BIORREMEDIAÇÃO DE SOLOS CONTAMINADOS POR ÓLEO DIESEL COM O USO DA MICROBIOTA NATIVA

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1 BIORREMEDIAÇÃO DE SOLOS CONTAMINADOS POR ÓLEO DIESEL COM O USO DA MICROBIOTA NATIVA Bruno Gabriel Nascimento Andrade Rio de Janeiro 2009 BRUNO GABRIEL NASCIMENTO ANDRADE Aluno do Curso de Biotecnologia Matrícula

2 BIORREMEDIAÇÃO DE SOLOS CONTAMINADOS POR ÓLEO DIESEL COM O USO DA MICROBIOTA NATIVA Trabalho de Conclusão de Curso, TCC, apresentado ao curso de Graduação em Biotecnologia, da UEZO como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Tecnólogo em Biotecnologia, sob a orientação da Prof a Dr a Judith Liliana Solórzano Lemos Rio de Janeiro Julho de 2009

3 BIORREMEDIAÇÃO DE SOLOS CONTAMINADOS POR ÓLEO DIESEL COM O USO DA MICROBIOTA NATIVA Elaborado por Bruno Gabriel Nascimento Andrade Aluno do curso de Tecnologia em Biotecnologia da Uezo Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com Grau: Rio de Janeiro, de de 2009 Prof a. Dr a. Marise costa de Mello Prof a. Dr a Maria de Fátima Sarro Prof a. Dr a Judith Liliana Solórzano Lemos RIO DE JANEIRO, RJ - BRASIL JULHO DE 2009

4 A minha família que me incentivou mesmo quando estava na iminência de desistir; a minha orientadora, Profa. Judith Liliana Solórzano Lemos, que sempre quando necessário me dava um puxão de orelha, e a todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para que eu terminasse de trilhar este caminho.

5 É melhor tentar e falhar do que preocupar-se e ver a vida passar. É melhor tentar, ainda que em vão, que sentar-se fazendo nada até o final. Martin Luther King Jr ( )

6 Resumo As contaminações ambientais, tanto aquáticas quanto terrestres, provocadas por produtos químicos e derivados de petróleo são um grande problema nos dias de hoje. Além do problema ambiental gera-se o problema social e econômico, pois, a limpeza desses ambientes por métodos tradicionais é demasiadamente cara e, em alguns casos, prejudicial, apenas transferindo a poluição de um local para outro. Este trabalho apresenta um processo que já vem sendo empregada há um certo tempo, porém só nos ultimos anos ganhou destaque como uma maneira ecologicamente correta de limpar ambientes contaminados. O trabalho teve como objeto de estudo uma amostra de solo comum da Zona Oeste, na qual foi testado o crescimento da microbiota nativa sob condições normais em diferentes concentrações de fase lama (10, 20 e 30%), sendo a de 30% a mais favorável para a remediação de óleo diesel, adicionado em concentração de 5% v/v sendo utilizada como fonte de carbono. Palavras-Chave: Biorremediação, Microflora, Bioaumento.

7 Abstract The environmental contamination, both aquatic and terrestrial, caused by chemicals and oil products are a major problem nowadays. Besides the fact that environmental problems also generates social and economic problems, cleaning such environments is very expensive and, in some cases, prejudicial, just transferring the pollution from one place to another. This work presents a process that is already being used for a long time; however, only in recent years this process has gained prominence as an ecologically correct way to clean contaminated environments. This work had as object of study, a common sample of soil of the western zone, which was tested the growth of native microflora, under normal conditions, in different concentration of mud phase (10, 20 and 30%), being the 30% better for remediation of diesel oil, on concentration of 5% v/v, and used as carbon source. Keywords: Biorremediation, Microflora, Bioaugmentation

8 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Esquema para diluição seriada 12 Figura 2. Placas contendo colônias bacterianas de diluição Figura 3. Placa contendo colônia fúngica de diluição Figura 7. Consumo de O 2 16

