UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA JOANA FERNANDES EIGENHEER MOREIRA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA JOANA FERNANDES EIGENHEER MOREIRA AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA DE CÉLULAS INFLAMATÓRIAS NO ENDOMÉTRIO DE ÉGUAS SADIAS E REPETIDORAS DE CIO EM PROGRAMAS DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES. NITERÓI 2011

2 1 JOANA FERNANDES EIGENHEER MOREIRA AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA DE CÉLULAS INFLAMATÓRIAS NO ENDOMÉTRIO DE ÉGUAS SADIAS E REPETIDORAS DE CIO EM PROGRAMAS DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES. Tese apresentada ao Programa de Pósgraduação em Medicina Veterinária. da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Animal. Orientadora: Prof. Dra. ANA MARIA REIS FERREIRA Niterói 2011

3 2 JOANA FERNANDES EIGENHEER MOREIRA AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA DE CÉLULAS INFLAMATÓRIAS NO ENDOMÉTRIO DE ÉGUAS SADIAS E REPETIDORAS DE CIO EM PROGRAMAS DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES. Tese apresentada ao Programa de Pósgraduação em Medicina Veterinária. da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor. Área de Concentração: Clínica e Reprodução Animal. Aprovada em 17 de junho de BANCA EXAMINADORA Profª. Drª. Ana Maria Reis Ferreira Orientadora Universidade Federal Fluminense/UFF Profª. Drª. Alline Ferreira Brasil Centro Universitário Plínio Leite/UNIPLI Profª. Drª. Daniela de Carvalho Martins Universidade do Grande Rio Prof. José de Souza Herdy/UNIGRANRIO Prof. Dr. Daniel Augusto Barroso Lessa Universidade Federal Fluminense/ UFF Prof. Dr. José Antonio Silva Ribas Universidade Federal Fluminense/UFF Niterói 2011

4 3 O justo atenta para a vida dos seus animais. (Provérbios 12: 10) A meus pais, Emílio Maciel Eigenheer e Stela Cristina Fernandes Eigenheer os que primeiro me ensinaram a amar os animais pela dedicação e incentivo para que eu sempre seguisse em frente. A Agnelo Alberto Peres Moreira, meu marido, cujo amor e cumplicidade enriqueceram os últimos doze anos de minha vida. À minha irmã Júlia Fernandes Eigenheer, pelo carinho e a amizade que nos possibilitou compartilhar os risos e os choros.

5 4 AGRADECIMENTOS A Deus que me criou por ter renovado minhas forças e me ajudado a romper barreiras e ultrapassar obstáculos. À professora Ana Maria Reis Ferreira pela orientação, paciência e dedicação em ensinar e como coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, área de concentração: Clínica e Reprodução Animal, pela oportunidade e pela grande ajuda na realização deste trabalho. Ao Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária pela oportunidade oferecida para o meu crescimento profissional. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior/CAPES, pelo apoio financeiro concedido para a realização deste trabalho. À professora Daniela de Carvalho Martins e à professora Juliana da Silva Leite pela ajuda valiosa na tese sem as quais esse trabalho não teria se concretizado. Ao médico veterinário Flávio Tavares Fernandes pela chance que me ofereceu de aprender em campo, pelos ensinamentos que me transmitiu e o exemplo profissional que revelou nesse convívio. Ao médico veterinário Fernando José Rohen de Queiroz pela oportunidade e o ensino. Aos médicos veterinários Thalita Pissinati, Aline Emerin Pinna, Gabriel Greco e Milena Blaness pelo grande empenho em me auxiliar na realização deste trabalho. À médica veterinária Elaine Cristina Amorim Pupino cuja ajuda foi importante na etapa final deste trabalho. À professora Ana Beatriz Monteiro pela execução da análise estatística e pela ajuda preciosa. Às alunas de iniciação científica Lais Machado Grebos e Aline Gomes Araújo pela importante ajuda no desenvolvimento dos dados da imuno-histoquímica.

