EFEITO DA TEMPERATURA E CONCENTRAÇÃO DE NITROGÊNIO SOBRE A COMPOSIÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS DE Heterochlorella luteoviridis

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1 EFEITO DA TEMPERATURA E CONCENTRAÇÃO DE NITROGÊNIO SOBRE A COMPOSIÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS DE Heterochlorella luteoviridis T. Menegol, D. Vargas, E. Rodrigues, R. Rech Universidade Federal do Rio Grande do Sul Instituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos Caixa Postal CEP Porto Alegre RS Brasil, (rrech@ufrgs.br) RESUMO Este trabalho avaliou a influência da temperatura (22 C, 27 C e 32 C) e da concentração de nitrogênio (75 mg L -1, 150 mg L -1, 225 mg L -1, 300 mg L -1 e 375 mg L -1 de NaNO 3) sobre a formação e a composição de lipídios de Heterochlorella luteoviridis utilizando um delineamento experimental hexagonal. Os teores de lipídios na biomassa variaram entre 63,7 mg g -1 e 90,2 mg g -1. A composição qualitativa dos ácidos graxos foi semelhante em todos os tratamentos. O teor médio de ácidos graxos saturados foi 50,6 ± 1,5 %. Os teores de ácidos graxos monoinsaturados e poli-insaturados variaram de 9,6 a 14,7 % e de 34,4 a 40,7 % do total de ácidos graxos, respectivamente. Os ácidos graxos essenciais, ácido linoleico (LA - ω6) e α-linolênico (ALA ω3) forma os principais constituintes dos ácidos graxos poli-insaturados. Também se observou a presença dos ácidos eicosapentaenoico (EPA) e docosaexaenoico (DHA). ABSTRACT This study evaluated the influence of temperature (22 C, 27 C and 32 C) and nitrogen concentration (75 mg L -1, 150 mg L -1, 225 mg L -1, 300 mg L -1 and 375 mg L -1 de NaNO 3) on the lipid content and composition of Heterochlorella luteoviridis using a hexagonal experimental design. The lipid content in biomass ranged from 63.7 mg g -1 to 90.2 mg g -1. The qualitative composition of fatty acids was similar in all treatments. The content of saturated fatty acids was 50.6 ± 1.5 %. The monounsaturated and polyunsaturated fatty acids content ranged from 9.6 % to 14.7 % and 34.4 % to 40.7 % of total fatty acids, respectively. The essential fatty acids linoleic acid (LA - ω6) and α-linolenic (ALA - ω3) constitute the major components of polyunsaturated fatty acids. The eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA) were also found. PALAVRAS-CHAVE: Heterochlorella luteoviridis; ácidos graxos; temperatura; nitrogênio. KEYWORDS: Heterochlorella luteoviridis; fatty acids; temperature; nitrogen. 1. INTRODUÇÃO Microalgas são conhecidas pela produção de compostos alto valor, tais como lipídios, carboidratos, proteínas e compostos bioativos como ácidos graxos e carotenoides. Os lipídios e sua fração de ácidos graxos são componentes intracelulares das microalgas com a função de manter a estrutura e também armazenar energia para célula. Microalgas produzem uma variedade interessante de ácidos graxos insaturados variando de 16 a 22 átomos de carbono e contendo de 1 a 6 ligações duplas na configuração cis, sendo consideradas produtoras dominantes de ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) ômega 3 na biosfera (Behrens & Kyle, 1996). Os AGPI ômega 3 incluem o ácido eicosapentaenoico (EPA) e o ácido

