Avaliação Imunológica na Endocardite Infecciosa

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1 Artigo Original Avaliação Imunológica na Endocardite Infecciosa Wilma C. Neves Forte, Aline C. Mario, Adilson da Costa, Luciana S. Henriques, Carla L. Gonzales, Roberto A. Franken São Paulo, SP Objetivo - Analisar a resposta imunológica em sangue periférico de portadores de endocardite infecciosa. Métodos Foram estudados 10 pacientes com endocardite infeciosa com a idade de 20 a 50 de ambos os sexos e 20 controles normais de mesma faixa etária. O diagnóstico da doença baseou-se no quadro clínico, ecocardiográfico e na hemocultura. Os pacientes não sendo portadores de atopias ou desnutrição, de doenças auto-imunes e não fazendo uso de imunossupressores, nem antibióticos, no momento da coleta, feita antes do início do tratamento. Resultados - Os pacientes com endocardite mostraram: contagem de linfócitos T, B, células CD4+, CD8+, níveis séricos de IgM, IgG e componente C4 do complemento significativamente mais elevados do que o grupo controle; sem diferenças significativas para IgA sérica e metabolismo oxidativo de neutrófilos; diminuição significativa de C3, quimiotaxia e fagocitose por monócitos; em 66,6% dos pacientes houve presença de crioglobulina, formada por IgG, IgM, IgA, C3 e C4. Conclusão - Os portadores de endocardite infecciosa apresentaram-se imunocompetentes na maioria dos setores de resposta imunológica e, num determinado momento, pode estar presente um componente auto-imune. Palavras-chave: crioglobulina, endocardite, resposta imunológica, auto-imunidade Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo Correspondência: Roberto Franken Rua Dr. Franco da Rocha 163/ São Paulo, SP Recebido para publicação em 24/9/99 Aceito em 1/3/2000 A endocardite inicia-se com a formação de vegetação estéril composta de fibrina e plaquetas devido a uma lesão endocárdica. Esse processo é denominado endocardite trombótica não-bacteriana 1-3. Nesse local, há ambiente favorável à aderência de microorganismos que são envolvidos por novas camadas de fibrina e plaquetas. Esse quadro é denominado de endocardite infecciosa, desenvolvido geralmente em locais onde o sangue vai de uma fonte com alta pressão, através de um orifício, para um local de baixa pressão, uma vez que os efeitos da pressão e da turbulência sangüínea favorecem a deposição de bactérias provenientes da rápida corrente circulatória. Por essa razão, predomina no lado esquerdo do coração, sendo as valvas mitral e aórtica as mais acometidas 1. A partir dai, pode-se observar que, para o desenvolvimento de endocardite, são necessários vários mecanismos patogenéticos, entre eles, hemodinâmicos, imunológicos e microbiológicos 2. Há uma gama de agentes microbianos causadores da endocardite infecciosa 2, porém, destacam-se as bactérias, cuja presença foi constatada por Virchow em 1869 e por Winge e Heiberg em Dentre estes microorganismos, destacam-se: Streptococcus viridans 4-6, Streptococcus bovis 4, Streptococcus agalactiae 4, Streptococcus gordonii 7, Haemophilus sp 4, Actinobacillus actinomycetemcomitans 4,8, Cardiobacterium hominis, Eikenella sp e Kingella Kingae 4. Também fazem parte desta lista, o Staphylococcus aureus e o Enterococcus faecalis, principalmente, quando associados à infecção comunitária e ausência de um foco alternativo de infecção 4. Mais raramente, outros microorganismos também podem causar a endocardite, como Staphylococcus epidermidis 4, Coxiella burnetii 4,9-11, Pseudomonas aeruginosa 12 e outros 13. A cicatrização do processo inicia-se mesmo na ausência de tratamento, porém, só se completa após a antibioticoterapia, quando as vegetações diminuem e se endotelizam. A valva curada torna-se fibrosada e calcificada, permanecendo susceptível à infecção por toda a vida. Estudos recentes sugerem a importante participação da fibronectina, uma glicoproteína presente na matriz extracelular do endotélio, na formação do trombo estéril e sua Arq Bras Cardiol, volume 76 (nº 1), 43-7,

