Th1 frente a estímulos específicos, poder estar relacionada a um aumento na produção de IL-10 e TGF- (62, 66, 67, 68), a presença de células supressoras poderia também explicar essa diminuição na resposta celular e na produção de IFN-. Recentemente, foi descrita uma sub-população de células T CD4 + expressam altos níveis de receptores CD25, as quais foram denominadas que

24 13 CD4 + CD25 HIGH ou células T reguladoras. Evidências apontam como função primordial, in vivo, destas células T reguladoras: a manutenção da tolerância a antígenos próprios, através da modulação da atividade de células T auto-reativas (30, 69). Em indivíduos saudáveis, as células CD4 + CD25 HIGH 10% do total de células T CD4 + circulantes (30, 69, 70, 71, 72). representam de 5% a Recentemente em um estudo publicado, observou-se que o número de células CD4 + CD25 HIGH, na circulação periférica, em pacientes com tuberculose pulmonar era 3 vezes maior ao observado em indivíduos saudáveis. Além disso, demonstrou-se que a depleção de células T reguladoras (CD4 + CD25 + ) levava a uma restauração na produção de IFN- pelas células mononucleares de sangue periférico, atingindo níveis comparáveis aos apresentados por indivíduos saudáveis (73). Corroborando estes resultados, Guyot-Revol e colaboradores (2006) (74) também demonstraram, quase que simultaneamente, esse aumento do número de células T reguladoras nos pacientes portadores de tuberculose e sugerindo também a participação destas células na supressão da resposta Th1 específica na tuberculose. Outro mecanismo capaz de mediar a supressão da resposta imune observada na tuberculose, seria a pré-existência de infecção por helmintos intestinais, parasitas indutores de uma forte resposta imune do tipo Th-2, em indivíduos portadores de M. tuberculosis Resposta Imune contra Helmintos A resposta imune típica induzida pelos helmintos intestinais é dependente de células Th2, resposta que envolve produção de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, assim como a produção de IgE e a mobilização e expansão de células efetoras específicas, como mastócitos, eosinófilos e basófilos.

25 14 Portanto, a polarização da resposta imune para uma resposta tipo Th-2 pode influenciar negativamente uma resposta do tipo Th-1, inibindo a proteção imunológica do hospedeiro frente a patógenos cuja resposta protetora é Th-1- dependente (75). As células Th-2 produzem IL-10, a qual age sobre os macrófagos inibindo a ativação de resposta Th-1 e bloqueando a síntese de IL-12 pelo macrófago. Adicionalmente, as células Th-2 podem produzir TGF-, a qual atuaria diretamente sobre as células Th-1, impedindo a sua proliferação (76) Impacto da Infecção Helmíntica na Resposta Th-1 Resposta imune modulada frente a patógenos, induzida por infecções helmínticas, vem sendo demonstrada por vários autores. Em estudo de pacientes com infecções helmínticas crônicas, foi sugerido que a ativação persistente do sistema imune pelos helmintos está associada a uma diminuição na transdução de sinais com conseqüente diminuição da resposta imune (hiporesponsividade) e anergia (77). Esta hiporesponsividade é manifestada por prejuízo na transdução de sinais na célula T, diminuição na expressão de CD28 (receptor co-estimulatório) com concomitante aumento na expressão de CTLA-4, diminuição da secreção de quimiocinas e diminuição de resposta imune do tipo tardia (77). Também, em outro estudo de pacientes cronicamente infectados por helmintos intestinais, foi demonstrada uma diminuição no número de células T CD4 + e aumento de células T CD8 + circulantes e estas células apresentavam um alto nível de ativação (78). Achados como estes sugerem que uma infecção helmíntica crônica tem efeito importante e prolongado no sistema imune do hospedeiro (78). A infecção helmíntica crônica afeta também a expressão de TLRs. Dois estudos independentes mostraram que a expressão de TLR9 é diminuída em células B de pacientes infectados (79, 80) quando comparados a indivíduos sadios. Em

26 15 modelos animais, antígeno do ovo do S. mansoni foi capaz de diminuir a produção de IL-12 alterando a resposta de DCs a ligantes de TLRs. Células dendríticas humanas expostas ao helminto Brugia malayi apresentaram menor expressão de DC-SIGN, o que provavelmente explica sua menor produção de IL-10 quando infectadas com M. tuberculosis. Estas mesmas DCs apresentam menor expressão de CD14, CD54, HLA-DR e IFN- e, quando cocultivadas com células T CD4 + autólogas foram menos capazes de induzir a produção de IFN- do que outras DCs (81). Além da estimulação de uma resposta Th-2 vigorosa, alguns estudos realizados demonstraram que as infecções helmínticas podem induzir células T reguladoras, capazes de suprimir respostas do tipo Th-1 e, conseqüentemente, interferir na ativação das células T efetoras (82, 83, 84, 85). Em 2004, McKee e Pearce (83) demonstraram experimentalmente que células CD4 + CD25 + em camundongos infectados com Schistosoma mansoni produziam IL-10, inibiam a produção de IFN- e o desenvolvimento de resposta Th-1 pela diminuição na secreção de IL-12, e suprimiam proliferação de células T CD4 + após a estimulação com antígeno do ovo do S. mansoni. Os resultados de um estudo realizado em pacientes com hanseníase, demonstraram que a freqüência de helmintos intestinais era significativamente maior entre os pacientes com as formas multibacilares (38,3%) em relação aos pacientes com formas paucibacilares (24,6%), sugerindo que a infecção por nematóides intestinais pode aumentar o risco para uma forma mais grave da hanseníase (86). Ainda em estudo com indivíduos portadores de hanseníase, infectados ou não por helmintos intestinais, avaliou-se a produção de citocinas por células mononucleares, observoundo que pacientes portadores de hanseníase coinfectados com helmintos intestinais apresentavam uma menor produção de IFN-, quando comparados a pacientes portadores de hanseníase sem infecção helmíntica (86).

