QUANTIFICAÇÃO HISTOMORFOMÉTRICA 2D A PARTIR DE TOMOGRAFIA COMPUTADORIZADA 3D

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1 QUANTIFICAÇÃO HISTOMORFOMÉTRICA 2D A PARTIR DE TOMOGRAFIA COMPUTADORIZADA 3D Inayá Lima, José Marcos Alves*, Luis Fernando de Oliveira, Ricardo Tadeu Lopes, Edgar Francisco O. de Jesus Laboratório de Instrumentação Nuclear - COPPE/UFRJ, C.P , Rio de Janeiro - RJ *Escola de Engenharia de São Carlos - USP, São Carlos SP RESUMO Neste estudo são mostrados resultados preliminares do uso da técnica de microtomografia computadorizada tridimensional (3D-µCT) para a caracterização de tecido ósseo, através de quantificação histomorfométrica que está baseada em conceitos de estereologia. Foram utilizadas duas a- mostras de calcâneo humano, sendo as mesmas devidamente preparadas para serem submetidas a aquisição tomográfica. O sistema utilizado para a realização das microtomografias ósseas foi um sistema radiográfico de um tubo de raios X microfoco. Através destes processos de aquisição, reconstrução e quantificação foi possível obter resultados animadores e coerentes com os obtidos na literatura, o que leva a realização futura de comparação dos mesmos resultados com o método convencional, ou seja, histomorfometria convencional. Keywords: X ray, microtomography, histomorphometry, trabecular bone, bone anysotropy. I. INTRODUÇÃO Neste estudo são mostrados resultados preliminares do uso da técnica de microtomografia 3D por raios X (µct) para a visualização de calcâneo humano visando a quantificação do mesmo. Esta técnica tem sido utilizada em estudos de diversas estruturas complexas, tais como: filtros cerâmicos, estruturas em trelissa e materiais porosos em geral, ou seja, estruturas internamente conectadas, em especial amostras ósseas trabeculares. A arquitetura tridimensional do osso trabecular é composta de placas ou bastões ósseos interconectados. Com a técnica mencionada acima, propõe-se investigar a microestrutura tridimensional do osso trabecular em amostras de calcâneo de pequena dimensão com base em conceitos de estereologia e morfologia matemática. Os parâmetros medidos da microestrutura são a fração de volume ósseo (BV/TV), relação entre superfície e volume ósseo (BS/TV), número de trabéculas (Tb.N), separação entre trabéculas (Tb.Sp), espessura de trabéculas (Tb.Th) e anisotropia. Este conjunto de parâmetros constitui a base para a análise histomorfométrica. A quantificação é realizada a partir das seções transversais reconstruídas pela microtomografia tridimensional. A visualização tridimensional auxilia na compreensão dos parâmetros espaciais: conectividade e anisotropia. Este trabalho apresenta a seguir, os tópicos relacionados a apresentação do sistema de tomografia, ao processo de aquisição e reconstrução, metodologia de obtenção dos dados tomográficos e dos histomorfométricos bem como a análise dos mesmos. II. SISTEMA TOMOGRÁFICO Para a microtomografia computadorizada tridimensional, cujo princípio de obtenção das projeções radiográficas está esquematizado na Fig. 1, utilizou-se um sistema de raios X FEIN FOCUS (Fig. 2) do Laboratório de Instrumentação Nuclear (LIN) que possui um sistema de radiografia em tempo real com tubo de raios X microfoco cujo tamanho focal é de 60 (±5%) µm, e dispositivos eletromecânicos que viabilizam vários graus de liberdade com relação à movimentação e posicionamento do corpo de prova, bem como o ajuste do fator de magnificação da i- magem a ser capturada. Figura 1. Esquema da obtenção das projeções 2D. O feixe de raios X gerado pelo sistema é cônico e por isso é utilizado um intensificador de imagem de 9 de diâmetro para converter os fótons de raios X em fótons de

