Nesta aula prática serão utilizados alguns reagentes, com as seguintes finalidades:

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1 Universidade Estadual de Londrina Centro de ciências biológicas Departamento de ciências fisiológicas Disciplina de Biofísica - Aula prática Difusão de moléculas através da membrana de diálise. Introdução Difusão é a movimentação de uma população de partículas de um local para outro por deslocamento aleatório individual. Em solução, todas as partículas presentes estão em constante movimento aleatório, sendo que seu deslocamento é dependente da temperatura e do seu peso molecular. A rota percorrida por cada partícula é alterada quando há choque entre elas. Apesar de o movimento individual de partículas ser de direção aleatória, podemos avaliar se existe movimentação preferencial de uma população de partículas de uma região para outra dentro de uma solução. Para tanto, analisamos o fluxo de partículas, que indica o número de partículas que atravessa uma determinada área em um período de tempo definido. Segundo a primeira lei de Fick, o fluxo (J) de uma determinada molécula é diretamente proporcional à área observada (A), à diferença de concentração da substância entre as áreas observadas (dc), e ao coeficiente de difusão, que leva em consideração o peso molecular, a temperatura da solução, a estrutura química da molécula (solubilidade, p.ex.) e a natureza da solução, enquanto que a distância a ser percorrida pelas partículas (dx) tem relação inversa com o fluxo. A diferença de concentração determinará a direção do fluxo, que será sempre da região de maior concentração para a região de menor concentração. Notas Nesta aula prática serão utilizados alguns reagentes, com as seguintes finalidades: O amido consiste de duas grandes moléculas que reagem diferentemente a presença de iodo. A α-amilose consiste de longas cadeias insolúveis em água, que formam micelas hidratadas que, na presença de iodo, resultam na coloração azul. Amilopectina é uma molécula ramificada e forma soluções tanto coloidais quanto micelares, e na presença de iodo gera a coloração vermelho-violeta. A α-amilose pode ser hidrolisada pela α-amilase, enzima presente na saliva, gerando maltose e maltotriose, que são moléculas pequenas. α-amilase não consegue atacar os pontos de ramificação da amilopectina, gerando como produto da hidrólise a isomaltose e um produto grande e altamente ramificado, a dectrina-limite. A solução de AgNO 3 revela os íons cloreto, formando um precipitado branco (o cloreto de prata). A solução de Fehling ou Benedict revela a maltose, gerando uma coloração vermelho tijolo. A membrana de celofane possui poros de diferentes tamanhos e restringe a passagem de algumas substâncias, sendo por isso utilizada como modelo de membrana semipermeável.

2 . Técnica:.. Mergulhe a folha de celofane em água destilada por 5 minutos. Faça um saquinho com o celofane e coloque no seu interior 0 ml de solução de NaCl %, 0 ml de amido e ml de saliva. Amarre-o com linha. Coloque-o em um Becker e adicione uma quantidade mínima de água destilada, o suficiente para cobrir todo o saco de celofane. Marque o tempo inicial... Tome tubos de ensaio: no primeiro, coloque ml de solução de amido % e gota de solução de lugol. Ao segundo, coloque ml de solução de NaCl % e 3 gotas de solução de AgNO 3. Observe e anote os resultados..3. Após 5 minutos, tome 3 tubos. Adicione a cada tubo ml do líquido de diálise. Ao º adicione gota de lugol, ao º, 3 gotas de AgNO 3 e ao terceiro ml do reativo de Benedict ou Fehling. O último tubo deve ser aquecido até ebulição..4. Repetir a mesma operação aos 30 minutos. Com o dialisado e com o conteúdo do saquinho. 3. Responda: a. O que você pode concluir sobre o tamanho dos poros da membrana de celofane? b. Qual o mecanismo de passagem do cloreto para o meio exterior ao saquinho de diálise? c. Quais são os requisitos para que uma substância atravesse a membrana através da porção lipídica ou por canais iônicos?

