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1 - Instituto Politécnico de Lisboa - - Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Lisboa - Licenciatura em Anatomia Patológica, Citológica e Tanatológica Imunocitoquímica Autor: Amadeu Borges Ferro Dezembro de 2010

2 AMADEU BORGES FERRO o Bacharel em Anatomia Patológica, Citológica e Tanatológica pela Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Lisboa. o CESE em Metodologias do Ensino da Ciências pela Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias. o Mestre em Educação Médica pela Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa. o Professor Adjunto da Área Científica de Anatomia Patológica da Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Lisboa. o Coordenador da Licenciatura em Anatomia Patológica, Citológica e Tanatológica da Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Lisboa. o Responsável pela Unidade Curricular de Imunocitoquímica da Licenciatura em Anatomia Patológica, Citológica e Tanatológica da Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Lisboa. ii

3 ÍNDICE GERAL ÍNDICE DE FIGURAS... v ÍNDICE DE TABELAS... vii 1 IMUNOCITOQUÍMICA Definição geral Enquadramento histórico Principais aplicações ANTIGÉNIO E ANTICORPO Antigénio Anticorpo Imunoglobulinas Cadeias leves Cadeias pesadas Cadeia pesada α - Alfa Cadeia pesada γ - Gama Cadeia pesada δ - Delta Cadeia pesada μ - Miu Cadeia pesada ε - Epsilon Bases da especificidade: Forças de ligação entre Antigénio e Anticorpo Características dos Anticorpos Especificidade Afinidade PRÉ-REQUISITOS PARA IMUNOCITOQUÍMICA SOROS POLICLONAIS E SOROS MONOCLONAIS Imunogénios Soros Policlonais Etapas da produção de Soros Policlonais Três tipos de soros policlonais Soros Monoclonais Etapas da produção de Soros Monoclonais Produção de Soros Monoclonais passo a passo Soros Monoclonais versus Soros Policlonais Soros Monoclonais: Soros Policlonais: MANUSEAMENTO DE SOROS Recepção Armazenamento Frascos contentores Temperatura Manipulação diária IMUNOFLUORESCÊNCIA Métodos de Imunofluorescência Fluorocromos União dos fluorocromos a anticorpos Microscópio de fluorescência Microscopia de Imunofluorescência no diagnóstico IMUNOENZIMOLOGIA Enzimologia Básica Papel Catalisador iii

4 7.1.2 Características das Enzimas Modelos De Interacção Enzima / Substrato Factores que afectam a Actividade Enzimática Classificação das Enzimas Tipos de Inibição Imunoenzimologia Horseradish Peroxidase HRP Calf intestine alkaline phosphatase Glucose Oxidase (Aspergillus niger) Beta-Galactosidase (E. coli ) Contraste MÉTODOS IMUNOCITOQUÍMICOS Método Directo Métodos indirectos Simples Método PAP (Peroxidase Anti Peroxidase) Método APAAP (Alkaline phosphatase anti Alkaline phosphatase) Métodos de Avidina-Biotina Enquadramento histórico Principais características da avidina Principais características da Streptavidina Principais características da Biotina A ligação entre a avidina e a biotina Biotinilação Marcação da avidina Métodos Imunocitoquímicos de avidina-biotina Características das técnicas de avidina-biotina Métodos de polímero Polímero de esqueleto interno MicroPolímeros de enzimas EXECUÇÃO DE TÉCNICAS IMUNOCITOQUÍMICAS Higiene e segurança no Laboratório Cuidados com material e reagentes Diluição de soros de anticorpos A diluição ideal Teste de diluição de soros de Anticorpos Pipetagem Cuidados gerais Preparação da Micropipeta Como retirar uma amostra com uma micropipeta Como expelir a amostra da micropipeta Tempo de duração da incubação Temperatura de incubação ph PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS Fixação em Imunocitoquímica Actuação do fixador Fixação para cortes de crióstato Fixação em Imunocitoquímica de rotina Processamento histológico Preparação de lâminas em IHQ iv

5 Cromo-alúmen gel Vectabond Lâminas com cargas electrostáticas Amino-Propil-Trietoxisilane (APES/TESPA/SILANE) Corte em Imunocitoquímica RECUPERAÇÃO ANTIGÉNICA Consequências da fixação Digestão enzimática proteolítica Recuperação antigénica de origem térmica INIBIÇÃO DE PARTÍCULAS ENDÓGENAS Peroxidase Endógena Fosfatase Alcalina Glucose Oxidase Pontos susceptíveis de atrair proteínas Causas de marcação inespecífica CONTROLO DE QUALIDADE Avaliação da qualidade da Imunocitoquímica Preservação da morfologia do tecido Sensibilidade Especificidade Score final de qualidade da imunocitoquímica APLICAÇÃO PRÁTICA DA IMUNOCITOQUÍMICAS Principais antigénios detectados por imunocitoquímica MARCAÇÃO MÚLTIPLA Método simultâneo Método sequencial com desnaturação intercalar CONCLUSÃO APÊNDICES Apêndice 1 - Adesivação de lâminas - APES Apêndice 2 - Tampão EDTA 1 mm ph Apêndice 3 - Tampão citrato, ph Apêndice 4 - Tampão Tris/EDTA, ph Apêndice 5 - Solução de pepsina 0,4% ph 1/ Apêndice 6 - Solução de bloqueio da Peroxidase Endógena Apêndice 7 Protocolo de Técnica Imunocitoquímica LSAB Apêndice 8 Protocolo de Técnica Imunocitoquímica de Polímero Indirecto LISTA BIBLIOGRÁFICA ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 Albert Coons Figura 2 Anticorpo e Antigénio Figura 3 Aspecto esquemático de uma imunoglobulina Figura 4 Quebra da Molécula de Anticorpo pela Enzima papaína Figura 5 Quebra da Molécula de Anticorpo pela Enzima pepsina Figura 6 Zona de hinge do Anticorpo... 8 Figura 7 Localização das diferentes zonas estruturais do Anticorpo Figura 8 Estrutura esquemática da IgA v

6 Figura 9 Concentrações das diferentes Subclasses de IgG ao longo da vida Figura 10 Representação esquemática da IgM Figura 11 Soro Policlonal Figura 12 Soro Monoclonal Figura 13 - Kohler e Milstein Figura 14 Produção de Soros Monoclonais Figura 15 frascos contentores Figura 16 Imunofluorescência Figura 17 Microscópio de Fluorescência Figura 18 - IMF positiva para IgG, em padrão linear Figura 19 - IMF positiva para IgA em padrão granular Figura 20 Microscópio óptico Figura 21 Enzimas e Co-factores Figura 22 Papel catalisador das enzimas numa reacção Figura 23 Reacção de oxidação-redução Figura 24 Reacção de transferência Figura 25 Reacção de hidrólise Figura 26 Reacção de liase Figura 27 Reacção de isomerizacão Figura 28 Reacção de ligação Figura 29 estrutura química da HRP Figura 30 revelação por DAB Figura 31 revelação por AEC Figura 32 reacção de revelação da fosfatase alcalina por NBT-BCIP Figura 33 Revelação por NBT-BCIP Figura 34 Revelação por New Fuchsin Figura 35 Revelação por Fast Red TR Figura 36 Hematoxilina de Harris Figura 37 Hematoxilina de Mayer Figura 38 Nuclear Fast Red Figura 39 Verde Metilo Figura 40 Método directo Figura 41 Método indirecto simples Figura 42 Método PAP Figura 43 Método APAAP Figura 44 Avidina e Biotina Figura 45 estrutura química da Biotina Figura 46 Método LSAB/LAB Figura 47 Método ABC/StrepABC Figura 48 Bloqueio da biotina endógena Figura 49 Polímero Figura 50 Estrutura química do dextrano Figura 51 EPOS Figura 52 Polímero de esqueleto interno indirecto Figura 53 MicroPolímero de enzimas indirecto Figura 53 Soros pré-diluidos Figura 54 Colocação de ponta na micropipeta Figura 55 Colocação da micropipeta Figura 56 Utilização do polegar para pipetar Figura 57 Micropipeta e tubo ao nível dos olhos Figura 58 Pressão no êmbolo da micropipeta vi

7 Figura 59 Introdução da ponta no líquido Figura 60 Libertar o êmbolo da micropipeta Figura 61 Micropipeta e tubo ao nível dos olhos Figura 62 Ponta a tocar parede do tubo Figura 63 Pressão no êmbolo da micropipeta Figura 64 Crióstato Figura 65 Cortes de parafina Figura 66 Processador automático de tecidos Figura 67 - Algoritmo utilizado para tumores indiferenciados Figura 68 - Algoritmo utilizado para situações linfoproliferativas Figura 69 - Receptores de Estrogénio Figura 70 - Receptores de progesterona Figura 71 - Proteína p Figura 72 - HER Figura 73 - Bcl Figura 74 - CD Figura 75 - CD Figura 76 - CD Figura 77 - CD Figura 78 - CD Figura 79 - CD Figura 80 - Ki Figura 81 - melanoma HMB Figura 82 - CL Kappa Figura 83 - CL lambda Figura 84 - vimentina Figura 85 - CK Figura 86 - PAN CK clones -AE1\AE Figura 87 - proteína S Figura 88 - actina do músculo liso Figura 89 - CD3 (negro) e CD20 (castanho) em gânglio linfático Figura 90 - Glicoforina A (castanho), CD20 (negro) e CD3 (vermelho) em baço Figura 91 - Insulina (castanho), Citoqueratina (negro) e CD34 (vermelho) em pâncreas Figura 92 CD20 (castanho), Citoqueratina (negro) e AML (vermelho) em ap. ileo-cecal ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1 Marcadores em Imunocitoquímica... 2 Tabela 2 Pré-requisitos para Imunocitoquímica Tabela 3 Características dos Fluorocromos Tabela 4 Grelha de avaliação de qualidade da imunocitoquímica Tabela 5 Factores de ponderação do Score Final da qualidade da imunocitoquímica vii

8 IMUNOCITOQUÍMICA 1 IMUNOCITOQUÍMICA 1.1 Definição geral Nome dado ao conjunto de técnicas que utilizam anticorpos para identificar estruturas tecidulares (que funcionam como antigénios) in situ. O objectivo principal destas técnicas consiste em situar e identificar determinadas substâncias tecidulares. Assim, o princípio básico das referidas técnicas incide num conjunto de reacções específicas (interacções anticorpo-antigénio), que conferem cor ou electrodensidade aos compostos que se pretende estudar. O valor prático desta área tecnológica específica da Anatomia Patológica, resulta da possibilidade de conjugar um marcador com um anticorpo, outra proteína ou composto, sem provocar qualquer tipo de dano à ligação específica estabelecida entre o anticorpo e o antigénio. Este facto propicia a observação microscópica dos locais onde se encontra o anticorpo e, consequentemente, o antigénio. Podemos dizer que a Imunocitoquímica se apresenta como um poderoso meio de identificação de várias estruturas celulares normais (através dos respectivos antigénios) e patogénicas (neoplásicas ou não), bem como das consequências, a nível funcional e morfológico, da acção desses mesmos elementos. 1.2 Enquadramento histórico A 1ª técnica de Imunocitoquímica foi introduzida por Coons et al em 1941 (Figura 1), e consistiu na conjugação de um Anticorpo com um corante fluorescente e sua utilização para identificação de antigénios em cortes histológicos, o que significou a entrada numa nova dimensão no diagnóstico Anatomopatológico. Figura 1 Albert Coons. Fonte: 1

9 IMUNOCITOQUÍMICA O 1º composto a ser conjugado com um Anticorpo foi o isocianato de fluoresceína e mais tarde surgiu o isotiocianato de fluoresceína (mais fácil de conjugar), gradualmente passaram a utilizar-se novos compostos marcadores como outras moléculas fluorescentes: Isotiocianato de Rodamina (vermelho); ou enzimas: Peroxidase (1966), Fosfatase alcalina (1978), Glucose oxidase (1979). O produto final destas reacções enzimáticas, pode ser tornado electron-dense, mas existem outros produtos que intrinsecamente já possuem esta capacidade, podendo ser utilizados em Imunocitoquímica para microscopia electrónica: Ferritina (1961) e Ouro Coloidal (1971). Também se tornou possível a marcação de Anticorpos com substâncias radioactivas, visualizando-se o resultado por Autoradiografia (Tabela 1). Grupo Nome Cor final obtida Isotiocianato de Fluoresceína Verde Compostos fluorescentes Isotiocianato de Rodamina Vermelho Peroxidase (HRP) Castanho Fosfatase alcalina Vermelho Enzimas Glucose oxidase Azul Ferritina Negro Metais pesados Ouro coloidal Negro 14 C - 35 S - Compostos Radioactivos 3 H - Tabela 1 Marcadores em Imunocitoquímica 2

10 IMUNOCITOQUÍMICA Métodos por ordem cronológica de criação: A. Método directo simples B. Métodos indirectos: a. Simples b. Enzima anti-enzima: i. PAP (peroxidase anti peroxidase) ii. APAAP (fosfatase alcalina anti fosfatase alcalina) c. Avidina biotina i. Streptavidina-biotina ii. LSAB (Labelled streptavidin-biotin) d. Polimero: i. Polímero directo (EPOS ) ii. Polímero indirecto (EnVision, Picture ) 1.3 Principais aplicações A Imunocitoquímica têm as suas principais aplicações ao nível de: Estudo de neoplasias. o Diagnóstico. Diagnóstico de neoplasias de baixa diferenciação morfológica. Caracterização da histogénese e patogénese. Distinção do carácter maligno ou benigno de determinadas proliferações celulares (ex. plasmócitos). Caracterização da origem de metástases indiferenciadas. o Prognóstico. Identificação da presença de receptores hormonais (ex. ER e PgR). Caracterização da expressão de proto-oncogenes (ex. Her2/neu). Estudo de proteínas supressoras de tumor (ex. p53). Caracterização da presença de indicadores de proliferação celular (ex. Ki67). o Indicação terapêutica. Quantificação da expressão de Her2/neu em neoplasia mamária (trastuzumab). Identificação da presença de CD117 em tumores do estroma gástrico (Glivec). 3

11 IMUNOCITOQUÍMICA Estudo de doenças infecciosas. o Caracterização dos agentes etiológicos (bactérias, vírus, protozoários, etc.). o Fenotipagem da reacção inflamatória envolvente. Estudo de outras patologias. o Caracterização de subtipos de amiloidose. o Caracterização de produtos de secreção de células. Hormonas. Enzimas. A Imunocitoquímica é uma disciplina em permanente evolução, devendo todos os investigadores que se dedicam a esta actividade permanecer em constante procura, no sentido de estabelecer novos protocolos, adaptando às suas necessidades toda a gama de reagentes disponível no mercado. 4