6 5 Á Dalva Rocha Vieira pela incansável ajuda no processamento histológico das amostras. Á Alessandra Escóssia da Costa por estar sempre pronta a me socorrer. Às secretárias da Pós-Graduação Ana Paula Neves Areas, Renan Freitas e Sidney Gonçalves Cordeiro pelo apoio durante todo o desenvolvimento do trabalho. Aos funcionários da Clínica de Reprodução Eqüina e da Equus Veterinária por toda força e boa-vontade. Aos meus avós, Romeu Salles Fernandes (in memoriam) e Ephigênia Cristina César Mafra Salles Fernandes, por estarem sempre ao meu lado e orando por mim. À minha avó Delurdes Maciel Eigenheer (in memoriam) e ao meu avô Emílio Eigenheer (in memoriam) que sempre torceram por mim e gostariam de ter visto o meu desempenho acadêmico. Às minhas amigas Fernanda Martinez Xavier Alves e Patrícia Riddell Millar pela amizade sincera e por estarem sempre por perto. A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a concretização deste trabalho.

7 6 SUMÁRIO LISTA DE ILUSTRAÇÕES, p. 8 LISTA DE GRÁFICOS, p. 10 LISTA DE TABELAS, p. 12 RESUMO, p. 14 ABSTRACT, p INTRODUÇÃO, p OBJETIVOS, p OBJETIVO GERAL, p OBJETIVOS ESPECÍFICOS, p REVISÃO DE LITERATURA, p CICLO ESTRAL DA ÉGUA, p MORFOLOGIA UTERINA DA ÉGUA, p PROCESSO DE REPARAÇÃO TECIDUAL, p TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM ÉGUAS, p Fatores que afetam as taxas de prenhez e a sobrevivência embrionária, p Idade, p Anormalidades uterinas, p Endometrite, p Endometrose, p Endometrite infecciosa, p Endometrite persistente pós-cobertura, p Susceptibilidade a endometrite, p BIÓPSIA ENDOMETRIAL NA ÉGUA, p Técnica, p. 39

8 Indicações, p Sistema de classificação da biópsia endometrial, p Alterações patológicas encontradas no exame histológico, p Interpretação dos achados histopatológicos, p IMUNO-HISTOQUÍMICA, p Anticorpo anti-mpo, p Anticorpo anti-cd3, p Anticorpo anti-mac 387, p MATERIAL E MÉTODOS, p ANIMAIS, p COLETA DAS AMOSTRAS ENDOMETRIAIS DE BIÓPSIA, p TÉCNICA DE HISTOPATOLOGIA, p TÉCNICA DE IMUNO-HISTOQUÍMICA, p ANÁLISE HISTOMORFOMETRICA, p ANÁLISE ESTATÍSTICA, p RESULTADOS, p AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA, p AVALIAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA, p Análise da imunomarcação com o anticorpo anti-mpo (mieloperoxidase), p Análise da imunomarcação com o anticorpo anti-cd3, p Análise da imunomarcação com o anticorpo anti-mac 387, p DISCUSSÃO, p AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA, p AVALIAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA, p CONCLUSÕES, p REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS, p. 105