2 Arq Bras Cardiol colonização. A fibronectina é exposta à corrente sangüínea quando o revestimento endotelial é lesado e é produzida em grande quantidade durante o processo de reparo desta lesão 1, podendo ativar o sistema complemento. Tem sido demonstrado que certos microorganismos são capazes de se ligarem à fibronectina através de receptores específicos 14. O número de receptores para fibronectina correlaciona-se diretamente com a virulência do microorganismo 15. Demonstrou-se que cepas de Staphylococcus aureus isoladas em pacientes com endocardite infecciosa têm alto número desses receptores 15. Encontrou-se também elevado número de ligações entre a fibronectina e essa bactéria 16 (56,2%). Há autores que admitem que em determinado momento da doença, o quadro clínico seja mantido por processos imunitários independentemente da presença de microorganismos 17. Assim, pesquisadores observaram presença de imunocomplexos em 97% dos casos estudados e fator reumatóide em 50% dos casos, dependendo da etiologia 18. Trabalhos sugerem que problemas extracardíacos, como articulares, renais, vasculares e cutâneos sejam decorrentes de depósito de imunocomplexos circulantes nos vários órgãos acometidos 5,17, A grande prova da participação imunológica na endocardite infecciosa reside na agressão renal que coexiste na doença 18. Baseados no exposto, qual seria o motivo pelo qual alguns pacientes, diante dos mesmos microorganismos, apresentem apenas quadros de amigdalites e outros, quadros de endocardite bacteriana? Haveria uma imunodeficiência transitória levando à evolução para endocardite? Sabe-se que a endocardite resulta de fatores que predispõem o endotélio a infecções (diversas lesões cardíacas) e situações que levam à bacteremia transitória. Fundamentados em estudos existentes sobre um componente imune na endocardite infecciosa e na ausência de trabalhos que estudassem todos os setores da resposta imunológica em portadores de endocardite infecciosa, em atividade e na importância da doença em questão, é que nos propusemos a elaborar o presente estudo. Métodos Foi feita análise do sangue periférico de 11 portadores de endocardite infecciosa. O diagnóstico da doença baseou-se no quadro clínico (sinais e sintomas inespecíficos de início insidioso que sugeriam um quadro infeccioso), no ecocardiograma para visualização das vegetações e na hemocultura para pesquisa da bactéria (critérios de Duke). Os pacientes pertenciam à faixa etária de 20 a 50 anos de idade, de ambos os sexos, não portadores de atopias ou desnutrição, não portadores de doenças auto-imunes ou história de auto-imunidade, sem apresentarem outras doenças infecciosas, e que não faziam uso de imunossupressores nem antibióticos no momento da coleta, a qual foi feita imediatamente antes do início do tratamento (grupo II). Os dados encontrados foram comparados ao grupo controle (grupo I) formado por 20 indivíduos saudáveis entre 20 e 50 anos. A coleta do material foi realizada no momento da internação dos pacientes na Unidade de Pulmão e Coração (UPCOR) do Hospital Central da Santa Casa de São Paulo junto a coleta de outros exames, sendo que os pacientes consentiram de que parte destes exames seriam destinados à pesquisa. A análise do material foi feita no Laboratório de Imunologia da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo. Os métodos utilizados foram: 1) contagem de linfócitos timo-dependentes (linfócitos T) por microscopia de imunofluorescência, utilizando-se anticorpos monoclonais