RELAÇÃO ENTRE EXAME ANDROLÓGICO, SOROLOGIA, CULTIVO MICROBIOLÓGICO E PCR DO SEMEN NA BRUCELOSE BOVINA E SUA IMPORTANCIA AO AGRONEGÓCIO

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1 RELAÇÃO ENTRE EXAME ANDROLÓGICO, SOROLOGIA, CULTIVO MICROBIOLÓGICO E PCR DO SEMEN NA BRUCELOSE BOVINA E SUA IMPORTANCIA AO AGRONEGÓCIO Geraldo de Nardi Junior 1, Marcio Garcia Ribeiro 2, Jane Megid 2, Adriana Cortez 4, Fernando Listoni 2, Lília Paulin 3 1 Prof. Dr.Curso de Tecnologia em Agronegócio da Faculdade de Tecnologia de Botucatu, Fatec-Bt (gjunior@fatecbt.edu.br). 2 Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da FMVZ, UNESP, Botucatu, SP. 3 Laboratório de Doenças Bacterianas da Reprodução, do Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Animal do Instituto Biológico de São Paulo, SP. 4 Universidade de Santo Amaro, UNISA, São Paulo. 1 INTRODUÇÃO A brucelose bovina é reconhecida como doença infectocontagiosa causada pela Brucella abortus (B. abortus), caracterizada por manifestações clínicas da esfera reprodutiva e severos prejuízos aos produtores (ACHA; SZYFRES, 2003). Na América Latina, as perdas econômicas devido a brucelose são da ordem de 600 milhões de dólares/ano. No Brasil, os prejuízos com a brucelose em bovinos foram estimados em 100 milhões dólares/ano (FOLHA DE SÃO PAULO, 2000). O produto interno bruto (PIB) do estado de São Paulo é estimado em cerca de 727 bilhões de reais, equivalente a 33,9% do PIB do Brasil. A atividade agropecuária constitui 1,5% desse total, correspondente a 18,7% do PIB agropecuário do país (SÃO PAULO, 2005). O rebanho bovino brasileiro é estimado em 200 milhões de animais (IBGE, 2006). Neste cenário, faz-se importante considerar que o aparecimento de problemas sanitários, como a brucelose, impacta de forma acentuada a unidade produtiva, particularmente a cadeia agroindustrial, restringindo mercados e determinando prejuízos na produção (DIAS et al., 2009).Os sinais clínicos da brucelose estão relacionados principalmente à esfera reprodutiva. Nas vacas, a doença se caracteriza por abortamentos, metrite e retenção de placenta (VASCONCELLOS et al., 1987). Nos touros, a patogenicidade do agente está associada principalmente à infecção das glândulas acessórias e aos testículos (HAFEZ, 1995), manifestada principalmente por vesiculite e, secundariamente, por quadros de orquite e epididimite (RADOSTITS et al., 2007), levando frequentemente os animais infectados a sub e/ou infertilidade (NICOLETTI, 1986). A fertilidade é, inquestionavelmente, uma das mais importantes características de produção a ser considerada, tanto nos sistemas de produção de carne como nos de leite. Economicamente, o mérito reprodutivo é cinco vezes mais rentável para o

2 produtor de bezerros do que o desempenho no crescimento e dez vezes mais significativo do que a qualidade do produto. Esses aspectos ilustram os reflexos da atividade reprodutiva nos criatórios de bovinos (BARBOSA et al., 2005). Ao se considerar o touro isoladamente nos plantéis, conclui-se que a importância da fertilidade do macho individualmente é muito maior do que a de qualquer fêmea, visto que o touro pode se acasalar com número muito maior de fêmeas, na monta natural ou quando se considera a inseminação artificial (BARBOSA et al., 2005). As principais causas de baixa fertilidade ou de infertilidade em touros criados no Brasil - independentemente da constituição genética - são degeneração testicular, maturidade sexual retardada, hipoplasia testicular, espermiogênese imperfeita e imaturidade sexual. Todos esses distúrbios ocorrem como consequência de fatores ligados ao ambiente desfavorável, procedimentos de manejo incorretos, fatores de ordem genética e, principalmente, de origem infecciosa (HAFEZ, 1995; BARBOSA et al., 2005). Pelo exame andrológico completo podem ser detectadas alterações do desenvolvimento do sistema genital, anomalias regressivas, patologias progressivas e alterações inflamatórias, oriundas ou não de doenças infectocontagiosas nos diversos órgãos, bem como distúrbios na libido e na habilidade de cópula. Essas alterações levam tanto à incapacidade de fertilização como de monta, em graus variáveis, determinando quadros de subfertilidade e/ou de infertilidade nos machos dos plantéis (BARBOSA et al., 2005). Considerando o grande rebanho bovino no Brasil, o potencial zoonótico da brucelose, o impacto negativo da doença nos plantéis, o objetivo do presente estudo foi comparar o exame andrológico, as provas sorológicas e o cultivo microbiológico e reação em cadeia da polimerase (PCR) do sêmen de touros criados na região centrooeste do estado de São Paulo e sul do Mato-Grosso do Sul. 2 MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizados no estudo 335 touros em idade reprodutiva (com mais de 3 anos), de diferentes raças ou mestiços, sem sinais aparentes de orquite ou inflamação das glândulas acessórias, provenientes da região centro-oeste do estado de São Paulo e sul do Mato Grosso do Sul. O diagnóstico sorológico foi realizado utilizando as provas do antígeno acidificado tamponado (AAT) corado com rosa bengala, 2-mercaptoetanol (2-ME) e a