3 Universidade Estadual de Londrina Centro de ciências biológicas Departamento de ciências fisiológicas Disciplina de Biofísica - Aula prática Difusão através da membrana celular. Introdução: A membrana plasmática de praticamente todas as células é bastante permeável à água. Nesta aula, analisaremos alguns fatores que determinam o fluxo de água através da membrana de eritrócitos. O movimento de água chamado de osmose ou fluxo osmótico compreende o movimento natural das moléculas de água de uma solução com maior concentração de água livre para outra com menor concentração de água livre. Nas soluções do organismo, a presença de certos sais e outras moléculas em um fluído reduz a concentração de água livre. O movimento da água para o compartimento que contém maior concentração de sais cria uma pressão hidrostática devido ao aumento de volume nesse compartimento. A pressão hidrostática necessária para impedir o fluxo osmótico de água em determinada solução é chamada de pressão osmótica. A magnitude da pressão osmótica está relacionada à concentração de partículas dissolvidas. A pressão osmótica de uma solução ideal de não-eletrólitos é diretamente proporcional à soma das concentrações molares de todos os seus solutos. Soluções ideais de mesma osmolaridade são isosmóticas. Tendo soluções ideais de concentrações molares diferentes, a que possui maior concentração molar é considerada hiperosmótica em relação à outra, a hiposmótica. A tonicidade é uma fração da pressão osmótica total de uma solução, quando ela se encontra em contato com uma membrana semipermeável, assim como também é semipermeável a membrana celular. A membrana celular, por exemplo, permite a passagem de água e de alguns solutos, mas não de todos. Assim, a pressão osmótica a que a membrana celular está exposta se refere aos solutos impermeantes à membrana. Logo, a tonicidade de uma solução não depende exclusivamente da concentração molar dessa solução, mas também da permeabilidade da membrana que separa essa solução de outra. Os fluídos do organismo humano possuem, em sua maioria, por volta de 0,30 osmóis por litro. Se um soluto não pode atravessar a membrana (impermeante), qualquer alteração na sua concentração produzirá um gradiente de concentração através da membrana, conduzindo a um fluxo resultante de água para dentro ou para fora da célula, o que acarretará em modificação do volume celular. Somente os solutos não permeantes é que podem alterar o volume celular no longo prazo, acarretando uma mudança de concentração de água livre através da membrana. Solutos que se movimentam passivamente apenas pela membrana tendem a alcançar o equilíbrio e, portanto não tem efeito sobre a osmose. No caso das hemácias, quando existe aumento do seu volume a aproximadamente o dobro, esta hemolisa (hemólise osmótica).

4 . Protocolo experimental Hemólise osmótica a) Coloque numa estante 7 tubos de ensaio. b) Coloque em cada tubo ml de solução de NaCl de seguintes molaridades : 0,6; 0,; 0,0; 0,08; 0,06; 0,04; 0,0. c) Adicione gota de sangue, agite suavemente por poucos minutos e deixe a suspensão em repouso por 0 minutos. d) No fim deste período, agite os tubos novamente e analise os resultados. Determine o limite da fragilidade de membrana celular, isto é, a menor concentração salina na qual ocorre hemólise. Analise o grau de hemólise pelo grau de transparência da suspensão. Hemólise osmótica e não-osmótica: a) Coloque numa estante 5 tubos de ensaio; b) Adicione 5 ml das seguintes soluções, respectivamente: 0,6 M de NaCl; 0,3% de saponina; 0,3% de saponina em 0,6M de NaCl; 0,3M de uréia em 0,6 M de NaCl; 0,3 M de uréia. c) Adicione gota de sangue a cada um dos tubos, agite suavemente e deixe em repouso por 0 minutos. d) No fim deste período, observe o grau de opacidade da suspensão de células. Avalie em qual suspensão ocorreu hemólise. e) Assumindo que qualquer troca de materiais entre eritrócitos e a solução externa não altere expressivamente a composição do meio externo, analise a direção do movimento de água para cada um dos tubos. 3. Questões para discussão 3.. O que significa hemólise parcial e porque ela ocorreu? 3.. Qual a diferença entre hemólise osmótica e não osmótica? Em quais tubos ocorreram? 3.3. Por que não houve hemólise na solução hiperosmótica de uréia e NaCl? 3.4. Por que houve hemólise na solução hiperosmótica de uréia?