27 16 Por outro lado, pacientes infectados por M. leprae e helmintos apresentavam uma maior produção de IL-4 e IL-10 em relação aos pacientes infectados apenas pela micobactéria.(86). Visando avaliar se, assim como na hanseníase, a tuberculose poderia também estar associada à presença de helmintos intestinais, um outro estudo foi conduzido por Tristão el al (87). Os resultados deste estudo indicaram uma associação positiva entre a tuberculose e a infecção helmíntica. Prevalência significativamente maior vem sendo demonstrada, de nematóides intestinais em pacientes com tuberculose pulmonar (57,8%) em relação ao grupo controle (20,9%), sendo S. stercoralis o helminto mais prevalente (24,5%) encontrado entre todos os pacientes portadores de tuberculose (87). Recentemente, foi demosntrado que pacientes com tuberculose pulmonar e infecção por helmintos intestinais apresentam uma linfopenia significativa quando comparados a pacientes com tuberculose pulmonar livre de helmintose (88). As análises das subpopulações de linfócitos T (linfócitos T CD4 + e linfócitos T CD8 + ) demonstram que pacientes com tuberculose pulmonar e infecção por helmintos intestinais apresentam um número significativamente menor de linfócitos T CD4 + e de CD8 + quando comparados aos pacientes com tuberculose pulmonar livre de helmintíase e a indivíduos do grupo controle (88). A produção de IFN- em culturas de sangue total estimuladas com filtrado de cultura de M. tuberculosis tanto no início (Dia 0) quanto ao término do tratamento anti-tuberculose (Mês 6), é significativamente menor entre pacientes com tuberculose pulmonar e infecção por helmintos intestinais (Tb+Helminto) quando comparado aos com tuberculose pulmonar livre de helmintíase (Tb) (88). Enquanto que a quantificação dos níveis de IL-10 nestes mesmos sobrenadantes de cultura de sangue total mostrou que, no início do tratamento (Dia 0), não existia diferença significativa entre os grupos Tb e Tb+Helminto. Entretanto, ao término do tratamento anti-tb (Mês 6), apesar dos níveis de IL-10 em

28 17 sobrenadante de cultura diminuírem significativamente entres os pacientes do grupo Tb, os mesmos são mantidos elevados entre os pacientes com Tb+Helminto (88). Adicionalmente, observou-se a presença de células T regulatórias em uma freqüência elevada tanto no grupo TB quanto no TB+Helminto, quando comparados à indivíduos saudáveis. Considerando-se que a participação de células T regulatórias na tuberculose humana foi descrita recentemente e que estas células são encontradas na mucosa de modelos experimentais infectados com helmintos intestinais (85). É possível que a presença de helmintos intestinais, além de ativar uma resposta do tipo Th2, ative também células T reguladoras, e que a expansão destas células, mesmo que restrita aos tecidos linfóides associados à mucosa, contribua para a interferência na resposta Th1 específica contra o M. tuberculosis. Em suma, a avaliação dos estudos já realizados, indica a existência de uma forte associação entre infecção helmíntica e outras doenças infecciosas, incluindo a tuberculose. Essa associação entre infecção helmíntica e tuberculose torna-se relevante quando consideramos a situação de países em desenvolvimento, onde ambas as infecções apresentam prevalências elevadas e podem coexistir em uma mesma área. Apesar de não conclusivos, alguns estudos indicam que a presença de patógenos indutores de uma resposta imune do tipo Th2, como por exemplo os helmintos, pode afetar a capacidade do hospedeiro em organizar uma resposta imune apropriada para o controle de uma infecção por um patógeno, cuja eficiência da resposta imune é Th1-dependente. Além disso, existem evidências que a infecção por helmintos podem induzir células T reguladoras. Baseando-se nas evidências fornecidas, a proposta do estudo é avaliar a resposta imune celular em pacientes portadores de tuberculose co-infectados por helmintos intestinais e o impacto da presença destes parasitas na resposta imune e clínica durante a tuberculose. Considerando-se que:

29 18 a) O sucesso do tratamento da TB, culminando com a eliminação do bacilo, depende tanto da eficácia do esquema terapêutico quanto de uma resposta potente de células T; b) Uma resposta imune eficaz contra o M. tuberculosis depende de uma resposta Th1 intacta, a qual pode ser afetada pelos níveis de IL-15, IL-12 ou IL-10, produzidas por macrófagos ou células dendríticas; c) A participação de macrófagos ou células dendríticas na montagem de uma resposta imune adequada ao M. tuberculosis pode ser afetada por alterações numéricas e/ou fenotípicas/funcionais destas populações celulares; d) Uma resposta imune eficaz contra o M. tuberculosis depende de uma resposta Th1 intacta, a qual pode ser alterada ou mesmo inibida pela ação de células T reguladoras e/ou ativação de células T CD4 + do tipo Th1.