2 docosaexaenoico (DHA), os quais são considerados gorduras dietéticas que apresentam amplos benefícios a saúde, sendo relacionados à prevenção de doenças cardiovasculares, ao bom desenvolvimento fetal e ao envelhecimento saudável (Swanson, Block, & Mousa, 2012). As características de crescimento e a composição das microalgas são influenciadas diretamente pelas condições de cultivo, tais como temperatura, nutrientes, iluminação, etc. Devido a sua flexibilidade metabólica as microalgas são capazes de produzir altas concentrações de lipídios quando cultivadas sob condições de crescimento limitadas (Maity, Bundschuh, Chen, & Bhattacharya, 2014). A composição também varia entre as espécies de microalgas (Behrens & Kyle, 1996) Informações sobre a versatilidade metabólica da microalga Heterochlorella luteoviridis são poucas e até mesmo inexistentes. Assim, o presente estudo experimental teve o objetivo de avaliar a influência de diferentes temperaturas e concentrações de nitrogênio sobre a formação de lipídios e sua composição da microalga Heterochlorella luteoviridis. 2. MATERIAIS E MÉTODOS A microalga marinha Heterochlorella luteoviridis BE 002 foi obtida do banco de algas no Laboratório de Bioengenharia do ICTA/UFRGS. O meio de cultivo utilizado foi o f/2 (Guillard, 1975) com alterações nas quantidades de nitrato de sódio (75 mg L -1, 150 mg L mg L -1, 300 mg L -1 e 375 mg L -1 ). O inóculo foi preparado a uma diluição de 1:10, mantido por 14 dias em estufa rotatória (90 rpm, 28 C) sob iluminação constante de aproximadamente 2,5 klx. Após esse período, iniciou-se o cultivo em fotobiorreator de placa airlif, com capacidade de 2,4 L. A temperatura (22 C, 27 C e 32 C) foi mantida utilizandose banho térmico. Foi aplicado um delineamento experimental hexagonal de 2 fatores com repetições no ponto central totalizando 8 ensaios. Todos os cultivos foram realizados em duplicata. A aeração do sistema foi realizada a vazão de 1 L min -1 de ar comprimido e 0,01 L min -1 de CO2. A iluminação foi fixada em 18,0 klx. Ao final de 7 dias o conteúdo dos biorreatores foi centrifugado, congelado e liofilizado. A biomassa liofilizada foi armazenada a - 22 C para posterior análise. O acompanhamento do crescimento da biomassa foi realizado diariamente por densidade ótica (DO750nm) correlacionada com peso-seco. Os lipídios foram determinados pela metodologia proposta por Bligh e Dyer (Bligh & Dyer, 1959). Todos os ensaios foram realizados em duplicata, os resultados se referem à média dos resultados obtidos das análises de dois cultivos. A determinação dos ácidos graxos foi realizada pelo método descrito por Joseph & Ackman, (1992), onde os ácidos graxos são determinados na forma de ésteres metílicos de ácidos graxos. O perfil de ácidos graxos foi determinado por cromatografia gasosa (GC Modelo 2010, Shimadzu, Kyoto, Japão) utilizando BHT (hidroxitolueno butilado) como padrão interno. A identificação de cada ácido graxo foi realizada comparando o tempo de retenção com uma mistura padrão de ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME-MIX 37 padrão Sigma ). A quantificação dos ácidos graxos foi realizada seguindo a metodologia da AOCS (AOCS, 1997). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3 As baixas concentrações de nitrogênio no meio de cultivo resultaram em maior conteúdo de lipídios totais na biomassa. Neste estudo, os teores de lipídios na biomassa variaram entre 63,7 mg g -1 e 90,2 mg g -1, quando a concentração de nitrogênio diminuiu de 60 mg L -1 para 12 mg L -1 N-NO3 (Tabela 1). A obtenção de maiores teores de lipídios em cultivos com menores concentrações de nitrogênio é bem fundamentada pela literatura (Converti, et al., 2009; Juneja, Ceballos, & Murthy, 2013). A temperatura não demonstrou efeito sobre a síntese de lipídios da H. luteoviridis BE002. A composição qualitativa de ácidos graxos da H. luteoviridis foi semelhante em todas as condições de cultivo testadas (Tabela 1). A concentração de ácidos graxos saturados (AGS) foi cerca de 50 % do total de ácidos graxos totais, sendo o ácido hexadecanoico (C16:0) o principal AGS em todas as condições de cultivo, seguido pelo ácido octadecanoico (C18:0). A síntese do C16:0 foi favorecida em baixas concentrações de nitrogênio e temperatura elevada. As maiores concentrações de C18:0 foram observadas sob altas concentrações de nitratos e em baixas temperaturas. O teor de ácidos graxos monoinsaturados (AGM) variou de 9,6% a 14,7% dos ácidos graxos totais. O principal AGM foi C18:1n-6, seguido por C16:1n-9 e C18:1n-9. Os dois primeiros foram favorecidos a altas temperaturas, enquanto C18:1n9 aumentou na biomassa nos cultivos a baixa temperatura. O teor de ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) variou de 34,4% a 40,7% de ácidos graxos totais (Tabela 1), sendo o maior valor observado no cultivo com alta concentração de nitrogênio (60 mg L -1 N-NO3). Este resultado indica a importância de elevar a disponibilidade de nitrogênio no meio de cultivo, para aumentar os níveis de AGPI nesta microalga. Os AGPI são os principais ácidos graxos que constituem a estrutura dos cloroplastos na célula e tem a função de manter a estrutura da membrana em algas verdes. Assim, a redução de AGPI em cultivos com baixas concentrações de nitrogênio, podem estar relacionados com o efeito da privação de nitrogênio no sistema de fotossíntese das algas (Zhu et al., 2014). Os ácidos graxos essenciais, ácido linoleico (LA, C18:2n-6) e α-linolênico (ALA, C18:3n-3) constituem os principais componentes de AGPIs (Tabela 1), outros importantes AGPIs como EPA, (20:5n3) e o DHA (22:6n3) também estão presentes na fração de ácidos graxos poliinsaturados da H. luteoviridis. Observou-se uma tendência para aumentar a síntese dos ácidos graxos poli-insaturados em cultivos a temperatura de 22 C. No entanto, o LA, demonstrou um aumento nos cultivos sob temperatura elevada. A relação entre a temperatura e conteúdo AGM e AGPI pode ser explicada pelas alterações na fluidez dos fosfolipídios das camadas da membrana celular, o que depende do grau de insaturação dos ácidos graxos. O teor de EPA não foi influenciado pela temperatura e sua síntese foi favorecida quando as células foram cultivadas em concentrações elevadas de nitrogênio. A ingestão de ácidos graxos ω3, tais como ALA, EPA e DHA, está associada com baixa incidência de infarto do miocárdio, inflamação crônica, doenças autoimunes e doenças cardiovasculares. Além de ser rica em ácidos graxos ω3, a H. luteoviridis também apresentou uma baixa relação ω6:ω3 (LA:ALA, Tabela 1), em torno de 2:1. A baixa relação ω6:ω3 na dieta foi associada com uma redução de 45 % das mortes por doenças do coração, enquanto a alta relação de ω6:ω3 pode aumentar o risco de doenças inflamatórias (Russo, 2009; Simopoulos, 2002). Nas últimas décadas houve aumento no consumo de ω6, sendo que a relação ω6:ω3 varia de 16:1 a 20:1 em dietas ocidentais (Simopoulos, 2004). Este aumento no