9 SUMÁRIO Resumo v Abstract vi Listas de Figuras viii 1. Introdução 1 2. Revisão Bibliográfica Exploração do Petróleo Transporte e Refino História do Petróleo no Brasil Óleo Diesel Técnicas Remediadoras Incineração Lavagem Química Biorremediação Microorganismos degradadores de petróleo 9 3. Materiais e Métodos Amostra Vidrarias Reagentes Equipamentos Preparação e esterilização dos materiais Análise das populações microbianas do solo Bactérias Fungos Análise da capacidade biorremediadora da microbiota Resultados e discussão Análise quantitativa da microbiota do solo Bactérias Fungos Análise da capacidade biorremediadora da microbiota Conclusão Referências bibliográficas 18

10 1. INTRODUÇÃO A exploração do petróleo não tem sido uma atividade totalmente segura ao longo da história, pois inúmeros acidentes têm ocorrido. Durante a extração, transporte ou refino podem ocorrer vazamentos de petróleo bruto ou de combustíveis já refinados, causando graves danos ao meio ambiente, como graves poluições de ambientes terrestres ou aquáticos. Na última década a preocupação com o meio ambiente teve um crescimento assombroso, por isso processos ecologicamente corretos para a limpezas de ambientes estão sendo desenvolvidos e utilizados, entre eles está a biorremediação. A Biorremediação é uma técnica que consiste na utilização de microorganismos para a degradação de poluentes, transformando-os em CO2, água e energia, quando há uma mineralização completa, ou então em compostos menos complexos, podendo ser menos poluentes do que aqueles que lhes deram origem. A microbiota nativa do ambiente contaminado utilizada para este fim ou, uma população microbiana exógena capaz de degradar aquele. A caracterização de microorganismos com uma maior capacidade natural de degradar hidrocarbonetos complexos como o petróleo e o desenvolvimento de novas e mais efetivas técnicas de biorremediação são de extrema importância, pois, além de terem o custo mais baixo quando comparado a outras técnicas remediadoras, tendem a produzir compostos biodegradáveis como resultado da ação microbiana que não afetam negativamente o meio a ser tratado e evitam a transferência do poluente de um meio para o outro.

11 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. EXPLORAÇÃO DO PETRÓLEO A exploração de depósitos de petróleo com interesse comercial depende da existência de rochas sedimentares no subsolo ou rochas impermeáveis com espaços vazios. A exploração pressupõe uma investigação de regiões com tais características, o que é feito a partir do estudo do relevo da região, de estudos geológicos da superfície e de processos geofísicos. A perfuração, em função do tipo de solo, é programada para profundidades que variam de 800 a 5000 m e é feita com o auxílio de brocas de tungstênio ou diamante para rochas muito duras, ou brocas de dentes ou lâminas para rochas menos resistentes. Quando a perfuração é feita no mar, na chamada plataforma continental, utilizam-se plataformas de aço ou navios-sonda. Essas plataformas atingem 150 m ou mais de comprimento e sua altura podem ser regulados por complexos sistemas elétricos e hidráulicos, podendo ser rebocadas e colocadas na posição adequada, existe outro tipo de plataforma, chamada semi-submersível, que ocupa uma posição abaixo do movimento das ondas, dando grande estabilidade ao equipamento, e que é sustentada na superfície do mar por uma espécie de pequenos submarinos. Embora as perfurações no mar apresentem um custo quatro vezes maior que as feitas em terra, no Brasil, elas tornam-se interessantes economicamente porque os poços marítimos produzem muito mais que os terrestres ( TRANSPORTE E REFINO DO PETRÓLEO Após a extração do petróleo, o transporte se dá por oleodutos até os portos de embarque. Grandes petroleiros dão seqüência ao transporte até os terminais marítimos a que se destinam, onde, novamente, através de oleodutos, o petróleo é bombeado até as refinarias. Como o petróleo é uma mistura de milhares de hidrocarbonetos cujos pontos de ebulição estão muito próximos, seria impossível separá-los um a um;