30 19 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral O presente estudo tem por objetivo avaliar o fenótipo celular e o perfil de citocinas em pacientes com diagnóstico recente de tuberculose pulmonar coinfectados ou não por helmintos intestinais e avaliar o impacto da helmintose intestinal na resposta clínica durante o tratamento da TB. 2.2 Objetivos Específicos Avaliar o impacto da presença de helmintos intestinais na resposta imune inata Avaliar o impacto da presença de helmintos intestinais na resposta imune celular específica; Correlacionar a presença de helmintos intestinais e alterações na resposta micobacteriológica, carga bacilífera, dos pacientes; Avaliar o efeito da presença de helmintos intestinais na resposta clínica paciente com tuberculose. Correlacionar a presença de helmintos intestinais e alterações no parenquima pulmonar atravéz do raio x de tórax

31 20 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Pacientes e indivíduos controles Termo de consentimento informado, devidamente assinado será obtido tanto dos pacientes quanto dos controles antes de sua inclusão no protocolo. Foram incluidos no estudo, 53 pacientes HIV-negativos, com baciloscopia em amostra de escarro positiva, com diagnóstico recente de tuberculose pulmonar (Tb), atendidos no ambulatório de tuberculose da Policlínica de Referencia Epidemiológica e Sanitária Cardoso Fontes e Comte Telles sendo 38 pacientes com Tb (grupo 1) apenas e 15 pacientes com Tb co-infectados por helmintos intestinais (Grupo 2). O Grupo controle contou com 34 indivíduos clinicamente saudáveis, sem sintomas clínicos e respiratórios, portanto sem Tb e com parasitológico de fezes negativos e outros 12 indivíduos com helmintíase intestinal Tb negativo, ambos com sorologia HIV negativa. Exames parasitológicos de fezes foram realizados tanto em pacientes com Tb quanto controles. O diagnóstico parasitológico foi realizado através das técnicas de Lutz, Kato-Katz, e Baerman-Moraes em pelo menos 3 amostras consecutivas de fezes, conforme descrito a seguir. Pacientes com Tb e controles saudáveis co-infectados por helmintos intestinais foram denominados Tb+Helm e Controle+Helm, respectivamente. Tanto Tb+Helm quanto Controle+Helm receberam tratamento padrão para suas verminoses, e foram re-avaliados (exames parasitológico de fezes) durante o projeto. Pacientes com Tb receberam tratamento padrão para Tb de acordo com o Manual de recomendações brasileiro para tratamento da tuberculose. 3.2 Amostras Amostras de sangue periférico, plasma e fezes foram obtidas de todos os participantes do estudo (Tb, Tb+Helm, Controle, Controle+Helm) (Figura 1). Amostras de sangue periférico foram utilizadas para avaliação quantitativa e fenotípica das populações celulares, para a realização de sorologia para HIV.

32 21 Amostras de plasma foram obtidas e utilizadas para avaliação do perfil de citocinas no sangue periférico. Amostras de fezes foraam utilizadas para o diagnóstico de infecção por helmintos intestinais e como critério de cura pós-tratamento específico das helmintíases. Amostras de escarro foram obtidas dos pacientes Tb e Tb+Helm, antes e durante o curso do tratamento anti-tb, Amostras de sangue, fezes e escarro foram obtidas nos seguintes pontos: Dia 0, 30, 60 e Descrição das metodologias e estratégia Para melhor detalharmos nossa estratégia e as metodologias que foram empregadas durante a execução do projeto (tabela 1), as mesmas foram descritas em contexto de cada um dos cincos objetivos específicos listados acima. Tabela 1 Fluxograma dos experimentos a serem realizados. Dia 0 1 mês 2 mês 3 mês GRUPO Tb X X X X X X X X X X X X Tb + Helm X X X X X X X X X X X X Controle X X X Controle+Helm X X X X X X Legenda: 1 Exame parasitológico de fezes; 2 Escarro (baciloscopia e cultura); 3 - Sangue; Observação: quadrículas preenchidas (X) denotam experimentos a serem realizados por período no respectivo grupo.

33 22 Afim de avaliar a freqüência fenotípica das células do sangue periférico e o perfil de citocinas produzidas em resposta a antígenos específicos realizamos os experimentos descritos abaixo em amostras de sangue periférico. 1. Imunofenotipagem dos leucócitos de sangue periférico pela citometria de fluxo Amostras de 5 ml de sangue periférico todo foram coletadas em tubos Vacutainer EDTA (BD Bioscience, Mountain View, CA ) por punção venosa e mantidos à temperatura ambiente até 12 horas antes da análise imunofenotípica. Alíquotas de 100 ml, foram incubadas na presença de 5 ml de anticorpos monoclonais (mabs) específicos para marcadores de superfície das células T. Para a determinação das subpopulações leucocitárias foram utilizados os seguintes conjuntos de anticorpos monoclonais: linfócitos T (CD3 CD4 CD8 CD69), linfócitosb (CD5 CD19 HLA- DR), células NK (CD3, CD16, CD56, CD69), monócitos (CD14, CD40, CD80 CD86), linfócitos T (CD4 regulador, CD25, CD152, FOXP3) (CD8/CD4/CD3) (BD). Os anticorpos foram acoplados com os seguintes fluorocromios: PE, APC, FITC, PE- Cy7 e PerCP. Os mabs foram todos adquiridos a partir de Caltag (Burlingame, CA) e incluíram anti - CD3 - TC (MHCD0306, clone S4.1), anti - CD4 - PE (MHCD0404, clone S3.5), anti - CD8 - FITC (MHCD0801, clone 3B5) e anti - CD69 - FITC ( MHCD6901, clone CH/4 ). Após a incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente, no escuro os eritrócitos foram lisados usando 2 ml de solução de lise FACS ( BD Biosciences / Pharmingen, San Diego, CA). Os leucócitos foram então lavados com 2 ml de solução salina tamponada com fosfato contendo azida de sódio a 0,01% e fixado em 200 ml de solução de FACS - FIX (10g/L de paraformaldeído, cacodilato de sódio a 1%, cloreto de 6,65g/L de sódio, 0,01% de sódio azida). Um total de eventos/tubo foram adquiridas usando uma FACSCalibur citômetro de fluxo (Becton Dickinson, San Jose, CA) corretamente configurado para medir a frente (FSC), lateral (SSC), espalha luz, FITC (FL- 1), PE (FL -2), e TC (FL 3) de fluorescência. O software CellQuestTM fornecido pelo fabricante foi utilizado para a aquisição e análise de dados. Análise seletiva de linfócitos foi realizada pela primeira gating a população do FSC (baixo) / SSC eventos (baixo) no FSC vs SSC

