Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Ano Lectivo 2011/2012. Unidade Curricular de BIOQUÍMICA I Mestrado Integrado em MEDICINA 1º Ano

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1 Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra Ano Lectivo 2011/2012 Unidade Curricular de BIOQUÍMICA I Mestrado Integrado em MEDICINA 1º Ano ENSINO PRÁTICO E TEORICO-PRÁTICO 5ª AULA PRÁTICA Determinação da concentração das proteínas plasmáticas (proteinémia) Electroforese de proteínas plasmáticas- Interpretação do proteinograma

2 As proteínas As proteínas são polímeros de aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas. Existem 20 aminoácidos diferentes constituintes das proteínas, com uma característica estrutural comum: são alfa-aminoácidos, ie ácidos carboxílicos com um grupo amina ligado ao carbono 2 (ou alfa). Todos os aminoácidos, com exceção da glicina (ou glicocola), podem existir como estereoisómetros D ou L (à semelhança do gliceraldeído). R - C NH 2 COOH Os aminoácidos constituintes das proteínas são L-aminoácidos. Os grupos R conferem aos aminoácidos propriedades características, que dependem do ph da solução. Com base na interacção dos grupos R com a água a ph 7,0, os aminoácidos classificam-se em famílias: Não polares Polares sem carga com carga positiva negativa Os aminoácidos existem como moléculas dipolares e anfotéricas (têm pk e pi característicos). A forma iónica de um aminoácido (ou a carga global de uma proteína) pode ser influenciada pelo ph. O ponto isoeléctrico (pi) é o ph ao qual um determinado aminoácido (ou proteína) é electricamente neutro e existe na sua forma de zwitterião (ião híbrido, com duas cargas opostas). A carga eléctrica a um determinado ph permite a separação de aminoácidos ( e das proteínas) por electroforese ou por cromatografia de troca iónica. O grupo amínico (NH 2 ) dos aminoácidos pode ser identificado por duas reacções químicas importantes: reacção com a ninhidrina e reacção com 1-fluoro-2,4 dinitrobenzeno (FDNB). 1

3 Os aminoácidos aminoácidos. São as cadeias laterais (grupos R) que definem as características de cada um dos Classificação dos vinte aminoácidos constituintes das proteínas, de acordo com as cadeias laterais com cadeia com grupo com com grupos com com grupos iminoácidos alifática hidroxilo enxofre carboxilo ou grupos aromáticos (OH) suas amidas básicos Glicina Serina Cisteína Àcido aspártico Arginina Histidina Prolina Alanina Treonina Metionina Asparagina Lisina Fenilalanina Valina Tirosina Ácido glutâmico Histidina Tirosina Leucina Glutamina Triptofano Isoleucina A ligação peptídica Os aminoácidos ligam-se entre si formando longas cadeias (polipeptídeos). Todos os peptídeos têm um NH 2 terminal e um COOH terminal, excepto alguns peptídeos que têm um grupo terminal cíclico: inóforos (valinomicina), antibióticos (penicilina), hormonas (vasopressina). Os aminoácidos de um peptídeo chamam-se resíduos. A cadeia polipeptídica principal repete-se regularmente, enquanto as cadeias laterais variam, consoante o aminoácido a que pertenciam. A cadeia polipeptídica tem uma determinada direcção: o grupo amina terminal localiza-se à esquerda e grupo carboxilo terminal à direita (Fig. 1). Fig. 1- Estrutura de um dipeptídeo: dois aminoácidos unidos pela ligação peptídica 2