anti-cd3, após separação de 3x10 6 linfócitos/ml através de gradiente Ficoll-Hypaque, obtendo-se os valores absolutos a partir de leucograma; 2) contagem de linfócitos bursa-equivalentes (linfócitos B) por microscopia de imunofluorescência, utilizando-se anticorpos monoclonais anti- CD19, após separação de 2x10 6 linfócitos/ml através de gradiente Ficoll-Hipaque; 3) contagem de subpopulações de linfócitos T, por microscopia de imunofluorescência, utilizando-se anticorpos monoclonais anti-cd4 e anti-cd8, após separação de 10 6 linfócitos/tubo através de gradiente Ficoll-Hypaque, utilizando-se anti-cd4 e anti-cd8 nas diluições de 1/5 e 1/10, respectivamente; 4) dosagem quantitativa de imunoglobulinas séricas IgG, IgM, IgA e dos componentes C3 e C4 do complemento por imunodifusão radial simples e cálculo das concentrações por curva de diâmetro do halo, com leitura após 48h e 72h; 5) teste do nitro blue tetrazolium espontâneo e estimulado, utilizando-se 100ml de sangue heparinizado, 50ml de solução nitro blue tetrazolium 0,1% tamponada e 50ml de lipopolissacáride bacteriano para estimulação. O teste do nitro blue tetrazolium avalia diretamente a liberação de elétrons na transformação NADPH+ para NADP, elétrons estes captados por flavoproteínas da membrana citoplasmática, transportados pelo citocromo b558 e utilizados na etapa da digestão por metabolismo oxidativo; 6) avaliação da atividade quimiotática por monócitos: após a separação das células por gradiente Ficoll-Hypaque, utilizaram-se câmaras de Boyden. Foram feitos três experimentos: controle; monócitos incubados com lipossacáride bacteriano e pool de soro humano normal (soro homólogo) e monócitos incubados com lipossacáride bacteriano e soro do próprio paciente (soro autólogo). Os resultados foram avaliados por distância de migração em micra. A fagocitose por monócitos, após separação das células, foi analisada por três experimentos análogos utilizando-se tubos de Leighton: monócitos (controle), monócitos incubados com zymosan e soro homólogo, monócitos incubados com zymosan e soro autólogo. O primeiro ensaio foi realizado para verificar que a célula estava viva e o método adequado; soro homólogo e soro autólogo fornecem complemento necessário para a fagocitose: se com soro homólogo e soro autólogo os resultados fossem diferentes entre si, a alteração não seria obrigatoriamente do fagócito mononuclear; 7) detecção e identificação de crioprecipitados, aguardando-se a formação do crioprecipitado a partir de soro, por um período de 10 dias a 4 0 C; no caso de formação de crioprecipitados, estes foram separados por centrifugação refrigerada a C, lavados 10 vezes em solu- 44

3 ção salina, seguindo-se identificação para IgG, IgM, IgA, C3 e C4 através de placas por imunodifusão radial simples, lendo-se o diâmetro do halo após 48h e 72h; provas paralelas de aquecimento do crioprecipitado foram realizadas para exclusão de fibrinogênio. A metodologia por anticorpos monoclonais dosados por imunodifusão radial tem sido amplamente utilizada. Os anticorpos utilizados foram da DAKO Corporation e a diluição foi de 1:10 para CD4, CD8, CD3, CD19 e 1:20 para o conjugado. O teste do nitro blue tetrazolium é útil para avaliação do metabolismo oxidativo de polimorfonucleares neutrofílicos, uma vez que estando funcionalmente viável a etapa da digestão da fagocitose por estas células, há liberação de elétrons que são captados pelo corante amarelo nitro blue tetrazolium, que é então reduzido, dando origem à formazana que se deposita na forma de grânulos azuis no citoplasma celular. Os exames sobre quimiotaxia e fagocitose por fagócitos mononuclerares refletem a migração direcionada e a etapa de ingestão dessas células, avaliando sua funcionalidade, pois quimiotaxia