12 então, a separação é feita em grupos de hidrocarbonetos, chamados frações do petróleo. Cada fração do petróleo é ainda uma mistura de hidrocarbonetos formada por um número menor de substâncias, e sua separação só é possível porque as frações apresentam diferentes pontos de ebulição. Inicialmente o petróleo é aquecido em um forno, sendo praticamente vaporizado, e direcionado para uma coluna de fracionamento provida de várias bandejas. A temperatura da coluna varia em função da altura, sendo que no topo encontra-se a menor temperatura. Os hidrocarbonetos de massas molares maiores, ainda líquidos, permanecem no fundo e são separados para sofrerem, posteriormente, uma destilação a pressão reduzida. Os mais leves, no estado gasoso, tendem a subir na coluna, resfriando-se. Quando esses vapores atingem uma bandeja com temperatura inferior ao ponto de ebulição de uma das frações, eles se condensam e são retirados da coluna. Os vapores restantes borbulham através dessa fração já líquida e passam para a bandeja superior, onde o mesmo processo se repete e outra fração é liquefeita e retirada; isso ocorre sucessivamente ao longo de toda uma coluna, que pode estar equipada até com 50 bandejas. Na verdade, é impossível separar de uma maneira eficiente as frações na primeira vez em que este processo é efetuado, por isso ele deve ser repetido. Uma parte dos vapores que deveriam se liquefazer na primeira bandeja sobe para a segunda e só então se liquefaz. Existem comunicações externas à coluna, entre as bandejas, que permitem que o líquido obtido na segunda bandeja retorne à primeira. Nessa primeira bandeja ocorre a vaporização dos componentes que vieram da segunda bandeja, mas os componentes da primeira bandeja permanecem líquidos e são retirados. Este processo se repete várias vezes em cada bandeja. ( HISTÓRIA DO PETRÓLEO NO BRASIL A história da indústria petrolífera do Brasil se confunde com a criação da Petrobras, em 1953, empresa que alavancou a exploração deste recurso natural que se tornaria um dos termômetros da política internacional. No

13 cenário mundial, hoje, o Brasil ocupa o 16º lugar no ranking dos maiores produtores de petróleo do mundo. Até isso ocorrer foi preciso que houvesse um aumento da capacitação de recursos humanos, injeção de capital, crises internacionais e a criação de políticas que organizaram e priorizaram o petróleo para o desenvolvimento do país. Mas este foi o resultado de uma caminhada que começou quando observadores e curiosos foram gradativamente desvendando os primeiros vestígios de petróleo em solo brasileiro a partir do final do século XIX. Nos EUA, em 1859, perfurava-se o primeiro poço de petróleo na Pensilvânia, descoberto pelo coronel Edwin L. Drake. No Brasil, as primeiras tentativas de encontrar petróleo datam de 1864, Mas apenas em 1897, o fazendeiro Eugênio Ferreira de Camargo perfurou, na região de Bofete (SP), o que foi considerado o primeiro poço petrolífero do país, muito embora apenas dois barris tenham dele sido extraídos. Nesta época o mundo conheceu os primeiros motores à explosão que expandiriam as aplicações do petróleo, antes restritas ao uso em indústrias e iluminação de residências ou locais públicos. No final do século XIX, dez países já extraíam petróleo de seus subsolos. Durante a década de 30, já se instalava no Brasil uma campanha para a nacionalização dos bens do subsolo, em função da presença de trustes (reunião de empresas para controlar o mercado) que se apossavam de grandes áreas de petróleo e de minérios, como o ferro. Um das pessoas que desempenhou papel chave nesta campanha foi Monteiro Lobato, que sonhava com um Brasil próspero que pudesse oferecer progresso e desenvolvimento para sua população. Depois de uma viagem aos Estados Unidos, em 1931, Lobato retorna entusiasmado com o modelo de país próspero que conhecera e passa a defender as riquezas naturais do Brasil e sua capacidade de produzir petróleo, através de contribuições de artigos para jornais e palestras para promover a conscientização popular. Nesse meio tempo, no interior da Bahia, Manoel Ignácio Bastos, um engenheiro que trabalhava para a delegacia de Terras e Minas encontra amostras de uma substância negra que, após ser analisada pelos engenheiros Antonio Joaquim de Souza Carneiro, da Escola Politécnica de São Paulo e Oscar Cordeiro, da Bolsa de Mercadorias, é confirmada como sendo petróleo.