12 ANTIGÉNIO E ANTICORPO 2 ANTIGÉNIO E ANTICORPO 2.1 Antigénio Um antigénio é geralmente uma molécula de grandes dimensões, como por exemplo: uma molécula proteica, lipídica, um hidrato de carbono ou um ácido nucleico, que uma vez introduzido no organismo induz a uma resposta por parte do sistema imunitário, com produção de anticorpos específicos. Tal deve-se ao facto de cada antigénio ser constituído por diversos radicais químicos, com capacidade de promover a produção de anticorpos ou imunoglobulinas. Os antigénios são reconhecidos devido à sua estrutura tridimensional, resultante da sua nuvem de electrões e não devido à sua estrutura química, sendo este facto consistente com a natureza das afinidades antigénio-anticorpo. Cada uma destas moléculas apresenta na sua superfície, um ou mais locais específicos de ligação ao anticorpo determinante antigénico ou epítopo. Estas regiões de ligação altamente específicas são constituídas por sequências (completas ou fragmentos) de proteínas ou de polissacarídeos. Tendo em conta que, segundo a sua constituição química os antigénios apresentam a capacidade de estabelecer ligações com um dado anticorpo, todas as moléculas podem constituir potenciais antigénios. Releve-se que, quando essas moléculas evidenciam um peso molecular superior a 8000 Dalton, possuem a capacidade de actuar por si só como antigénios. Por sua vez, substâncias de baixo peso molecular podem ligar-se a moléculas com um peso molecular superior (os chamados haptenos), e desempenhar as funções de antigénio. 2.2 Anticorpo Nome dado às moléculas de natureza proteica que são produzidas maioritariamente pelos plasmócitos em resposta à presença de material dentro do organismo que é por ele reconhecido como estranho. A sua principal característica é combinar-se com o material indutor (antigénio) em condições fisiológicas favoráveis à sua ligação (Figura 2). O local de ligação ao epítopo é chamado de paratopo. Esta ligação constitui a base da Imunocitoquímica. 5

13 ANTIGÉNIO E ANTICORPO Figura 2 Anticorpo e Antigénio. Fonte: Imunoglobulinas Classe de proteínas que possuem actividade de anticorpo. As imunoglobulinas podem ser visualizadas no microscópio electrónico e demonstram uma conformação em Y, que é tomada como exemplo quando se quer representar um anticorpo (Figura 3). Figura 3 Aspecto esquemático de uma imunoglobulina. Fonte: Estrutura geral Cada imunoglobulina possui uma estrutura básica constituída por 4 cadeias proteicas: 2 cadeias pesadas idênticas e 2 cadeias leves idênticas, unidas por ligações dissulfídicas que mantêm a estabilidade do anticorpo. A enzima papaína divide a molécula em (Figura 4): - 2 Fragmentos com capacidade de ligação ao antigénio - Fab (fragment antigen binding) - 1 Fragmento sem capacidade de ligação ao antigénio - Fc (fragment crystallisable) 6

14 ANTIGÉNIO E ANTICORPO Fab Quebra pela papaína Fc Figura 4 Quebra da Molécula de Anticorpo pela Enzima papaína. A molécula também pode ser quebrada pela enzima pepsina dando origem a um fragmento específico: F(ab )2, com capacidade de ligação ao antigénio e cristalização limitada (Figura 5). A maioria dos anticorpos utilizados em imunocitoquímica são tratados desta forma, para evitar reactividade cruzada com a porção Fc que é reconhecida por alguns receptores de células humanas, podendo originar falsos positivos e fundo (Key, 2006). F(ab') 2 pfc' Quebra pela pepsina Figura 5 Quebra da Molécula de Anticorpo pela Enzima pepsina. 7

15 ANTIGÉNIO E ANTICORPO Por redução e acidificação pode-se dividir uma imunoglobulina nos seus constituintes básicos (cadeias pesadas e leves). Possuem uma zona móvel denominada Hinge (dobradiça), que permite ao Anticorpo uma mudança de ângulo de orientação de modo a existir uma maior capacidade de ligação ao antigénio (Figura 6). Figura 6 Zona de hinge do Anticorpo Fonte: Nas cadeias leves e pesadas existem 3 tipos de zonas (Figura 7): - Zonas constantes - Zonas variáveis - Zonas hipervariáveis Zona constante da cadeia pesada- CH: determina o tipo de cadeia pesada em questão e consequentemente o tipo de imunoglobulina. Zona constante da cadeia leve Cl: determina o tipo de cadeia leve em questão. Zonas variáveis - zonas de ligação do Anticorpo. Zonas hipervariáveis: dentro das zonas variáveis são responsáveis pela ligação altamente específica a um antigénio. 8

16 ANTIGÉNIO E ANTICORPO Zona variável Zona constante Zona hipervariável Figura 7 Localização das diferentes zonas estruturais do Anticorpo. Fonte: Distribuição das zonas hipervariáveis entre os aminoácidos: Cadeia pesada Cadeia leve Presença de ligações dissulfídicas entre os aminoácidos: Cadeia pesada Cadeia leve Isto vai permitir a organização espacial da molécula do Anticorpo de modo a formar áreas específicas de ligação (zona hiperváriavel) expostas ao contacto com o Antigénio. 2.4 Cadeias leves A distribuição de cadeias leves difere em todas as classes e subclasses de Imunoglobulina, bem como entre diferentes espécies animais, no entanto cada Anticorpo possui duas cadeias leves de um só destes tipos: K - Kappa λ - Lambda No ser humano as cadeias leves K constituem cerca de 65% do total de cadeias leves. 9

17 ANTIGÉNIO E ANTICORPO 2.5 Cadeias pesadas As cadeias pesadas de cada imunoglobulina diferem nas propriedades antigénicas e estruturais e definem a classe e subclasse de cada molécula Cadeia pesada α - Alfa Está presente na IgA. Esta existe nas secreções sero-mucosas saliva, lágrimas, suor, corrimento nasal, secreções gastrointestinais, etc., onde possui funções de defesa contra o ataque por microorganismos. Existe nestes líquidos sob a forma de dímero estabilizado contra a proteólise por combinação com outra proteína - o componente secretor- sintetizado por células epiteliais e que possui uma cadeia peptídica simples. A dimerização é efectuada por conjugação com uma outra cadeia protéica cadeia J (Figura 8). Componente secretor Figura 8 Estrutura esquemática da IgA. Fonte: Tem como função principal ligar-se aos microorganismos, diminuindo a sua capacidade de aderência às células epiteliais, impedindo assim a sua entrada. Possui duas subclasses: IgA 1, IgA 2 (com diferentes ligações dissulfídicas) Cadeia pesada γ - Gama Está presente na IgG. Esta é a imunoglobulina que existe em maior quantidade e possui capacidade de atravessar a barreira placentária: passa da mãe para o feto e defende-o nas primeiras semanas de vida. É a imunoglobulina com maior capacidade de difusão, sendo a primeira responsável pela neutralização imediata das toxinas bacterianas e pela promoção da fagocitose. Existem 4 subclasses IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4 possuindo, cada uma delas, cadeias pesadas ligeiramente diferentes, na constituição por aminoácidos e nas ligações dissulfídicas. Também possuem diferentes concentrações serológicas ao longo da vida do ser humano (Figura 9). 10

18 ANTIGÉNIO E ANTICORPO Figura 9 Concentrações das diferentes Subclasses de IgG ao longo da vida Cadeia pesada δ - Delta Está presente na IgD. Esta foi a última imunoglobulina a ser descoberta. Possui menor capacidade de resistência à digestão proteolítica, ao contrário das outras imunoglobulinas, o que explica o seu curto tempo de vida no plasma sanguíneo. Possui uma elevada percentagem de glúcidos. Encontra-se na superfície de linfócitos sanguíneos com a função de activador/inibidor Cadeia pesada μ - Miu Está presente na IgM. As moléculas de IgM são polímeros de 5 unidades de anticorpos, unidos por uma cadeia J (Figura 10). Existe principalmente na corrente sanguínea e possui principal apetência para antigénios com vários epítopos. Tem alta capacidade citolítica e resposta rápida, estando envolvida nos casos de resposta a bacterémia. Figura 10 Representação esquemática da IgM. Fonte: 11

19 ANTIGÉNIO E ANTICORPO Cadeia pesada ε - Epsilon Está presente na IgE. Esta existe em baixa proporção no organismo humano. Forma uma segunda barreira de defesa contra o ataque de microorganismos nas superfícies externas do organismo. Está presente em afecções por parasitas. É responsável por alguns dos sintomas de alergia atópica (reacção inflamatória). 2.6 Bases da especificidade: Utilizando haptenos (moléculas que não estimulam a produção de Anticorpo específicos, mas que se combinam com estes depois de formados) demonstrou-se que a configuração de um Antigénio, é mais importante que a sua natureza química. Assim, este é reconhecido devido à sua estrutura tridimensional, resultante da sua nuvem de electrões e não devido à sua estrutura química, sendo isto consistente com a natureza das afinidades Antigénio-Anticorpo que não envolvem ligações covalentes Forças de ligação entre Antigénio e Anticorpo Todas as forças de atracção entre Antigénio e Anticorpo possuem em comum a necessidade de proximidade entre moléculas para se criarem Electrostáticas Devem-se à atracção entre grupos iónicos carregados com cargas contrárias Pontes de Hidrogénio São relativamente fracas e reversíveis e formam-se entre grupos hidrofílicos como OH e NH 2 e COOH, dependendo da proximidade das duas moléculas que transportam estes grupos. São fortemente condicionadas pela electronegatividade dos elementos Hidrofóbicas Da mesma forma que as gotas de óleo na água podem juntar-se todas numa só, grupos hidrofóbicos não polares (ex. Imunoglobulinas) tendem a fazer o mesmo. Se dois grupos hidrofóbicos de 2 proteínas se aproximarem o suficiente, de tal forma a excluírem todas as moléculas de água entre elas, a superfície em contacto com a água é reduzida e as proteínas adquirem um estado de energia mais baixo (menor entropia) do que aquele que existia enquanto estavam separadas, ou seja, surge uma atracção entre elas. As forças hidrofóbicas contribuem em mais de 50% da força total da ligação Antigénio-Anticorpo. 12

20 ANTIGÉNIO E ANTICORPO Van der Waals Estão ligadas a perturbações temporárias da nuvem de electrões de uma molécula, que podem formar um dipolo eléctrico que induz uma perturbação dipolar em outra molécula, tendo assim os dois dipolos uma força de atracção entre eles. 2.7 Características dos Anticorpos Especificidade Característica de um Anticorpo que lhe permite reconhecer e estabelecer ligações com Antigénios individualizados e específicos. Depende da proximidade entre Antigénio-Anticorpo e da complementaridade entre Antigénio-Anticorpo (Modelo chave-fechadura). A alta complementaridade Anticorpo- Antigénio vai estar relacionada com a proximidade entre grupos específicos no Antigénio e no Anticorpo que estabelecem ligações muito fortes entre si, por perfeita correspondência Afinidade Característica que define a força de ligação entre Antigénio-Anticorpo. Muitas complementaridades Alta afinidade Elevada força de ligação Poucas complementaridades Baixa afinidade Baixa força de ligação 13

21 ANTIGÉNIO E ANTICORPO 14

22 PRÉ-REQUISITOS PARA IMUNOCITOQUÍMICA 3 PRÉ-REQUISITOS PARA IMUNOCITOQUÍMICA Qualquer tipo de tecnologia aplicada necessita de respeitar determinados requisitos, de modo a que possa ser realizada de uma forma correcta e eficaz. As técnicas de Imunocitoquímica não fogem a esta regra, uma vez que, para serem aplicadas correctamente, devem também obedecer a algumas regras básicas, essenciais para o seu sucesso. A primeira condição a respeitar é que o antigénio deve permanecer insolúvel mas disponível no tecido, no decorrer da técnica. Note-se que essa insolubilidade implica a sua permanência no local original. A par disso, deve também manter inalteradas as características que vão ser reconhecidas pelo anticorpo. Daí que nalguns casos, seja necessário proceder à realização de métodos de recuperação antigénica. A segunda condição é a marcação específica pelo anticorpo primário, isto é, o anticorpo deverá apenas ligar-se ao antigénio pretendido (marcação específica) e não a outros elementos estranhos em simultâneo (marcação inespecífica). O que se pretende obter é uma marcação específica do antigénio com ausência de marcação inespecífica de fundo. Todavia, para que tal seja possível, surge a terceira condição: é fundamental conhecer os atributos dos tipos de soros a aplicar. Note-se que, o conhecimento das várias características do tipo de soro a utilizar tais como: clonalidade, classe ou subclasse da imunoglobulina, especificidade, reactividade, condições de manuseamento, revelam-se essenciais para a interpretação de resultados, bem como para a avaliação da qualidade da técnica. Finalmente surge a quarta e última condição: para uma correcta e eficaz realização destas técnicas é imprescindível o uso de uma marcação estável com uma intensidade suficiente, que não suscite qualquer tipo de dúvidas relativamente à presença ou ausência do antigénio no tecido (Tabela 2). 15

23 PRÉ-REQUISITOS PARA IMUNOCITOQUÍMICA PRÉ-REQUISITO CARACTERÍSTICAS O antigénio deverá permanecer insolúvel mas disponível. A sua insolubilidade implica a sua permanência no local original. Antigénio disponível (preservado ou recuperado). Marcação específica. O antigénio deverá manter as suas características reconhecíveis pelo anticorpo (com ou sem métodos de recuperação) Métodos de recuperação/digestão mais usuais: Digestão enzimática. Aquecimento a altas temperaturas em solução de recuperação. O anticorpo deverá ligar-se ao Antigénio pretendido. Deverão ser conhecidos todos os elementos teciduais que despoletam resposta por parte do anticorpo. Anticorpo bem caracterizado. Deverá ser perfeitamente conhecida toda a sequência de ligação do Anticorpo ao Antigénio. Deverá conhecer-se a espécie animal onde foi produzido o Anticorpo. As características do Anticorpo deverão ser estabelecidas: Classe. Subclasse. Modo de produção. Qual o antigénio que o despoletou. Fluoresceína ou rodamina. Produto final ou marcador facilmente visualizavel. Peroxidase (HRP). Fosfatase alcalina. Glucose oxidase. Entre outros Tabela 2 Pré-requisitos para Imunocitoquímica. 16

24 SOROS POLICLONAIS E SOROS MONOCLONAIS 4 SOROS POLICLONAIS E SOROS MONOCLONAIS 4.1 Imunogénios Um imunogénio é um antigénio, sintético ou natural, utilizado para produzir anticorpos em massa. A fonte e preparação de um imunogénio são muito importantes para se obter a melhor qualidade de reagentes para técnicas Imunocitoquímicas. Existem dois grandes grupos de imunogénios: péptidos sintéticos e proteínas purificadas. Os péptidos sintéticos têm a vantagem de possuir uma sequência de aminoácidos conhecida, contudo, pode não ser possível alcançar laboratorialmente a conformação tridimensional da proteína nativa, o que pode originar falsos negativos se a aplicação do anticorpo criado a partir deste imunogénio não for devidamente caracterizada. Pode ainda ser impossível recriar determinado antigénio in vitro visto que as modificações pós-traducionais representam muitas vezes um importante processo para a conformação final de um antigénio in vivo. O uso de antigénios purificados evita muitos destes problemas, mas origina outros. O processo de purificação é muitas vezes difícil de optimizar, podendo o produto final conter demasiadas proteínas contaminantes. Um outro problema ao utilizar antigénios purificados, prende-se com a presença de outros epítopos que não são específicos para a obtenção do anticorpo pretendido. Os anticorpos são produzidos por imunização de um animal (coelho, ratinho, cabra, cavalo, etc.) com o antigénio pretendido. O animal reage à imunização produzindo anticorpos para o antigénio pretendido (Ramos-Vara, 2005). 4.2 Soros Policlonais Os Soros Policlonais possuem Anticorpos produzidos por várias células, reagindo assim com diversos epítopos de um Antigénio (Figura 11). O animal mais utilizado para a produção de soros policlonais é o coelho, mas podem ser utilizados outros: cabra, porco, ovelha, cavalo, etc. Figura 11 Soro Policlonal Fonte: 17