9 8 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Fig. 1 QUADRO 1 Esquema de corte longitudinal do útero normal da égua, adaptado de Van Camp (1988), f. 22 Alterações morfológicas fisiológicas endometriais durante o ciclo estral (Van Camp, 1988), f. 24 QUADRO 2 Classificação da biópsia endometrial segundo Kenney e Doig (1986), f. 42 Fig. 2 Fig. 3 Biópsia endometrial eqüina. Endometrite. A égua 35, sadia, doadora, classificação endometrial IIA infiltrado inflamatório predominante de mononucleares, difuso e leve com presença de edema; B égua 36A, repetidora de cio, doadora com classificação IIA infiltrado inflamatório com predomínio de mononucleares de leve a moderado e presença de hemorragia; C égua 37, sadia, doadora com classificação IIB infiltrado inflamatório com mono e polimorfonucleares difuso com presença de hemorragia; D égua 37, sadia, doadora com classificação IIB infiltrado inflamatório com mono e polimorfonucleares difuso; E égua 33, repetidora, doadora com classificação IIB infiltrado inflamatório com predomínio de mononuclerares difuso, com glândulas dilatadas com conteúdo luminal; F égua 28, repetidora, doadora com classificação III ninho glandular fibrosado (A-F HE; A-E 200X original; F 100X original), f. 89 Biópsia endometrial eqüina. Endometrite. A égua 3, repetidora de cio, receptora com classificação endometrial IIB - imuno-reatividade dos neutrófilos no epitélio luminal e próximo dele no interstício do estrato compacto e em menor proporção próximo às glândulas endometriais com o anticorpo anti-mpo; B égua3 detalhe - imuno-reatividade dos neutrófilos no interstício do estrato compacto e próximo às glândulas endometriais com o anticorpo anti-mpo; C égua 33, repetidora, doadora com classificação IIB imunoreatividade dos linfócitos no epitélio luminal, no interstício do estrato

10 9 compacto, próximo às glândulas endometriais com o anticorpo anti- CD3; D égua 33 imuno-reatividade dos linfócitos no interstício do estrato compacto ao redor das glândulas endometriais com o anticorpo anti-cd3, em maior aumento; E égua 16, sadia, doadora com classificação endometrial IIA imuno-reatividade dos macrófagos no estrato compacto, próximo às glândulas endometriais com o anticorpo anti-mac 397; F égua 16 imuno-reatividade dos macrófagos no estrato compacto, próximo às glândulas endometriais com o anticorpo anti-mac 397, em maior aumento (A,C,D 100X original; B,D,F- 400X original), f. 90

11 10 LISTA DE GRÁFICOS GRÁFICO 1 - GRÁFICO 2 - GRÁFICO 3 - GRÁFICO 4 - Comparação dos grupos (repetidoras doadoras, sadias doadoras, repetidoras receptoras e sadias receptoras) quanto à classificação endometrial (IIA, IIB e III), f. 69 Comparação dos grupos (repetidoras doadoras e sadias doadoras) quanto à classificação endometrial (IIA, IIB e III), f. 70 Comparação dos grupos (repetidoras doadoras, sadias doadoras, repetidoras receptoras e sadias receptoras) quanto à quantidade de ninhos glandulares fibrosados, f. 72 Relação entre a faixa de idade das éguas e a classificação endometrial (IIA, IIB e III), f. 74 GRÁFICO 5 - Diagrama de dispersão da imunomarcação do anticorpo anti-mac 387 X anti-cd3 em éguas repetidoras de cio doadoras, f. 76 GRÁFICO 6 - GRÁFICO 7 - GRÁFICO 8 - GRÁFICO 9 - GRÁFICO 10 - GRÁFICO 11 - Diagrama de dispersão da imunomarcação do anticorpo anti-cd3 X idade (anos) em éguas sadias doadoras, f. 77 Boxplot da mediana do anticorpo anti-mpo (média) nas diferentes classificações endometriais (IIA, IIB e III), f. 78 Boxplot da mediana do anticorpo anti-mpo (média) em éguas repetidoras doadoras, sadias doadoras, repetidoras receptoras e sadias receptoras, f. 79 Boxplot da mediana do anticorpo anti-mpo (média) em relação à faixa etária (anos) das éguas, f. 80 Boxplot da mediana do anticorpo anti-cd3 (média) nas diferentes classificações endometriais (IIA, IIB e III), f. 82 Boxplot da mediana do anticorpo anti-cd3 (média) em éguas repetidoras doadoras, sadias doadoras, repetidoras receptoras e sadias receptoras, f. 83