4 Do mesmo modo que os aminoácidos, as proteínas têm comportamento ácido/ base devido à presença de grupos NH 2 e COOH livres. A ligação peptídica é planar e rígida e tem um carácter parcial de dupla ligação. O comprimento da ligação C-N na ligação peptídica é de 1,32 A, isto é, está entre C-N (1,49 A, ligação simples) e C=N (1,27 A, ligação dupla). Os estados estruturais das proteínas 1. Estrutura primária É a estrutura química básica que resulta da sequência dos aminoácidos. Na manutenção desta estrutura são importantes as ligações peptídicas. 2. Estrutura secundária É o arranjo regular da cadeia polipeptídica ao longo de uma determinada dimensão. Na manutenção desta estrutura são importantes as ligações dissulfito e ligações de hidrogénio. A molécula pode arranjar-se em: A. HÉLICE: - hélice α (a mais comum) - Na hélice α, o grupo NH do resíduo n está ligado ao grupo CO do resíduo (n - 4) por uma ligação de hidrogénio. - ribão - hélice 3 - hélice TT B. FOLHA β Este tipo de estrutura é estabilizada por ligações de hidrogénio entre C=O e N-H de cadeias polipeptídicas diferentes, enquanto na hélice α elas se formavam entre aminoácidos da mesma cadeia polipeptídica. Polipeptídeo em folha β pregueada : as cadeias adjacentes numa folha β podem estar orientadas na mesma direcção (folha β paralela) ou em direcções opostas (folha β antiparalela). 3

5 Estrutura terciária Diz respeito ao arranjo das estruturas secundárias no espaço. 4. Estruturas superiores Arranjo das estruturas terciárias em supraestruturas, por ligações de subunidades monoméricas. Nem todas as proteínas exibem esta estrutura. O arranjo das estruturas terciárias é determinado por: - Característica dos resíduos laterais dos aminoácidos polares, apolares, polares com carga, conteúdo em enxofre e comportamento em solução aquosa. - Tipos de ligações intra-moleculares por interacção dos grupos laterais R - Interacção de resíduos hidrofílicos com água. CLASSIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS Holoproteínas: compostas apenas por cadeias polipeptídicas. Heteroproteínas: compostas por uma ou mais cadeias polipeptídicas e uma parte não proteica (grupo prostético): Grupos prostéticos: - Fosfato: fosfoproteínas - Ácido nucleico: nucleoproteínas - Glícido: glicoproteínas - Lípido: lipoproteínas - Pigmento: cromoproteínas - Metais (Cu, Fe, Zn): metaloproteínas 4

6 As proteínas representam cerca de 50% do peso seco das células e desempenham importantes funções em todos os processos biológicos, nomeadamente: 1. Catálise enzimática Quase todas as reacções químicas nos sistemas biológicos são catalizadas por enzimas. Quase todas as enzimas são proteínas. Ex: glicose-6-fosfatase, piruvato desidrogenase. 2. Transporte e armazenamento Pequenas moléculas e iões são transportados por proteínas. Ex: hemoglobina (transporta O 2 no sangue), mioglobina (transporta O 2 no músculo), transferrina (transporta ferro), ferritina (armazena ferro no fígado), ceruloplasmina (transporta cobre). 3. Movimento As proteínas são componentes do músculo. O movimento dos cromossomas na mitose, bem como a propulsão dos espermatozóides, deve-se à acção de proteínas contrácteis. Ex: actina e miosina. 4. Suporte mecânico Resistência à tensão da pele e do osso. Ex: colagéneo. 5. Respostas imunológicas Os anticorpos são proteínas altamente específicas. Defesa contra a infecção e reconhecimento de self-not self. Ex: imunoglobulinas (IgA, IgE). 6. Geração e transmissão do impulso nervoso A maior parte dos receptores são proteínas. Alguns aminoácidos são neurotransmissores. Ex: receptores α e β adrenérgicos. Os aminoácidos glutamato e aspartato. 5

7 7. Controlo do crescimento e diferenciação Algumas hormonas são proteínas. A informação genética traduz-se na sequência proteica. Controlo da informação genética. Factores de crescimento. Hormonas e coordenação da actividade celular. Ex: somatostatina (hormona do crescimento), insulina (hormona hipoglicemiante), hormonas tiroideias, histonas (protecção de informação genética). 8. Manutenção da pressão osmótica - No plasma, a mais importante é a albumina. 9. Tampões de ph - Todas as proteínas. Classificação das proteínas plasmáticas: 1) Proteínas simples - albumina 2) Glicoproteínas A maioria das proteínas plasmáticas faz parte do grupo das glicoproteínas, à excepção da albumina. As proteínas da coagulação e as imunoglobulinas são proteínas plasmáticas importantes na manutenção da homeostase do organismo. As proteínas responsáveis pelo sistema AB0 (A, B, zero) do sangue, e pela histocompatibilidade são glicoproteínas. A porção glucídica da proteína é responsável pelo código de superfície da célula tendo, portanto, influência na regulação do crescimento celular. Alterações de glicoproteínas de membrana estão relacionadas com tumorigénese e neoplasias. 3) Lipoproteínas Estas proteínas têm várias funções no sistema circulatório, transportando lípidos entre os vários tecidos e participando no metabolismo lipídico. Classificam-se pela sua densidade, obtida por ultracentrifugação: HDL, IDL, LDL, VLDL e quilomicra. 6