25 SOROS POLICLONAIS E SOROS MONOCLONAIS Etapas da produção de Soros Policlonais Quanto melhores forem as técnicas de purificação tanto melhor será a qualidade do soro policlonal. O uso de animais de laboratório pouco expostos a ambientes adversos (altamente contaminados por Antigénio) facilita a obtenção de soros com poucos Anticorpos previamente desenvolvidos contra outros Antigénios. Sequência habitual de produção: 1. Escolha do Antigénio. 2. Purificação do Antigénio: a. Precipitação. b. Centrifugação. c. Diálise. d. Cromatografia. e. Electroforese. 3. O Antigénio é injectado no animal escolhido. a. As injecções são repetidas a intervalos regulares de modo a manter a concentração de Anticorpos específicos alta. 4. É colhido sangue do animal testado, normalmente sem o sacrificar. 5. O soro é separado dos elementos celulares do sangue por centrifugação ou outros métodos adequados. 6. O soro pode ser purificado de modo a permanecerem somente os Anticorpos desejados. a. Métodos de purificação: i. Para separação das outras proteínas do sangue: 1. Precipitação salina. 2. Cromatografia por troca iónica. ii. Para separação de outros anticorpos: 1. Cromatografia de afinidade. 2. Técnicas de absorção por fase sólida ou líquida Três tipos de soros policlonais Existem três tipos de soros policlonais diferenciados pela etapa de selecção e purificação em que se encontram Soro total/ whole serum Obtido após extracção dos elementos celulares: 18

26 SOROS POLICLONAIS E SOROS MONOCLONAIS o o o Soro que se obtém logo a seguir à centrifugação. Possui diversos Anticorpos e proteínas circulantes (albumina, Alfa, beta globulinas). Se não se conseguir um soro mais purificado este é utilizado, apesar de não ser o ideal Soro de fracção de imunoglobulinas/ Ig fraction Obtido após extracção das proteínas (excepto imunoglobulinas): o Possui diversos Anticorpos específicos e não específicos Soro de afinidade Isolada/ Affinity isolated antibodies Obtido após extracção das imunoglobulinas não específicas para o antigénio pretendido: o o o Possui Anticorpos específicos e vestígios de contaminantes (proteínas e outras imunoglobulinas). Nem sempre se consegue este tipo de soros. Como é muito mais puro que os outros soros, tem a possibilidade de oferecer uma melhor marcação 4.3 Soros Monoclonais Um soro monoclonal é um reagente que é o produto de um único clone de plasmócitos imortalizados e que, como tal, é uniforme em estrutura, especificidade e afinidade, podendo ser produzido em relativa grande quantidades. Os Anticorpos de um determinado clone são imunoquimicamente idênticos e reagem com um determinado epitopo de um Antigénio, contra o qual foram produzidos (Figura 12). O animal mais utilizado para obter clones de Anticorpos monoclonais é o ratinho. Figura 12 Soro Monoclonal Fonte: Estes reagentes revolucionaram muitas áreas de trabalho experimental, industrial e clínico, tendo proporcionado um Prémio Nobel da Medicina e Fisiologia aos seus maiores impulsionadores - Kohler e Milstein - em 1984 (Figura 13). 19

27 SOROS POLICLONAIS E SOROS MONOCLONAIS Figura 13 - Kohler e Milstein Fonte: Etapas da produção de Soros Monoclonais A técnica mais utilizada para a produção de soros monoclonais consiste, resumidamente, nos seguintes passos (Figura 14): A. Imunização de um animal de modo a serem produzidos Anticorpos para um determinado Antigénio que é introduzido por injecções repetidas. B. Colheita de plasmócitos no baço desse animal. C. Fusão desses plasmócitos (curto tempo de vida) com células de mieloma (longo tempo de vida). D. Colocação individual das células resultantes da fusão em cultura de modo a poder recolher-se os Anticorpos por elas produzidos. E. Testes para os Anticorpos em causa, no sentido de se saber quais as suas características. F. Manutenção das culturas (clones) que demonstrem características úteis e destruição das restantes. G. Recolha sistemática dos Anticorpos produzidos pelo clone que passam a constituir o soro monoclonal e que podem ser utilizados em IHQ. 20

28 SOROS POLICLONAIS E SOROS MONOCLONAIS Figura 14 Produção de Soros Monoclonais. Fonte: Produção de Soros Monoclonais passo a passo 1 - Imunização Nome dado ao processo pelo qual se obtém uma resposta imunológica, por parte de um ser vivo, para um determinado antigénio. 1.1 Escolha do animal a ser imunizado. Definida pelo tipo de células de mieloma a utilizar posteriormente, pois sabe-se que fusão de DNA entre espécies iguais permite melhores resultados. 1.2 Escolha da porta de entrada para a imunização. Definida pelas características do Antigénio (solúvel ou insolúvel). Caso o Antigénio seja solúvel pode ser utilizada a injecção endovenosa, caso seja insolúvel deve ser utilizada a injecção intraperitoneal, intradérmica ou intramuscular. 1.3 Determinação da capacidade do Antigénio para produzir uma resposta imunológica. Esta característica pode ser manipulada nalguns casos de modo a obter o máximo de resposta com um mínimo de Antigénio. Pode-se, por exemplo, adicionar ao Antigénio determinados reagentes, como o hidróxido de alumínio, que permitem a formação de um "depósito" de Antigénio no animal que lenta, mas consistentemente, vai provocar a resposta imunológica sem que seja necessário o uso de injecções repetidas. 1.4 Determinação dos factores que afectam a classe e a afinidade dos Anticorpos produzidos. 21

29 SOROS POLICLONAIS E SOROS MONOCLONAIS Existem alguns factores que não podem ser controlados: A natureza do Antigénio - se possuir elevado teor em glúcidos tende a despoletar uma resposta sob a forma de IgM. As características individuais de cada animal, que vão estar envolvidos no tipo de imunoglobulina produzido após a imunização. Mas podem ser utilizadas algumas estratégias de modo a ser produzido o tipo de Imunoglobulina pretendido: Se for utilizada uma única injecção para produzir a resposta imunitária esta vai ser sob a forma de IgM. Se forem utilizadas várias injecções separadas por um espaço de tempo relativamente prolongado a resposta tende a ser sob a forma de IgG. Isto é muito útil pois estes soros são mais procurados devido às menores dimensões desta molécula, que possibilitam uma maior capacidade de difusão tecidual, e também devido à facilidade com que é digerida pela pepsina de modo a ser eliminada a porção Fc que pode originar falsas marcações. Mas, por vezes, é útil possuir um soro de IgM para um antigénio, que pode ser utilizado em técnicas de dupla marcação simultaneamente com um soro de IgG para outro Antigénio. Finalmente é importante ter em conta que os Anticorpos com maior afinidade para o Antigénio são produzidos tardiamente e portanto deve-se esperar algum tempo entre a primeira injecção e a colheita de plasmócitos. 2 - Escolha das células de mieloma a utilizar. 2.1 Tipos existentes. Estão disponíveis comercialmente diversos tipos de linhas celulares de mieloma. Os mais utilizados são o Ag8 para ratinho e o Y0 para ratazana, pois não produzem qualquer tipo de cadeia, permitindo assim que todos os Anticorpos produzidos após a fusão sejam do tipo anteriormente produzido pelo plasmócito imunizado. 3 - Métodos de fusão entre um grupo de células de mieloma e um grupo de plasmócitos. O método mais utilizado é o que utiliza o polietileno glicol (PEG) como diminuidor da tensão superficial entre as membranas celulares das células do mieloma e as células do baço do animal utilizado, que, entretanto foi sacrificado para permitir a sua retirada. Uma vez diminuída a tensão superficial as células fundem as suas membranas celulares e numa posterior mitose fundem o seu DNA o que resulta numa célula híbrida que mantém a imortalidade de uma célula-mãe e a capacidade de produzir anticorpos específicos da outra célula-mãe. Esta célula híbrida prolifera e dá origem a um clone. 4 - Selecção HAT. 22

30 SOROS POLICLONAIS E SOROS MONOCLONAIS Após a junção, em meio de cultura, dos grupos de células de mieloma e dos plasmócitos são aplicadas as técnicas de fusão anteriormente referidas e daí resultam três tipos de células: a) Células híbridas - o objectivo desta técnica. b) Plasmócitos não hibridados - Que morrem em pouco tempo. c) Células de mieloma - Que são eliminadas pela adição ao meio de cultura de HAT (Hipoxantina, Aminopterina e Timidina), pois não possuem enzimas para contornar o efeito destes elementos tóxicos. 5 - Selecção de clones As células híbridas são testadas por etapas até se individualizarem clones produtores de Anticorpos para o Antigénio pretendido. Normalmente os testes são feitos por IHQ, aplicando os sobrenadantes da cultura de tecidos onde repousam as células híbridas a testar como soros primários de uma técnica de imunofluorescência indirecta. (As células libertam para o líquido sobrenadante da cultura os Anticorpos que produzem). 6 - Produção alargada de soro monoclonal. A partir do momento em que um sobrenadante de um clone é intensivamente testado e é comprovada a sua viabilidade, este pode ser utilizado para IHQ de rotina. A cultura pode então produzir soro durante muito tempo, desde que mantida em boas condições. O sobrenadante é assim regularmente recolhido e comercializado pelo seu produtor. Existe ainda a hipótese de inocular o clone de células (ou parte) na cavidade abdominal de um ratinho e recolher regularmente o líquido ascítico que se desenvolve e que é muito rico em Anticorpos específicos. 7 - Purificação, digestão e conjugação de Anticorpos. Podem ser realizadas estes tipos de intervenções utilizando técnicas específicas para esse fim. 8 - Armazenamento de Anticorpos. Os soros podem ser conservados durante longos períodos (anos) em câmaras frigoríficas a -70ºC, mas uma vez descongelado poderá permanecer a 4ºC durante alguns meses ou, no caso de possuir conservantes específicos (Ex. Sodium Azide), alguns anos. 4.4 Soros Monoclonais versus Soros Policlonais Soros Monoclonais: Vantagens: Alta especificidade. Alta afinidade. Determinação de um só epítopo de um Antigénio. 23

31 SOROS POLICLONAIS E SOROS MONOCLONAIS Alta homogeneidade. Ausência de Anticorpos não específicos. Maior facilidade de caracterização. Baixa variabilidade de lote para lote. Desvantagens: Alto custo relativo. Identificação de só um epítopo de um Antigénio. Esse epítopo pode estar destruído (por ex.: pela fixação) mesmo que exista a molécula total do Antigénio.. Se o soro não foi produzido contra um epítopo específico do Antigénio que se quer detectar e se existirem outros Antigénio com esse epítopo, a grande vantagem da alta especificidade será inútil. Relativa dificuldade de obtenção em grandes quantidades Soros Policlonais: Vantagens: Baixo custo relativo. Capacidade para detectar um Antigénio mesmo na ausência de vários dos seus epitopos. Relativa facilidade de obtenção em grandes quantidades. Desvantagens: Relativa baixa especificidade. Determinação de vários epitopos que podem pertencer a vários Antigénio.. Relativa baixa homogeneidade. Possibilidade de presença de Anticorpos não específicos. Maior dificuldade de caracterização. Relativa alta variabilidade de lote para lote. 24

32 MANUSEAMENTO DE SOROS 5 MANUSEAMENTO DE SOROS Para se conseguir o máximo de qualidade nas marcações de Imunocitoquímica é importante que na utilização de todos os soros se sigam as regras de manuseamento e armazenamento que são indicadas pelo fabricante na "bula" que os acompanha. 5.1 Recepção Assim que se recebe um soro no laboratório é muito importante que se proceda ao seu armazenamento, de acordo com as indicações do fabricante (Normalmente é indicado o seu armazenamento no frigorífico a 4ºC.). Cada soro deverá ser registado numa folha do laboratório onde se indicam: o lote, data de validade, data de recepção e número da nota de encomenda. Estes dados serão úteis em caso de posterior reclamação. 5.2 Armazenamento Os principais factores a ter em conta quando se fala em armazenamento de soros são: os frascos contentores, a temperatura e a manipulação diária Frascos contentores Deverão ser utilizados frascos de polipropileno, policarbonato ou de vidro borossilicado, pois possuem uma baixa capacidade de absorção de proteínas. É também útil utilizar frascos transparentes pois permitem uma rápida inspecção (Figura 15). Figura 15 frascos contentores Fonte: Temperatura Este factor é talvez o mais determinante quando se fala em conservação de anticorpos. Todas as indicações dos fabricantes deverão ser seguidas criteriosamente em relação a esta condicionante. Os frigoríficos e arcas congeladoras utilizados para armazenar anticorpos devem ter indica- 25

33 MANUSEAMENTO DE SOROS ção digital da temperatura que desenvolvem e ser monitorizados regularmente para prevenir eventuais flutuações. Deverá existir um sistema de "Back-up" para compensar eventuais falhas de energia. É também de evitar o "descongelar/congelar" diário dos soros que requerem congelação, mantendo-se uma pequena quantidade de soro a 4ºC para uso de curta duração Manipulação diária O tratamento adequado dos soros durante a sua utilização previne a sua deterioração ou contaminação. Deve-se manter o reagente afastado do calor e da luz solar directa, para além de se proceder à sua devolução atempada ao local de armazenamento após utilização. É também importante utilizarem-se pontas descartáveis para recolha de soros. 26

34 IMUNOFLUORESCÊNCIA 6 IMUNOFLUORESCÊNCIA 6.1 Métodos de Imunofluorescência Nome dado aos métodos de ICQ que utilizam como substâncias propiciadoras da visualização do antigénio moléculas fluorescentes (Figura 16). Estes métodos exigem a utilização de um microscópio especial para a visualização das marcações, com uma lâmpada que emite radiação no campo dos ultravioletas ( nm). Figura 16 Imunofluorescência. Fonte: As técnicas de imunofluorescência foram introduzidas por Albert Coons e pelos seus colaboradores em 1941 e, desde então, são aplicáveis tanto para diagnóstico como para investigação. São de uso limitado no diagnóstico de rotina, sendo por isso pouco utilizados, uma vez que as moléculas fluorescentes perdem actividade com o passar do tempo, não permitindo a conservação das lâminas em arquivo. A imunofluorescência é uma forma de luminescência, entendo-se esta última como a emissão de luz que se produz a partir de uma fonte de energia não térmica. A fluorescência primária ou autofluorescência é aquela que certos tecidos ou orgãos apresentam sem haver necessidade de serem modificados. Por exemplo, a lâmina elástica das artérias mostra autofluorescência em determinadas substâncias. Podemos induzir fluorescência em determinadas substâncias que não tenham esta capacidade (fluorescência secundária) marcando anticorpos dirigidos contra antigénios tecidulares com fluorocromos. 27