5 . Introdução: Universidade Estadual de Londrina Centro de ciências biológicas Departamento de ciências fisiológicas Disciplina de Biofísica - Aula prática Equilíbrio de Donnan Consideramos o sistema constituído por dois compartimentos separados por uma membrana impermeável a proteínas, porém permeável a pequenos íons. Como as proteínas em solução apresentam cargas elétricas, conforme o ph da solução, sua presença em apenas um dos compartimentos do sistema alterará a distribuição final dos íons difusíveis, e a pressão osmótica das soluções, o que é denominado efeito Donnan. Para compreender a origem desse fenômeno, suponhamos a seguinte situação inicial e final: Membrana semi-permeável Compartimento Compartimento 5 P - 0 A - 5B + 0B + t Compartimento 5 P - 4 A - 9B + Compartimento 6 A - 6B + onde: *[P - ] = concentração do ânion não-difusível *[A - ] = concentração do ânion difusível *[B + ] = concentração do cátion difusível * Os compartimentos têm paredes rígidas e o sistema é fechado. Se não existisse o íon não-difusível P -, os cátions e ânions difusíveis atravessariam a membrana segundo o seu gradiente de concentração até atingir o equilíbrio de difusão. Devido a impermeabilidade ao ânion P -, não se produz a equipartição dos íons difusíveis, pois é necessário que se estabeleça a eletroneutralidade das soluções. Assim, o sistema após ter alcançado o equilíbrio apresentará as seguintes características... Eletroneutralidade O número total de cargas negativas deve ser igual ao número de cargas positivas em cada um dos dois compartimentos. Portanto: P - + A - = B +, no compartimento A- = B +, no compartimento No compartimento, o cátion B + deve achar-se em maior concentração que no compartimento, porque deve neutralizar os ânions P - e A -... Equilíbrio eletroquímico de todos os íons difusíveis Na situação do Equilíbrio de Donnan, existe um gradiente de concentração para cada espécie de íons difusível. Esse gradiente é de direção oposta por cátions e ânions. Assim, a condição de equilíbrio não pode ser especificada apenas em termos de concentrações químicas, visto que os gradientes de concentrações individuais resultariam em distribuição igual de íons difusíveis através da membrana. Os

6 gradientes de concentração para íons difusíveis existentes no equilíbrio devem ser, portanto, neutralizados por força impulsora de mesma intensidade e oposta. Essa força é um potencial de equilíbrio gerado pela distribuição desigual de íons difusíveis através da membrana. Quando o sistema entrar em equilíbrio, o potencial de equilíbrio deverá ser igual para cada íon difusível. Isto significa que podemos aplicar a equação de Nernst para cada íons difusível do sistema (veja anexo para demonstração), de forma que no equilíbrio teremos que o produto das concentrações dos íons difusíveis em cada lado da membrana serão iguais: A. B = A B. Assim, é estabelecida uma diferença de potencial através da membrana tal que o compartimento que contém o ânion não difusível é eletronegativo em relação ao outro. Por outro lado, em sistemas biológicos, existe a presença de transporte ativo nas membranas celulares, o que determina as distribuições iônicas entre o interior e o exterior da célula.. Protocolo experimental O protocolo experimental a seguir será utilizado para estudo do efeito de um íon não-difusível exerce sobre a distribuição de íons difusíveis em uma membrana semipermeável. 3. Técnica 3.. Coloque 50 ml de água destilada no Becker e ml de indicador de bromofenol. Junte HCl 0,N gota a gota até atingir a coloração amarela, sendo que a solução ficará primeiramente esverdeada. Em seguida, adicione NaOH 0,N gota a gota até a coloração esverdeada novamente. 3.. Retire 0 ml de alíquota do Becker e deixe para posterior comparação. Verificar o volume restante Coloque 50 ml de solução de gelatina % no Becker e ml de indicador azul de bromofenol. Adicione HCl 0,N até a coloração semelhante da solução contida no Becker. As duas soluções terão aproximadamente o mesmo ph Retire do Becker um volume de forma que se igualem os volumes dos Becker e. Esse volume retirado do Becker deverá ser guardado para posterior comparação Coloque a solução de gelatina do Becker em um saco de celofane (igual a prática de diálise) e coloque no Becker. Agite periodicamente Observe a modificação da cor das soluções comparando com os dois tubos controle. Analise os resultados. Nota: indicador de bromofenol ph = 3,0 amarelo ph = 4, verde ph = 4,6 azul ponto isoelétrico da gelatina = 4,8 4. Questões para discussão a. O que é ponto isoelétrico de um aminoácido ou proteína? b. Por que houve no Becker com gelatina uma necessidade de maior adição de HCl para tornar verde a solução? c. Por que houve mudança do ph das soluções? Explique d. Defina: equilíbrio de Donnan. e. Em uma célula viva normal, o equilíbrio de Donnan é atingido? Explique.