12 11 GRÁFICO 12 - GRÁFICO 13 - GRÁFICO 14 - GRÁFICO 15 - Boxplot da mediana do anticorpo anti-cd3 (média) em relação à faixa etária (anos) das éguas, f. 84 Boxplot da mediana do anticorpo anti-mac 387 (média) nas diferentes classificações endometriais (IIA, IIB e III), f. 86 Boxplot da mediana do anticorpo anti-mac 387 (média) em éguas repetidoras doadoras, sadias doadoras, repetidoras receptoras e sadias receptoras, f. 87 Boxplot da mediana do anticorpo anti-mac 387 (média) em relação à faixa etária (anos) das éguas, f. 88

13 12 LISTA DE TABELAS TABELA 1 - TABELA 2 - TABELA 3 - TABELA 4 - TABELA 5 - TABELA 6 - TABELA 7 - TABELA 8 - TABELA 9 - TABELA 10 - TABELA 11 - TABELA 1 Número de éguas estudadas nos grupos das sadias doadoras, repetidoras doadoras, sadias receptoras e repetidoras receptoras, f. 59 Diluições dos anticorpos e tempo de banho-maria e de revelação com diaminobenzidina para os anticorpos utilizados nas biópsias endometriais das éguas sadias e repetidoras de cio. Niterói, 2011, f. 61 Classificação da biópsia endometrial, segundo Kenney e Doig (1986), de éguas sadi doadoras, f. 64 Classificação da biópsia endometrial, segundo Kenney e Doig (1986), de éguas sadias receptoras, f. 65 Classificação da biópsia endometrial, segundo Kenney e Doig (1986), de éguas repetidoras de cio doadoras, f. 66 Classificação da biópsia endometrial, segundo Kenney e Doig (1986), de éguas repetidoras de cio receptoras, f. 67 Porcentagem de éguas dos quatro grupos (repetidoras doadoras, sadias doadoras, repetidoras receptoras e sadias receptoras) de acordo com a classificação endometrial (IIA, IIB e III), f. 68 Porcentagem de éguas de dois grupos (repetidoras doadoras e sadias doadoras) de acordo com a classificação endometrial, f. 69 Porcentagem de éguas dos quatro grupos (repetidoras doadoras, sadias doadoras, repetidoras receptoras e sadias receptoras) de acordo com o tipo de infiltrado inflamatório, f. 71 Porcentagem de éguas dos quatro grupos (repetidoras doadoras, sadias doadoras, repetidoras receptoras e sadias receptoras) de acordo com a intensidade do infiltrado inflamatório, f. 71 Porcentagem de éguas dos quatro grupos (repetidoras doadoras, sadias doadoras, repetidoras receptoras e sadias receptoras) de acordo com a quantidade de ninhos glandulares fibrosados, f. 72

14 13 TABELA 12 - TABELA 13 - TABELA 14 - TABELA 15 - TABELA 16 - TABELA 17 - TABELA 18 - TABELA 19 - TABELA 20 - TABELA 21 - TABELA 22 - TABELA 23 - Porcentagem de éguas dos quatro grupos (repetidoras doadoras, sadias doadoras, repetidoras receptoras e sadias receptoras) de acordo com a quantidade de lacunas linfáticas, f. 73 Porcentagem de éguas (jovens e velhas) em relação a cada tipo de classificação endometrial (IIA, IIB e III), f. 74 Porcentagem de éguas (jovens e velhas) de acordo com a quantidade de ninhos glandulares fibrosados, f. 75 Valores da média com desvio padrão, mediana e valores máximo e mínimo da média da expressão do anticorpo anti-mpo nas diferentes classificações endometriais (IIA, IIB e III), f. 78 Valores da média com desvio padrão, mediana e valores máximo e mínimo da média da expressão do anticorpo anti-mpo nos quatro grupos de éguas (sadias doadoras, sadias receptoras, repetidoras doadoras e repetidoras receptoras), f. 79 Valores da média com desvio padrão, mediana e valores máximo e mínimo da média da expressão do anticorpo anti-mpo em relação à faixa etária das éguas (anos), f. 80 Valores da média com desvio padrão, mediana e valores máximo e mínimo da média da expressão do anticorpo anti-cd3 nas diferentes classificações endometriais (IIA, IIB e III), f. 81 Valores da média com desvio padrão, mediana e valores máximo e mínimo da média da expressão do anticorpo anti-cd3 nos quatro grupos de éguas (sadias doadoras, sadias receptoras, repetidoras doadoras e repetidoras receptoras), f. 83 Valores da média com desvio padrão, mediana e valores máximo e mínimo da média da expressão do anticorpo anti-cd3 em relação à faixa etária das éguas (anos), f. 84 Valores da média com desvio padrão, mediana e valores máximo e mínimo da média da expressão do anticorpo anti-mac 387 nas diferentes classificações endometriais (IIA, IIB e III), f. 85 Valores da média com desvio padrão, mediana e valores máximo e mínimo da média da expressão do anticorpo anti-mac 387 nos quatro grupos de éguas (sadias doadoras, sadias receptoras, repetidoras doadoras e repetidoras receptoras), f. 87 Valores da média com desvio padrão, mediana e valores máximo e mínimo da média da expressão do anticorpo anti-mac 387 em relação à faixa etária das éguas (anos), f. 88

