Monitoramento molecular de Begomovirus infectando plantas de batata (Solanum tuberosum L.) em plantações no Estado de São Paulo.

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João Pedro Marreiro Gentil
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1 Monitoramento molecular de Begomovirus infectando plantas de batata (Solanum tuberosum L.) em plantações no Estado de São Paulo. Haiko Enok Sawasaki 1 ; José Alberto Caram Souza-Dias 1 ; Paulo Castanho Almeida Pernambuco Fo 2 ; Anneliese Vogt Salles 2. 1 APTA-Instituto Agronômico Campinas, CP28, Campinas-SP; 2 Estudante-estagiário. ABSTRACT: Molecular monitoring of Begomovirus infecting potato plants (Solanum tuberosum L.) in commercial fields in the State of São Paulo (SP). In the main solanaceous crop region of Campinas, SP, over the past 10 years, by molecular and biological monitoring, top leaves of potato plants (Solanum tuberosum), showing deforming mosaic symptoms (dms): a yellowing mosaic or mottling on distorted and deformed leaflets, have been associated with Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV-U79998, 1997). Using universal primers, cloned and sequenced 1320bp fragments from isolates obtained in 2000 and 2004, presented high similar sequences (99,8%) and were named ToYVSV-IAC (AY829113). Although ToYVSV-IAC showed identity of only 88,7% with the original (U79998) and 94% nucleotide identity to Tomato golden vein virus (ToGVV-AY751742), it was 99,7% similar with elsewhere isolate (G22- EF459696) from march/2007. Another elsewhere isolate (Ba-3-EF417915, February 2007), showed 96,4% identity to the ToYVSV (U79998), but seems to be a putatively stored original sample. Between August-October/2006 from a potato plantation in Sumaré (cv. Agata), showing 5-7% of dm, four infected samples analyzed for DAS-ELISA for PVY, PLRV, PVX, PVS were all negative, while nucleotides sequences revealed a 98,8%-95,3% similarity to Tomato severe rugose virus (ToSRV) isolates from Goiás (DQ207749) and Uberlândia (AY029750), respectively. These results present evidences that ToSRV was the causal agent infecting and showing dms in 2006 potato plants from Sumaré. Another survey made in May/June2007, in São Paulo State potato producing areas, located in Paranapanema region, which is over 300 km southwest of Sumaré, confirmed ToSRV in that region, in two independent potato fields. The PCR identification analysis between ToYVSV and ToSRV isolates, were facilitated when followed by an EcoRI enzyme restriction: ToYVSV was not restricted while ToSRV resulted in two fragments (340 and 988bp). This simplified method is an alternative to the more timely and costly sequencing techniques. Keywords: Solanum tuberosum, ToSRV; ToYVSV; geminivirus; PCR; EcoRI enzyme restriction.

1 APTA-Instituto Agronômico Campinas, CP28, 13001-970-Campinas-SP; 2 Estudante-estagiário. ABSTRACT: Molecular monitoring of Begomovirus infecting potato plants (Solanum tuberosum L.

2 INTRODUÇÃO Begomovirus (Família Geminiviridae, gênero Begomovirus) constitui um grupo de vírus de plantas de grande importância econômica em diversas culturas. Na região de Campinas (Sumaré, Monte Mor, Elias Fausto), a constatação do begomovirus denominado Tomato yellow vein streak virus (U79998) tem sido observada em batata (Solanum tuberosum) (Faria et al., 1997). Questões relacionadas à instabilidade ou diversidade dos begomovirus, pressão de disseminação via inseto vetor ou movimentação de tubérculo/batata-semente, demandam o monitoramento de begomoviroses em outras regiões de batata e o desenvolvimento de metodologia simplificada de identificação molecular. A partir do ano 2000, utilizando-se os pares de primers universais para Begomovirus (Rojas et al., 1997) que descriminam begomovirus transmitidos pela mosca branca Bemisia tabaci e amplificam parte do gene rep (ORF AC1); a região comum (CR); e parte do gene cp (ORF AV1), foi iniciado o monitoramento da presença e variabilidade genética de begomovirus em plantações de tomate (Lycopersicon esculentum) e batata, na região de Campinas. O monitoramento foi realizado inicialmente através de PCR seguido de sequenciamento para a identificação das espécies (Sawazaki et al., 2001, 2007). No presente trabalho são relatados estudos de espécies de Begomovirus infectando batatais na região Paulista de Paranapanema, assim como testes de distinção entre duas espécies: ToYVSV e Tomato severe rugose vírus (ToSRV) via enzima de restrição, dispensando o processo de sequenciamento de maior custo e complexidade. MATERIAL E MÉTODOS O monitoramento molecular de begomovirus foi realizado em duas plantações de batata-consumo na região de Paranapanema: Estância Trigo, cv. Bintje; e Fazenda Rodeio, cv. Ágata, nas quais foram transplantadas plantas indicadoras de Datura stramonium, em blocos ao acaso. Em meados de maio de 2007, no estádio de 70 dias do plantio do batatal, amostras de folhas das plantas de batata e D. stramonium apresentando sintomas típicos de infecção por geminivirus (Souza-Dias et al., 2004), foram coletadas para análise, sendo apenas 5 da cv Bintje (a cv. Ágata não apresentou sintoma) e 10 de D. stramonium (6 do campo de Bintje e 4 do campo de Ágata). Após extração do DNA e reação de PCR (Sawazaki et al. 2007) com os primers degenerados PAC1v1978 / PAV1c715 (Rojas et al., 1997), os fragmentos amplificados de 1320 pb purificados (QIAquick,QIAGEN) foram clonados em PGEM (pgem-t Easy System, Promega). O DNA plasmidial foi seqüenciado utilizando os primers T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3) ou SP6 (5'-