14 Depois de muitas tentativas frustradas de atrair a atenção das autoridades, finalmente, em 1939, a sonda enviada pelo DNPM jorraria petróleo abundantemente, sendo considerado o primeiro poço comerciável do país, dois anos depois. Apenas como curiosidade, quem recebeu os créditos pela descoberta foi Oscar Cordeiro, fato que só seria corrigido pela Petrobras em 1965, quinze anos após a morte de Ignácio Bastos, após extensa análise documental apresentada pela viúva de Bastos. O êxito obtido reforçou a necessidade de o país minimizar sua dependência em relação às importações de petróleo. Conseqüentemente, em 1939 o governo de Getúlio Vargas instala o Conselho Nacional do Petróleo (CNP), com a primeira Lei do Petróleo do país, para estruturar e regularizar as atividades envolvidas, desde o processo de exploração de jazidas até a importação, exportação, transporte, distribuição e comércio de petróleo e derivados. Este decreto tornou o recurso patrimônio da União. Daí em diante muitas perfurações foram feitas nas bacias do Paraná de Sergipe-Alagoas e do Recôncavo, sendo que as principais descobertas foram feitas nesta. Nos anos 50, a pressão da sociedade e a demanda por petróleo se intensificavam, com o movimento de partidos políticos de esquerda que lançam a campanha "O petróleo é nosso". O governo Getúlio Vargas responde com a assinatura, em outubro de 1953, da Lei 2004 que instituiu a Petróleo Brasileiro S.A (Petrobras) como monopólio estatal de pesquisa e lavra, refino e transporte do petróleo e seus derivados ( ÓLEO DIESEL O Óleo é um combustível derivado do petróleo sendo constituído basicamente por hidrocarbonetos (compostos orgânicos que contém átomos de carbono e hidrogênio). Alguns compostos presentes no diesel, além de apresentar carbono e hidrogênio apresentam também enxofre e nitrogênio. Normalmente, o diesel é um combustível mais pesado do que a gasolina e sendo formado por cadeias carbônicas de 6 a 30 átomos, essa característica também confere menor volatilidade e menor solubilidade em água. Participam da

15 composição do óleo diesel participam hidrocarbonetos parafínicos, oleofínicos e aromáticos. Produzido a partir da refinação do petróleo, o óleo diesel é formulado através da mistura de diversas correntes como gasóleos, nafta pesada, diesel leve e diesel pesado, provenientes das diversas etapas de processamento do petróleo bruto. Recebeu este nome em homenagem ao engenheiro alemão Rudolf Diesel que inventou um meio mecânico para explorar a reação química originada da mistura de óleo e do oxigênio presente no ar ( O Diesel é constituído de muitos compostos recalcitrantes para o ataque microbiano, possuindo em sua composição alcanos e compostos aromáticos de alto peso molecular, dificultando muito sua degradação por microorganismos (VIEIRA, 2007) TÉCNICAS REMEDIADORAS Para a descontaminação de ambientes poluídos por hidrocarbonetos complexos, como o petróleo e seus derivados, ou mesmo por outros agentes químicos são empregadas técnicas cuja ação vai depender do tipo do contaminante, da concentração do mesmo e da extensão da área afetada. Por esse motivo, diversas tecnologias de remediação têm sido desenvolvidas e consolidadas principalmente pelos países desenvolvidos. O Brasil, hoje mais preocupado com seus locais contaminados, começa a desenvolver suas próprias tecnologias e também a adaptar as tecnologias já estabelecidas às nossas condições ambientais. O Estado de São Paulo, em função de sua intensa industrialização, apresenta uma situação mais crítica em relação a esta questão. Desta forma, a CETESB tem desenvolvido manuais e adaptado legislações, principalmente normas Holandesas (CETESB, 1996), com vistas ao controle das áreas suspeitas de contaminação e comprovadamente contaminadas. Neste sentido, destaca-se o Manual de Gerenciamento de Áreas Contaminadas 1, que tem por função fornecer informações e metodologias a serem utilizadas na solução dos problemas gerados por áreas contaminadas, desde a investigação preliminar até a proposição de técnicas de remediação (CETESB, 1996).