e fagocitose dependem da integridade de receptores nos monócitos para C3a-C5a e C3b-C5b, respectivamente. O método estatístico utilizado foi o teste t de Student, sendo considerados significativos os valores <0,05. Resultados Os resultados estão apresentados na tabela I e tabela II. A tabela I mostra aumento significativo para linfócitos T e B, células CD4 e CD8, IgM e IgG séricas e componente C4 do complemento, diminuição significativa do componente C3 do complemento sem alteração significativa de IgA nos portadores de endocardite. A tabela II mostra diminuição significativa dos valores de fagocitose e quimiotaxia por monócitos nos casos de endocardite. Não foram observadas diferenças significativas para os valores do teste do nitro blue tetrazolium. Foi observada ainda a presença de crioprecipitados em Tabela I - Resultados dos números absolutos dos linfócitos B e T, células CD4 e CD 8 positivas, níveis séricos de imunoglobulinas e componentes C3 e C4 do complemento em pacientes portadores de endocardite infecciosa (grupo II) e em indivíduos normais (grupo I) Grupo Endocardite Controles Significância 0,05 Linfócitos T 2914± ±568 S Linfócitos B 647± ±147 S Células CD ± ±467 S Células CD ± ±175 S IgM (mg/dl) 243± ±116 S IgG (mg/dl) 1971± ±507 S IgA (mg/dl) 353± ±156 NS 3 (mg/dl) 86± ±58 S C4 (mg/dl) 42±15 29 ±29 S S- significante; NS- não significante; Média ± DP. Tabela II - Resultados de quimiotaxia (distância em micra), fagocitose por monócitos (percentual de monócitos que fagocitam 3 ou mais partículas de Zimosan entre um número fixo de 200 monócitos) e teste do nitro blue tetrazolium (NBT) para neutrófilos em pacientes portadores de endocardite infecciosa (grupo II) e em indivíduos normais (grupo I) Grupo Endocardite Controles Significância P < ou = a 0,05 Quimiotaxia por monócitos- 20±13 27±5 NS Controle Quimiotaxia por monócitos- 45±29 65±7 S soro homólogo Quimiotaxia por monócitos- 47±30 68±7 S soro autólogo Fagocitose por monócitos- 13±7 18±5 NS Controle Fagocitose por monócitos- 52±20 63±7 S soro homólogo Fagocitose por monócitos- 56±20 66±6 S soro autólogo NBT espontâneo 9±4 11±3 NS NBT estimulado 19±9 20±4 NS S- significante; NS- não significante. Media ± DP oito dos onze pacientes com endocardite infecciosa, sendo todos constituídos por IgM, IgG, IgA, C3 e C4. Discussão Foram selecionados, imediatamente antes do início do tratamento, na tentativa de ter como única variável a endocardite infecciosa, os portadores de endocardite infecciosa, sem atopias, desnutrição e outras doenças sistêmicas, sem antecedentes de auto-imunidade. Os experimentos foram realizados em duplicata e utilizadas técnicas bem estabelecidas 24,25. Os resultados significativamente elevados para linfócitos bursa equivalentes (células CD19 positivas), timo dependentes (células CD3 positivas) e subpopulações de células auxiliares (CD4 positivas) e citotóxicas (CD8 positivas), assim como o aumento dos níveis séricos de IgM, IgG e componente C4 do complemento nos portadores de endocardite são compatíveis com valores habitualmente observados frente a infecções. Há trabalhos na literatura apresentando títulos elevados de IgM, IgG e IgA em pacientes com endocardite infecciosa 26,27. Não foram encontrados estudos que avaliassem linfócitos T, B, células CD4 e CD8 positivas na endocardite em atividade, exceto a respeito de uma forma rara e atípica de endocardite causada pela Coxiella burnetii que cursa com raras vegetações e hemocultura negativa 11. Nesse caso, evidenciou-se, além de crioglobulinemia e gamopatia policlonal 11, uma diminuição dos linfócitos B (CD19 positivas) e T (CD3 positivas) com maior diminuição nas células CD4 positivas do que nas células CD8 positivas 28, sugerindo que esse tipo de endocardite esteja associado à supressão da resposta linfocitária a antígenos específicos 10. Fo- 45