3 TATTTAGGTGACACTATAG-3) através do sistema BigDye/ABI PRISM 377 (Applied Biosystems). As seqüências analisadas por BLAST foram alinhadas com sequências correlatas pelo programa Bioedit v.7.05 (Hall, 1999) para análise de similaridade. Para escolha do tipo de restrição específica, foi preliminarmente realizada análise in silico ( RESULTADOS E DISCUSSÃO As análises de PCR amplificaram fragmentos característicos de 1320pb para todos os 10 isolados de plantas sintomáticas de D. stramonium, e também para 2 das 5 amostras de plantas de batata (cv. Bintje), que apresentavam sintomas sugestivos de mosaico deformante associado a geminivirus. O fragmento restrito do isolado de ToSRV apresentou as bandas de 340 e 988 pb, enquanto o ToYVYV apenas a banda de 1320pb (Figura 1), semelhante aos fragmentos obtidos em 2000 e 2004 clonados e seqüenciados, cujas seqüências, praticamente idênticas (99,8%), foram denominadas ToYVSV-IAC (AY829113). Os testes de PCR aliado à restrição com a enzima EcoRI, cujo sítio não está presente no ToYVSV, mas sim, no Tomato severe rugose virus (ToSRV), indicaram a possibilidade de uso desta técnica, sem a necessidade de sequenciamento na diferenciação dos dois isolados em questão. Um isolado de ToYVSV (G22-EF março 2007), cuja identidade é de 99,6% com o ToYVSV-IAC (AY829113), indica estabilidade deste vírus a partir do ano 2000, enquanto outro isolado (Ba-3-EF fevereiro 2007) mostrou semelhança de 96,4% com o primeiro isolado ToYVSV (U ); possivelmente por ser procedente de isolado mantido em laboratório. Como a seqüência do primeiro isolado ToYVSV (U ) tem similaridade de 88,7% com as seqüências de , questiona-se possível adaptação a novos hospedeiros da região seguida por estabilização. A análise de BLAST dos isolados de Paranapanema mostrou identidade de quase 100% com o ToSRV encontrado em agosto-outubro/2006 em plantas de batata (cv. Ágata) na região de Sumaré. Esse isolado com similaridade de 98,8%-95,3% aos isolados do ToSRV de Goiás-DQ e Uberlândia-AY029750, respectivamente, apresentaram apenas 72,8% com o ToYVSV-IAC (AY829113), confirmando tratar-se de outra espécie. Devido à possibilidade da substituição do begomovírus outrora predominante na região de Campinas: ToYVSV > ToSRV, provavelmente este último parece ter melhores condições de disseminação e sobrevivência, demandando o monitoramento para certificação desta prevalência.

RESULTADOS E DISCUSSÃO As análises de PCR amplificaram fragmentos característicos de 1320pb para todos os 10 isolados de plantas sintomáticas de D.

4 Figura 1. Perfil de PCR com primers universais para begomovirus / folhas sintomáticas de batata e D. stramonium : 1) ToSRV; 2) ToYVSV; 3) ToSRV restrito com EcoRI; 4- ToYVSV restrito com EcoRI; P- padrão de 1Kb Plus (Invitrogen). Obs.:ToYVSV, de batata, armazenado em 20 o C. CONCLUSÕES 1- Foi confirmada a disseminação do ToSRV em campos de produção de batata na região de Paranapanema. 2- A técnica de PCR aliada à restrição com a enzima EcoRI possibilita a diferenciação entre os isolados de begomovirus ToYVSV e ToSRV sem a necessidade de sequenciamento. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS FARIA, JC; SOUZA-DIAS, JAC; SLACK SA; MAXWELL, DP A new geminivirus associated with tomato in the State of São Paulo, Brazil. Plant Disease.81: ROJAS, A; KVARNHEDEN, A; MARCENARO, D; VALKONEN, JPT Sequence characterization of tomato leaf curl Sinaloa virus and tomato severe leaf curl virus: phylogeny of New World begomoviruses and detection of recombination. Archives of Virology 150: SAWAZAKI, HE; SOUZA-DIAS, JAC; COLARICCIO, A.; SIQUEIRA, W; MATOS, E Sequenciamento parcial do atual geminivirus dos tomatais da região de Campinas, SP. In: XXIV CONGRESSO PAULISTA DE FITOPATOLOGIA, Anais... Piracicaba: Summa Phytopathologica, 27:116. SAWAZAKI, HE; SOUZA-DIAS, JAC; MENDONÇA, ENA; PERNAMBUCO-FILHO, PCA.2007.Outro begomovirus na região metropolitana de Campinas, SP: Tomato severe rugose vírus (ToSRV). Summa Phytopathologica, 33:11. SOUZA-DIAS, JACDE; SAWASAKI, HE, SANTINI, A Infestação Hereditária: Plantio sucessivo de batata e tomate, perpetua o vírus Tomato yellow vein streak geminivirus (ToYVSV) e procria a mosca branca transmissora. Cultivar, HF, 5: AGRADECIMENTOS Agradecemos a FUNDAG pelo apoio financeiro.

CONCLUSÕES 1- Foi confirmada a disseminação do ToSRV em campos de produção de batata na região de Paranapanema.

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