35 IMUNOFLUORESCÊNCIA As técnicas de imunofluorescência realizam-se quase sempre com tecido congelado porque o processo de fixação com formol e a inclusão em parafina alteram a estrutura dos tecidos, provocam um aumento dos fenómenos de autofluorescência e o bloqueio de alguns determinantes antigénicos Fluorocromos Fluorocromos são substâncias que têm a propriedade de absorver altas fontes de energia precedentes da radiação UV e do espectro de luz visível. Assim, quando estas substâncias são iluminadas, há uma libertação gradual de energia que se prolonga mesmo sem a fonte luminosa. Este fenómeno denomina-se fosforescência. Os fluorocromos mais utilizados nas técnicas de imunofluorescência são a fluoresceína e a rodamina. A fluoresceína usa-se quase sempre sob a forma de isotiocianato (FITC), que absorve a luz azul e emite fluorescência verde. A rodamina usa-se na forma de isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC); absorve luz verde e emite fluorescência vermelha (Tabela 3). Tabela 3 Características dos Fluorocromos. Para ser utilizado em imunofluorescência, um fluorocromo deverá ter determinadas características: a) Não deve interferir com a relação antigénio-anticorpo; b) O seu armazenamento deverá ser estável; c) Deverá encontrar-se disponível na sua forma purificada; d) A sua emissão deverá ser máxima no espectro do visível; e) O comprimento de onda da luz absorvida e da luz emitida devem ser muito diferentes para que possam diferenciar-se facilmente. Os fluorocromos podem ligar-se de forma covalente aos anticorpos (sem alterar as suas propriedades) e estes últimos ligam-se depois aos antigénios. Assim, os fluorocromos ligados a anticorpos específicos constituem um meio útil para visualizar zonas onde ocorra a reacção antigénio-anticorpo. Também podem marcar-se o anticorpos específicos marcados com fluorocromos distintos (marcação múltipla). 28

36 IMUNOFLUORESCÊNCIA União dos fluorocromos a anticorpos O tipo de ligação depende do tipo de fluorocromo. O FITC e o TRITC ligam-se ao anticorpo através de ligações covalentes com os grupos amina e carboxilo dos anticorpos. Esta ligação deve ser feita em ph alcalino e devem usar-se moléculas purificadas para que os fluorocromos não se liguem a outras proteínas e originem falsa marcações Microscópio de fluorescência Para a visualização das técnicas de imunofluorescência deve usar-se um microscópio de fluorescência (Figura 17). Este tipo de microscópio tem incorporado: 1. Fonte de luz UV e visível; 2. Filtros primários que seleccionam o comprimento de onda que vai incidir sobre a amostra; 3. Filtro secundário que selecciona os comprimentos de onda emitidos dentro do espectro de luz visível, deixando passar apenas a luz emitida por uma substância fluorescente. Figura 17 Microscópio de Fluorescência. Fonte: A fonte de luz pode ser uma lâmpada de vapor de mercúrio a alta pressão ou uma lâmpada halogénea de quartzo. A primeira produz mais energia e é preferível quando se pretende uma imunofluorescência de baixa intensidade. No entanto, é dispendiosa, há risco de explosão e perde a intensidade com o tempo. Existem dois tipos de microscópios de imunofluorescência: o microscópio de transmissão e o de luz de incidência. 29

37 IMUNOFLUORESCÊNCIA Microscopia de Imunofluorescência no diagnóstico A utilização da imunofluorescência para o diagnóstico das doenças glomerulares do rim é importante, principalmente, porque algumas delas devem seu nome a particularidades dessa técnica. As glomerulopatias podem apresentar-se com imunofluorescência negativa (doenças glomerulares não imuno mediadas). Porém a maioria apresenta imunofluorescência positiva para anticorpos anti- IgA, IgG, IgM ou complementos (C1, C3 ou C4) que pode ter padrão linear ou padrão granular (cerca de 95%). Quando o padrão da imunofluorescência é fortemente linear é feito o diagnóstico de Doença Glomerular por Anticorpos Anti Membrana Basal Glomerular, essa doença quando associada ao componente pulmonar é chamada de Doença de Goodpasture (Figura 18). Figura 18 - IMF positiva para IgG, em padrão linear. Quando o padrão é granular evidencia-se outra patologia glomerular cujo diagnóstico exige a técnica de imunofluorescência que é a Glomerulopatia de IgA, quando a imunoglobulina detectada pela imunofluorescência é a IgA (Figura 19). Figura 19 - IMF positiva para IgA em padrão granular 30

38 IMUNOENZIMOLOGIA 7 IMUNOENZIMOLOGIA Dá-se o nome de Imunoenzimologia aos métodos de Imunocitoquímica que utilizam, como substâncias propiciadoras da visualização do antigénio, enzimas. São os métodos mais utilizados actualmente, pois permitem a visualização em microscópio óptico comum e a obtenção de preparações permanentes (Figura 20). Possuem como principal vantagem a visualização da estrutura geral do tecido em simultâneo com a marcação imunocitoquímica. Figura 20 Microscópio óptico. Fonte: Enzimologia Básica As enzimas são catalisadores biológicos muito potentes e eficazes, responsáveis pela maior parte das reacções químicas que mantém a homeostase. Como possuem um papel muito importante ao nível dos processos dos seres vivos, tornam-se chaves importantes no diagnóstico clínico e terapêutica. As enzimas podem ser classificadas com base na sua composição: Enzimas Simples: compostas apenas por proteínas Enzimas Complexas: quando compostas por proteínas e uma pequena quantidade de moléculas orgânicas. As enzimas complexas também são denominadas de holoenzimas, cujo componente proteico é denominado de apoenzima e o componente não-protéico de coenzima ou de grupo prostético (ex.protoporfirina de ferro da peroxidase). Quando a coenzima quando é um ião ou molécula inorgânica, denomina-se co-factor (Figura 21). 31

39 IMUNOENZIMOLOGIA ENZIMAS COMPLEXAS EXEMPLO DE COFACTOR Figura 21 Enzimas e Co-factores. As enzimas podem ser encontradas em todos os tecidos e fluidos do corpo, como por exemplo: Enzimas intracelulares catalisam as reacções da cascata metabólica. Enzimas da membrana plasmática - regulam a catálise dentro das células em resposta a sinais extracelulares. Enzimas do Sistema Circulatório são responsáveis pela regulação da coagulação sanguínea Papel Catalisador Um catalisador é uma substância que acelera uma reacção química, diminuindo a energia de activação. Como catalisadores as enzimas actuam em pequena quantidade, não levando a cabo reacções que sejam energicamente desfavoráveis, não modificam o sentido dos equilíbrios químicos, mas sim acelerando o seu processo (Figura 22). Figura 22 Papel catalisador das enzimas numa reacção. Fonte: 32

40 IMUNOENZIMOLOGIA Características das Enzimas As enzimas possuem a capacidade de distinguir de forma específica o substrato sobre o qual agem (Especificidade do Substrato) e cada reacção é catalisada por uma enzima específica (Especificidade de Acção). A reacção entre enzima e substrato descreve-se da seguinte forma: ENZIMA (E)+ SUBSTRATO (S) COMPLEXO ENZIMA SUBSTRATO (CES) CES E + PRODUTO FINAL (P) A acção enzimática caracteriza-se pela formação de um complexo que representa o estado de transição, logo é necessário a formação do complexo enzima - substrato antes da obtenção do produto final. O substrato une-se ao centro activo da enzima através de numerosas interacções como, por exemplo: pontes de hidrogénio, ligações electrostáticas e ligações hidrofóbicas. O centro activo é uma pequena porção da enzima, constituída por uma série de aminoácidos que interactuam com o substrato Modelos De Interacção Enzima / Substrato Modelo de Fisher Chave/Fechadura Elaborado por Fisher no início do século passado, é baseado no princípio de que as enzimas são muito específicas, e só actuam sobre determinados substratos, catalisando reacções. Fisher sugeriu que esta especificidade é devida ao facto dos substratos encaixarem perfeitamente no centro activo das enzimas, provocando a abertura ou fecho desta. De acordo com este modelo o centro activo é uma estrutura rígida, havendo assim um ajuste perfeito entre enzima e o substrato Modelo De Koschland - Encaixe Induzido De acordo com este modelo, a enzima e o centro activo não são estruturas rígidas. O substrato que tem afinidade para determinada enzima liga-se ao centro activo, modificando-o, de modo que haja um encaixe perfeito do substrato à enzima. Exerce-se assim uma força sobre o substrato, quebrando ligações da molécula ou estabelecendo outras (reacções de catálise ou de síntese). Assim se explica a especificidade relativa das enzimas, isto é, uma enzima pode catalisar alguns substratos com diferenças estruturais pequenas. 33

41 IMUNOENZIMOLOGIA Factores que afectam a Actividade Enzimática Existem diversos factores que afectam a actividade enzimática. Em seguida são destacados os principais Concentração enzimática A velocidade de transformação do substrato é proporcional à concentração da enzima Concentração do substrato A actividade enzimática aumenta com o aumento da concentração do substrato até à saturação da enzima ph O ph pode afectar de diferentes maneiras: O centro activo pode conter aminoácidos com grupos ionizados que podem variar com o ph do meio. A ionização dos aminoácidos que não estão no centro activo podem provocar modificações na conformação das enzimas. O substrato pode ser afectado por variações do ph. Um ph extremo modifica irreversivelmente a estrutura da enzima, desnaturando a proteína e em certos casos modifica a ligação entre a apoenzima e a coenzima. Algumas enzimas apresentam variações peculiares, como por exemplo: a pepsina do estômago apresenta um ph ideal = 2, enquanto que a fosfatase alcalina do intestino apresenta um ph ideal= Temperatura A temperatura influencia fortemente a actividade enzimática. Uma determinada temperatura representa o máximo da actividade enzimática, mas quando se supera um valor considerável (normalmente acima dos 50ºC) a actividade enzimática cai bruscamente, pois a enzima sofre uma desnaturação Concentração de sais e iões da solução envolvente Algumas enzimas necessitam que estejam presentes iões metálicos Mg++, Mn++, Zn++ - que funcionam como agentes electrofílicos. 34

42 IMUNOENZIMOLOGIA Classificação das Enzimas Oxiredutases Actuam em reacções de Oxidação Redução. Nestas reacções há uma molécula se reduz e outra que se oxida (Figura 23). Figura 23 Reacção de oxidação-redução Fonte: Tranferases Actuam pela Transferência de grupos funcionais que podem ser aldeídos, alquilos, glucosilos ou fosfatos (Figura 24). São denominadas Quinases. Figura 24 Reacção de transferência Fonte: Hidrolases Actuam em reacções de Hidrólise (Figura 25). Transformam os polímeros em monómeros, actuando sobre: ligações éster ligações glucosídicas ligações peptidícas ligações C-N Figura 25 Reacção de hidrólise 35

43 IMUNOENZIMOLOGIA Fonte: Liases Produzem adição a duplas ligações entre C e C; entre C e O; entre C e N (Figura 26). Figura 26 Reacção de liase Fonte: Isomerases Catalisam reacções de Isomerização (Figura 27). Figura 27 Reacção de isomerizacão Fonte: Ligases Participam na formação de ligações com gasto de ATP entre C e O; C e S; C e N; C e C (Figura 28). Figura 28 Reacção de ligação Fonte: Tipos de Inibição Podem existir dois tipos de inibição: Inibição Competitiva ocorre em enzimas que tem a capacidade de se ligar a mais do que um substrato. Se o inibidor se liga à enzima ao nível do centro activo, diminui a sua afinidade para o substrato. 36

44 IMUNOENZIMOLOGIA Inibição Não-Competitiva o inibidor liga-se à enzima no centro alostérico (zona específica extra-centro activo), levando a uma alteração da configuração do centro activo, o que faz com que a enzima tenha dificuldade a ligar-se ao centro activo do substrato. 7.2 Imunoenzimologia Os métodos de marcação imunoenzimáticos utilizam reacções do tipo enzima-substrato para obterem produtos finais coloridos a partir de cromogénios incolores. As enzimas mais utilizadas são: Peroxidase (Horseradish Peroxidase) Fosfatase Alcalina ( Calf intestine Alkaline Phosphatase ) Glucose Oxidase Beta Galactosidase São critérios para selecção de enzimas em Imunocitoquímica: A enzima deve existir em grandes quantidades na natureza numa forma altamente pura e ser pouco dispendiosa. A Conjugação não deve anular a actividade enzimática. A enzima conjugada deve ser estável em solução A actividade da enzima endógena não deve interferir em grande escala com a técnica. Os produtos da reacção enzimática devem ser facilmente detectados e permanecerem estáveis durante longos períodos Horseradish Peroxidase HRP Características gerais: Peso molecular: 40 Kdal ph ideal: ph estável : Estabilidade Térmica: abaixo dos 60º C Composição: glicoproteína com uma mole de protoheme IX Açucares neutros e amino representam 18% Ponto isoeléctrico:7.2 Especificidade: grande especificidade para o H 2 O 2 37

45 IMUNOENZIMOLOGIA Estabilidade: bastante estável. Como pó liofilozado, pode ser guardado durante muitos anos no frigorífico. Em solução aquosa (1mg/ml) pode ser mantida mais do que um ano a 5º C, sem diminuição da actividade. Obtida da raiz do Rábano, contém um grupo de base férrica (hematina) no seu centro activo, possuindo em solução uma cor castanha (Figura 29). A hematina da peroxidase forma um complexo com o peróxido de hidrogénio provocando a sua decomposição em H 2 O e Oxigénio atómico. A peroxidase também pode oxidar outras substâncias como os nitratos e os polifenois. Em ICQ a peroxidase oxida indirectamente os cromogénios ao reagir com o peróxido de hidrogénio. Os cromogénios utilizados são substâncias que na sua forma oxidada são coloridas e estáveis, conferindo cor ao local da reacção. Existe sob a forma de peroxidase endógena em várias estruturas humanas como os glóbulos vermelhos. Figura 29 estrutura química da HRP. Fonte: Pode ser conjugada com outras proteínas de duas maneiras: Ligação covalente: o Pode ser realizada utilizando o glutaraldeído. o Estão envolvidos os grupos E-amino da lisina e os grupos N-terminal de ambas as proteínas. Ligação não-covalente: o ligação anticorpo / peroxidase através da porção Fab (Complexo PAP) Substratos e Cromogéneos A actividade da peroxidase em presença de um substrato resulta, numa primeira fase, na formação de um complexo enzima-substrato: PEROXIDASE + PERÓXIDO DE HIDROGÉNIO COMPLEXO ES 38

46 IMUNOENZIMOLOGIA E, posteriormente, na oxidação de um dador de electrões que cede electrões e permite que a reacção prossiga. DADOR DE ELECTRÕES COMPLEXO ES PEROXIDASE + H 2 O +O 2- Existem alguns dadores de electrões que uma vez oxidados se tornam coloridos e portanto são designados cromogénios. Este facto associado à capacidade de precipitarem no local da reacção após a oxidação, torna-os muito úteis em Imunocitoquímica. Os Cromogénios mais utilizados para a peroxidase são: 3,3 Diaminobenzidina Tetrahydrochloride (DAB) Gera um composto castanho, insolúvel em álcool e noutros solventes orgânicos (Figura 30). Figura 30 revelação por DAB. A sua oxidação causa a polimerização, permitindo a reacção com o tetróxido de ósmio, aumentando a intensidade da cor e permitindo o surgimento da densidade para os electrões (útil em ICQ de microscopia electrónica). O composto final pode mudar a sua cor para negro caso seja utilizado, em simultâneo com a oxidação, o cloreto de níquel. Pode também intensificar-se a cor castanha caso seja utilizado, em simultâneo com a oxidação, o sulfato de cobre. 3-Amino-9-Etilcarbazol (AEC) Após oxidação forma um produto final vermelho-rosado, solúvel no álcool (Figura 31). Devem ser utilizados um meio de montagem e um contraste aquosos. 39