34 23 distribuições gráficos de pontos, seguido por quantificação de TCD3 +, TCD4 +, TCD8 + e ativação lance estado CD69 + expressão de superfície, usando anti - CD3 bi-dimensional CT versus anti - CD4 com FITC, anti - CD3 CT versus anti - CD8 PE ou FSC versus anti - CD69 FITC gráficos de pontos Um portal de dispersão específicas de FSC contra SSC foi realizada para análise de monócitos identificados como FSC ( intermediário) / SSC eventos (intermediário). Os dados foram registados como percentagem de células positivas dentro fechado leucócitos subpopulações, tal como obtido ao longo do quadrante estatísticas aplicadas sobre gráficos de pontos. 2. Quantificação de citocinas séricas A dosagem de citocinas das amostras de plasma dos pacientes e controles foi realizada pela técnica de Citometria de Fluxo CBA (Cytometric Bead Array) com o Kit BD TM Human T H 1/T H 2/T H 17 Cytokine (Cat. N , Lot.: 29132, marca BD Biosciences, San Diego, CA, USA), seguindo as orientações descritas pelo fabricante. As citocinas quantificadas foram: IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN- e IL17. O Kit BD TM CBA utiliza uma série de partículas (microesferas ou beads) de tamanho conhecido e com intensidade de fluorescência distinta para detectar simultaneamente através de uma superfície de captura as várias citocinas solúveis. Cada bead de captura esta conjugada com um anticorpo específico para cada citocina. A detecção das citocinas presentes na amostra é realizada através de anticorpos conjugados ao fluorocromo ficoeritrina (PE) que fornecem um sinal fluorescente em proporção a quantidade de citocina da amostra ligada a bead. Os complexos formados de bead de captura + citocina da amostra + anticorpo de detecção são quantificados através da Citometria de Fluxo. A intensidade da Fluorescência PE de cada complexo revela a concentração em pg/ml de cada citocina. Para a aquisição das amostras foi utilizado o Citômetro de Fluxo FACSCanto II (Becton, Dickinson and Company, San Jose, CA, USA) do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD) - Fiocruz Amazônia. Para o cálculo das

35 24 concentrações em pg/ml e Intensidade Média de Fluorescência (MFI) de cada citocina foi utilizado o software FCAP-Array TM (v3.0.1). O efeito da presença de helmintos intestinais na resposta clínica do paciente com tuberculose foi avaliado da seguinte forma: 1. Análise da evolução clínica Os pacientes do estudo foram submetidos a exame radiológico torácico e os resultados avaliados. Considerando o aspecto radiográfico das lesões pulmonares no raio-x de tórax, os pacientes portadores de tuberculose foram classificados de acordo com o grau de extensão da doença: mínima, moderada ou avançada (CLASSIFICATION OF PULMONARY TUBERCULOSIS, 1969). Os critérios para determinação da extensão da doença são descritos a seguir: a) Doença mínima: caracterizada pela presença de infiltrações de densidade leve a moderada e nenhuma cavidade deve estar presente. As lesões podem envolver uma pequena porção de ambos os pulmões, porém o volume total de infiltrações deve ser o volume de um pulmão; b) Doença moderada: as lesões podem estar presentes em ambos os pulmões, mas a extensão total destas não deve ser maior que o volume total de um pulmão ou o volume equivalente de ambos. Caso elas se apresentem em formas densas e confluentes, não devem envolver mais do que 1/3 do volume de um pulmão, sendo que o diâmetro total da cavidade (se presente) não deve ser maior que 4 cm; c) Doença avançada: lesões mais extensas do que as descritas na doença moderada. O exame radiográfico foi repetido no fim do tratamento anti-tuberculose e os resultados foram comparados aos obtidos no início do tratamento entre pacientes com Tb e com Tb + Helmintos. 3.4 Análise Estatística

36 25 Para a descrição dos grupos de comparação foram utilizadas frequências, proporções e medidas de tendência central e dispersão. As variáveis categóricas foram comparadas por homogeneidade de proporções, por meio do teste do quiquadrado. As médias foram comparadas com o teste-t de Student ou teste-t pareado. Para comparar a carga bacilar, dividida em três categorias de resultados de baciloscopia direta (1+++/3+++, 2++/3+++ e 3+++/3+++), utilizou-se o teste de McNemar. O mesmo procedimento estatístico foi aplicado para os laudos das imagens das radiografias de tórax, também dividida em quatro categorias (normal, alteração mínima, moderada e avançada). O nível de significância estatística foi fixado em 5% para todos os testes. Esta análise estatística foi realizada com pacote STATA version 11 (STATA Corporation, College Station, TX, USA). O Kruskal-Wallis seguido Turk pos-test (Dunn s multiple comparison test) foi usado para a análise quantitative do fenótipo e citocinas e foi usado GraphPad Prism software, versão 5.0 (GraphPad Prism Inc., San Diego, CA). Adicionalmente a análise para variáveis não paramétricas foi usado test T. Os valores foram expressos em medianas e interbvalos interquatis. 3.5 Cálculo De Amostras O cálculo da amostra foi realizado com a utilização do programa Statcalc (Epiinfo versão 3.5.1), utilizando-se uma aproximação para estudo de coorte, tendo em vista que a presença ou não de helmintos intestinais é o fator de risco hipotetizado para a evolução clinica diferenciada. Assim, adotando-se erro alfa de 5% e erro beta de 20% (poder de 80%), com freqüência estimada de boa evolução clinica entre o grupo não exposto (sem helmintos intestinais) de 80% e entre o grupo exposto (com helmintos intestinais) de 40%, obtivemos, na proporção de 1 caso exposto: 1 não exposto, 22 pacientes por grupo. Obs: Os resultados serão apresentados em forma de artigo segundo formatação da revista