8 CORRELAÇÕES CLÍNICAS Hiperproteinémia: 1. A relação albumina/ globulina é normal: hemoconcentração 2. A relação albumina/ globulina é anormal: a) aumento de albumina erro técnico b) aumento das globulinas: - ex: síndromes infecciosas, mieloma múltiplo, etc Hipoproteinémia / Hipoalbuminémia: 1. Diminuição de síntese - nutrição / absorção deficiente - malnutrição proteica - insuficiência hepática 2. Aumento da excreção ou degradação - perdas renais: síndrome nefrótica - perdas intestinais: gastroenteropatias exsudativas - perdas cutâneo-mucosas: queimaduras 3. Aumento do volume de distribuição ex: na hiperhidratação Determinação da concentração de proteínas plasmáticas A concentração de proteínas é habitualmente determinada por espectrofotometria de absorção. As proteínas apresentam uma banda de absorção ao nível dos 280 nm (ultravioleta). Para utilização do espectrofotómetro de luz visível recorre-se à utilização de um reagente que permita corar as proteínas presentes numa solução. Um dos reagentes mais frequentemente utilizados é o reagente do biureto. O reagente do biureto é uma solução alcalina de sulfato de cobre (azul) que reage com o biureto (ou biureia) originando um produto arroxeado. Não exite biureia circulante no plasma (apenas ureia).por outro lado, há uma semelhança estrutral entre o biureto e as ligações peptídicas, pelo que compostos que as contenham, como os polipeptídeos e as proteínas dão uma reação do biureto positiva, ie dão origem ao aparecimento de um composto arroxeado em presença do reagnete de sulfato de cobre.. A reacção do biureto é assim específica para as ligações peptídicas e ocorre quando um composto tem pelo menos duas ligações peptídicas, ou seja, a cadeia peptídica deve ter pelo menos três aminoácidos. A cadeia peptídica reage com o cobre do reagente num meio bastante 7

9 alcalino e forma um complexo de cor violeta cuja intensidade de coloração é proporcional à quantidade de proteínas existentes na solução. Existem outros métodos espectrofotométricos que podem ser aplicados, consoante a quantidade de proteína presente na solução (Tabela I). TABELA I- MÉTODOS COLORIMÉTRICOS MAIS FREQUENTES USADOS PARA A QUANTIFICAÇÃO DE PROTEINAS MÉTODO Fundamento λ Sensibilidade Biureto Ligações peptídicas 540 nm Moderada ( µg) Lowry Grupos fenólicos (tirosina e triptofano) 700 nm Elevada ( µg) Bradford Grupos amínicos (NH 3 +) 595 nm Muito elevada (2-5 µg) Em qualquer dos casos há que conhecer o espetro de absorção das proteínas ou dos compostos corados delas derivados de modo a selecionar o comprimento de onda ao qual a absorvância é máxima. Consegue-se assim uma escala mais sensível, ie para uma determinada variação de concentração, a variação de densidade ótica é a máxima. As proteínas plasmáticas estão livres no plasma, sob a forma de dispersão coloidal, não necessitando de prévio tratamento com detergente para a sua quantificação. Pelo constrários, no caso das proteínas membranares, há que libertá-las dos lípidos que constituem as membranas celulares. Para tal é imperativo o uso de um detergente (p.e. dodecil sulfato de sódio, SDS), que separa os constituintes das membranas e desnatura as proteínas, permitindo uma interacção mais eficaz com o reagente de deteção. 8