47 IMUNOENZIMOLOGIA Figura 31 revelação por AEC. 4 Cloro-1-Naftol (CN) Forma um produto final azul. É solúvel em álcool e noutros solventes orgânicos. Tende a difundir-se do local onde precipita. p- fenilenodiamino Dihydrochloride/pirocatecol Também chamado de Reagente de Hanker Yates. Forma um produto final azul a negro, insolúvel no álcool e em solventes orgânicos. Possui características semelhantes ás do DAB Calf intestine alkaline phosphatase Características gerais: Peso Molecular: 100Kdal ph ideal: 9.8 Ponto Isoeléctrico: 5.7 Activadores : Zn, Mg ++, Ca ++ Tem com função principal remover por hidrólise e transferir grupos fosfatos de ésteres orgânicos, quebrando as ligações P-O. É formada uma ligação temporária entre a enzima e o substrato PO 4. Estas reacções são activadas por diversos iões metálicos como: Mg ++, Mn ++ e Ca ++. Não era muito utilizada em ICQ até surgir o método APAAP, que tem como principal vantagem o facto de evitar a actividade endógena da peroxidase. É recomendada a sua utilização em esfregaços e tecidos com muito sangue. Para a inibição da fosfatase alcalina endógena do osso, rim, fígado e glóbulos brancos, recomenda-se a utilização de Levamisole, que é adicionado à solução de revelação Substratos e Cromogéneos A enzima hidrolisa os ésteres de fosfato-naftol (substratos) em compostos fenólicos e fosfatos. Os fenois reagem com os sais incolores de Diazonium (cromogénio) para produzir corantes azo. 40

48 IMUNOENZIMOLOGIA Podem ser utilizadas diferentes combinações de substratos e cromogénios: 5-Bromo-4-Cloro-Indolil Fosfato ( BCIP ) - substrato Nitro Blue Tetrazolium (NBT) - cromogénio O BCIP é hidrolisado pela fosfatase alcalina levando à formação de um composto temporário que posteriormente é dimerizado para produzir um corante de índigo. O NBT é reduzido a formazan pela dimerização do composto anterior (Figura 32). Figura 32 reacção de revelação da fosfatase alcalina por NBT-BCIP. Fonte: Technology/Enzyme-Labeled-Fluorescence.Par Image gif Esta combinação de reagentes forma um precipitado azul a negro virtualmente insolúvel em solventes orgânicos (Figura 33). Figura 33 Revelação por NBT-BCIP. Fonte: New Fucsin (cromogénio) Produz um tom avermelhado, sendo insolúvel no álcool e nos solventes orgânicos (Figura 34). Possui uma intensidade bastante forte. 41

49 IMUNOENZIMOLOGIA Figura 34 Revelação por New Fuchsin. Fonte: Naftol As-Mx Fosfato + Fast Blue BB Naftol As-Mx Fosfato + Fast Red Tr O Naftol As-Mx Fosfato pode ser utilizado na sua forma ácida ou de sal sólido (substrato). Os cromogénios Fast-Red TR e Fast Blue BB produzem uma cor vermelha (Figura 35) e azul Brilhante respectivamente, sendo solúveis em álcool e nos solventes orgânicos. Outros Substratos: o Naftol As-BI Fosfato o Naftol AS-TR Fosfato Outros Cromogénios: o Fast Red LB o Fast Garnet GBC Figura 35 Revelação por Fast Red TR. Fonte: 42

50 IMUNOENZIMOLOGIA Glucose Oxidase (Aspergillus niger) Características gerais: Peso molecular: 185 Kdal. ph: 5.5. Especificidade: altamente específica para Beta-D-glucose. Inibidores: Ag, Hg, Cu. Estabilidade: as preparações são estáveis durante anos se guardadas no frio, sendo as soluções racionalmente estáveis sobre uma variedade de condições. Considerada com uma flavoenzima, pois o seu grupo prostético é composto por flavina. 20% da sua constituição são carbohidratos. No seu estado puro contém polissacáridos como a amilase, maltase e sucrase, que podem contribuir para falsos resultados. Sendo uma holoenzima, é constituída por duas subunidades idênticas, que estão ligadas entre si por ligações não covalentes. Existem cerca de 120 pontos de contacto entre os dímeros centrados à volta de 11 resíduos, formando cada um ligações de hidrogénio. Não existe nos mamíferos, o que significa que não existe actividade enzimática endógena. Possui pouca sensibilidade quando comparada com a fosfatase alcalina e com a peroxidase Cromogéneos Existem muitos sais cujos produtos de reacção são apropriados para as técnicas de imunoenzimologia que utilizam a glucose oxidase. INT vermelho solúvel no álcool. As lâminas devem ser montadas em meio de montagem aquoso NBT azul a negro virtualmente insolúvel no álcool. Produz bons resultados em métodos de dupla marcação Tetranitro Blue Tetrazolium TNBT- Castanho - Insolúvel no álcool. É mais estável no que se refere a preparações permanentes. 43

51 IMUNOENZIMOLOGIA Beta-Galactosidase (E. coli ) Características gerais: Peso Molecular: 500 Kd. ph: 6 8. Estabilidade: é estável 4-6 meses quando guardada a 5º C. Quando se utiliza um ph 7 não é necessário particular cuidado com a Beta-Galactosidase endógena. Recorrendo ao 5-Bromo-4-3-indoxil-D-Galactoside com substrato, pode ser obtido um precipitado de cor azulada. È pouco utilizada em ICQ Contraste As colorações de contraste são escolhidas tendo em conta a cor do produto final obtido na técnica de ICQ. As Colorações de contraste recomendadas para os cromogénios anteriormente referidos são: Hematoxilina de Harris cor azul (Figura 36). Figura 36 Hematoxilina de Harris. Hematoxilina de Mayer cor azul (Figura 37). Figura 37 Hematoxilina de Mayer. 44

52 IMUNOENZIMOLOGIA Nuclear Fast Red ou Kernechtrot cor vermelha. Figura 38 Nuclear Fast Red. Fonte: Methyl Green ou verde de metilo cor verde Figura 39 Verde Metilo Fonte: dendritic_cells_.htm 45

53 IMUNOENZIMOLOGIA 46

54 MÉTODOS IMUNOCITOQUÍMICOS 8 MÉTODOS IMUNOCITOQUÍMICOS Uma vez que os anticorpos, como proteínas que são, não possuem cor própria nem outra forma de serem visualizados nas preparações histológicas e citológicas, foi necessário encontrar forma de lhes conferir uma maneira de serem observáveis quando se encontram ligados aos antigénios que se querem detectar em Anatomia Patológica. Existem actualmente diversos métodos aplicáveis a Imunocitoquímica. A sua invenção teve praticamente sempre o mesmo denominador comum: a procura de uma ampliação de sinal mais potente. Todos ambicionaram continuamente associar o máximo de moléculas visualizáveis a uma molécula de Anticorpo-Antigénio. Se no início, com Coons, a ampliação de sinal era medíocre, o que limitava a exequibilidade da Imunocitoquímica a situações excepcionais e esporádicas, isso não toldou as potencialidades destas técnicas, tendo desde sempre os investigadores procurado identificar quantidades cada vez mais ínfimas de antigénio. Ao longo dos anos têm sido desenvolvidas abundantes formas de aumentar o sinal (cor, fluorescência, etc.) que está associado ao antigénio tecidual. Algumas dessas metodologias não singraram e nunca obtiveram uma expansão relevante, outras tiveram muita aplicabilidade no seu tempo mas foram ultrapassadas e não são praticamente utilizadas nos dias de hoje. No entanto, todas possuem as suas vantagens e desvantagens que devem ser conhecidas para uma compreensão mais profunda da Imunocitoquímica. 47

55 MÉTODOS IMUNOCITOQUÍMICOS Símbolos utilizados: - Antigénio - Anticorpo primário - Anticorpo secundário - Complexo PAP - Complexo APAAP - avidina / streptavidina - Biotina - Biotina com braço espaçador - Marcador - polímero 48

56 MÉTODOS IMUNOCITOQUÍMICOS 8.1 Método Directo Neste método é utilizado somente um anticorpo primário, que possui o marcador. Isto significa que o anticorpo que possui o marcador se liga directamente ao antigénio (Figura 40). Figura 40 Método directo. Vantagens: Simples Rápido Desvantagens: Pouca ampliação de sinal, pois somente existe uma molécula de marcador por molécula de antigénio. Dispendioso, pois obriga à existência de Anticorpos primários com marcador. 8.2 Métodos indirectos Simples Neste método são utilizados dois tipos de anticorpos (Figura 41): O primário, que é dirigido contra o antigénio que se quer detectar. O secundário, que é dirigido contra as imunoglobulinas da espécie animal onde foi produzido o Anticorpo primário. O Anticorpo secundário está marcado com a substância que permite a visualização do complexo. Exemplos de Anticorpos secundários: RAM (CAR) Rabbit anti mouse Igs utilizado no caso do anticorpo primário ser produzido em ratinho (geralmente monoclonal). SAR (PAC) Swine anti rabbit Igs utilizado no caso do anticorpo primário ser produzido em coelho (geralmente policlonal). 49

57 MÉTODOS IMUNOCITOQUÍMICOS Figura 41 Método indirecto simples. Vantagens: Mais sensível do que o método directo, pois há maior número de moléculas de marcador por cada molécula de Antigénio. Maior versatilidade do que o método directo, pois basta possuir um anticorpo secundário marcado não é necessário que os primários estejam marcados. Mais económico. Desvantagens: Mais demorado e complexo do que o método directo Método PAP (Peroxidase Anti Peroxidase) A sequência de actuação é a seguinte (Figura 42): É aplicado o Anticorpo primário dirigido contra o antigénio a detectar. É aplicado o Anticorpo secundário ou de ponte dirigido contra as imunoglobulinas da espécie animal em que foi produzido o anticorpo anterior. É aplicado o Complexo PAP (enzima-anti-enzima). Figura 42 Método PAP. 50

58 MÉTODOS IMUNOCITOQUÍMICOS O complexo PAP deve ser produzido na mesma espécie animal do Anticorpo primário de modo a que o Anticorpo secundário possa fazer a ponte entre os dois. O Anticorpo secundário deve ser aplicado em excesso de modo a manter uma porção Fab ligada ao Anticorpo primário e a outra porção Fab livre para se poder ligar ao complexo PAP. Vantagens: Possui maior sensibilidade do que os métodos anteriormente descritos. Não utiliza Anticorpo marcados Permite o aumento das diluições do Anticorpo 1º e consequentemente a diminuição da marcação de fundo. Desvantagens: Mais demorado do que os métodos descritos anteriormente. Mais complexo do que os métodos descritos anteriormente Método APAAP (Alkaline phosphatase anti Alkaline phosphatase) Método semelhante ao PAP, mas que utiliza como marcador a fosfatase alcalina em vez da peroxidase deste último (Figura 43). É bastante utilizado em situações que pela sua natureza impeçam ou dificultem a utilização dos métodos de imunoperoxidase, como, por exemplo, lâminas de citologia com muitos eritrócitos. Figura 43 Método APAAP. 8.3 Métodos de Avidina-Biotina Enquadramento histórico Os métodos de Avidina-Biotina são utilizados desde a década de 40 em cromatografias bioquímicas que se baseavam na grande afinidade entre a avidina e a biotina. Só em 1977 se dá a aplicação do sistema avidina-biotina em Imunocitoquímica, por Heggeness e Ash em métodos de imunofluores- 51

59 MÉTODOS IMUNOCITOQUÍMICOS cência. Em 1980 Hsu et al introduziram os métodos de Imunocitoquímica pelo Complexo Avidinabiotina (ABC), que permitiram a grande popularização destas técnicas e ainda hoje são utilizados. Posteriormente surgiram novas inovações como por exemplo: Utilização da streptavidina. Técnica da Labelled Avidin-biotin (LAB) Técnica da Labelled Streptavidin-biotin (LSAB). Todos os métodos de avidina-biotina se baseiam em 4 princípios gerais: 1. A extraordinária afinidade existente entre a avidina e a biotina que se ligam formando um complexo praticamente indissociável. 2. A possibilidade existente de ligação entre a biotina e outras moléculas, como enzimas e anticorpos (anticorpos biotinilados). 3. Possibilidade de se marcar a avidina com uma variedade de substâncias como enzimas, metais pesados ou fluorocromos. 4. Possibilidade de utilização da avidina como ponte entre duas moléculas biotiniladas. a. Ex. um Anticorpo e uma enzimas (peroxidase) Principais características da avidina Trata-se de uma glicoproteína básica (p.m 67 Kd), presente na clara do ovo em grandes quantidades e que, apesar de existir em alguns ovíparos, não tem expressão nos mamíferos. É constituída por quatro subunidades, que por sua vez são constituídas cada uma, por uma cadeia polipeptídica simples de 128 aminoácidos. A principal característica da estrutura terciária desta molécula é a formação de quatro bolsas, cada uma correspondente a uma das referidas subunidades, e que têm a capacidade de se ligar a uma molécula de biotina (Figura 44). Figura 44 Avidina e Biotina. Apesar das suas úteis características, a avidina possui uma desvantagem que é a presença de resíduos oligossacáridos na sua estrutura. Estes elementos induzem a ligação da avidina a estruturas 52

60 MÉTODOS IMUNOCITOQUÍMICOS tecidulares de carga eléctrica negativa, o que provoca o aparecimento de marcação inespecífica de fundo. Para suplantar este problema implantou-se a utilização de streptavidina Principais características da Streptavidina A streptavidina é uma proteína de p.m 60 Kd, extraída da cultura de Streptomyces avidinii, não possuindo resíduos oligossacáridos. Esta molécula é igual à avidina em tudo o resto e pode ser utilizado em ICQ Principais características da Biotina Também conhecida por vitamina H, é uma proteína muito simples de apenas 244 d, existente em grande quantidade na gema do ovo (Figura 45). A sua simplicidade permite a sua ligação em cada uma das bolsas, que existem na molécula de avidina para a qual é específica. Figura 45 estrutura química da Biotina. Fonte: A ligação entre a avidina e a biotina A ligação entre a avidina e a biotina é devida a ligações químicas não covalentes e é extremamente rápida e forte, sendo uma das ligações mais duradouras das existentes na Natureza. Só pode ser quebrada em situações extremas como a utilização de um meio de ph extremamente baixo (ph 1.5) Biotinilação Processo pelo qual a biotina é conjugada com uma variedade de moléculas por exemplo: enzimas, ácidos nucleicos ou anticorpos. O pequeno tamanho da molécula da biotina, permite a ligação às referidas estruturas sem que ocorram alterações ao nível das suas características imunológicas ou físicas. Pode até ser efectuada a múltipla biotinilação do mesmo anticorpo sem que surjam alterações imunológicas. Surge-nos assim a possibilidade de revestir um Anticorpo ou uma enzima com um grande número de moléculas de biotina, que se comportam como locais de ligação para a avidi- 53