4 Arq Bras Cardiol ram verificados, ainda, aumento significativo de TNF-alfa e IL-1beta, citocinas proinflamatórias produzidas por monócitos ativados durante o processo inflamatório, além do aumento de IgG e IgA e de imunocomplexos nesse tipo de endocardite 10. Crioglobulinemia também foi observada por um outro estudo sobre endocardite bacteriana subaguda 29. A presença, na maioria dos pacientes, de crioprecipitado formado por IgG, IgM, IgA, C3 e C4, observada no presente trabalho, sugere caráter de auto-imunidade na doença. Ainda os dados observados sobre diminuição do componente C3 do complemento e da atividade de monócitos contribuem para tal hipótese. Complemento freqüentemente é consumido em doenças auto-imunes em fase de atividade. Da mesma forma, fagócitos mononucleares necessitam perfeita funcionalidade para que possam degradar imunocomplexos circulantes. Fatores envolvidos na adesão de monócitos e/ou bactérias na superfície das vegetações podem afetar a fagocitose de bactérias pelos fagócitos mononucleares 30. Verificou-se que a fibronectina, um componente da matriz extracelular, pode estar envolvida na adesão da bactéria à superfície das vegetações endocárdicas de forte intensidade conduzindo a uma fagocitose diminuída por parte dos monócitos 30. Os fagócitos mononucleares dos portadores de endocardite apresentaram diminuição da quimiotaxia e da fagocitose, o que poderia contribuir para menor degradação de imunocomplexos circulantes e conseqüente presença de crioglobulinas. A diminuição da quimiotaxia e fagocitose por monócitos não ocorre habitualmente em processos infecciosos. Quando se avalia fagocitose na presença de soro ho- mólogo está sendo fornecido o componente C3, o qual irá se unir ao receptor para C3 presente em monócitos, permitindo a fagocitose. Estando esta diminuída, implica que haja um problema intrínseco celular do monócito, fato confirmado ao se fornecer soro autólogo e não haver diferença entre fagocitose com soro homólogo e com soro autólogo (ambas igualmente diminuídas). Trabalhos anteriores observaram diminuição dos componentes C3 e C4 do complemento e presença de imunocomplexos circulantes em pacientes com endocardite 5,17-21,31. Autores descrevem aumento de imunocomplexos circulantes com a evolução da doença e diminuição com tratamento 5. Pesquisadores relacionam o achado de imunocomplexos com a infecção endocárdica e não com o defeito endocárdico 17,20. Trabalhos mostram uma predisposição genética em portadores de endocardite infecciosa, sendo o haplotipo mais freqüente HLA-B35 32, sugerindo maior suscetibilidade da doença em determinados indivíduos. Nossos resultados, apresentando aumento significativo de linfócitos T, B, células CD4+, CD8+, IgM, IgG e componente C4 do complemento, são compatíveis com os observados em processos infecciosos de indivíduos imunocompetentes. Por outro lado, a diminuição significativa observada para componente C3 do complemento, da quimiotaxia e fagocitose por monócitos e a presença de crioprecipitados no soro dos pacientes com endocardite permitem concluir que exista também um componente auto-imune na doença. É possível que a endocardite infecciosa seja determinada por um microorganismo agressor associado a um componente auto-imune, como sugerido pela presença de crioglobulina no soro desses pacientes. Referências 1. João SR, Afonso MRB, Júnior LM, Júnior BNA, França HH. Aspectos patogê nicos e imunitários da endocardite infecciosa. Arq Bras Cardiol 1990; 54: Anguita M, Torres F, Castillo JC, Valles F. Etiopathogenesis of infective endocarditis: predisposing heart diseases and casual microorganisms. 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