10 Ano Lectivo 2011/2012 BIOQUÍMICA I 1º Ano PROTOCOLO DE BANCADA - 5ª AULA PRÁTICA Determinação da proteinémia Grupos 1 a 4: 1. Fazer uma curva padrão segundo o esquema: TUBOS Albumina 0,4% H 2 O Reagente do biureto 1 0 ml 2,00 ml 2 ml 2 0,25 ml 1,75 ml 2 ml 3 0,45 ml 1,55 ml 2 ml 4 0,65 ml 1,35 ml 2 ml 5 0,85 ml 1,15 ml 2 ml DO (540 nm) 2. Ler a DO a 540 nm. O tubo 1 deve ser ajustado a zero de absorvância, passando a funcionar como branco, para que a curva padrão passe na origem do gráfico. 3. Preparar as amostras fazendo uma diluição do soro sanguíneo de 20 vezes com soro fisiológico. As amostras devem ser feitas em duplicado e determinada a média. DO (540 nm) 0,5 ml amostra 1,5 ml H 2 O 2 ml reagente 0,5 ml amostra 1,5 ml H 2 O 2 ml reagente média Esperar 10 minutos. 4. Ler a DO a 540 nm. 5. Fazer os cálculos para a determinação da quantidade de proteína no soro sanguíneo (mg/ ml; g/ l), tendo em conta o factor de diluição (20 x). [N g/l]

11 Electroforese de proteínas plasmáticas- Interpretação do proteinograma CONSIDERAÇÕES GERAIS A electroforese é a designação genérica de um método que tem como objectivo a separação e identificação dos constituintes de uma fase sólida com carga, em suspensão numa fase líquida tamponada, quando se lhe aplica um campo eléctrico contínuo. Princípio fundamental As partículas carregadas electricamente deslocam-se num campo eléctrico para o eléctrodo de sinal contrário; iões positivos (catiões) para o cátodo e iões negativos (aniões) para o ânodo. Os aminoácidos, os peptídeos ou as proteínas apresentam carácter anfotérico devido à coexistência, em cada molécula, de funções ácidas (-COOH) e básicas (-NH2). Assim, as substâncias anfotéricas, em meio ácido, comportam-se como bases fracas, captando iões H +, e, em meio alcalino, pelo contrário, actuam como ácidos fracos, libertando protões. Raramente os grupos -NH2 e -COOH existem em número igual na forma livre. Neste caso, é ainda mais raro que estes grupos funcionais sejam ionizados igualmente [pk (COOH) = 2,4 e pk (NH2) = 9-12]. Assim, cada molécula anfotérica possui o seu ponto isoeléctrico característico. O ponto isoeléctrico é o ph em que uma substância não se desloca sob a influência do campo eléctrico, ou seja, é electricamente neutra, (tendo o mesmo número de cargas positivas e negativas). As propriedades do meio líquido são essenciais na separação electroforética: o ph, a força iónica, a viscosidade, a constante dieléctrica, a temperatura, conjugam as suas acções para conferir à espécie molecular que se pretende separar, a mobilidade electroforética dependente do campo eléctrico do meio tamponado. A carga eléctrica das proteínas do soro depende do ph do meio. Se o ph é superior ao ponto isoeléctrico, a proteína fica com carga negativa e migra para o ânodo, mas se o ph é inferior ao ponto isoeléctrico, a proteína é carregada positivamente e migra para o cátodo. A velocidade de migração das proteínas na electroforese é directamente proporcional à sua carga eléctrica e inversamente proporcional ao seu peso molecular. A deslocação das partículas é ainda influenciada pela força iónica do meio (número de iões do meio) e pela temperatura. Deste 1