37 26 4. RESULTADOS Plos Neglected Tropical Diseases Title: AVALIAÇÃO DO IMPACTO DA INFEÇÃO POR ASCARIS LUMBRICOIDES NA RESPOSTA CLÍNICA, MICROBIOLÓGICA E IMUNOLÓGICA EM PACIENTES COM TUBERCULOSE PULMONAR João Hugo Abdalla Santos 1, João Paulo Pimentel 3, Marcelo Cordeiro dos Santos, 1,2, Valeria Saraceni 4, Alda Maria Da-Cruz 5 1, 2*, Marcus V. G. Lacerda Running title: Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado, Amazonas, Brazil 1. Universidade Federal do Amazonas, Manaus, Amazonas Brasil 2. Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado, Manaus, Amazonas, Brazil; 3. Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, Amazonas, Brazil; 4. Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, Manaus, Amazonas, Brazil; 5. Secretaria Municipal de Saúde, Prefeitura da Cidade do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil; 6. Laboratório Interdisciplinar de Pesquisas Médicas, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ; Rio de Janeiro, Brazil *Address correspondence to Marcus V. G. Lacerda, Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado, Av. Pedro Teixeira, 25 - Manaus - Amazonas - Brasil , Fone: Fone/fax: , Celular: Electronic mail: Other authors:

38 27 Abstract: Backgraund: O controle imunológico da tuberculose pulmonar (Tb) é baseado na resposta imune celular, mediada predominantemente por células TCD4 + Th1. A presença de células T reguladoras está associada com uma supressão da atividade das células T CD4 + efetoras, e conseqüentemente com uma incapacidade em eliminar o Mycobacterium tuberculosis do local da infecção. Outro mecanismo capaz de mediar a supressão da resposta imune observada na tuberculose é a pré-existência de infecção por helmintos intestinais, parasitas indutores de uma forte resposta imune do tipo Th2. Avaliamos o fenótipo celular e o perfil de citocinas em pacientes com diagnóstico recente de tuberculose pulmonar co-infectados ou não por helmintos intestinais e o impacto da helmintose intestinal na resposta clínica durante o tratamento da Tb. Finding: A frequência de A lumbricoides nos pacientes co-infectados com tuberculose foi de 78%. Quando comparados com os pacientes de Tb apenas, estes pacientes tiveram menos lesões avançadas no parenquima pulmonar e aproximadamente 60% destes se enquadraram como paucibacilar quando avaliado quanto a sua carga bacilar no escarro. Nos casos de co-infecção TbAl houve uma recuperação mais lenta dos níveis médios de hemoglobina. A resposta imunológica, fenotípica e perfil de citocinas, dos pacientes com tuberculose pulmonar co-infectados ou não, apresentaram-se semelhantes. Conclusion: A infecção por A. lumbricoides parece não levar a repercussões clínicas expressivas na apresentação e evolução da tuberculose pulmonar. Parece haver uma tendência de redução da lesão do parenquima pulmonar bem como da carga bacilar e a IL-6 deve estar envolvida neste mecanismo. Ao contrário do esperado, a associação com Al tambem não influenciou na resposta do tipo Th1 e Th2, bem como o percentual das subpopulações de linfócitos T. Keywords: Mycobacterium tuberculosis. Tuberculose pulmonar. Ascaris lumbricoides. Fenótipo celular. Perfil de citocinas. Author Summary A prevalência de tuberculose é alta em áreas endêmicas para helmintos, sugerindo que muitas pessoas estão cronicamente infectado com ambos os patógenos. Como a infecção por helmintos pode suprimir o sistema imunitário do hospedeiro a fim de facilitar a sua própria sobrevivência, eles freqüentemente afetam a resposta imune do hospedeiro. Vários estudos têm mostrado que a infecção por helminto prejudica as respostas imúnológicas específicas de Mycobacterium tuberculosis, levantando a possibilidade de que possa haver uma diminuição da capacidade do hospedeiro em controlar a infecção M. tuberculosis. Avaliamos a resposta imune celular em pacientes portadores de tuberculose co-infectados por helmintos intestinais, tendo como foco a ascaridiose, e o impacto da presença deste parasito na resposta imune e na clínica da tuberculose pulmonar. Foram avaliados 91 indivíduos: 38 pacientes com primo-diagnóstico de tuberculose pulmonar apenas (Tb, grupo 1), 11 pacientes com Tb coinfectados com A. lumbricoides (grupo 2, TbAl), 10 pacientes com A. lumbricoides apenas e 34 indivíduos negativos para ambos as infecções e clinicamente saudáveis. Nossos resultados apontam que a infecção por A. lumbricoides parece não levar a repercussões clínicas expressivas na apresentação e evolução da tuberculose pulmonar. Curiosamente, parece haver uma tendência de redução da lesão do parenquima pulmonar bem como da carga bacilar e a IL-6 deve estar envolvida neste mecanismo. Ao contrário do esperado, a associação com Al tambem não influenciou na resposta do tipo Th1 e Th2, bem como o percentual das subpopulações de linfócitos T.