61 MÉTODOS IMUNOCITOQUÍMICOS na. O número máximo de moléculas de biotina que se podem ligar a um Anticorpo foi estimado em 150. O processo de biotinilação implica a passagem da biotina para a sua forma activada permitindo assim a sua ligação através do grupo carboxílico as zonas NH 2 da molécula a ser biotinilada. A biotinilação não é somente aplicada a anticorpos, mas também a Ácidos nucleicos para utilização em ISH (in situ hibridization) Marcação da avidina A Avidina pode ser marcada com diversas moléculas, como por exemplo: fluorocromos: rodamina ou fluoresceína. enzimas: peroxidase, fosfatase alcalina, beta- galactosidase; ferritina ou ouro coloidal. No caso dos fluorocromos, pode existir ligação via um derivado do isotiocianato. Para as enzimas e a ferritina é utilizado um reagente de braço duplo como o gluteraldeído; finalmente o ouro coloidal liga-se através de forças electrostáticas não covalentes. As técnicas que utilizam a avidina marcada estão actualmente em expansão, sendo das mais utilizadas Métodos Imunocitoquímicos de avidina-biotina Os métodos que utilizam a avidina e a biotina não diferem, no seu essencial, dos outros. Logo não é necessária a utilização de processamento ou fixação especial, o que permite a aplicação desses métodos na rotina hospitalar. Métodos mais conhecidos: LSAB Labelled streptavidin-biotin LAB - Labelled avidin-biotin ABC- Avidin-biotin complex Método LAB/LSAB Descrição sumária (Figura 46): 1. Aplicação do Anticorpo primário contra o Antigénio pretendido. 2. Aplicação do Anticorpo secundário biotinilado dirigido contra o Anticorpo primário. 3. Aplicação da avidina ou streptavidina marcada com substância propiciadora da visualização (normalmente peroxidase). 4. Revelação (quando necessário) e visualização. 54

62 MÉTODOS IMUNOCITOQUÍMICOS Figura 46 Método LSAB/LAB Método ABC/StreptABC Descrição sumária (Figura 47): 1. Aplicação do Anticorpo primário dirigido contra o Antigénio pretendido. 2. Aplicação do Anticorpo secundário biotinilado dirigido contra o Anticorpo primário. 3. Aplicação do complexo avidina-biotina (marcado com substância propiciadora da visualização - normalmente peroxidase) 4. Revelação (quando necessário) e visualização. Figura 47 Método ABC/StrepABC Preparação do complexo ABC: É feita cerca de 1 a 4h antes da aplicação. Mistura-se avidina e biotina marcada com peroxidase de modo a que haja ligação entre elas. As proporções adicionadas devem facultar a existência de uma zona livre na avidina e 3 ocupadas com biotina marcada Características das técnicas de avidina-biotina Vantagens: Alta Sensibilidade 55

63 MÉTODOS IMUNOCITOQUÍMICOS o A possibilidade de biotinilação de um Anticorpo secundário com cerca de 150 moléculas de biotina, permite uma ampliação de sinal, que as técnicas usadas anteriormente não atingem. o No método ABC, a avidina e a biotina com o marcador, possuem uma alta capacidade de formar uma rede interligada que atinge grandes proporções e que permite a existência de um grande número de moléculas de marcador por cada Anticorpo primário. Alta versatilidade o A alta polivalência do processo de biotinilação permite a utilização das técnicas de avidina-biotina em diversas situações como a Imunocitoquímica, Hibridação in situ ou a citoquímica de afinidade, quer em microscopia electrónica quer em microscopia óptica. Desvantagens: Ligação da avidina a estruturas tecidulares carregadas negativamente. o Esta desvantagem foi suplantada com a introdução da streptavidina Ligação da avidina e streptavidina à biotina endógena. o A biotina existe normalmente em alguns órgãos humanos como o rim, o fígado ou a mama. o Quando durante uma técnica de ICQ por avidina-biotina, se aplica a 3ª camada de reagente, corre-se o risco deste se ligar à biotina previamente existente no tecido (endógena), para além da biotina que se encontra acoplada ao Anticorpo secundário. Se isso acontecer, surgirão zonas de falsa marcação que poderão ser prejudiciais ao diagnóstico Bloqueio da biotina endógena Para suplantar os problemas provocados pela biotina endógena pode ser feita uma técnica de bloqueio da biotina endógena, que consiste na aplicação, no início da técnica de IHQ, de avidina livre que se irá ligar à biotina endógena, bloqueando-a. Seguidamente é aplicada biotina livre para bloqueio dos pontos activos livres da avidina previamente aplicada, que entretanto se ligou ao tecido via biotina endógena. Logo, no local onde havia uma molécula de biotina passa a existir um complexo de avidina-biotina completamente desactivado (Figura 48). 56

64 MÉTODOS IMUNOCITOQUÍMICOS 1 - Biotina endógena 2 - Aplicação de avidina livre 3 - Biotina endógena bloqueada Figura 48 Bloqueio da biotina endógena Aplicações práticas Os métodos que utilizam a avidina-biotina, sendo altamente sensíveis, são extremamente úteis para a detecção de pequenas quantidades de Antigénio. Estas pequenas quantidades podem existir normalmente ou como consequência da fixação e processamento. Também devido à alta sensibilidade, estes métodos permitem a diminuição do fundo por aumento da diluição dos Anticorpos primários, o que também diminui os custos. Para além disso, estes métodos facultam uma diminuição dos tempos de incubação, tornando a técnica mais rápida Conclusão Os métodos de ICQ que utilizam avidina-biotina ou streptavidina-biotina são, actualmente, os mais utilizados pois possuem grande versatilidade e grande sensibilidade, o que permite o aumento da qualidade da marcação em casos de fixação prolongada ou processamento deficiente e a diminuição do tempo de duração e dos custos da técnica. Também permitem a melhoria da qualidade da marcação, com maiores intensidades e melhores aspectos visuais (melhor fotografia). Para além disso facultam a diminuição do fundo e elevada especificidade. No entanto, a alta sensibilidade pode ter consequências negativas como a ampliação do sinal de pequenas quantidades de biotina endógena ou a ampliação de sinal de pequena quantidade de Anticorpo primário ligado inespecificamente. 8.4 Métodos de polímero Posteriormente surgiram no mercado novos sistemas de amplificação que transmitem uma nova abordagem dos conceitos anteriormente utilizados. Os métodos que maior sucesso obtiveram foram os métodos de polímero, que podem ser de esqueleto interno ou de micropolimeros de enzimas. 57

65 MÉTODOS IMUNOCITOQUÍMICOS Polímero de esqueleto interno Como o próprio nome indica estas metodologias recorrem a uma macromolécula constituída por um esqueleto central de grandes dimensões, ao qual estão acopladas grandes quantidades de anticorpos e moléculas propiciadoras da visualização que podem ser enzimas (Figura 49). Figura 49 Polímero Fonte: A principal molécula utilizada como esqueleto interno é o dextrano, uma substância de elevado peso molecular aprox. 500 kd. Os dextranos são polissacarídeos de elevado peso molecular, que consistem em unidades de α-d-glicose ligadas predominantemente por ligações glicosídicas 1-6 (Figura 50). Figura 50 Estrutura química do dextrano. Fonte: Os dextranos são formados a partir da sacarose durante o crescimento de bactérias pertencentes aos géneros Leuconostoc, Streptococcus e Lactobacillus, todas pertencentes à família Lactobacillacea. No entanto, a maioria dos dextranos é sintetizada pela bactéria da espécie Leuconostoc mesenteroides. 58

66 MÉTODOS IMUNOCITOQUÍMICOS Polímero de esqueleto interno directo (EPOS ) Neste método utiliza-se somente um polímero que é constituído pelo esqueleto de dextrano ao qual estão acoplados anticorpos primários e substâncias propiciadoras da visualização normalmente peroxidase (Figura 51). Figura 51 EPOS Fonte: Vantagens Por possuir só um passo, trata-se de um método extremamente rápido e fácil, evidenciando uma diminuição de factores de erro. Desvantagens Possui pouco poder de amplificação. Para além disso, é relativamente dispendioso e existem poucos anticorpos primários comercializados desta forma Polímero de esqueleto interno indirecto Neste método aplica-se um anticorpo primário dirigido contra o antigénio pretendido e posteriormente aplica-se um polímero ao qual estão acoplados anticorpos secundários e substâncias propiciadoras da visualização normalmente HRP (Figura 52). 59

67 MÉTODOS IMUNOCITOQUÍMICOS Figura 52 Polímero de esqueleto interno indirecto. Fonte: Vantagens Por possuir só dois passos, trata-se de um método extremamente rápido e fácil, evidenciando uma diminuição de factores de erro. Para além disso é um método muito ampliativo, deslocando bastantes moléculas propiciadoras de visualização por molécula de antigénio. Desvantagens É relativamente dispendioso MicroPolímeros de enzimas Estes métodos baseiam-se na polimerização de enzimas e sua associação a anticorpos, formando os micropolímeros de enzima (Figura 53). Segundo os seus fabricantes esta abordagem evita os problemas decorrentes do uso de dextran ou de outras macromoléculas como esqueleto. O micropolímero com uma alta densidade de enzima muito activa acoplada a um anticorpo secundário gera um reagente, que supera a interferência estérica, que advém do enorme volume ocupado pelo polímero de esqueleto interno. Este método proporciona maior acessibilidade ao antigénio pois a pequena dimensão dos seus reagentes permite uma melhor difusão aos pontos-alvo e uma redução da ligação não específica. Figura 53 MicroPolímero de enzimas indirecto. Fonte: 60

68 EXECUÇÃO DE TÉCNICAS IMUNOCITOQUÍMICAS 9 EXECUÇÃO DE TÉCNICAS IMUNOCITOQUÍMICAS 9.1 Higiene e segurança no Laboratório Ao trabalhar dentro de qualquer laboratório, é importante ter presente regras de segurança indispensáveis a uma boa prática. Cada indivíduo tem o dever de tomar os procedimentos adequados à salvaguarda da sua saúde e segurança e daqueles que o rodeiam. O uso de substâncias tóxicas, corrosivas, inflamáveis ou explosivas, de alta temperatura ou electricidade potenciam os riscos. Por isso, devem cumprir-se as regras básicas de segurança: Conservar as bancadas arrumadas e limpas, Não correr ou fazer movimentos bruscos, Lavar as mãos com frequência, Não pipetar com a boca, Fazer a correcta manipulação de reagentes, Adicionar soluções concentradas sobre outras mais diluídas e não o inverso. É também indispensável o uso de equipamentos de protecção individual, como bata, luvas, óculos, máscara e outros, sempre que a situação o justifique. A protecção colectiva representa um importante factor de segurança e é conseguida com adequados sistemas de ventilação e extracção de ar, entre outros. Em caso de acidente é importante saber como agir. Para tal, são necessárias noções básicas de primeiros socorros, destacando-se os procedimentos PAS a cumprir em caso de acidente: 1. Prevenir actuar no sentido de evitar a ocorrência de mais acidentes ou o agravamento dos já ocorridos; 2. Alertar informar as entidades competentes da ocorrência; 3. Socorrer abordar os feridos e proceder de acordo com as situações encontradas. Em caso de ingestão de produto tóxico ou nocivo não se deve provocar o vómito sem indicação expressa de Profissional de Saúde competente ou dar de beber à vítima. Quando um reagente perigoso contacta com os olhos, pele ou mucosas deve lavar-se de imediato e abundantemente a zona afectada com água fria. Ao assumir uma atitude cautelosa/ponderada e respeitando as regras de segurança laboratorial estamos a contribuir drasticamente para a diminuição do número de acidentes. 61

69 EXECUÇÃO DE TÉCNICAS IMUNOCITOQUÍMICAS 9.2 Cuidados com material e reagentes Existem diversos procedimentos a assegurar na execução de técnicas imunocitoquímicas, sendo que um dos principais se prende com a correcta utilização do material e reagentes. Todo o material a utilizar deve encontrar-se devidamente limpo, de forma a evitar contaminações ou danos na técnica, e aquele que é descartável deve ser cuidadosamente separado após utilização. Os reagentes habitualmente utilizados nas baterias de hidratação/desidratação, como álcool, xilol ou água destilada devem ser mudados dos recipientes com relativa frequência, de forma a manter a maior grau de genuinidade possível. Ao utilizar pipetas de Pasteur, estas devem ser descartadas num recipiente apropriado após cada utilização, bem como as pontas das micropipetas. 9.3 Diluição de soros de anticorpos Existem no mercado diversos soros sob a forma pré-diluida que permitem aplicação imediata, mas a margem de manobra que facultam é limitada (Figura 54). A maior parte dos Anticorpos são comercializados sob a forma concentrada e é necessário dilui-los para posterior aplicação. A apresentação concentrada dos Anticorpos é a ideal para a aplicação e adaptação personalizada de cada laboratório com as suas características específicas, sendo assim possível contornar condições de fixação e de processamento que, por vezes, se encontram longe das ideais. Figura 54 Soros pré-diluidos Fonte: A diluição ideal É considerada diluição ideal de um soro a diluição que permite a maior intensidade de marcação com o menor fundo possível. A diluição representa-se por: X/Y X= partes de soro concentrado Y= partes de solução final Exemplo: 1/20; 1/1000; 1/

70 EXECUÇÃO DE TÉCNICAS IMUNOCITOQUÍMICAS É necessário efectuar alguns cálculos quando se pretende calcular as quantidades de soro a pipetar. Existe ainda a possibilidade de conjugar a diluição do Anticorpo com outros factores que podem ser manipulados de modo a melhorar e adaptar à técnica as condições de cada laboratório: - Método utilizado - Tempo de incubação - Temperatura de incubação 9.5 Teste de diluição de soros de Anticorpos Caso o fabricante forneça uma indicação de partida para a diluição ideal do Anticorpo, esta deverá ser utilizada como ponto de partida para o teste. Se isso não acontecer, deverá ser utilizado o teste padrão do laboratório para os Anticorpos, cuja diluição é desconhecida. Exemplo: 1/20; 1/50; 1/100; 1/200; 1/500. A diluição correcta de um Anticorpo é o factor que mais contribui para a qualidade de uma lâmina de Imunocitoquímica. A maneira mais utilizada para o teste de Anticorpos é a utilização de um método sensível, um tempo e uma temperatura de incubação constantes, e fazer variar as diluições de forma programada até se identificar a diluição ideal. 9.6 Pipetagem Para manusear pequenas quantidades de reagente de forma precisa, utilizam-se micropipetas, que medem um volume exacto e facilmente aspiram e expelem líquidos. Ao utilizar a micropipeta, deve escolher-se a ponta adequada, normalmente reconhecida pela cor presente no topo da micropipeta. Por regra, utiliza-se o polegar para controlar cuidadosamente o êmbolo da micropipeta, pois este é, para a maioria dos indivíduos, o dedo com melhor motricidade fina. 9.7 Cuidados gerais 1º - Seleccione o volume a pipetar dentro da amplitude da micropipeta. Não tente seleccionar um volume que ultrapasse o mínimo ou o máximo permitidos pela micropipeta. 63