12 modo, numa electroforese mantêm-se constantes o ph e a força iónica do meio, através de uma solução tampão. MODALIDADES DE ELECTROFORESE 1) Electroforese livre (de Tiselius), realizada em meio líquido 2) Electroforese de zona ou de suporte, realizada sobre diversos materiais de suporte: a) Papel de filtro b) Agarose c) Acetato de celulose d) Gel de amido e) Poliacrilamida Electroforese de zona Na electroforese de zona, utilizada em bioquímica clínica, a fase aquosa é estabilizada sobre um suporte poroso impregnado de solução tampão condutora. A maior aplicação deste processo diz respeito ao fraccionamento das proteínas e lipoproteínas séricas e acessoriamente às urinárias e raquidianas. A electroforese inclui 3 fases: 1ª fase- electroforese propriamente dita, em que há separação das diferentes fracções proteicas. 2ª fase- revelação (coloração e lavagem dos meios de suporte) 3ª fase- leitura (avaliação quantitativa das diversas fracções). Quando colocamos as proteínas do soro num campo eléctrico com meio a ph 8,6 (tampão veronal ou de Michaelis), elas comportam-se como aniões e deslocam-se portanto para o pólo positivo (pi albumina= 4,5; pi γ-globulina 7,5). Podemos, em seguida, revelar a electroforese, utilizando corantes específicos, conforme queremos evidenciar: 2

13 a) Apenas as cadeias peptídicas usa-se um corante específico, por exemplo, o amidoschwartz (negro de amido), e obtemos um proteinograma; b) As fracções glucosídicas das glicoproteínas usa-se um corante para glúcidos, por exemplo, o Mac. Manus (reagente de Shiff) e obtemos um glucidograma (glicoproteinograma); c) As estruturas lipídicas das lipoproteínas usa-se um corante para lipídos, por exemplo, o negro de Sudão, e obtemos um lipidograma (lipoproteinograma). PROTEINOGRAMA ELECTROFORÉTICO Aplicabilidade clínica Num proteinograma, observam-se 5 zonas de migração, ou bandas, em que a mais aniónica corresponde à albumina (menor peso molecular e maior carga eléctrica negativa) e as seguintes, respectivamente, às globulinas α1, α2, β e γ. Os valores normais destas fracções proteícas no soro (em %) são: Albumina 57,1-74,3 % Globulina α1 2,9-5,7 % " α2 5,7-10,0 % " β 10,0-12,9 % " γ 10,0-20,0 % A Albumina é a proteína plasmática que existe em maior quantidade e tem funções importantes como a regulação da pressão oncótica e o transporte de moléculas. Das α1 globulinas fazem parte, entre outras, proteínas importantes da fase aguda da inflamação como é o caso da α1 antitripsina. Do grupo das α2 globulinas fazem parte proteínas como a haptoglobina, a α2 macroglobulina e a ceruloplasmina. A transferrina e o fibrinogénio são exemplos de proteínas plasmáticas que migram na banda das β globulinas. Das γ globulinas fazem parte as proteínas responsáveis pela resposta imune (imunoglobulinas, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE). O proteinograma electroforético é solicitado na prática clínica como auxílio diagnóstico, permitindo avaliar o estado funcional do indivíduo. 3

14 Estão descritos perfis electroforéticos típicos de determinadas situações clínicas. No caso de tumores produtores de plasmócitos (plasmocitomas) este tipo de estudo permite identificar o tipo de proteína que é segregada pelas células tumorais. Muitas doenças neoplásicas, metabólicas e infecciosas estão associadas a um distúrbio não específico das proteínas séricas, caracterizado por hipoalbuminémia e aumento da concentração de α-globulina. A análise electroforética das proteínas do líquido céfalo-raquídeo é um exame laboratorial útil no diagnóstico de várias doenças neurológicas. Pode dar indicação de alteração da integridade da barreira hematoencefálica e ainda do funcionamento celular do sistema nervoso central, nomeadamente se existe ou não síntese intratecal de proteínas, como por exemplo, de Ig G, na esclerose múltipla. DESCRIÇÃO DA TÉCNICA 1) Depósito da amostra (soro, LCR, urina) sobre a linha de partida: Deposita-se a amostra num ponto do suporte e faz-se passar uma corrente contínua através deste. A "natureza do suporte" é variável, em função da separação que se pretende efectuar. Na maior parte das vezes procura-se a separação das cinco grandes famílias proteicas do soro sanguíneo, utilizando-se então como suporte o acetato de celulose. 2) Migração electroforética: As proteínas migram em função da carga e dos factores atrás referidos parando em diferentes zonas, obtendo-se uma separação na forma de "bandas". A designada "mobilidade electroforética" exprime a velocidade de migração das partículas e, consequentemente, a distância de migração relativamente ao ponto de aplicação em função do campo eléctrico. A superfície carregada da partícula, em contacto com o meio líquido tamponado, rodeia-se de uma camada de iões cuja concentração e mobilidade variam em relação com numerosos factores, nomeadamente, a ionização variável dos grupos carboxilo e amina das proteínas. 3) Fixação e coloração das fracções proteicas. 4) Integração das bandas coloridas - obtenção do perfil electroforético por leitura num densitómetro a determinado comprimento de onda. A cada banda corresponde um pico cuja altura é proporcional à intensidade da coloração e cujo integral da superfície é proporcional à quantidade relativa de proteínas. Assim, num soro normal desenha-se um perfil electroforético 4