16 Muitas opções ou combinações de opções estão disponíveis para restaurar a qualidade do solo e da água subterrânea. A seleção de tecnologias a serem utilizadas baseia-se fundamentalmente no conhecimento das características físico-químicas do contaminante, volume vazado, tempo de vazamento, caracterização geológica e hidrogeológica do local, análise do meio físico superficial e subterrâneo e extensão da pluma contaminante (SPILBORGHS, 1997) Incineração A incineração é um processo tecnológico que emprega a decomposição térmica, via oxidação em alta temperatura (usualmente 900ºC ou superior), para destruir a fração orgânica de um resíduo ou reduzir o seu volume. Qualquer resíduo contendo uma fração orgânica perigosa, não importa se pequeno, é um candidato à incineração. Até mesmo águas contaminadas podem ser incineradas. A incineração de solos contaminados por vazamentos de produtos perigosos ou combustíveis é bastante praticada. (RODRIGUES, 2002) Embora a incineração seja considerada o meio mais eficiente para destruir resíduos perigosos, ele possui a desvantagem de destruir completamente o solo contaminado e possuir um custo extremamente elevado (NEHEMIAS et al, 2001) Lavagem química A lavagem química é um processo tecnológico que desagrega hidrocarbonetos do solo através do uso de solventes leves. Os solos contaminados por produtos petrolíferos são encaminhados para a unidade móvel de lavagem de sólidos, reciclador / lavador. Procede-se a lavagem a quente, com forte agitação hidromecânica, que provoca um forte movimento com desagregação eficiente dos produtos petrolíferos. Utiliza-se nesta fase um surfactante biodegradável para transferência dos compostos orgânicos da matriz sólida para a fase líquida.

17 O processo de lavagem é realizado em ciclos, por cargas, até a obtenção de um baixo nível de hidrocarbonetos. O ciclo continua até não haver libertação de produtos petrolíferos, esta técnica tem a vantagem de não destruir o solo, sendo o mesmo devolvido após o processo ( Biorremediação A Biorremediação é uma técnica alternativa e ecologicamente correta do ponto de vista da destinação final dos resíduos. Desde meados da década de 90 a técnica de biorremediação tem sido adotada como uma maneira extremamente eficaz e de baixo custo para a remediação de compostos orgânicos em solos. Estas técnicas são baseadas em processos microbiológicos que convertem os contaminantes em dióxido de carbono e água, pela minerização completa, ou pela redução da toxicidade dos compostos através de sua degradação parcial. Entretanto, a eficácia da biorremediação sofre um impacto direto do processo de intemperização que o solo contaminado passou desde a data do derramamento do contaminante (TRINDADE, 2002). A intemperização é a conseqüência da ação de fenômenos químicos, físicos e biológicos. As ações destes fenômenos resultam na redução do composto contaminante, seja por volatilização de compostos mais leves, ou pela lixiviação dos compostos, afetando o tipo de contaminante presente no solo e a disponibilidade deste para o ataque microbiano. A natureza do contaminante presente no solo vai interferir na extensão da degradação microbiana, por estar intrinsecamente relacionada ao peso molecular do composto orgânico e da razão de hidrocarbonetos saturados e aromáticos. Outra importante conseqüência do processo de intemperização é a redução da disponibilidade dos contaminantes aos microorganismos (biodisponibilidade), devido à maior sorção destes pela matriz do solo, tirandoos da fase dissolvida. Este fator será mais pronunciado em solos argilosos, já que é grande a fração de partículas finas deste que intensificam a interação entre a matriz e o contaminante (TRINDADE, 2002).