39 28 Introdução A Organização Mundial de Saúde (OMS) estimou, em 2011, 8,7 milhões de casos novos de tuberculose no mundo, com um saldo de 1,4 milhões de óbitos (1). Segundo dados do Ministério da Saúde do Brasil, o Amazonas é hoje o estado da federação com a maior incidência contabilizando 68,3/ , casos de tuberculose. O Mycobacterium tuberculosis é um exemplo clássico de patógeno cuja resposta protetora é dependente de uma resposta imune efetora eficiente. O controle imunológico desta infecção é dependente da resposta imune celular, mediada predominantemente por células T CD4 + do tipo Th1 (2). Por meio dos receptores semelhantes a Toll (Toll Like Receptors, TLR), antígenos do M. tuberculosis induzem a produção de IL-12 pelos macrófagos e células dendríticas, sendo esta uma importante citocina pró-inflamatória, (2, 3) e uma das responsáveis pelo desencadeamento de uma resposta do tipo Th1. Estes linfócitos Th por sua vez liberam IFN-, também produzido por T CD8 + e células NK. (4, 5, 6). Considerada como a principal citocina no controle da infecção e eliminação do bacilo, o IFN- ativa o macrófago infectado e dessa maneira, induz a que esta célula exerça seu papel microbicida, pela ativação da produção de reativos de oxigênio e de nitrogênio, necessários para a eliminação do bacilo (5,6). Além disso, o IFN- estimula o macrófago a liberar TNF, citocina importante para a formação do granuloma e para o controle da propragação da infecção (7; 8). Os helmintos intestinais são causa de significativa morbidade em humanos, estima-se que um terço da população mundial esteja infectado por pelo menos uma espécie de helminto. Dados apontam que a infecção isoladamente por Ascaris lumbricoides afeta mais de um bilhão de pessoas com morbidade significativa. (9). A prevalência atual das infecções helmínticas no Brasil e no Amazonas não é conhecida. A resposta imune típica induzida pelos helmintos intestinais é dependente de células Th2, resposta que envolve produção de IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, assim como a produção de IgE e a mobilização e expansão de células efetoras não-específicas, como mastócitos, eosinófilos e basófilos (10). Pacientes com infecções helmínticas crônicas, mantêm ativação persistente do sistema imune pelos antígenos parasitários, estando associada a uma diminuição na transdução de sinais na células T, com conseqüente diminuição da resposta imune (hiporresponsividade) e anergia. (10) A polarização da resposta imune para uma resposta tipo Th2 pode influenciar negativamente uma resposta do tipo Th1, inibindo a proteção imunológica do hospedeiro

40 29 frente a patógenos cuja resposta protetora é Th1 dependente (11). As células Th2 produzem IL-10, a qual age sobre os macrófagos inibindo a ativação de resposta Th-1 e bloqueando a síntese de IL-12 (12). Também levam a um aumento na expressão de CTLA-4, diminuição da secreção de quimiocinas e diminuição de resposta imune do tipo tardia (10). Pacientes crônicamente infectados por helmintos intestinais, apresentaram uma diminuição no número de células T CD4 + e aumento de células T CD8 + circulantes, sendo que estas células apresentavam um alto nível de ativação (10). A infecção helmíntica crônica afeta também a expressão de TLR. Dois estudos independentes mostraram que a expressão de TLR9 é diminuída em células B de pacientes infectados (13,14) quando comparados a indivíduos sadios. Curiosamente, alguns estudos têm relatado que as infecções por helmintos podem modular a resposta imune influenciando no desenvolvimento de algumas co-infecções como a malária, tuberculose e HIV (2). Foi demonstrado que pacientes com tuberculose que têm infecções helmínticas apresentam manifestações pulmonares mais graves, deficiência na resposta imune contra a tuberculose e resposta prejudicada a terapia anti-tb (15). No entanto, como a indução da resposta imune pode ser diferenciada em em função do tipo de interação que cada espécie de helminto estabelece com o hospedeiro, fica dificil determinar a real influência de cada helminto na tuberculose. Em suma, a avaliação dos estudos já realizados, indica a existência de uma forte associação entre infecção helmíntica e outras doenças infecciosas, incluindo a tuberculose. Essa associação entre infecção helmíntica e tuberculose torna-se relevante quando consideramos a situação de países em desenvolvimento, onde ambas as infecções apresentam prevalências elevadas e podem coexistir em uma mesma área. Baseando-se nas evidências objetivamos avaliar a resposta imune celular em pacientes portadores de tuberculose co-infectados por helmintos intestinais, tendo como foco a ascaridose, e o impacto da presença deste parasito na resposta imune e clínica na tuberculose pulmonar. Material e Métodos População estudada Foram avaliados 91 indivíduos: 38 pacientes com primo-diagnóstico de tuberculose pulmonar apenas (Tb, grupo 1), 11 pacientes com Tb coinfectados com A. lumbricoides (grupo 2, TbAl), 10 pacientes com A. lumbricoides(al) apenas e 34 indivíduos negativos para ambos as infecções e clinicamente saudáveis. Os pacientes controles (Al e clinicamente