2 luz que podem ser capturados por uma câmera de vídeo. O sistema de movimentação e posicionamento do corpo de prova e de captura de imagens foram remotamente controlados por um microcomputador Pentium III-833MHz com 128MB de memória RAM Escalonamento das projeções 2D R β (p,ζ). R D so ( p, ζ) = R ( p ζ) β β, Dso + ζ + p Filtragem das projeções 2D (já escalonadas) utilizando o filtro h(p), aplicada a cada linha das projeções. Q ( p, ζ) = R ( p ζ) h( p) β β, Retroprojeção de cada projeção 2D (já escalonadas e filtradas) no volume de reconstrução. ~ f ( t, s, z) π D so Dsot Dso z = Qβ β ( ), d D s Dso s Dso s so IV. METODOLOGIA Figura 2. Desenho esquemático do sistema de microtomografia. O sistema apresentado na Fig. 2 opera num intervalo de tensão que varia de 40 a 160 kv de tensão e corrente de 0 a 1 ma. III. PROCESSO DE RECONSTRUÇÃO 3D IV.1. OBTENÇÃO DOS DADOS TOMOGRÁFICOS Neste trabalho utilizaram-se três amostras cilíndricas de osso trabecular retiradas de calcâneos humanos limpos e desidratados entituladas por R92, L32 e R97, com altura de 1,6 cm, conforme Fig. 3. Estas amostras são originárias de cadáveres com idade desconhecida, doadas pela Empresa OrthoLogic Corp., após sua utilização em estudos anteriores [2], cujo processo de obtenção se encontra descrito na referência [3]. O algoritmo de reconstrução tridimensional implementado no LIN está baseado no algoritmo de Feldkamp [1] e consiste de três passos básicos: escalonamento, filtragem e retroprojeção. Matematicamente, estes estágios podem ser descritos como se segue, sendo que na Tabela 1 estão as definições das variáveis utilizadas. TABELA 1. Definição e variáveis do processo de reconstrução. D so é a distância entre a fonte de raios X e o centro de rotação. p e ζ são os eixos horizontal e vertical do plano de projeção. R β (p,ζ) e R β (p,ζ) são as projeções bidimensionais antes e depois do escalonamento. é o filtro usado no processamento h(p) da projeção bidimensional depois do escalonamento. Q β (p,ζ) é o resultado da convolução. são as coordenadas do espaço tridimensional onde os dados são t, s e z retroprojetados. ~ é a função reconstruída. f ( t, s, z) Figura 3. Amostra óssea retirada do calcâneo humano. Os parâmetros utilizados para a realização das microtomografias encontram-se especificados a seguir, na Tabela 2. TABELA 2 - Parâmetros microtomográficos. Amostra Tensão (kv) Corrente (ma) Nq Np M R , ,98 R , ,9 L , ,9 Com Nq representando o número de quadros, Np o número de projeções e M o fator de magnificação utilizados.

3 A partir de então, através do programa Reconv, desenvolvido no LIN, deu-se a reconstrução das microtomografias e, posteriormente sua visualização 3D utilizando o software comercial. 3D Doctor (versão de demonstração disponível na Internet) [4]. A apresentação destes dados se encontra na seção V. IV.2. OBTENÇÃO DOS DADOS HISTOMORFOMÉ- TRICOS Os parâmetros levantados neste trabalho se baseiam em princípios de estereologia, que estuda estruturas tridimensionais de amostras bidimensionais [5]. Estes podem se dividir em primários e derivados. Os primários consistem de dois: razão do volume de tecido ósseo sobre volume total da amostra (BV/TV - %) e o número de trabéculas ósseas, por milímetro de tecido, sendo também um índice que expressa a densidade trabecular (TbN 1/mm), dados por [6]: apresenta qualquer direção preferencial nas orientações de suas conexões. Além do programa de reconstrução tomográfico, o LIN confeccionou também um outro programa, chamado HST, que segue o procedimento anteriormente referido para o cálculo dos parâmetros histomorfométricos. Os dados de entrada do programa HST são: tamanho do pixel no detector, magnificação utilizada na aquisição das imagens e as microtomografias realizadas. A partir deste momento, torna-se possível os efetivos cálculos para a quantificação óssea necessária. V. RESULTADOS As Figs. 4 e 5 apresentadas a seguir, fornecem visualizações tri e bidimensionais, de diferentes seções, das amostras ósseas mencionadas na seção IV. BV = Pp TV (1) TbN = Pl (2) Tem-se que Pp é a fração de pontos que se encontram dentro do osso e Pl é o número de interseções de linhas de teste com a interface entre tecido "mole" e osso, dividido pelo comprimento total de linhas de teste. A partir desses parâmetros pode-se obter os ditos derivados, e são eles: razão da superfície do osso contra o volume do mesmo (BS/BV), em %, espessura trabecular (Tb.Th), dado em mm, e separação trabecular (Tb.Sp), geralmente dado em mm. Eles podem ser calculados através das seguintes equações: (a) (b) Figura 4. Microtomografia da amostra óssea L32 com visualizações 3D (a) e 2D (b). BS 2Pl = (3) BV Pp 2 Pp TbTh = = (4) BS Pl BV TbSp 1 1 Pl = TbTh = (5) TbN Pp A partir dos dados microtomográficos, pode-se ainda obter um outro parâmetro histomorfométrico chamado anisotropia. Dentro do contexto de tecido ósseo, a anisotropia está relacionada às propriedades biomecânicas do osso, e quando este parâmetro é incorporado na análise da resistência óssea, eleva para 95% o entendimento da variação da mesma. Uma estrutura é dita anisotrópica se ela ( a ) ( b ) Figura 5. Microtomografia da amostra óssea R92 com visualizações 3D e 2D.