4 consumo de ω6 está sobretudo relacionado com o uso de óleos vegetais (Bhattacharya, Sun, Rahman, & Fernandes, 2007; Calder, 2008). Tabela 1 - Composição de ácidos graxos da H. luteoviridis BE 002 cultivada sob diferentes temperaturas e concentrações de nitrogênio. Temperatura ( C) Nitrogênio (mg L -1 ) Lipídios totais (mg g -1 ) 90,2 ± 0,2 a 63,7 ± 0,2 b 73,5 ± 0,1 ab 80,3 ± 0,5 ab 74,8 ± 0,1 ab 71,2 ± 0,4 b 72,6 ± 0,5 b Ácidos graxos saturados (% Total de ácidos graxos) 14:0 1,4 ± 0,1 ab 1,5 ± 0,1 ab 2,0 ± 0,0 a 0,7 ± 0,1 ab 0,8 ± 0,1 b 1,7 ± 0,0 ab 1,4 ± 0,1 ab 16:0 47,6 ± 0,9 a 42,6 ± 0,2 cd 44,1 ± 0,0 bc 46,6 ± 0,2 ab 44,2 ± 0,7 bc 40,9 ± 1,4 d 44,7 ± 1,8 bc 18:0 2,7 ± 0,3 bc 4,8 ± 0,4 a 4,3 ± 0,4 ab 2,0 ± 0,4 c 2,7 ± 0,8 bc 4,8 ± 0,4 a 4,0 ± 1,0 ab 20:0 0,1 ± 0,0 ab 0,1 ± 0,0 ab 0,2 ± 0,1 a 0,1 ± 0,0 ab 0,1 ± 0,0 b 0,1 ± 0,0 b 0,1 ± 0,0 ab 22:0 0,5 ± 0,0 ab 0,6 ± 0,0 ab 0,7 ± 0,1 a 0,3 ± 0,0 b 0,3 ± 0,1 b 0,5 ± 0,2 ab 0,5 ± 0,2 ab 24:0 0,7 ± 0,0 bc 0,5 ± 0,0 c 1,1 ± 0,0 a 0,4 ± 0,0 d 0,3 ± 0,0 d 1,0 ± 0,3 a 0,8 ± 0,1 b Total 52,9 ± 1,2 a 50,0 ± 0,7 bc 52,2 ± 0,5 ab 50,2 ± 0,7 bc 48,5 ± 0,6 c 49,0 ± 1,2 c 51,4 ± 0,7 ab Ácidos graxos monoinsaturados (% Total de ácidos graxos) 14:1 0,3 ± 0,0 ab 0,4 ± 0,0 ab 0,4 ± 0,0 ab 0,4 ± 0,0 ab 0,4 ± 0,0 a 0,3 ± 0,1 b 0,3 ± 0,1 ab 16:1n-9 2,2 ± 0,5 bc 2,6 ± 0,6 bc 1,6 ± 0,2 c 3,1 ± 0,5 ab 3,8 ± 0,4 a 1,7 ± 0,8 c 2,6 ± 0,9 abc 16:1n-7 0,2 ± 0,0 b 0,3 ± 0,0 ab 0,3 ± 0,0 ab 0,3 ± 0,0 ab 0,4 ± 0,0 a 0,4 ± 0,2 ab 0,2 ± 0,0 ab 18:1n-6 7,2 ± 0,6 ab 5,4 ± 1,1 bcd 4,0 ± 0,2 cd 8,8 ± 0,4 a 7,2 ± 1,6 ab 3,3 ± 0,8 d 6,0 ± 1,2 bc 18:1n-9 2,7 ± 0,0 b 3,2 ± 0,1 b 3,3 ± 0,1 b 2,7 ± 0,1 b 3,0 ± 0,0 b 4,6 ± 0,7 a 2,8 ± 0,2 b Total 12,5 ± 0,1 abc 11,7 ± 1,6 abc 9,6 ± 0,5 c 15,2 ± 0,9 a 14,7 ± 2,1 ab 10,3 ± 2,7 bc 12,0 ± 2,0 abc Ácidos graxos poli-insaturados (% Total de ácidos graxos) 18:2n-6 20,6 ± 0,9 b 21,0 ± 0,2 b 18,8 ± 0,4 c 23,8 ± 0,4 a 25,3 ± 0,2 a 18,5 ± 0,2 c 20,4 ± 0,8 b 18:3n-6 0,4 ± 0,0 cd 0,8 ± 0,2 b 0,7 ± 0,1 bc 0,4 ± 0,0 d 0,6 ± 0,2 bcd 1,1 ± 0,1 a 0,6 ± 0,2 bcd 18:3n-3 8,3 ± 0,2 b 9,5 ± 0,1 b 11,2 ± 0,5 a 5,1 ± 0,5 c 5,5 ± 0,7 c 12,4 ± 1,1 a 8,8 ± 0,7 b 20:4n-6 1,4 ± 0,1 cd 2,3 ± 0,2 bc 2,8 ± 0,1 ab 1,1 ± 0,1 d 1,3 ± 0,2 d 3,8 ± 0,6 a 2,6 ± 0,9 b 20:3n-3 0,2 ± 0,0 a 0,1 ± 0,0 b 0,2 ± 0,0 a 0,1 ± 0,0 ab 0,1 ± 0,0 b 0,2 ± 0,0 ab 0,1 ± 0,0 ab 20:5n-3 1,6 ± 0,0 d 2,7 ± 0,0 ab 1,9 ± 0,0 cd 2,4 ± 0,0 abc 2,7 ± 0,4 a 2,6 ± 0,1 ab 2,2 ± 0,3 bc 22:4n-3 1,2 ± 0,1 a 1,4 ± 0,0 a 1,5 ± 0,1 a 1,3 ± 0,1 a 1,2 ± 0,1 a 1,3 ± 0,2 a 1,3 ± 0,4 a 22:6n-3 0,8 ± 0,1 c 0,5 ± 0,0 d 1,2 ± 0,0 a 0,3 ± 0,0 e 0,2 ± 0,0 e 1,0 ± 0,0 b 0,6 ± 0,0 d Total 34,4 ± 1,31 ab 38,3 ± 0,9 ab 38,2 ± 0,5 c 34,6 ± 0,3 a 36,8 ± 1,7 bc 40, 7 ± 1,7 a 36,8 ± 1,5 bc LA:ALA (ω6:ω3) 1,87 1,71 1,40 2,74 2,79 1,35 1,81 Letras diferentes na mesma linha são diferentes significativamente por teste de Tukey (p<0,05). 4. CONCLUSÃO A composição qualitativa de ácidos graxos foi independente das condições de cultivo. O aumento de nitrogênio no meio de cultivo causou aumento na síntese de EPA. A baixa temperatura induziu o aumento na concentração de AGPI, principalmente na síntese dos ácidos graxos 3. A H. luteoviridis mostrou ser uma fonte importante de ácidos graxos poliinsaturados, apresentando uma baixa relação ω6:ω3.

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