PESQUISA EM ANDAMENTO

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1 Empresa Brasileira de Pesquisa Agrpecuária Embrapa Gad de Crte Ministéri da Agricultura e d Abasteciment Rdvia BR 262, km 4 - Caixa Pstal 154 CEP Telefne (067) Fax (067) N~ 49, Abril/1999, p. 1-5 Camp Grande-MS PESQUISA EM ANDAMENTO CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DO Trypansma vivax ISOLADO NO PANTANAL DO ESTADO DE MATO GROSSO E O DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DA INFECÇÃO POR Trypansma evansi PELA REAÇÃO EM CADEIA DA POllMERASE (PCR) '<0 <O E c U <O +-' 'w.s'.;:: ' UJ.:;; ea. "O <O x: ::J Q) li: l<{ l> Zw I- <{ Cláudi R. Madruga 1 Subbash Mrzaria" Phelix O. Majiwa 2 Trypansma vivax fi intrduzid na América d Sul n sécul passad. A prevalência é variável em diverss países deste cntinente, nde crrem surts esprádics e perdas ecnômicas cnsideradas imprtantes. N Brasil, Trypansma vivax fi diagnsticad pela primeira vez n Estad d Pará em 1972, infectand búfal. Até recentemente, a incidência desse hemprtzári estava restrita à regiã Nrte d País. Entretant, este hemparasit fi diagnsticad, em 1995, infectand um rebanh bvin em Pcné, regiã d Pantanal d Estad de Mat Grss, cujs sintmas principais eram anemia, cnjuntivite, disenteria, abrt e mrte. Psterirmente, a infecçã pr este agente etilógic fi diagnsticada em utras regiões d Pantanal. Prtant, é necessári um estud epiztilógic para btençã de dads para avaliar s riscs da incidência, efeit na prdutividade e impact ecnômic na bvincultura da regiã. Para alcançar esses bjetivs, as técnicas de diagnóstic sã fundamentais. Os testes srlógics para detecçã de anticrps existentes, aglutinaçã em cartã, imunflurescência indireta e imunadsrçã enzimática, apresentam reaçã cruzada cm T. evansi, embra neste últim teste crra em menr percentagem. Pr utr lad, as técnicas de diagnóstic diret cm a de micrhematócrit u técnica de W e imunadsrçã enzimática para detecçã de antígens de Trypansma apresentam baixa sensibilidade, apesar da alta especificidade. A alternativa é a reaçã em cadeia da plimerase (per) que pssui 1 Méd.-Vet., Ph.D., CRMV-MS N2 0587, Embrapa Gad de Crte, Caixa Pstal 154, CEP Camp Grande, MS, Brasil. 2 Internatinal Livestck Research Institute (llradl. P.O. Bx 30709, Nairbi, Kenia.

2 PA-49, abr./1999, p.2 elevads índices de sensibilidade e especificidade. O bjetiv deste trabalh fi identificar gene que cdifica uma prteína slúvel de 8 kda de T. vivax n islad btid de uma vaca nelrada cm sintmas clínics de tripanssmíase n surt crrid em Pcné, Pantanal de Mat Grss. Este gene pssui múltiplas cópias repetidas em tandem n genma d T. vivax, na mairia ds islads analisads até presente. Entretant, existe islad cm menr númer de cópias deste gene u cm divergência genética, que resulta numa amplificaçã insatisfatória para a utilizaçã dessa PCR cm diagnóstic. O segund bjetiv fi verificar a frmaçã d prdut de 1,5 kb cm primers para subgêner Trypanzn que inclui T. evansi, cm a finalidade de estabelecer um PCR múltipl que pssa realizar um diagnóstic diferencial de T. vivax. Na caracterizaçã d gene que cdifica a prteína slúvel de T. vivax e PCR, fram utilizads DNA d islad d Pantanal de Pcné, Estad de Mat Grss (CNPGCPPTV01) e d clne ILDat1.2 riginári de islad d Oeste da África. A PCR para T. vivax empregu s primers ILO1264, de seqüência de bases CAG CTC GCC GAA CAC TTG GCT GGG e IL01265 TCG CTA CCA TCG CAA TCG TCG TCT CAA GG. A reaçã de amplificaçã fi realizada num vlume de 20 micrlitrs utilizand 50 nangrams de primers, Mde cada dntps e três unidades de Thermus aquaticus DNA plimerase. O termcicladr fi prgramad para 92 C, 1 minut (desnaturaçã), 55 C, 1 minut (alinhament) e 72 C, 1 minut (extensã) pr 30 cicls. Cinc micrlitrs da reaçã fram clcads em gel agarse 1%, para eletrfrese e crads cm brmet de etídi, e as bandas visualizadas em luz ultravileta e ftgrafadas em filme plaróide. Os prduts da PCR e DNA genômic fram transferids para membrana de nitrcelulse s/ts b/ts e hibridizads cm plasmíde pgdsil-800/2/1 marcad cm 32p. Adicinalmente, DNA genômic sfreu digestã cm a enzima de restriçã Sau3A e fi clcad para eletrfrese em agarse 0,8% e crad cm brmet de etídi para ftgrafia. Na seqüência, DNA d gel fi desnaturad, neutralizad e transferid para uma membrana de náiln. A hibridaçã desta membrana fi também realizada cm pgdsil-800/2/1 marcad cm 32p. Na PCR para T. evansi, fram utilizads s seguintes primers: IL0342 GAT CCG CAG CCG GGC CTG e IL0343 CCG CGG TGG CTC CTT CCC. As cndições da reaçã de PCR fram idênticas às empregadas para DNA de T. vivax. A PCR, tant d DNA genômic d islad brasileir de T. vivax cm d clne ILDat1.2, amplificu um prdut de, aprximadamente, 400 pb. Huve hibridaçã tant d DNA genômic quant d prdut da PCR cm a snda utilizada (Figs. 1 e 2). A hibridaçã d DNA genômic digerid pr Sau3A apresentu igual tamanh