15 14 RESUMO A subfertilidade na égua é o maior problema na criação equina, causando grande perda econômica. Associada à biópsia endometrial, a imuno-histoquímica pode ser utilizada no auxílio de diagnóstico de uma forma mais precisa. O objetivo desse trabalho foi avaliar as amostras de biópsias endometriais de éguas sadias e repetidoras de cio, doadoras e receptoras de embrião, através da análise dos achados histopatológicos e de imuno-histoquímica (neutrófilos, linfócitos T e macrófagos) e a partir dos resultados, demonstrar se existe uma relação entre estes e a redução de fertilidade nestas fêmeas. Foram coletadas amostras de 24 éguas sadias (grupo controle), e de 30 éguas repetidoras de cio, em idade reprodutiva (3 a 23 anos) das raças Mangalarga Marchador e Campolina. As reações imuno-histoquímicas foram realizadas com os anticorpos monoclonais MPO, CD3 e MAC 387. Foi encontrada correlação entre a classificação endometrial IIB e III e a condição de subfertilidade das éguas repetidoras de cio (doadoras e receptoras). As endometrites e as fibroses foram as alterações histopatológicas mais frequentes em éguas repetidoras de cio; as éguas velhas apresentaram maior quantidade de fibrose (ninhos glandulares fibrosados) e as classificações endometriais de pior prognóstico (IIB e III) estão diretamente ligadas à idade da égua (mais velhas). Já na análise da imuno-histoquímica, não foi encontrada correlação entre a idade das éguas e a quantidade de células inflamatórias estudadas, nem associação entre a quantidade de neutrófilos e os achados histopatológicos e nem das células inflamatórias com a redução de fertilidade dessas fêmeas. Éguas do grupo IIB apresentaram maior quantidade de linfócitos T. Observou-se também que éguas com alterações histopatológicas mais graves apresentaram maior quantidade de macrófagos. A escolha de uma égua receptora levando em consideração as características histológicas do útero através de exame realizado no início da temporada e pela idade (jovem) é de fundamental importância para aumentar a probabilidade de sucesso da gestação. Outros trabalhos ainda devem ser realizados para entender melhor a dinâmica do processo inflamatório e como isso pode estar ligado a subfertilidade em éguas para auxiliar no diagnóstico e no tratamento desses animais. Palavras-chaves: égua, biópsia endometrial, MPO, CD3, MAC 387, subfertilidade.