18 Estudos recentes apontaram que várias bactérias e fungos filamentosos possuem a capacidade de mineralizar ou degradar hidrocarbonetos, no entanto esta técnica é mais apropriada para um tratamento de refino e não quando se tem altas concentrações do poluente. Então, a biorremediação poderia ser empregada em associação a outras técnicas que façam um abatimento ambiental considerável, deixando o contaminante remanescente para os microrganismos (MANCERA et al, 2006) Várias técnicas de biorremediação foram desenvolvidas, mas a bioestimulação é a mais usada (HEAD, 1998). Esta técnica consiste na ativação dos microorganismos nativos do solo através da adição de nutrientes (PROVIDENTI et al, 1993). No entanto, em alguns casos a população microbiana do solo afetado pode não ser o suficientemente grande, ou então carecer da habilidade de degradar compostos com alto peso molecular; nesses casos a técnica do bioaumento poderia ser usada. Essa técnica consiste na adição de culturas microbianas com capacidade de remediação específicas e conhecidas (D ANNIBALE et al., 2006). Essas culturas devem, conseqüentemente, possuir a habilidade de crescer em solos diferentes e sobreviver à presença de outros microorganismos (RISER-ROBERTS, 1998) Microrganismos degradadores de petróleo e/ou seus derivados Bactérias e fungos são os principais microrganismos degradadores de hidrocarbonetos. As bactérias constituem os microrganismos mais estudados, dentre os quais as Pseudomonas foram as primeiras a serem postas em evidência em função da sua capacidade de degradar hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP). Mais tarde, outros gêneros (Alcaligenes, Mycobacterium, Rhodococcus) foram também aplicados na degradação destes compostos (BOUCHEZ et al., 1996). Leahy e Colwell (1990) citam os seguintes gêneros de bactérias como os mais importantes: Achromobacter, Acinetobacter, Alcaligenes, Arthobacter, Bacillus, Flavobacterium, Nocardia e Pseudomonas. Além das bactérias, os fungos representam importante papel na degradação dos hidrocarbonetos no solo, suas enzimas extracelulares podem proporcionar substratos para o crescimento de bactérias através da hidrólise de

19 polímeros e também importantes metabólitos secundários. O mecanismo da degradação de hidrocarbonetos por fungos têm sido menos estudado, mas provavelmente envolvem oxigenases induzíveis similares as apresentadas por algumas bactérias Dentre os fungos que degradam hidrocarbonetos de petróleo é importante distinguir os filamentosos, degradadores de lignina, tais como Phanaerochaete chrysosporium, e os não degradadores de lignina como Cunninghamella elegans (BOUCHEZ et al., 1996) Os atributos que distinguem os fungos filamentosos das outras formas microbianas determinam porque estes microrganismos são bons biodegradadores. Primeiro, o crescimento micelial confere uma vantagem sobre os microorganismos unicelulares, bactérias e leveduras, especialmente no que concerne à colonização de substratos insolúveis. Os fungos ramificamse rapidamente no substrato, digerindo-o através da secreção de enzimas extracelulares, disponibilizando, desta forma, o acesso para o ataque bacteriano. Em segundo lugar, os fungos, aparentemente, toleram maiores concentrações de produtos tóxicos no microambiente externo do que no seu interior. São capazes de crescer sob condições ambientais de estresse, como em meios com baixos valores de ph, por exemplo, e ainda suportar meios pobres em nutrientes. Por outro lado, apresentam uma capacidade de sobrevivência em meios com baixa atividade de água maior do que as bactérias e leveduras, propriedade esta que os apontam como os mais apropriados para trabalhar em condições de baixa umidade relativa. (DYMINSKI, 2006).

20 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Amostra 70g de solo 3.2. Vidrarias 10 pipetas de 10 ml 10 pipetas de 5 ml 10 pipetas de 1 ml 12 placas de petri 2 Erlen Mayer de 250 ml 10 tubos de ensaio de 15 ml 2 provetas de 250ml 2 Beckers 3.3. Reagentes 720 ml de água destilada 210 ml de meio Ágar-Nutriente de marca DIFCO 210 ml de meio Ágar-Sabouraud de marca HIMEDIA 200ml de meio mineral Bushnell Hass 150 ml de solução salina Óleo Diesel 3.4 Equipamentos Manta aquecedora Capela de fluxo laminar Balança de precisão Autoclave Geladeira Vortex Estufa para crescimento microbiano Respirômetro eletrolítico Pipetador automático