41 30 saudáveis) foram escolhidos aleatoreamente nas proximidades em que se encontrava a unidade de atendimento dos pacientes casos. Foram considerados casos de Tb os indivíduos que apresentavam baciloscopia positiva no escarro e que não tinham relato anterior da doença. Para o diagnóstico parasitológico foram avaliadas três amostras de fezes coletadas em dias consecutivos. As técnicas de Lutz, Kato-Katz e Baerman-Moraes foram utilizadas para o diagnóstico e controle de cura. A distribuição dos helmintos na população estudada foi: A. lumbricoides 21 casos (77,8%), Trichuris trichiura 2 casos (7,4%) Strongyloides stercoralis 2 casos (7,4%), e ancilostomideo 2 casos (7,4%). Foram selecionados apenas os 21 casos que apresentavam infecção por A. lumbricoides. Todos os indivíduos que apresentassem sorologia HIV positiva eram excluídos do estudo. Os pacientes com Tb foram tratados com o esquema padrão com quatro drogas (rifampicina, isoniazida, pirazinamida e etambutol), de acordo com as recomendações do Ministério da Saúde do Brasil (16). Para o monitoramento terapêutico foi utilizado a quantificação da carga baciliar no escarro (1+/3+++, 2++/3+++, 3 +++/3+++) (16) e a quantificação semiquantivativa de imagens de alterações parequimatosas visualizadas na radiografia de tórax (mínima, moderada e avançada) (17). As radiografias foram analisadas por dois observadores independentes. Os pacientes com helmintose foram tratados com mebendazol (500 mg/dia por tres dias) ou tiabendazol (500 mg/dia por três dias). As amostras de sangue, fezes e escarro dos pacientes com Tb e TbAl foram estudadas nos dias 0, 30, 60 e 120 após a inclusão no estudo. O sangue dos pacientes com Al e controles sadios foram coletados apenas no momento de inclusão no estudo. Foram utilizados 10 ml de sangue periférico para as seguintes análises: leucograma, indices hematimétricos, fenótipo de células mononucleares e quantificação de citocinas no plasma. Considerações éticas. Este projeto foi aprovado pelo Comite de Ética em Pesquisa em Humanos da Fundação de Medicina Tropical Heitor Vieira Dourado ( ). Todos os sujeitos da pesquisa concordaram em participar do estudo e assinaram o Termo de consentimento informado, antes de sua inclusão no protocolo. Imunofonotipagem dos leucócitos do sangue priférico por citometria de fluxo Amostras de 5 ml de sangue periférico todo foram coletadas em tubos Vacutainer EDTA (BD Bioscience, Mountain View, CA ) por punção venosa e mantidos à temperatura ambiente até 12 horas antes da análise imunofenotípica. Alíquotas de 100 ml, foram incubadas na presença de 5 ml de anticorpos monoclonais (mabs) específicos para

42 31 marcadores de superfície das células T. Para a determinação das subpopulações leucocitárias foram utilizados os seguintes conjuntos de anticorpos monoclonais: linfócitos T (CD3 CD4 CD8 CD69), linfócitosb (CD5 CD19 HLA- DR), células NK (CD3, CD16, CD56, CD69), monócitos (CD14, CD40, CD80 CD86), linfócitos T (CD4 regulador, CD25, CD152, FOXP3) (CD8/CD4/CD3) (BD). Os anticorpos foram acoplados com os seguintes fluorocromios: PE, APC, FITC, PE- Cy7 e PerCP. Os mabs foram todos adquiridos a partir de Caltag (Burlingame, CA) e incluíram anti - CD3 - TC (MHCD0306, clone S4.1), anti - CD4 - PE (MHCD0404, clone S3.5), anti - CD8 - FITC (MHCD0801, clone 3B5) e anti - CD69 - FITC ( MHCD6901, clone CH/4 ). Após a incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente, no escuro os eritrócitos foram lisados usando 2 ml de solução de lise FACS ( BD Biosciences / Pharmingen, San Diego, CA). Os leucócitos foram então lavados com 2 ml de solução salina tamponada com fosfato contendo azida de sódio a 0,01% e fixado em 200 ml de solução de FACS - FIX (10g/L de paraformaldeído, cacodilato de sódio a 1%, cloreto de 6,65g/L de sódio, 0,01% de sódio azida). Um total de eventos/tubo foram adquiridas usando uma FACSCalibur citômetro de fluxo (Becton Dickinson, San Jose, CA) corretamente configurado para medir a frente (FSC), lateral (SSC), espalha luz, FITC (FL- 1), PE (FL -2), e TC (FL 3) de fluorescência. O software CellQuestTM fornecido pelo fabricante foi utilizado para a aquisição e análise de dados. Análise seletiva de linfócitos foi realizada pela primeira gating a população do FSC (baixo) / SSC eventos (baixo) no FSC vs SSC distribuições gráficos de pontos, seguido por quantificação de TCD3 +, TCD4 +, TCD8 + e ativação lance estado CD69 + expressão de superfície, usando anti - CD3 bi-dimensional CT versus anti - CD4 com FITC, anti - CD3 CT versus anti - CD8 PE ou FSC versus anti - CD69 FITC gráficos de pontos. Um portal de dispersão específicas de FSC contra SSC foi realizada para análise de monócitos identificados como FSC ( intermediário) / SSC eventos (intermediário). Os dados foram registados como percentagem de células positivas dentro fechado leucócitos subpopulações, tal como obtido ao longo do quadrante estatísticas aplicadas sobre gráficos de pontos. Quantificação de citocinas séricas As citoquinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-, IFN- e IL-17 foram medidos no soro criopreservado utilizando o cartão do kit de matriz citométrico t (CBA, BD Biosciences Pharmingen, EUA) seguindo as instruções do fabricante.