3 prova de fixação de complemento (FC), conforme as recomendações do PNCEBT do MAPA (BRASIL, 2009). A prova de fixação de complemento (ALTON, 1988; PAULIN et al., 2002) foi realizada no Laboratório de Doenças Bacterianas da Reprodução, do Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Animal do Instituto Biológico de São Paulo, SP. As demais provas, PCR e Cultivo Microbiológico,foram realizadas no Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública, da FMVZ-UNESP/Botucatu, SP, segundo Alton(1988), Richtzenhain et al. (2002) e Quinn et al. (2005). 3 RESULTADOS E DISCUSSÕES No exame andrológico, somente oito animais (2,38%) foram considerados inaptos para serviços reprodutivos (cinco animais com necrospermia animais 43, 52, 136, 157, e três com azospermia animais 84, 98, 110 Tabela 1). No entanto, esses animais não apresentaram reações nas provas sorológicas e foram negativos no cultivo e PCR. A desqualificação (inaptos) destes oito animais no exame andrológico considerados negativos para brucelose podem ter ocorrido por outras doenças infecciosas da esfera reprodutiva, como causas traumáticas, degenerativas ou genéticas, que alteram a qualidade do ejaculado de touros em idade reprodutiva (HAFEZ; HAFEZ, 2004). Nas provas sorológicas, cinco touros (números 331, 332, 333, 334, 335 Tabela 1) foram reagentes nas provas do AAT. Destes, somente dois (331, 333) foram reagentes no 2-ME. Nenhum destes cinco touros foi reagente à FC e todos os touros supracitados foram considerados aptos no exame andrológico. A localização preferencial da brucela nas glândulas acessórias e testículos nos machos bovinos pode induzir a presença de baixos títulos, ou mesmo a ausência de títulos séricos de Ig em touros infectados, dificultando o diagnóstico da brucelose nos machos bovinos com base em métodos sorológicos convencionais (AGUIAR et al., 2001; RADOSTITS et al., 2007). Casas Olascoaga (1976) afirmou que machos bovinos acometidos por B. abortus podem reagir à infecção mostrando baixos títulos de Ig séricas. Vasconcellos et al. (1987), no Brasil, e Radostitset al. (2007), nos EUA, referiram a possibilidade de ausência de aglutininas séricas anti-brucella abortus em provas convencionais de soroaglutinação em touros da espécie bovina infectados, apesar da presença do micro-organismo no sêmen e glândulas acessórias.