16 15 ABSTRACT The subfertility in the mare is the biggest problem in creating equine, causing great economic loss. Associated with endometrial biopsy, immunohistochemistry can be used to aid diagnosis of a more precise way. The aim of this study was to evaluate the endometrial biopsy samples from healthy mares in heat and repeaters, embryo donors and recipients through the analysis of histopathological and immunohistochemical (neutrophils, lymphocytes and macrophages) and from the results demonstrate if a relationship exists between them and reduced fertility in these females. Samples were collected from 24 healthy horses (control group), repeaters and 30 mares in heat, of reproductive age (3-23 years) and breeds Mangalarga Marchador Campolina. The immunohistochemical reactions were performed with monoclonal antibodies MPO, CD3 and MAC 387. Correlation was found between the endometrial classification IIB and III and the condition of subfertility in mares in heat repeaters (donors and recipients). The endometritis and fibrosis were the most frequent histopathological changes of estrus in mares repeaters; old mares had a higher amount of fibrosis (fibrous glandular nests) and ratings of poor prognosis endometrial (IIB and III) are directly linked to the age of the mare (older). The analysis of immunohistochemistry, we found no correlation between the age of the mares and the amount of inflammatory cells studied, no association between the amount of neutrophils and histopathological findings of inflammatory cells and not with the reduced fertility of these females. Mares in group IIB had a higher number of T lymphocytes It was also observed that horses with more severe pathological changes showed a higher concentration of macrophages. The choice of a recipient mare taking into account the characteristics of the uterus through histological examination early in the season and by age (young) is of fundamental importance to increase the likelihood of successful pregnancy. Other studies have yet to be conducted to better understand the dynamics of the inflammatory process and how it can be linked to subfertility in mares for the diagnosis and treatment of these animals. Key words: mare, endometrial biopsy, MPO, CD3, MAC 387, subfertility.

17 16 1 INTRODUÇÃO A espécie equina foi considerada por muito tempo como a de menor fertilidade entre as espécies domésticas, o que foi atribuído a características de seleção e problemas relacionados ao manejo reprodutivo (GINTHER, 1992). Com o passar do tempo, ocorreram avanços científicos e a aplicação de novas técnicas de manejo, mas pesquisas são sempre necessárias para garantir um bom resultado reprodutivo. A transferência de embrião tornou-se um mercado crescente no agronegócio, permitindo um maior aproveitamento do potencial genético e reprodutivo de animais de alta performance. A subfertilidade na égua é o maior problema na criação equina, causando grande perda econômica devido a redução da produção de um potro por ano (CONCHA-BERMEJILLO; KENNEDY, 1982). Um dos aspectos mais importantes para que se mantenha a gestação é a existência de um útero normal e particularmente um endométrio sadio (KENNEY, 1978). Assim, a biópsia endometrial é um auxílio diagnóstico de muito valor uma vez que retrata o estado do endométrio através do método histopatológico. A endometrite é um dos fatores que pode afetar a taxa de prenhez e a sobrevivência embrionária (LEBLANC, 2010). Os mecanismos de defesa do útero equino contra agentes estranhos incluem complexas interações de diferentes elementos, como componentes celulares, imunoglobulinas, substâncias bactericidas e fatores mecânicos (MELO et al., 2008). Assim, conhecer a dinâmica da inflamação, o papel das células inflamatórias nesse processo e como isso pode influenciar na fertilidade da égua é de grande importância.

18 17 A técnica de imuno-histoquímica utiliza conceitos da imunologia aplicados ao estudo histológico, utilizando uma ligação específica do anticorpo com antígenos teciduais (BEESLEY 1, 1993 apud MARTINS, 1997) através de substâncias marcadoras acopladas aos anticorpos sem que estes percam a capacidade de se combinar com o antígeno (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1999). Associada à biópsia endometrial, a imuno-histoquímica pode ser utilizada no auxílio de diagnóstico de uma forma mais precisa e também na análise de um endométrio normal (MARTINS, 1997). A imuno histoquímica tem uma grande especificidade e é muito importante para a identificação e avaliação de marcadores prognósticos, sendo um importante instrumento diagnóstico e também investigacional (PAINTER et al., 2010). O uso de anticorpos como o anti-mpo, anti-cd3 e anti-mac 387 para a detecção de células inflamatórias (neutrófilos, linfócitos T e macrófagos) se tornou mais útil e específico do que a avaliação pelo método de histologia convencional por hematoxilina-eosina (PAINTER et al., 2010). Desta forma, este trabalho, através da análise de achados histopatológicos e de imunohistoquímica de células inflamatórias neutrófilos, linfócitos T e macrófagos - do endométrio de éguas repetidoras de cio e sadias, visa contribuir com dados para futuros estudos relacionados ao diagnóstico e tratamento da subfertilidade em éguas utilizadas em programas de transferência de embriões. 1 BEESLEY, J. Immunocitochemistry: A Practical Approach. Oxford; New York: Oxford University Press, 1993.