7 Anexo Para cátions difusíveis RT B E B =.ln = ZF B RT B.ln F B + ; quando Z=+ Para ânions difusíveis RT A E A =.ln = ZF A RT A.ln F A ; quando Z=- No equilíbrio teremos E E B + = A RT B.ln F B = RT F.ln A A B A = B A A. B = A. B 3

8 Universidade Estadual de Londrina Centro de ciências biológicas Departamento de ciências fisiológicas Disciplina de Biofísica - Aula prática Determinação colorimétrica do ph. Efeito tampão: Uma ideia aproximada do ph de uma solução pode ser obtida usando indicadores. Estes são compostos orgânicos de origem sintética ou natural cujas cores são dependentes do ph. Indicadores são geralmente ácidos fracos que dissociam em solução: H. ln H+ + In- O ph de uma solução do indicador é dado pela equação: ( In ) ph = pkin + log ; sendo que o indicador exibe sua cor intermediária ( H. In) quando a razão (In)/(H.In) = e o ph = pk In. O intervalo mais eficiente para um determinado indicador é aproximadamente de duas unidades de ph, isto é: pk in ±. Para determinar o ph de uma solução, adicionam-se algumas gotas de solução de indicador e compara-se a cor obtida com a cor de uma série de tampões de ph conhecido e contendo a mesma quantidade de indicador. Indicadores universais são misturas de vários indicadores, a fim de abranger um intervalo mais amplo de ph. Por exemplo, segue o protocolo para preparo de uma solução de um indicador universal que abrange a faixa de ph 3 até : laranja de metila : 0,05g vermelho de metila : 0,5g azul de bromotinol : 0,30g fenolftaleína : 0,35g álcool etílico a 66% : litro azul 0... violeta ou mais... púrpura ph Cor 3 ou menos... vermelho 4... alaranjado 5... laranja 6... amarelo 7... verde amarelado 8... verde azulado

9 Aplicação prática Reagentes: Tampões de ph = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 0. Indicador universal NaOH 0,N HCl 0,N Técnica:. Preparar uma bateria de 8 tubos de ensaio. Adicionar ao primeiro tubo ml de solução tampão ph = 3, no segundo tubo ml de solução ph = 4 e assim sucessivamente até o tampão de ph = 0. Adicionar a cada tubo 9 ml de H O destilada e ml do indicador universal. Esta bateria irá construir a escala padrão de ph.. Preparar outra bateria de 4 tubos de ensaio e numerá-los de a 4. Adicionar ml do indicador universal a cada tubo. 3. Aos tubos e 3 adicionar 0 ml de H O destilada. 4. Aos tubos e 4 adicionar ml de solução tampão ph = 7 e 9 ml de H O destilada. 5. Adicionar gota de NaOH 0,N aos tubos e. Observar e determinar o ph. 6. Adicionar aos tubos 3 e 4 uma gota de HCl 0,N. Observar mudança de coloração e determinar o ph. 7. Continuar a adição de HCl ao tubo 4, gota a gota. Quantas foram adicionadas até que se obtenha a mesma coloração do tubo 3 da escala? Explicar.