21 3.5. PREPARAÇÃO E ESTERILIZAÇÃO DO MATERIAL O solo a ser testado foi colhido na zona oeste, transportado e armazenado na geladeira do laboratório de tecnologia de cultura de células da Universidade estadual da zona oeste por aproximadamente 144 horas Inicialmente foram dissolvidos 10g de solo em 90ml de solução salina, previamente esterilizada, para que fosse feita a diluição seriada do solo 1ml da suspensão inicial (solo + solução salina) foi pipetado em um tubo de ensaio contendo 9ml de solução salina fazendo a diluição (10-2 ), 1ml da solução deste tubo foi adicionado em outro contendo 9ml de solução salina (10-3 ), repetindo a operação até que a diluição atingisse um fator de 10-6, como a figura abaixo exemplifica. Fig1. Esquema de uma diluição seriada

22 Preparo do meio de cultivo para bactérias Foram preparados 210ml de meio Ágar-nutriente em um erlenmeyer de 250ml, e após o mesmo ser submetido a esterilização recomendada pelo fabricante, 15lb de pressão a 121C por 15 minutos em um autoclave, aproximadamente 30ml de meio foi vertido em cada placa de petri Preparo de meio de cultivo para fungos Seguindo o mesmo procedimento do meio Ágar-nutriente, foram preparados 210ml do meio Ágar-Saboraud e, após sua esterilização recomendada pelo fabricante, aproximadamente 15lb de pressão a 121C por 15 minutos, então vertidos em placas de petri ANÁLISE DA MICROBIOTA DO SOLO Bactérias As diluições 10-4, 10-5 e 10-6 foram plaqueadas em duplicata, transferindo para cada placa 0,8 ml. As placas foram levadas para a estufa a 36.7º C, e mantidas até o aparecimento de colônias, após 2 dias as colônias foram contadas, para que as unidades formadoras de colônias pudessem ser calculadas, isto é, para que as células viáveis, assumindo-se que cada colônia originou-se de uma célula viável, contidas nas suspensões fossem contadas Fungos Para os fungos foi repetida a diluição seriada, as suspensões também foram plaqueadas em duplicata em meio Sabouraud, e inoculados 0,4 ml da respectiva suspensão em cada placa de Petri. As placas foram levadas para a estufa a 30ºC, e mantidas até o aparecimento das colônias características. Para a contagem das colônias escolheu-se a diluição que continha entre 30 e 300 colônias e fez-se uma média entre as duplicatas. Para o cálculo das unidades formadoras de colônias (UFC/g de solo), foram utilizadas as seguintes equações, propostas por Carter (1993): FD = Di x Ds x Q (FD: fator de diluição; Di: diluição inicial; Ds: diluições subseqüentes; Q: volume de solução plaqueada) e UFC = 1/FD x n (UFC: número de unidades formadoras de colônias; FD: fator de diluição; n: número de colônias encontradas na placa).

23 3.7. CAPACIDADE BIORREMEDIADORA DA MICROBIOTA A amostra de solo foi inicialmente adicionada em 200 ml de meio mineral Bushnell Hass contendo diesel (5% v/v) como fonte de carbono. As amostras foram submetidas à agitação de 200 RPM e temperatura de 20 o C durante 9 dias. A quantidade de solo adicionada foi de 10, 20 e 30g de solo por 100 ml de meio mineral. O aparelho utilizado para esta fase do experimento se chama respirômetro, e é automaticamente aerado com a quantidade de oxigênio que é recirculada por causa da célula eletrolítica, registrando então o consumo de O2 das amostras.