43 32 Análise estatística. Para a descrição dos grupos de comparação foram utilizadas frequências, proporções e medidas de tendência central e dispersão. As variáveis categóricas foram comparadas por homogeneidade de proporções, por meio do teste do qui-quadrado. As médias foram comparadas com o teste-t de Student ou teste-t pareado. Para comparar a carga bacilar, dividida em três categorias de resultados de baciloscopia direta (1+++/3+++, 2++/3+++ e 3+++/3+++), utilizou-se o teste de McNemar. O mesmo procedimento estatístico foi aplicado para os laudos das imagens das radiografias de tórax, também dividida em quatro categorias (normal, alteração mínima, moderada e avançada). O nível de significância estatística foi fixado em 5% para todos os testes. Esta análise estatística foi realizada com pacote STATA version 11 (STATA Corporation, College Station, TX, USA). O Kruskal-Wallis seguido Turk pos-test (Dunn s multiple comparison test) foi usado para a análise quantitative do fenótipo e citocinas e foi usado GraphPad Prism software, versão 5.0 (GraphPad Prism Inc., San Diego, CA). Adicionalmente a análise para variáveis não paramétricas foi usado test T. Os valores foram expressos em medianas e interbvalos interquatis. Resultados A co-infecção com Ascaris lumbricoides não altera a evolução clínica da tuberculose pulmonar, mas pode influenciar na gravidade das lesões pulmonares A tabela 1 apresenta a frequência dos dados demográficos, características clínicas, exames laboratoriais e de imagens dos pacientes estudados. A amostragem dos grupos TbAl e Al foi similar em termos de faixa etária e sexo, apontando para uma homogeneidade dos pacientes estudados. Tosse, dor torácica, perda ponderal e febre foram os sintomas mais frequentes, sendo descritos em acima de 80% dos casos. Não houve diferença significativa na frequência de nenhum dos sinais e sintomas estudados quando foram comparados os grupos TbAl e Tb (Tabela 1). Vinte e oito porcento (7 em 25 casos) dos pacientes de Tb apresentavam evidências radiológicas de um grau avançado de comprometimento do parênquima pulmonar. Em contrapartida, nenhum dos 11 pacientes de TbAl apresentou avançado. Em relação à carga bacilar, mais da metade dos pacientes TbAl eram paucibacilares (1+/3+++), sendo esta proporção mais elevada do que a observada nos casos de Tb. Entretanto, essas diferenças em

44 33 termos de comprometimento pulmonar e carga bacilar não foram estatisticamente significativas entre os dois grupos estudados.

45 34 Tabela 1. Comparação da frequência dos dados demográficos, características clínicas, exames laboratoriais e de imagens dos pacientes com tuberculose apenas (Tb) ou co-infectados com Ascaris lumbricoides (TbAl), no momento da inclusão. Parâmetros avaliados Grupo 1 TbAl (n=11) Grupo 2 Tb (n=38) p-valor Dados demográficos Sexo masculino (%) 63,6 71,1 ns Idade (média) 45,7 40,0 ns Sintomas Cínicos Tosse (%) 100,0 89,5 ns Dor torácica (%) 90,9 86,8 ns Perda ponderal (%) 90,9 86,8 ns Febre (%) 81,8 83,8 ns Dispnéia (%) 72,7 60,5 ns Sudorese (%) 72,7 52,6 ns Astenia (%) 63,6 47,4 ns Dor abdominal (%) 27,3 29,0 ns Diarréia (%) 18,2 18,4 ns Hemoptoicos (%) 9,1 13,2 ns Perda ponderal (média, Kg) 6,5 7,6 ns Imagens radiográficas do tórax Grau não Avançada* (n) ns Grau Avançada (n) 0 7 ns Carga bacilar 1+/ ,6 34,2 ns 2++/ ,2 39,5 ns 3+++/ ,2 26,3 ns n = número; ns = não significante * imagens Grau não avançada incluem os critérios de alteração mínina e moderada

46 35 Os pacientes foram acompanhados por três meses para verificar se os co-infectados TbAl apresentariam uma resposta ao tratamento com quatro drogas (rifampicina, isoniazida, pirazinamida e etambutol) diferente dos pacientes apenas com Tb. Foi evidenciado que a remissão, simultânea dos principais sintomas, tosse, torácica, perda ponderal e febre, se deu de forma semelhante, já no segundo mês de acompanhamento, em ambos os grupos, sem significância estatística. Visando avaliar se havia diferença em termos de alterações hematológicas entre grupos TbAl e Tb, analisou-se a evolução dos parametros hematimétricos ao longo dos três meses de acompanhamento. Foram realizadas com quatro coletas de sangue nos dias 0, 30, 60 e 90 após o diangóstico de Tb. Nas quatro comparações não se evidenciou diferença no percentual de células sanguíneas (leucócitos, eosinófilos, linfócito, neutrófilo e plaquetas) entre os dois grupos. Ao avaliarmos a recuperação da hemoglobina, pela média, observou-se uma recuperação mais rápida e normalização dos níveis da mesma no grupo com tuberculose isoladamente, embora a diferença não tenha sido significativa (Figura 1) Figura 1. Média de hemoglobina entre pacientes com tuberculose (Tb) com ou sem Ascaris lumbricoides (Al) ao longo dos três meses de seguimento clínico (sem significância estatística). Perfil fenotípico de monocuncleares do sangue periférico de pacientes com associação tuberculose e Ascaris lumbricoides em relação aos monoinfectados e saudáveis. As infecções por M. tuberculosis e A. lumbricoides podem levar a alterações no grau de ativação do sistema imune, influenciando o percentual e a funcionalidade de

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