15 com cinco picos, correspondentes a cada uma das fracções proteícas: albumina, α1-globulina, α2-globulina, β-globulina e γ-globulina. 5) Expressão dos resultados - os resultados de uma electroforese devem ser sempre acompanhados do teor de proteínas totais do fluído biológico estudado. Assim, será possível exprimir por cada banda colorida e pela superfície abrangida por cada pico, o coeficiente de repartição em relação ao conjunto, facto que permite o cálculo de cada fracção em g/l, conhecendo o teor de proteínas totais. Tabela I - VALORES NORMAIS* DAS PROTEÍNAS DO SORO PLASMÁTICO E SUAS PROPORÇÕES Média (g/dl) Limites Ns Média (%) Limites Ns (%) (g/dl) ALBUMINA 4,5 4,0-5,2 64,3 57,1 74,3 GLOBULINAS 2,5 1,9-2,7 35,7 27,1 38,6 GLOB. α 0,79 0,6-0,9 11,3 8,6 12,9 GLOB. α1 0,31 0,2-0,4 4,4 2,9 5,7 GLOB. α2 0,48 0,4-0,7 6,9 5,7 10,0 GLOB.β 0,81 0,7-0,9 11,6 10,0 12,9 GLOB. γ 0,90 0,7-1,4 12,9 10,0 20,0 TOTAL 7,0 6,0 8,0 ALB/GLOB 1,8 1,4-2,7 *OS VALORES NORMAIS PODEM VARIAR CONSOANTE O LABORATÓRIO QUE REALIZA A ANÁLISE Nas globulinas γ, individualizaram-se imunologicamente diversos tipos, que se designam, actualmente, como sistema das globulinas γ, ou simplesmente, sistema das imunoglobulinas: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. 5

16 Aplicações Clínicas da Electroforese Todos os fluídos biológicos contêm uma mistura heterogénea de proteínas. A electroforese tem sido aplicada ao estudo de proteínas séricas, proteínas da urina, proteínas do líquido céfalo-raquídeo, lipoproteínas e glicoproteínas séricas. A análise electroforética das proteínas séricas ou proteinograma electroforético é um exame frequentemente requisitado na prática clínica diária, devido ao seu valor no auxílio do diagnóstico de variadas doenças. O aspecto global do perfil electroforético é por vezes suficiente para referenciar de imediato algumas anomalias proteicas características de diferentes entidades nosológicas. A electroforese desempenha um papel importante, por exemplo, no diagnóstico de mieloma múltiplo, macroglobulinémia, enteropatia exudativa, sindroma nefrótico, cirrose, sarcoidose e variadas doenças do colagéneo. Muitas doenças neoplásicas, metabólicas e infecciosas estão associadas a um distúrbio não específico das proteínas séricas, caracterizado por hipoalbuminémia e aumento da concentração de α-globulina. Por exemplo, o proteinograma sérico na cirrose hepática apresenta alterações úteis para o diagnóstico (Fig. 1). A par com uma diminuição da síntese hepática da albumina, há, em simultâneo, uma subida nas proteínas que migram nas fracções β e γ (o característico planalto β- γ ) por diminuição da catabolização das globulinas no fígado cuja função está deficiente (insuficiência hepática). No caso do síndrome nefrótico, há perda de proteínas pelo rim, sede inicial desta doença. Simultaneamente, dá-se a produção de proteínas inflamatórias, que migram normalmente na fracção α2-globulina e que originam um pico no proteinograma. A análise electroforética das proteínas do líquido céfalo-raquídeo é um exame laboratorial útil no diagnóstico de várias doenças neurológicas. Pode dar indicação de alteração da integridade da Barreira Hemato-Encefálica e ainda do funcionamento celular do Sistema Nervoso Central, nomeadamente se existe ou não síntese intratecal de proteínas, como por exemplo, de Ig G, na esclerose múltipla. Quase todas as proteínas do liquor provêm do soro. Exceptuam-se a β, a γ (gama) e a τ (Tau) globulinas, a proteína básica da mielina e a proteína fibrilhar glial que são de síntese intratecal. Entram por pinocitose através dos endotélios capilares e a velocidade de entrada depende do ponto isoeléctrico das proteínas. 6