71 EXECUÇÃO DE TÉCNICAS IMUNOCITOQUÍMICAS 2º - Quando utilizar a micropipeta colocar sempre primeiro a ponta. Se não proceder desta forma poderá aspirar liquido para dentro da câmara e provocar danos graves (Figura 55). Figura 55 Colocação de ponta na micropipeta. 3º - Mantenha sempre a micropipeta numa posição vertical quando tem líquido na ponta. Não permita que o líquido possa escorrer para o seu interior (Figura 56). Figura 56 Colocação da micropipeta. 4º - Mude sempre de ponta a cada pipetagem. 5º - Utilize o seu polegar para controlar a velocidade a que aspira ou dispensa o liquido. Se for demasiado brusco pode aspirar liquido para dentro da câmara da micropipeta (Figura 57). Figura 57 Utilização do polegar para pipetar Preparação da Micropipeta 1º - Verifique se possui a micropipeta correcta para pipetar a quantidade desejada. Possui três tamanhos no seu laboratório (1-10 µl; µl; µl). 2º - Regule o volume desejado. Sabe interpretar a escala? Se não sabe, PERGUNTE! 3º - Pressione a extremidade da micropipeta na ponta adequada. As pontas amarelas são para µl. As pontas azuis são para µl. 64

72 EXECUÇÃO DE TÉCNICAS IMUNOCITOQUÍMICAS Como retirar uma amostra com uma micropipeta 1º - Antes de pegar na micropipeta destape o tubo ou frasco de onde vai retirar a amostra. 2º - Segure a micropipeta na posição vertical numa mão e o tubo na outra mão. Ambos deverão estar ao nível dos olhos (Figura 58). Figura 58 Micropipeta e tubo ao nível dos olhos. 3º - Antes de colocar a ponta dentro do líquido pressione o êmbolo da micropipeta até sentir a primeira pressão e mantenha essa posição. Não ultrapasse a primeira pressão ou irá pipetar um volume incorrecto (Figura 59). Figura 59 Pressão no êmbolo da micropipeta. 4º Introduza a ponta no líquido a pipetar (Figura 60). Figura 60 Introdução da ponta no líquido. 5º - Aspire o líquido libertando lentamente o êmbolo da micropipeta. Em seguida tape o tubo ou frasco que contem o líquido a pipetar (Figura 61). Figura 61 Libertar o êmbolo da micropipeta. 65

73 EXECUÇÃO DE TÉCNICAS IMUNOCITOQUÍMICAS Como expelir a amostra da micropipeta 1º - Com a mão livre destape o tubo ou frasco para onde pretender colocar o liquido pipetado. 2º - Segure a micropipeta numa posição vertical com uma mão e segure o tubo ou frasco de destino com a outra. Ambos deverão estar ao nível dos olhos (Figura 62). Figura 62 Micropipeta e tubo ao nível dos olhos. 3º - Toque a parede interior do tubo ou frasco de destino com a ponta. Isto cria uma pequena tensão superficial que auxilia à expulsão do líquido da ponta da micropipeta (Figura 63). Figura 63 Ponta a tocar parede do tubo. 4º - Lentamente pressione o êmbolo da micropipeta até à primeira pressão. Depois continue até à segunda pressão e mantenha o êmbolo nessa posição (Figura 64). Figura 64 Pressão no êmbolo da micropipeta. 5º - Lentamente retire a micropipeta do tubo ou frasco, mantendo o êmbolo pressionado e evitando aspirar líquido para dentro da ponta. Fonte: Adaptado de Tempo de duração da incubação Normalmente estabelece-se um tempo de incubação uniforme para todos os soros. Esse é o ponto de partida e só é alterado caso prove ser inaplicável. Tempos mais utilizados: 30 minutos (a mais utilizada). 66

74 EXECUÇÃO DE TÉCNICAS IMUNOCITOQUÍMICAS 60 minutos. 16 horas (incubação overnight). De um modo geral, quanto maior o tempo de incubação, maior a intensidade de marcação e consequentemente de fundo. 9.9 Temperatura de incubação Estabelecida no início dos testes, e só é alterada caso se prove inaplicável (por maus resultados) Temperaturas mais utilizadas: 4º C. 37º C. temperatura ambiente (a mais utilizada). De um modo geral, quanto maior a temperatura, maior a marcação e consequentemente maior a marcação de fundo ph Estabelecido no início dos testes e assim permanece até final com o auxílio da solução tampão. O valor de ph mais utilizado é 7.4 a

75 EXECUÇÃO DE TÉCNICAS IMUNOCITOQUÍMICAS 68

76 PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS 10 PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS 10.1 Fixação em Imunocitoquímica É uma das mais importantes fases da técnica Imunocitoquímica. A sua função é preservar os tecidos, mantendo-os o mais próximo possível das características in vivo. Isso consegue-se, de um modo geral, mergulhando os tecidos a fixar numa solução fixadora Actuação do fixador O fixador previne a autólise por inibição das enzimas dos lisossomas. Inibe o crescimento dos fungos e bactérias que podem promover reacções de putrefacção. Protege os tecidos e as células das agressões do procedimento histológico e coloração. Os fixadores desnaturam as proteínas por: Coagulação Formação de compostos adicionados Uma mistura dos dois processos anteriores Existe consequentemente uma alteração na conformação das proteínas que resulta na inactivação das enzimas. Os compostos resultantes dos processos de fixação diferem dos compostos iniciais nos aspectos químicos e antigénicos. Pode-se inferir que um composto alterado é um composto protegido. A fixação provoca ainda outras alterações nos aspectos físicos do tecido: destrói a capa impermeável em torno das células tornando-as permeáveis a diversas macromoléculas que podem então entrar ou sair. Diferentes fixadores promovem diferentes graus de porosidade, sabendo-se que o formol permite um baixo grau de porosidade, ao contrário do B5, que permitem um alto grau de porosidade. Um factor extremamente importante a reter é que a fixação é sempre um passo de compromisso, ou seja, não existe fixação perfeita, com preservação morfológica e preservação antigénica perfeita Fixação para cortes de crióstato Os cortes de crióstato (Figura 65), pelo menos teoricamente, permitem uma maior preservação dos antigénios do que os de parafina, mas perdem no pormenor estrutural. As técnicas de Imunocitoquímica podem ser realizadas sem qualquer fixação química ou, posteriormente, podem ser utilizados diversos fixadores para os cortes de crióstato, como álcool, acetona ou até formol. 69

77 PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS Figura 65 Crióstato Fonte: Cada laboratório deve determinar o processo de fixação que considera melhor para si Fixação em Imunocitoquímica de rotina A maior parte dos cortes de Imunocitoquímica são cortes de tecidos incluídos em parafina (Figura 66), tendo surgido várias técnicas para a fixação inicial. Figura 66 Cortes de parafina Fixadores de formol Quimicamente, o Formaldeído é o mais simples dos aldeídos e tem a denominação da International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) de metanal. Possui a fórmula química H 2 CO. Apresentase em condições normais de pressão e temperatura como um gás incolor de cheiro característico e penetrante. Ao nível celular o formaldeído parece possuir a capacidade de fomentar o estabelecimento de pontes de metileno entre os aminoácidos de várias proteínas, alterando a sua forma e contribuindo para a sua inactivação funcional. Nesta reacção parecem estar também implicados os iões Ca 2+. Na utilização laboratorial o formaldeído é empregado sob a forma de gás a 37%-39% em solução aquosa, a que se dá o nome de formol. 70

78 PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS O fixador mais utilizado é o formol a 10% (também pode ser tamponado para manter o ph). Tem boa capacidade de penetração no tecido e é relativamente bem tolerado pelo tecido. Surgem assim baixas permeabilidades para as macromoléculas não existindo grandes alterações das proteínas intracitoplasmáticas. Apesar de ser um passo indispensável na técnica histológica, a fixação afecta directamente a aplicação de imunocitoquímica, podendo mascarar alguns antigénios e impedir o seu reconhecimento pelo anticorpo. Os efeitos negativos causados pelo formol podem ser minimizados com a aplicação das condições ideais de fixação, pois a capacidade de afectar os antigénios não depende somente do fixador utilizado mas também das condições da fixação, como o ph, temperatura, tempo de espera entre colheita de material e fixação, tamanho dos fragmentos a fixar (o ideal seria 10*10*3 mm), duração da fixação, entre outros. O formol pode reagir com um epitopo antigénico mascarando-o directamente ou pode também reagir com os aminoácidos envolventes do epitopo alterando a sua forma e mascarando-o indirectamente (Bancroft, 2008). Quando surge este obstáculo torna-se então necessária a recuperação antigénica. Apesar de causar efeitos adversos, o formol continua a ser o fixador mais utilizado em histopatologia por fornecer uma boa preservação morfológica e ser menos dispendioso que outros fixadores alternativos (Dabbs, 2006) Processamento histológico O processamento histológico (Figura 67) pode provocar alterações ao nível dos Antigénios, principalmente devido ao aquecimento do tecido na impregnação e inclusão, quando as altas temperaturas (60 0 C) podem destruir irreversivelmente um epitopo. Figura 67 Processador automático de tecidos Fonte:

79 PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS 10.3 Preparação de lâminas em IHQ Quando sujeitas às lavagens da técnica de Imunocitoquímica e à recuperação antigénica, os cortes podem descolar da lâmina, perdendo-se assim trabalho e tempo, por vezes essencial ao doente. Por regra, as lâminas de Imunocitoquímica são sujeitas a um tratamento que permite um aumento da força de ligação entre elas e os cortes, podendo utilizar-se diversas metodologias de adesivação das lâminas. A carga química dos tecidos é maioritariamente negativa (DNA, grupos fosfato, iões monovalentes, etc.) e ao fornecer às lâminas uma carga oposta (positiva) através da adesivação, torna-se mais fácil o estabelecimento de pontes entre o tecido e a sílica do vidro da lâmina Cromo-alúmen gel Este método é fácil de aplicar e permite bons resultados. Tem a desvantagem de fazer ponte entre o vidro e os corantes, levando a que as lâminas no final da técnica fiquem, em toda a sua extensão, coradas da cor do corante de contraste. Uma vez que utiliza substâncias de origem orgânica, há tendência para a formação de contaminantes (fungos e bactérias) nas lâminas preparadas e armazenadas Vectabond Este método permite bons resultados. Tem a desvantagem de utilizar reagentes tóxicos e corrosivos Lâminas com cargas electrostáticas Estas lâminas são adquiridas já preparadas (ex. superfrost plus) e permitem excelentes resultados. Apesar de serem relativamente dispendiosas são muito fáceis de utilizar pois são prontas a utilizar. Trata-se de um método muito utilizado em laboratórios com um grande volume de trabalho e poucos recursos humanos Amino-Propil-Trietoxisilane (APES/TESPA/SILANE) Trata-se de um dos métodos mais utilizados, e apesar de utilizar reagentes tóxicos e corrosivos, permite obter lâminas adesivadas de forma rápida, simples e pouco dispendiosa. A técnica para utilização deste composto está em Apêndice Corte em Imunocitoquímica Os cortes deverão ser o mais finos possível (2-4ųm) e não deverão possuir pregas ou estrias que facilitam o descolar nas lavagens e recuperação antigénica. É importante que estejam colocados numa 72

80 PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS posição central da lâmina, que por sua vez deve ter esmerilados de boa qualidade para que não se apaguem os números de registo. Na lâmina a processar deverão estar inscritos: N.º de exame N.º de bloco Soro a aplicar (antigénio a detectar) Em imunocitoquímica, o corte não deve ser demasiado espesso, principalmente quando se utilizam aparelhos de capilaridade, como o Sequenza. Na altura do corte, se o bloco histológico a estudar já se encontrar desbastado não se deve proceder a um novo desbaste, de forma a manter a mesma superfície de corte obtida na HE (Hematoxilina-Eosina), de forma a estabelecer comparação entre os casos. Após o corte, as lâminas permanecem o tempo necessário na estufa para que o tecido adira à lâmina (por exemplo: de 20min a 80ºC). 73

81 PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS 74

82 RECUPERAÇÃO ANTIGÉNICA 11 RECUPERAÇÃO ANTIGÉNICA Há alguns anos atrás, o interesse crescente dos Profissionais de Anatomia Patológica em expandir a aplicação de técnicas imunocitoquímicas em tecidos fixados em formol e impregnados em parafina foi influenciado pelos maus resultados obtidos. Foram dirigidas diversas tentativas para encontrar um substituto para o formol como fixador de rotina, mas falharam. Para ultrapassar a máscara imposta pelo formol, efectuaram-se diversos estudos com o intuito de recuperar as características originais dos antigénios afectados, surgindo assim o conceito de recuperação antigénica (Shi et al, 2001) Consequências da fixação Não está completamente estabelecido o mecanismo de actuação do formol mas parece estar relacionado com: Formação de pontes de metileno entre os pontos-chave de uma proteína ou de várias proteínas. Envolvimento de iões cálcio nesta reacção. Assim, surgem alterações nas estruturas quaternárias e terciárias das proteínas que condicionam a inibição de enzimas que poderiam autolisar o tecido. As estruturas primária e secundária são mantidas. As consequências da fixação dependem de: Concentração de formol ph Temperatura ºC Duração da fixação As alterações decorrentes da fixação podem ser de tal maneira extensas que levam ao não reconhecimento do antigénio fixado por parte do seu anticorpo específico. No final da fixação e processamento histológico podem existir três tipos de situações: Pode ser possível detectar diversos antigénios teciduais mesmo após fixação e consequente alteração proteica, não sendo necessário recorrer a processos de recuperação antigénica. Alguns antigénios têm o seu número diminuido nos tecidos após fixação, sendo de todo o interesse recorrer a processos de recuperação antigénica, de forma a aumentar a sensibilidade da técnica (evitando eventuais falsos negativos): 75

83 RECUPERAÇÃO ANTIGÉNICA Outros antigénios ficam completamente obstruídos pela fixação sendo imperioso recorrer a processos de recuperação antigénica (evitando de certeza falsos negativos) Os soros monoclonais em geral apresentam maiores problemas na detecção de antigénios fixados em formol do que os soros policlonais, pois estão limitados à detecção de somente um epitopo Digestão enzimática proteolítica Um dos estratagemas para "desmascarar" os antigénios obstruídos pela fixação é o tratamento dos tecidos com enzimas proteolíticas como por exemplo: pronase tripsina proteinase K pepsina Estas enzimas digerem ligações proteicas e levam à destruição indirecta das ligações induzidas pela fixação (pontes de metileno), expondo assim antigénios que estavam obstruídos ou mascarados pelas alterações estruturais decorrentes da fixação. No entanto, as ligações normais das proteínas também são destruídas, podendo haver destruição parcial ou total do antigénio por digestão enzimática, devendo o processo de digestão enzimática ser controlado de forma extremamente rigorosa. Para a digestão enzimática em banho-maria a temperatura ideal ronda os 37ºC, que é a temperatura óptima de actuação da maior parte das enzimas utilizadas Recuperação antigénica de origem térmica A recuperação antigénica mediada por calor é definida como o aquecimento a alta temperatura de secções tecidulares de modo a recuperar a antigenicidade que foi obstruída pela fixação em formol (Shi et al, 2001). Na década de 40 Fraenkel-Conrat et al, realizaram diversos estudos bioquímicos sobre as interacções entre o formaldeído e as proteínas, demonstrando que as ligações induzidas podiam ser destruídas por aquecimento a altas temperaturas ou por tratamento em soluções alcalinas fortes. Em 1991 Shi et al aplicaram estas técnicas a cortes de Histologia, procedendo ao aquecimento, em forno microondas, das lâminas mergulhadas em soluções de sais metálicos aumentando a sensibilidade das técnicas de Imunohistoquímica. O efeito de recuperação antigénica é atingido devido à transferência de energia resultante do aquecimento, que para além de quebrar as ligações Proteína-Proteína, quebra também as ligações entre os iões cálcio e os aminoácidos (nesta ultima reacção podem também estar envolvidos agentes quelantes existentes na solução de recuperação). O método de aquecimento pode ser : 76