3 PA-49, abr./1999, p.3 de bandas entre s rganisms de T. vivax estudads (Fig. 3). A amplificaçã pr PCR d DNA genômic d islad de T. evansi resultu num prdut de cerca de 1,5 kb, típic d subgêner Trypanzn. Cm base ns resultad~ btids, infere-se que islad de T. vivax da regiã de Pcné pssui gene que cdifica antígen slúvel de T. vivax e que sua rganizaçã genômica é similar a d clne d Oeste da África. Prtant, s primers desenvlvids n Internatinal Livestck Research Institute sã aprpriads para amplificaçã de DNA d islad da regiã d Pantanal d Brasil, cm fi demnstrad pel resultad da PCR. Os primers utilizads para subgêner Trypanzn apresentaram também resultads psitivs. Prtant, fi pssível desenvlver uma reaçã de PCR múltipla para diagnóstic diferencial das infecções pr T. vivax e T. evansi (Fig. 4). A próxima fase será a determinaçã da sensibilidade desta PCR, para utilizá-ia cm diagnóstic. A B FIG. 1. Hibridaçã d prdut de DNA qenrrnc (A) e PCR (B) e de Trypansma vivax cm plasmíde pgdsil , marcad cm 32p. Linha A DNA genômic, 1A-5A islad brasileir de T. vivax. 6A cntrle psitiv clne ILDat1.2, 7A T. evansi. Linha B Prdut d PCR, 1B-5B islad brasileir, 6B cntrle negativ T. evansi, 7B cntrle psitiv ILDat1.2.

4 ., PA-49, abr./1999, p FIG. 2. Hibridaçã d prdut da PCR para Trypansma vivax cm plasmíde pgdsil800/2/1 marcad cm 32p, cntend gene que cdifica antígen slúvel deste hemprtzári. Linha 1-5 DNA d islad da regiã d Pantanal, linha 6, cntrle negativ, linha 7 cntrle psitiv ILDat '; ", I~ i- ~t,i " FIG. 3. Shuthern blt e hibridaçã cm pgdsli-800/2/1 marcad cm 32p d DNA d clne ILDat 1.2 d Oeste da África e islad d Pantanal d Brasil digerid pr Sau3A. Linha 1, ILDat1.2, linhas 2 e 3 islad d Pantanal.

5 PA-49. abr./1999. p.5 FIG. 4. PCR múltipla para detecçã de DNA de Trypansma vivax e T. evansi. Linha 1 marcadr de pes mlecular, linha 2 cntrle psitiv ILDat1.2, linhas 3, 4 islad d Pantanal, linha 5 islad brasileir cm primers para Trypanzn, linha 6 ILDat1.2 cm primers para Trypenzn, linha 7 T. evansi cm primers para T. vivex, linha 8 T. evensi, linha 9 T. brucei, linha 10 cntrle negativ sem DNA de Trypansma. Tiragem: 50 exemplares