19 18 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Avaliar amostras de biópsias endometriais de éguas sadias e repetidoras de cio, doadoras e receptoras de embrião, através da análise dos achados histopatológicos e de imuno-histoquímica para neutrófilos, linfócitos T e macrófagos e a partir dos resultados, demonstrar se existe uma relação entre estes e a redução de fertilidade nestas fêmeas. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Descrever os achados histopatológicos das amostras endometriais de éguas sadias e de repetidoras de cio; Demonstrar se há relação entre os achados histopatológicos e de imunohistoquímica com a idade das éguas; Analisar a presença de neutrófilos, linfócitos T e macrófagos no endométrio de éguas sadias e de repetidoras de cio pelo método de imuno-histoquímica utilizando os anticorpos monoclonais mieloperoxidase (MPO), CD3 e MAC 387, respectivamente; Relacionar os achados histopatológicos e de imuno-histoquímica utilizando o anticorpo monoclonal mieloperoxidase (MPO); o anticorpo monoclonal CD3 e o anticorpo monoclonal MAC 387 das amostras endometriais de éguas sadias e de repetidoras de cio.

20 19 3 REVISÃO DE LITERATURA 3.1 CICLO ESTRAL DA ÉGUA As éguas são poliéstricas estacionais, apresentando uma atividade cíclica da primavera ao outono e entram em período de anestro durante o inverno (ARTHUR, 1979). A atividade ovariana cessa sob condições de diminuição de luz. Estendendo o fotoperíodo à noite, suprime-se a liberação de melatonina pela glândula pineal o que estimula a atividade ovariana (WATSON, 1998). Depois do anestro há um período de transição para a atividade cíclica regular. Neste período a duração do estro pode ser longa ou irregular (ARTHUR, 1979). O ciclo estral é normalmente de dias (ALLEN, 1994; WATSON, 1998) e compreende o período entre duas ovulações (DAELS; HUGHES, 1993). Fases do ciclo estral: Estro: Essa fase é caracterizada por uma alta concentração de estrogênio e do hormônio luteinizante (LH) e uma concentração basal de progesterona. Geralmente dura 5-6 dias com a ovulação ocorrendo horas antes do fim do estro. A égua encontra-se sexualmente receptiva (ARTHUR, 1979; HAFEZ, 1995; STABENFELDT; EDQVIST, 1996; WATSON, 1998) deixa ser montada, procura com atenção o garanhão, levanta a cauda, faz contrações rítmicas com o clitóris, urina e não dá coice. O cérvix apresenta-se rosado, relaxado, úmido, aberto e edematoso. Encontra-se no assoalho da vagina. O útero está edematoso e flácido. No exame de ultrasonografia, as pregas endometriais edematosas fazem com que a imagem no corte transversal do corno uterino se pareça com a metade de uma laranja (WATSON, 1998). O estrogênio ainda estimula o crescimento das glândulas endometriais; dos ductos das glândulas mamárias; regula a secreção de gonadotropina (aumenta a sensibilidade ao GnRH), incluindo a liberação ovulatória