84 RECUPERAÇÃO ANTIGÉNICA forno microondas panela de pressão aquecimento em chama banho-maria termostatizado outros As lâminas são colocadas num recipiente com a respectiva solução de recuperação e colocadas dentro do aparelho pré-definido, como o forno de microondas, entre outros. Para a recuperação térmica em forno microondas é utilizada frequentemente uma potência de 750W durante 15 ou 20 min. A morfologia geral do tecido não é particularmente afectada. O ph da solução de recuperação e a existência de agentes quelantes (promovem a extracção dos iões cálcio do tecido) também afecta de algum modo a recuperação antigénica, surgindo antigénios com preferência por determinados ph ou agentes quelantes (Ex. EDTA ou EGTA). De um modo geral utilizam-se dois tipos de soluções: tampão citrato ph 6 tampão EDTA 1mM ph 8 tampão ácido bórico a ph 7.0 Por vezes é necessário uma combinação de dois métodos de recuperação antigénica para se atingirem os resultados pretendidos (digestão enzimática+tratamento térmico). O sucesso da recuperação antigénica demonstrou que a modificação da estrutura proteica induzida pelo formol é um processo reversível sobre certas condições e desde que as proteínas mantenham a sua estrutura primária fornecida pelo conjunto de aminoácidos (Hayat, 2002). A introdução de métodos de recuperação antigénica foi, sem dúvida, um dos principais avanços que permitiram o desenvolvimento da Imunocitoquímica até ao modo que hoje conhecemos, pois até ao seu aparecimento somente uma pequena percentagem de antigénios podia efectivamente ser detectada. Com o aumento de substâncias detectáveis nos tecidos ou células aumentou a procura da ICQ tanto ao nível do diagnóstico, como do prognóstico, como da indicação terapêutica. 77

85 RECUPERAÇÃO ANTIGÉNICA 78

86 INIBIÇÃO DE PARTÍCULAS ENDÓGENAS 12 INIBIÇÃO DE PARTÍCULAS ENDÓGENAS 12.1 Peroxidase Endógena Existe principalmente em tecidos com glóbulos vermelhos, mas também ao nível do Baço, Rins, Fígado, Medula óssea e em áreas de necrose. É bloqueada por um excesso de substrato ( H 2 O 2 ) que leva à saturação da actividade enzimática. Para a inibição efectiva da peroxidase endógena pode ser utilizada uma solução de H 2 O 2 a 1.5% - 3% em água destilada imediatamente após a desparafinação/hidratação ou noutro momento considerado adequado Fosfatase Alcalina Existe em pequena quantidade no rim, fígado e osso. O bloqueio é feito por adição de levamisole a 5mM à solução de revelação. As fosfatases alcalinas do intestino não podem ser inibidas desta forma Glucose Oxidase Não existe nos mamíferos Pontos susceptíveis de atrair proteínas Podem ser pontos hidrofóbicos, electrostáticos ou outros. Estas estruturas teciduais podem existir em qualquer órgão ou tecido e poderão provocar o aparecimento de coloração de fundo ou de marcação inespecífica. Deverão ser anulados ou inibidos utilizando várias técnicas como por ex.: Utilização de soro normal não imune de uma espécie animal diferente da utilizada para produzir o anticorpo primário, aplicado imediatamente antes do soro primário. Utilização de PBS ou TBS de lavagem e de diluição de soros com um detergente (ex. triton X100; tween 20). Utilização de PBS ou TBS de diluição de soros com albumina sérica bovina (BSA) a 0.05% 12.5 Causas de marcação inespecífica Interacções hidrofóbicas. Interacções iónicas. Actividade enzimática endógena. Anticorpos naturais. Anticorpos contaminantes. 79

87 INIBIÇÃO DE PARTÍCULAS ENDÓGENAS Difusão antigénica. Reacções cruzadas. Receptores Fc. Outros: o Tecidos necrosado o Fixação deficiente o Má desparafinação 80

88 CONTROLO DE QUALIDADE 13 CONTROLO DE QUALIDADE O controle de qualidade da técnica é da responsabilidade do Técnico de Anatomia Patológica e surge como um dos passos mais importantes do desempenho deste profissional, pois implica conhecimentos profundos e capacidade crítica rigorosa. Todas as lâminas que saem do laboratório de Imunocitoquímica têm que ser avaliadas pelo Técnico responsável e ponderada a sua qualidade, tirando daí as consequentes ilações, tendo como objectivo máximo a melhoria permanente da qualidade do produto final do seu trabalho. Tipos de controlo de qualidade: Controlo de procedimentos o Substituição de reagentes o Controle tecidual Positivo Negativo Interno 13.1 Avaliação da qualidade da Imunocitoquímica De forma a permitir a interpretação e avaliação de lâminas de Imunocitoquímica, é importante possuir uma escala de avaliação que quantifica os parâmetros preservação da morfologia do tecido, sensibilidade e especificidade Preservação da morfologia do tecido É fundamental que uma metodologia imunocitoquímica garanta a estabilidade do substrato onde é aplicada, independentemente deste ser fresco ou de se apresentar fixado, ou então de se constituir em base citológica ou base histológica. A operacionalização será directa criando-se uma escala ordinal que corresponde a uma hierarquia iniciada na opção ausência total de preservação morfológica do tecido que corresponde à pior situação possível, e terminando na opção preservação perfeita da morfologia do tecido que corresponde à melhor situação possível (ver Tabela 4) Sensibilidade A sensibilidade é definida como a capacidade de reconhecer os verdadeiros positivos (Almeida, 1990). Partindo deste princípio poderemos operacionalizar este parâmetro analisando e classificando a intensidade da marcação específica e a quantidade relativa de estruturas marcadas. 81

89 CONTROLO DE QUALIDADE Intensidade de marcação A intensidade de marcação permite-nos avaliar a disponibilidade do antigénio e a capacidade amplificativa dos métodos de detecção e revelação utilizados. Este item obterá expressão prática submetendo-o a hierarquização numa escala ordinal que se inicia em intensidade de marcação nula que corresponde à pior situação possível e terminando em intensidade de marcação muito intensa que corresponde à melhor situação possível (ver Tabela 4) Quantidade relativa de estruturas marcadas A quantidade relativa de estruturas marcadas permite-nos quantificar o rácio existente entre estruturas marcáveis e estruturas marcadas. Este item obterá expressão prática submetendo-o a hierarquização numa escala ordinal que se inicia em 0% de estruturas marcadas que corresponde à pior situação possível e terminando em 100% de estruturas marcadas que corresponde à melhor situação possível (ver Tabela 4) Especificidade Genericamente podemos afirmar que a especificidade é a capacidade de reconhecer os verdadeiros negativos (Almeida, 1990). Em imunocitoquímica, a especificidade de um Anticorpo permite-lhe reconhecer e estabelecer ligações com Antigénios individualizados e específicos. Aplicando estes conceitos à marcação imunocitoquímica podemos caracterizar como inespecífica a presença de marcação em células ou em estruturas extra-celulares que não deveriam estar marcadas, uma vez que o anticorpo não é dirigido contra elas. Este item obterá expressão prática submetendo-o a hierarquização numa escala ordinal que se inicia em presença de marcação inespecífica que compromete a avaliação da marcação específica que corresponde à pior situação possível e terminando em sem marcação inespecífica que corresponde à melhor situação possível (ver Tabela 4) Marcação inespecífica e marcação de fundo A marcação inespecífica pode surgir por diversos motivos, como por exemplo reacções cruzadas entre anticorpos ou baixa afinidade entre Anticorpo e Antigénio. Comummente é feita a distinção entre marcação inespecífica propriamente dita e marcação de fundo. A principal diferença entre estas duas é dada pela forma de apresentação: enquanto a marcação inespecífica propriamente dita é electiva para as estruturas intra ou extra-celulares marcando-as de forma semelhante à marcação específica, a marcação de fundo não é electiva dispersando-se de forma irregular pelas estruturas celulares. No entanto, para efeitos desta escala de avaliação não foi considerada relevante esta distinção pois uma marcação imunocitoquímica é de baixa qualidade quando apresenta marcação inespecífica, independentemente do seu sub-tipo. 82

90 CONTROLO DE QUALIDADE Sensibilidade Especificidade Preservação da morfolo- Intensidade da marca- Quantidade relativa de Marcação inespecífi- gia do tecido ção específica estruturas marcadas ca/fundo 0 Ausência de preservação morfológica que invalida a avaliação Intensidade de marcação nula 0% de estruturas marcadas Presença de marcação inespecífica que invalida a avaliação 1 - Intensidade de marcação fraca 1 a 10% de estruturas marcadas - 2 Ausência de preservação morfológica que não invalida a avaliação Intensidade de marcação moderada 11 a 49% de estruturas marcadas Presença de marcação inespecífica que não invalida a avaliação 3 - Intensidade de marcação forte 50 a 89% de estruturas marcadas - 4 Preservação perfeita da morfologia Intensidade de marcação muito forte 90 a 100% de estruturas marcadas Ausência de marcação inespecífica Tabela 4 Grelha de avaliação de qualidade da imunocitoquímica Score final de qualidade da imunocitoquímica Para permitir uma constatação mais imediata e perceptível da qualidade da imunocitoquímica, uma comparabilidade entre estudos e um tratamento estatístico mais aprofundado, foi criado o Score Final de qualidade da imunocitoquímica. Este dado quantitativo resulta da aplicação de um algoritmo sobre os itens referidos anteriormente Factores de ponderação Numa tentativa de valorizar os itens que mais contribuem para a qualidade final da marcação imunocitoquímica foram introduzidos factores de ponderação. O item considerado mais relevante foi intensidade da marcação pelo que lhe foi atribuído o factor de ponderação 3. Em seguida foram considerados os itens quantidade relativa de estruturas marcadas e marcação inespecífica/fundo com o factor de ponderação 2. Finalmente foi atribuído o factor de ponderação 1 ao item preservação da morfologia do tecido (Tabela 5). 83

91 CONTROLO DE QUALIDADE Sensibilidade Especificidade Preservação da morfologia do tecido Intensidade da marcação específica Quantidade relativa de estruturas marcadas Marcação inespecífica/fundo Factor de ponderação Tabela 5 Factores de ponderação do Score Final da qualidade da imunocitoquímica. 84

92 APLICAÇÃO PRÁTICA DA IMUNOCITOQUÍMICA 14 APLICAÇÃO PRÁTICA DA IMUNOCITOQUÍMICAS As técnicas de Imunocitoquímica são uma ferramenta poderosa ao dispor do diagnóstico anatomopatológico e da investigação. Não obstante, a imunocitoquímica é um meio de pensar o diagnóstico e frequentemente serve de complemento a um raciocínio diagnóstico, não o substituindo. O prognóstico e a indicação terapêutica são muito condicionados pelo recurso a estas técnicas, demonstrando aqui o Técnico de Anatomia Patológica toda a sua responsabilidade e relevância para a melhoria da quantidade e qualidade de vida do doente. De um modo geral, já são conhecidos e estudados os diferentes antigénios que podem ser expressados pelos diferentes tipos de patologias, sendo necessário, muitas vezes, detectar a sua existência para confirmar a patologia correspondente. Noutras situações recorre-se a técnicas imunocitoquímicas não para confirmar uma suspeita proveniente do aspecto morfológico da patologia, mas sim como ferramenta de primeira linha pois o aspecto morfologico não indica caminhos definitivos. Aqui recorrem-se a algoritmos diagnósticos (Figura 68 e Figura 69), surgindo a imunocitoquímica como a principal determinante da resposta final. 85

93 APLICAÇÃO PRÁTICA DA IMUNOCITOQUÍMICA Figura 68 - Algoritmo utilizado para tumores indiferenciados. 86

94 APLICAÇÃO PRÁTICA DA IMUNOCITOQUÍMICA Figura 69 - Algoritmo utilizado para situações linfoproliferativas. 87

95 APLICAÇÃO PRÁTICA DA IMUNOCITOQUÍMICA 14.1 Principais antigénios detectados por imunocitoquímica Figura 70 - Receptores de Estrogénio Figura 71 - Receptores de progesterona Figura 72 - Proteína p53 Figura 73 - HER-2 88

96 APLICAÇÃO PRÁTICA DA IMUNOCITOQUÍMICA Figura 74 - Bcl-2 Figura 75 - CD3 Figura 76 - CD15 Figura 77 - CD20 89

97 APLICAÇÃO PRÁTICA DA IMUNOCITOQUÍMICA Figura 78 - CD30 Figura 79 - CD34 Figura 80 - CD45 Figura 81 - Ki67 90

98 APLICAÇÃO PRÁTICA DA IMUNOCITOQUÍMICA Figura 82 - melanoma HMB45 Figura 83 - CL Kappa Figura 84 - CL lambda Figura 85 - vimentina 91

99 APLICAÇÃO PRÁTICA DA IMUNOCITOQUÍMICA Figura 86 - CK 7 Figura 87 - PAN CK clones -AE1\AE3 Figura 88 - proteína S100 Figura 89 - actina do músculo liso 92

100 MARCAÇÃO MÚLTIPLA 15 MARCAÇÃO MÚLTIPLA A múltipla marcação consiste na aplicação de mais de um anticorpo primário num corte durante a técnica imunocitoquímica e consequente identificação dos correspondentes antigénios. Cada ligação anticorpo-antigag irá apresentar uma diferente cor que pode ser separadamente identificada. Existem duas formas distintas de aplicar marcação múltipla: método simultâneo ou método sequencial (Kropf, 2006) Método simultâneo Nesta metodologia de múltipla marcação os anticorpos primários são todos colocados em simultâneo na lâmina, assim como os anticorpos secundários e assim sucessivamente. É necessário que seja feita uma planificação adequada para que não surjam interacções indesejadas entre os reagentes utilizados que podem comprometer a especificidade e sensibilidade da marcação imunocitoquímica. Vantagens: Rápida. Desvantagens: Planificação complicada. Exigência de reagentes altamente específicos Método sequencial com desnaturação intercalar Este método implica a realização de uma técnica Imunocitoquímica completa, incluindo revelação, seguida de uma desnaturação e posteriormente de nova técnica imunocitoquímica, e assim sucessivamente (Figura 90, Figura 91, Figura 92, Figura 93). A desnaturação tem a função de eliminar todos os reagentes colocados no tecido pela técnica anterior, de forma deixar o tecido limpo para os novos anticorpos. Pode ser realizada com soluções de baixo ph ou por alta temperatura. Vantagens: Planificação mais simples. Não exige reagentes altamente específicos. Desvantagens: Mais demorada e trabalhosa. 93

101 MARCAÇÃO MÚLTIPLA Figura 90 - CD3 (negro) e CD20 (castanho) em gânglio linfático. Figura 91 - Glicoforina A (castanho), CD20 (negro) e CD3 (vermelho) em baço. Figura 92 - Insulina (castanho), Citoqueratina (negro) e CD34 (vermelho) em pâncreas. Figura 93 CD20 (castanho), Citoqueratina (negro) e AML (vermelho) em ap. ileo-cecal. 94