10 3 Universidade Estadual de Londrina Centro de ciências biológicas Departamento de ciências fisiológicas Disciplina de Biofísica - Aula prática Medida de tensão de CO. Introdução: A difusão de um gás ocorre pela tendência que suas moléculas apresentam em passar de um ponto de maior pressão para outro ponto de pressão menor, distribuindo-se por todo espaço disponível. Cada gás de uma mistura exerce pressão de acordo com sua própria concentração, independentemente da pressão de outros gases. Este estudo permite avaliar como se dá a passagem dos gases respiratórios dos alvéolos para o sangue capilar, dos capilares para os alvéolos, do sangue para os tecidos ou do tecido para o sangue. Quando um gás é colocado em contato com uma superfície líquida, as moléculas gasosas bombardeiam a superfície do líquido e passam para o seu interior, que depende da solubilidade desse gás no meio líquido. Contudo, as moléculas gasosas dissolvidas também tendem a escapar do líquido. No equilíbrio, a velocidade com que as moléculas escapam do líquido é a mesma com que elas penetram no interior do mesmo, estabelecendo, portanto, uma concentração constante de gás na fase líquida. A pressão parcial ou tensão de um gás dissolvido em um líquido é a pressão exercida pelo gás dentro da fase líquida, ou seja, é a mesma pressão que o gás tem na fase gasosa quando em equilíbrio com a fase líquida. A velocidade de difusão de um gás em um líquido depende de vários fatores, como diferença de pressão, solubilidade do gás no líquido, temperatura, área de secção transversal do líquido, distância através da qual o gás deve se difundir e peso molecular do gás.. Protocolo experimental: Para se avaliar a tensão aproximada de CO no ar expirado, utilizaremos nesta prática um sistema fechado contendo bicarbonato em concentrações variadas, de modo que o ar expirado, quando em contato com a solução de bicarbonato, formará ácido carbônico e bicarbonato, com consequente alteração do ph da solução. A mudança de ph dependerá da pressão parcial de CO no ar expirado, visto que esta pressão determinará a quantidade de CO dissolvido na solução de bicarbonato. O protocolo utilizado será o seguinte: a) Tubo : 0 ml de NaHCO 3 0,04M; b) Tubo : 5 ml de NaHCO 3 0,04M e 5ml de H O destilada (solução de NaHCO 3 0,03M); c) Tubo 3: 0 ml de NaHCO 3 0,04M e 0ml de H O destilada (solução de NaHCO 3 0,0M); d) A cada um dos 3 tubos foi adicionado ml de indicador universal. e) Os tubos serão fechados. Montado o sistema, o aluno deve assoprar pelo tubo de borracha (de entrada) até observar mudança de coloração nos 3 tubos. Comparar cada um deles com a bateria de tampões e identificar o ph. 3

11 4. Dados: a. A equação de Henderson-Hasselbalch descreve o comportamento do ph de uma solução que contém um ácido ou base fraca e seus respectivos sais, ou seja, uma solução tampão: [ HCO3 ] ph = pk + log -> pk = 6, [ CO ] b. Lei de Henry: a quantidade dissolvida de um gás em solução é diretamente proporcional a pressão parcial do gás: [ CO] = β PCO c. Coeficiente de solubilidade ou coeficiente de absorção: define a solubilidade de um gás em solução. α = coeficiente de absorção volumétrico: (em l/atm) α H O = 0,57 l/atm α plasma = 0,5 l/atm β = coeficiente de absorção molar (em mmoles/mmhg β H O = 0,033 mmoles/mmhg β plasma = 0,03 mmoles/mmhg 3. Calcule: a. A tensão de CO nos tubos, e 3. b. A [CO ] no sangue venoso, sabendo que a PCO = 46 mmhg c. A [CO ] no sangue arterial, sabendo que a PCO = 40 mmhg. 4

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