17 Proteinograma electroforético Normal: Fracção α 1 : α 1 -microglobulina α 1 antitripsina α 1 glicoproteína ác. Fracção α 2 : α 1 -macroglobulina Ceruloplasmina Haptoglobina α fetoproteína Proteína C-reactiva Fracção β: Transferrina β lipoproteína β 2 -microglobulina Complemento C3 Fracção γ: IgG, IgA, IgM, IgD, IgE Paraproteínas (crioglobulinas) Albumina α 1 α 2 β γ Proteinograma electroforético Anormal: Alb. α1 α2 β γ FRACÇÃO (%) g/dl Valores Referência Albumina 36,6 3,4 4,0-5,2 α1 3,1 0,9 0,2-0,4 α2 10,9 1,0 0,4-0,7 β 18,6 1,7 0,7 0,9 γ 30,8 2,8 0,7-1,4 Total 9,8 6,0-8,0 A/G 0,58 1,4-2,7 Fig. 1- Perfil electroforético das proteínas do soro sanguíneo de um doente com cirrose hepática (diminuição da albumina, aumento das gamaglobulinas, planalto beta-gama). Em baixo está representado o gel respectivo. 7

18 Ano Lectivo 2011/2012 BIOQUÍMICA I 1º Ano PROTOCOLO DE BANCADA - 5ª AULA PRÁTICA ELECTROFORESE DAS PROTEÍNAS PLASMÁTICAS - Marcar as tiras de acetato e mergulhá-las lenta e cuidadosamente em tampão deixando embeber pelo menos durante 2 horas ou, de preferência, de um dia para o outro no frigorífico. - Deitar 500 ml de tampão frio em cada um dos compartimentos da tina e ligá-la durante 15 minutos a 200 V para estabilizar. - Encher os poços do porta-amostras com os soros ou plasmas a analisar. - Retirar as tiras do tampão, enxugá-las entre 2 folhas de papel de filtro e colocá-las nas pontes respectivas. - Mergulhar os aplicadores nas amostras e fazer uma aplicação prévia sobre papel de filtro para verificar o bom funcionamento do aplicador. - Mergulhar de novo nas amostras e aplicar sobre o acetato deixando permanecer durante ± 10 segundos. - Abrir a tina, introduzir as pontes com as tiras, fechar, verificar de novo a voltagem (200 V) e deixar correr durante 50 minutos. - Retirar as tiras de electroforese, cortar as pontas do acetato e corar em Ponceau S a 0,5 % (em TCA a 5 %) durante 6 minutos. - Lavar em 2 banhos sucessivos de ácido acético a 5 % até o acetato ficar branco. - Desidratar em Metanol cerca de 4 minutos. - Retirar do Metanol, deixar ao ar uns segundos e colocar em solução diafanizadora durante 5 minutos. - Escorrer as tiras e aplicá-las sobre lâminas de vidro cuidadosamente lavadas com álcool e secas. - Secar em placa térmica ou estufa a C duran te ± 10 minutos. - As tiras são lidas em densitómetro a 525 nm. 8