21 20 de LH pela hipófise anterior; pode ser responsável pela liberação da PGF2α e causa atividade secretora do oviduto, que favorece a sobrevivência do oócito e do espermatozóide (STABENFELDT; EDQVIST, 1996). A vulva e a vagina encontram-se edemaciadas e dilatadas no estro (ARTHUR, 1979; HAFEZ, 1995). Os folículos geralmente estão macios 24 horas antes da ovulação, mas, alguns se tornam túrgidos outra vez antes da ovulação. A égua é frequentemente sensível à palpação ovariana nesse momento. O folículo pré-ovulatório aumenta aproximadamente 30 mm seis dias antes da ovulação até em média 45mm no dia da ovulação. No auge da estação de monta, entretanto, não é raro a égua ficar no estro apenas três ou quatro dias e ovular um folículo menor que 35 mm de diâmetro. Depois da ovulação, a cavidade folicular é preenchida de sangue (corpo hemorrágico) (WATSON, 1998). Diestro: Geralmente dura de dias. A égua rejeita o garanhão. Esta fase é caracterizada por uma alta concentração de progesterona circulante. O corpo lúteo (CL) está presente no ovário. O CL pode ser preenchido com líquido (50%) ou não. Ele geralmente não é palpável. O cérvix está pálido, firme, seco e fechado. Está projetado para o meio do lúmen vaginal. O tônus uterino aumenta e os cornos uterinos tornam-se tubulares (WATSON, 1998). A progesterona promove o crescimento das glândulas endometriais; do lobuloalveolar na glândula mamária; a atividade secretora do oviduto e das glândulas endometriais para fornecer nutrientes para o desenvolvimento do embrião antes da sua implantação; evita a contração uterina durante a gestação e regula a secreção de gonadotropinas (diminui a sensibilidade ao GnRH) (STABENFELDT; EDQVIST, 1996). Além disso, a musculatura uterina encontra-se relaxada e o cérvix contraído. A mucosa vaginal está pálida e o muco vaginal e cervical escassos (ARTHUR, 1979). A PGF2α liberada pelo útero no dia 14 ou 15, causa uma luteólise e a fêmea retorna o estro caso não haja gestação (WATSON, 1998). Período transicional: Ocorre antes e após o anestro estacional. Na primavera, o comportamento do estro pode ser observado intermitentemente ou continuamente por várias semanas. A primeira ovulação da estação é geralmente seguida por uma atividade cíclica normal. Um conjunto de folículos grandes (> 30mm) é frequentemente encontrado nos ovários. A cérvix não está fechada firmemente até a égua ovular (WATSON, 1998).

22 21 Anestro estacional: É o período prolongado de inatividade sexual. A função ovariana está em inatividade temporária. O desenvolvimento folicular encontra-se ausente ou ligeiramente ativo. O cérvix está contraído ou relaxado (como uma cortina), o muco vaginal reduzido e a mucosa vaginal pálida (ARTHUR, 1979). Frequentemente a égua está passiva com o garanhão ou pode demonstrar alguns sinais leves comportamentais do estro. O útero está flácido. As concentrações de progesterona e estrogênio estão baixas (WATSON, 1998). 3.2 MORFOLOGIA UTERINA DA ÉGUA O útero da égua é composto por 3 camadas: endométrio (camada mais interna), miométrio e perimétrio (mais externa). O fragmento da biópsia consiste geralmente da porção do endométrio sem músculo, embora ocasionalmente inclua uma porção da camada circular interna do miométrio (KENNEY, 1978). O endométrio consiste em 2 camadas: epitélio luminal e lâmina própria. O epitélio luminal consiste de células cuboidais a colunares altas que residem em uma membrana basal (MB) e varia de altura de acordo com o ciclo estral (figura 1). Menos da metade das células são ciliadas (KENNEY, 1978). A lâmina própria é composta de 2 camadas, estrato compacto (EC) e estrato esponjoso (EE). O primeiro é caracterizado por ter uma densidade relativamente alta de células do estroma, com numerosos capilares sob a MB. As células do estroma são irregularmente estreladas com núcleo oval e citoplasma escasso. Já o estrato esponjoso possui uma densidade baixa de células com muitas fibras conectando as células, criando uma aparência esponjosa. Os espaços nas áreas esponjosas são normalmente preenchidos com um fluido tecidual. Os vasos sanguíneos no EE são capilares, arteríolas, vênulas e ocasionalmente pequenas artérias musculares. Também existem numerosos vasos linfáticos (KENNEY, 1978).

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