4 Após o cultivo microbiológico das 335 amostras de sêmen foi obtido o isolamento em cinco amostras (1,49%) de colônias sugestivas do gênero Brucella. Estes isolados foram submetidos à caracterização bioquímica pelas provas de catalase, oxidase, urease, citrato e redução de nitrato (ALTON, 1988). E com base nas características morfotintoriais e bioquímicas, as colônias foram classificadas como Brucella abortus (Tabela 1). As amostras reagentes às provas sorológicas foram às mesmas nas quais se obteve o isolamento microbiológico do sêmen. No entanto, estes animais foram considerados aptos a reprodução pelo exame andrológico (touros 331, 332, 333, 334, 335 Tabela 1). Pela técnica de PCR foram detectadas como positivas para B. abortus as mesmas cinco amostras reagentes na sorologia e isolamento no cultivo microbiológico. Estes isolados de B. abortus foram identificados como cepa vacinal,. O isolamento de B. abortus cepa vacinal do sêmen de cinco touros, reagentes nas provas de AAT e 2-ME com soro e plasma seminal, com confirmação molecular da cepa vacinal por PCR, poderia ser justificado pelo fato destes animais possivelmente terem sido vacinados inadvertidamente entre 3 e 8 meses de idade com fêmeas do mesmo plantel. Mesmo após 3 anos ou mais ainda apresentariam títulos vacinais residuais passíveis de detecção na AAT, 2-ME, além de estarem eliminando o agente vacinal pelo sêmen e, ocasionalmente, pela urina (NIELSEN; DUNCAN, 1990). Curiosamente, títulos vacinais em fêmeas bubalinas vacinadas entre 3 a 8 meses de idade negativaram nas provas convencionais de rotina e complementares aos 19 meses de idade (NARDI JUNIOR et al. 2012), mostrando que fêmeas vacinadas declinam os títulos mais precocemente do que os touros, ainda que se não preconize a vacinação de machos com a. Alternativamente, aventa-se que estes cinco touros infectados com B. abortus poderiam ter entrado em contato com a cepa vacinal eliminada por secreções e excreções eliminadas por fêmeas vacinadas no ambiente, ou mesmo por contato direto com fêmeas vacinadas utilizadas na estimulação de touros em centrais de coleta de sêmen. Apesar de B. abortus não causar doença nos touros, o isolamento de cepa atenuada da bactéria do sêmen dos animais representa reflexos em saúde pública, posto que pode representar risco aos profissionais que manipulam o sêmen de touros com finalidade de uso em biotécnicas da reprodução. Duas amostras (touros 13 e 25) foram positivas no PCR e negativas em todas as demais provas, além de serem considerados aptos no exame andrológico (Tabela 1).

5 Estes animais podem estar eliminando baixa quantidade do micro-organismo no sêmen, ou de forma intermitente. Desta forma, não foram identificados no cultivo e são negativos nas provas sorológicas e de plasma seminal, provavelmente devido à localização do agente em glândulas acessórias, com baixa estimulação de resposta humoral nos touros infectados (CASAS OLASCOAGA, 1976; SUTHERLAND, 1980; VASCONCELLOS et al., 1987; GRASSO; CARDOSO, 1998; RADOSTITS et al., 2007). Tabela 1 Exame andrológico, sorologia, reação em cadeia da polimerase e cultivo microbiológico das amostras de soro e sêmen de touros em idade reprodutiva. Botucatu, SP, Identificação Andrológico Sorologia PCR Cultivo AAT 2-ME FC 13 Apto NR NR NR Brucellasp Negativo 25 Apto NR NR NR Brucellasp Negativo 43 Inapto NR NR NR Negativo Negativo 52 Inapto NR NR NR Negativo Negativo 84 Inapto NR NR NR Negativo Negativo 98 Inapto NR NR NR Negativo Negativo 110 Inapto NR NR NR Negativo Negativo 136 Inapto NR NR NR Negativo Negativo 157 Inapto NR NR NR Negativo Negativo 161 Inapto NR NR NR Negativo Negativo 331 Apto Reagente Reagente NR B. abortus cepa B. abortus 332 Apto Reagente NR NR B. abortus cepa B. abortus 333 Apto Reagente Reagente NR B. abortus cepa B. abortus 334 Apto Reagente NR NR B. abortus cepa B. abortus 335 Apto Reagente NR NR B. abortus cepa B. abortus NR=nãoreagente; AAT=antígeno acidificado tamponado; 2-ME=2-mercaptoetanol; FC=fixação de complemento; PCR=reaçãoemcadeia da polimerase 4 CONCLUSÕES A detecção de brucela por PCR no sêmen de animais considerados aptos à reprodução no exame andrológico e negativos no cultivo e em testes complementares utilizando soro incluindo testes exigidos pelo PNCEBT denota séria preocupação em saúde animal. Este achado indica que estes animais podem estar sendo utilizados na monta natural em propriedades, servindo como fontes de infecção nos plantéis. Ainda, o sêmen destes animais pode ser utilizado, legalmente e com fins comerciais, em