24 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. ANÁLISE QUANTITATIVA DA MICROBIOTA DO SOLO Bactérias Dois dias após a inoculação dos microorganismos, as placas foram retiradas da estufa, suas colônias contadas e registradas visualmente (Figuras 2A, e 2B). As unidades formadoras de colônias, ou seja, o número de células viáveis presentes em 1g de solo foi calculada segundo a equação proposta por Carter, cujo valor foi de 8,68x10 7 u.f.c/g. Figura 2. placas contendo as diluições de 10-4 (duplicatas), nas quais houve uma contagem de 44 colônias( na figura 2A) e 51 colônias (na figura 2B) Fungos Sete dias após a inoculação dos microorganismos, as placas foram retiradas, suas colônias contadas e registradas visualmente (figura 3). Utilizando o mesmo método para a contagem de unidades formadoras de

25 colônia, foi encontrado o valor de 5,5x10 5 u.f.c/g. Não houve crescimento nas placas que receberam alíquotas provenientes da diluição 10-6 Figura 3. placas contendo colônias de fungos provenientes da diluição seriada 10-4 (duplicatas), onde houve uma contagem de 22 colônias ANÁLISE DA CAPACIDADE BIORREMEDIADORA DA MICROBIOTA Após 9 dias, este gráfico foi apresentado pelo respirômetro, que mostra que dentre as concentrações de solo testadas, aquela com 30% seria a mais recomendável para o processo de biorremediação. Pois as curvas 5 e 6 (duplicatas) foram as que mostraram maior captação de O 2, o que já era esperado. Figura 4. Acúmulo de oxigênio durante a degradação de óleo diesel por microbiota nativa de solo da zona oeste. (1=10%; 3 e 4=20% e 5 e 6=30%) por 210 horas de monitoramento

26 5 - CONCLUSÃO A Microbiota nativa do solo retirado da zona Oeste obteve um crescimento satisfatório em um ambiente sem restrições, e obteve êxito ao degradar óleo diesel, sendo esta degradação maior em uma concentração de lama de 30%. Apesar de ser uma técnica ecologicamente correta, ela é indicada para ambientes que não estejam saturados de contaminantes, de até 10% no máximo em relação ao ambiente, uma vez que o petróleo e seus derivados são muito tóxicos quando extrapolam essas concentrações, e sem uma concentração mínima de nutrientes e de água, o crescimento celular é inviável, sendo utilizada então como uma técnica polidora usada para retirar os residuos que ainda ficaram após a utilização de outras técnicas remediadoras. Estudos posteriores para o desenvolvimento de técnicas biorremediadoras mais eficazes poderão, e deverão ser feitos, tanto na utilização de microorganismos em ambientes mais saturados quanto na produção de linhagens de microorganismos mais eficazes, genéticamente alterados ou não. Apesar de no momento as técnicas biorremediadoras não serem a resposta definitiva na limpeza de ambientes contaminados por acidentes com petróleo, ou contaminantes de outras origens, com o tempo, após muitos estudos, poderão vir a ser.

27 6- Referências bibliográficas P.V.O. Trindade, L.G Sobral, Bioremediation of a weathered and a recently oil-contaminated soils form Brazil, chemosphere. M.E. Mancera-López, F. Esparza-García, Bioremediation of an aged Hydrocarbon-contaminated soil by a combined system of biostimulationbioaugmentation with filamentous fungi, International biodeterioration & biodegradation 61. Rodrigo Josemar S. Jacques, Fátima Menezes Bento. Biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, Universidade Federal de Santa Maria. Anders R. Johnsen, Lukas Y. Wick, Principles of microbial PAHdegradation in soil, Enviromental Pollution 133, Zhendi Wang, Merv Fingas, Comparison of oil composition changes due to biodegradation and physical weathering in different oils. Journal of Chromatography 809, Rodrigues Nehemias & Júnior Alencar, Incineração e Dioxinas: Análise do aporte teórico disponível. ALEF, K.; NANNIPIERI, P. (1995) Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry. San Diego: Academic Press,1 st ed., 576p. FERRARI, M.D. (1996) Biodegradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos y su aplicación em la biorremediación de suelos y lodos contaminados. Revista Argentina de Microbiologia, 28: DYMINSKI, A.S. (2006) Contaminação de solos e águas subterrâneas. Acessado em: Contaminacao_de_solos.pdf - Pesquisado em: 19/05/ 2008.

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