4 TbN (1/mm) 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0, Número de Lâminas Figura 8. Comportamento do parâmetro TbN. ( a ) ( b ) Figura 6. Microtomografia da amostra óssea R97 com visualizações 3D e 2D. Os resultados da quantificação óssea da amostra R97, se encontram a seguir, sendo primeiramente apresentados parâmetros básicos da histomorfometria, ou seja, BV/TV e TbN, nas Fig.s 7 e 8 repectivamente. Posteriormente apresentar-se o comportamento dos parâmetros derivados, isto é, BS/BV (razão da superfície do osso contra o volume do mesmo), TbTh (espessura óssea), TbSp (separação trabecular), nas Figs 9, 10 e 11 repectivamente. BS/BV(1/mm) Número de lâminas Figura 9. Comportamento do parâmetro BS/BV. BV/TV(%) 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 0, Número das Lâminas TbTh(mm) 0,15 0,14 0,14 0,13 0,13 0,12 0,12 0,11 0,11 0, Número de lâminas Figura 7. Comportamento do parâmetro BV/TV. Figura 10. Comportamento do parâmetro TbTh.

5 TbSp(mm) 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1, Número de lâminas Figura 11. Comportamento do parâmetro TbSp. Os resultados do parâmetro anisotropia se encontram apresentados na Fig. 12, dada a seguir. y Os resultados apresentados da Fig. 12 fornecem uma noção sobre as orientações das traves ósseas, na amostra R97. VI. CONCLUSÃO Os resultados obtidos revelam a potencialidade da técnica de microtomografia tridimensional em relação à extração e levantamento dos parâmetros histomorfométricos comparados aos métodos convencionais. Na µct-3d ocorre a otimização do processo de aquisição de dados juntamente com a obtenção de seus resultados. Entretanto, uma limitação deste tipo de técnica é o tamanho focal do tubo de raios X, estando esta diretamente relacionada à resolução espacial das reconstruções. Isto pode ser corroborado analisando-se os resultados obtidos na quantificação óssea. Porém, esta limitação pode ser superada reduzindo-se o tamanho da amostra óssea e consequentemente o fator de magnificação aplicado a microtomografia. A µtc possui diversas vantagens, e dentre todas elas pode-se destacar: (a) z x 1. possuir um tamanho de foco da ordem de micras, que significa possuir um poder de resolução maior que em um raios X hospitalar; 2. ser um ensaio não destrutivo, o que significa que a amostra não é destruída como na histomorfometria convencional; 3. obter a visualização da microestrutura óssea. Quando ocorre a quantificação da arquitetura óssea, e esta é unificada a análise da resistência do osso, tem-se um aumento de aproximadamente 95% no entendimento da variação da massa óssea. Enquanto que, este parâmetro avaliado sozinho, explica somente 65% da resistência. (b) z x Os resultados preliminares obtidos no presente estudo são animadores e estimulam os seus autores a implementação de um algoritmo de quantificação da microestrutura trabecular, cujos resultados deverão ser validados por histomorfometria convencional. As expectativas futuras para a visualização de estruturas complexas, é estender a análise microtomográfica não só para outras amostras ósseas, mas também aplicála a ensaios industriais, tais como filtros cerâmicos, estruturas em trelissa e materiais porosos em geral, ou seja, estruturas internamente conectas. (c) Figura 12 (a), (b) e (c): representação gráfica qualitativa do parâmetro anisotropia nos três planos cartesianos. y AGRADECIMENTOS À CAPES (Coordenadoria do Pessoal de Ensino Superior) que através de recursos do PROAP tem financiado as despesas do intercâmbio científico para a execução deste projeto.

6 REFERENCIAS [1] Feldkamp LA et al. Practical cone beam reconstruction. J Optical Soc Am, 1A: [2] Alves JM. Caracterização de Tecido Ósseo por Ultra- Som para o Diagnóstico de Osteoporose. Tese de Doutoramento, IFSC-USP, [3] MARCOS et al. Microtomografia 3D por Raios X para a Caracterização de Osso Trabecular. Congresso Brasileiro de engenharia Biomédica,2000; [4] [5] UNDERWOOD et al. Quantitative Stereology. Assison-Wesley Publishing Company, USA, 1970; [6] Feldkamp LA et al. The direct examination of threedimensional bone architecture in vitro by computed tomography. J Bone Miner Res, 4(1):3-11, ABSTRACT In the present article, preliminary results are presented showing the application of the tridimensional computerized microtomographic technique (3D-µCT) to bone tissue characterization, through histomorphometric quantification which are based on stereologic concepts. Two samples of human bone were correctly prepared to be submitted to the tomographic system. The system used to realize that process were a radiographic system with a microfocus X-ray tube. Through these three processes, acquisition, reconstruction and quantification, it was possible to get the good results and coherent to the literature data. From this point, it is intended to compare these results with the information due the conventional method, that is, conventional histomorphometry.