6 procedimentos de biotécnicas da reprodução como inseminação artificial e fertilização in vitro, servindo como via de disseminação do patógeno para animais de outros criadores, além dos riscos em saúde pública da manipulação de sêmen contendo brucela com sérios riscos aos profissionais do agronegócio. 5REFERÊNCIAS ACHA, P.N.; SZYFRES, B. Zoonosis y enfermidades transmisiblescomunes al hombre y a losanimales.3.ed. Washington: OrganizaciónPanamericana de la Salud, p ALTON, G.G. TechniquesfortheBrucellosisLaboratory. Paris: IntitutNational de la RechercheAgronomique, 1988, 545p. AGUIAR, D.M.; RIBEIRO, M.G.; BRITO, A.F.; PESSOA, V.M. Soroaglutinação, sêmen plasma aglutinação e exame andrológico no diagnóstico da brucelose em machos bovinos. Arq. Inst. Biol., v.68, n.2, p , BARBOSA, R.T.; MACHADO, R.; BERGAMASCHI, M.A.C.M. A importância do exame andrológico em bovinos. Circular Técnica. São Carlos, SP, p.1-13, BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Departamento de Defesa Animal. Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Bovina. Disponível em: < programa.htm>. Acesso em: 8 jul CASAS OLASCOAGA, R. Diagnósticoserológico de labrucelosis. Zoonosis, v.18, p , DIAS, R.A.; GONÇALVES, V.S.P.; FIGUEIREDO, V.C.F.; LOBO, J.R.; LIMA, Z.M.B.; PAULIN, L.M.S.; GUNNEWIEK, M.F.K.; AMAKU, M.; FERREIRA NETO, J.S.; FERREIRA, F. Situação epidemiológica da brucelose bovina no Estado de São Paulo. Arq. Bras. Med. Vet. Zoo.v.61, supl.1, p , FOLHA DE SÃO PAULO. Jornal a folha de São Paulo. Disponível em Acesso em 02 de setembro de GRASSO, L.M.P.S.; CARDOSO, M.V. Brucelose bovina. Biológico, v.60, p.71-79, HAFEZ, E.S.E. Reprodução animal. São Paulo: Manole Ltda. p.3-20, HAFEZ, E.S.E; HAFEZ, B. Reprodução animal. 8.ed. São Paulo, 2004, 583p. IBGE. Censo agropecuário Rio de Janeiro, Disponível em: < Acessado em: 14 fev SÃO PAULO. Fundação Sistema Estadual de Análise de Dados. Produto interno bruto do Estado de São Paulo. São Paulo, Disponível em: < Acessado em: 14 fev NARDI JUNIOR, G. ; RIBEIRO, M. G. ; JORGE, A.M. ; MEGID, J. ; Paulin, L..Serological Profile of Buffalo (Bubalusbubalis) Female Calves Vaccinated with Standard Brucellaabortus Strain 19 Vaccine using Rose Bengal, 2-Mercaptoethanol and Complement Fixation Tests. Biologicals (London. Print), v. 40, p , NICOLETTI, P. Brucellosis on bovine reproductive efficiency. In: MORROW, D.A. Current therapy in theriogenoly. Philadelphia: W.B. Saunders, p NIELSEN, K.; DUNCAN, J.R. Animal brucellosis. Boca Raton: CRC Press, p. PAULIN, L.M.S.; PRADO, G.E.S.; FEDERSONI, I.S.P.; TEIXEIRA, A.C.; CASTRO, V.; GENOVEZ, M.E. Estudo comparativo dos testes 2-mercaptoetanol e reação de fixação do complemento no sorodiagnóstico da brucelose bovina. Arq. Inst. Biol., v.69, p.41-47, QUINN, P.J.; CARTER, M.E.; MARKEY, B.; CARTER, G.R. Clinical veterinary microbiology.london: Wolfe, p , RADOSTITS, O.M.; GAY, C.C.; HINCHCLIFF, K.W.; CONSTABLE, P.D. Veterinary medicine: a textbook of the diseases of cattle, horses, sheep, pigs, and goats. 10.ed. Philadelphia: W.B. Saunders, p. RICHTZENHAIN, L. J.; CORTEZ, A.; HEINEMANN, M. B.; SOARES, R. M.; SAKAMOTO, S. M.; VASCONCELLOS, S. A.; HIGA, Z.M.M.; SCARCELLI, E.;GENOVEZ, M. E. A multiplex PCR forthedetection ofbrucellaspp and Leptospiraspp DNA fromabortedbovinefetuses. Veterinarymicrobiology, v.87, n.2, , SUTHERLAND, S.S. Immunology of bovine brucellosis. Vet. Bull., v.50, p , VASCONCELLOS, S.A.; ITO, F.H.; CÔRTES, J.A. Bases para a prevenção da brucelose animal. Comun.Cient. Fac. Med. Vet. Zootec.USP, v.11, p.25-36, 1987.

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