Revista Eletrônica Nutritime, Artigo 144. v. 8, n 05 p Setembro/Outubro 2011 FERRAMENTAS BIOTECNOLÓGICAS EM PRODUÇÃO ANIMAL

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1 Revista Eletrônica Nutritime, Artigo 144 v. 8, n 05 p Setembro/Outubro

2 Artigo Número 144 FERRAMENTAS BIOTECNOLÓGICAS NA PRODUÇÃO ANIMAL BIOTECHNOLOGY TOOLS IN ANIMAL PRODUCTION Naiana Einhardt Manzke¹*; Verônica Lisboa Santos¹; Eduardo Gonçalves Xavier²; Fernanda Medeiros Gonçalves¹; Cristiele Contreira³ ¹Programa de Pós Graduação em Zootecnia. Departamento de Zootecnia. Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas. RS. Brasil.*Autor para correspondência: ²Professor Adjunto do Departamento de Zootecnia da Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas. RS. Brasil. ³Graduanda em Agronomia. Faculdade de Agronomia Eliseu Maciel. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas. RS. Brasil. 1530

3 RESUMO Atualmente existe uma preocupação com o desenvolvimento de novos conhecimentos e técnicas no campo da biotecnologia que possam ser utilizadas no melhoramento de animais de produção, aperfeiçoando, as áreas de nutrição, sanidade e genética. A biotecnologia conheceu nas últimas décadas do século XX uma expansão intensa, proporcionado avanços no entendimento sobre mecanismos fisiológicos e nutricionais que permitem otimizar o desempenho animal. Ferramentas como a PCR possibilitaram a síntese de fragmentos de DNA a partir do DNA genômico, auxiliando o desenvolvimento de outras ferramentas como a técnica de microarranjos, que permite a avaliação quantitativa da expressão de genes envolvidos nos principais processos de regulação do metabolismo. Os microarranjos são empregados em estudos de nutrigenômica, esclarecendo a maneira como determinados nutrientes podem afetar uma via metabólica através da supressão ou ativação de um grupo de genes. Com esta nova ferramenta biotecnológica, é possível elucidar respostas que permanecem obscuras em estudos zootécnicos. Os marcadores moleculares são originados das variações no código genético dos animais, segregando pelas gerações segundo o padrão de herança Mendeliana, relacionados a características monogênicas ou poligênicas, as quais podem ser utilizadas para a investigação de genes de interesse na produção animal. O objetivo desta revisão foi avaliar o uso destas ferramentas em estudos de produção animal. Palavras Chave: Biotecnologia, PCR, microarranjos, marcadores moleculares. ABSTRACT There is a concern about developing new concepts and techniques in biotechnology that might be used in animal breeding, improving nutrition, health and genetics. Biotechnology has an intense expansion in last century, providing a background about how physiological and nutritional events can contribute to animal performance. Tools like PCR allowed DNA synthesis from genomic DNA, supporting other tools like microarrays techniques, which offer the benefits of a quantitative evaluation of gene expression in metabolic pathways. Nowadays, microarrays are useful in nutrigenomics science, given the information in which way a nutrient component can affect a metabolic pathway through gene down or up regulation. With this new technology, is possible to explain some events that remains unclear in animal science. Molecular markers are variations in genetic code according to Mendelian estate, related to monogenics or poligenics characteristics that can be used to investigate genes associated to performance response. The aim of this review is evaluate the use of the new biotechnology tools in animal science. Keywords: biotechnology, PCR, microarrays, molecular markers. INTRODUÇÃO Com o início do projeto genoma humano, no início dos anos 90, as sequências do DNA do genoma humano e de diversas espécies experimentais foram determinadas. Desde então, os projetos de sequenciamento foram dedicados a animais domésticos de importância para a agropecuária. O genoma de galinha foi completado em 2004 (Wallis et al., 2004), o de equinos (Ramery et al., 2009) e o de bovinos em 2006 (Gao et al., 2007) e o de suínos está em progresso. Juntamente com esses avanços surge um importante desenvolvimento de novos conhecimentos e técnicas no campo, amplamente denominado de "biotecnologia", que oferecem a perspectiva de atuar diretamente no melhoramento de animais de 1590

4 produção. A utilização de biotecnologias em sistemas de produção animal abre novas oportunidades na melhora da produtividade pelo aumento de parâmetros como qualidade de carcaça, índices reprodutivos e produtivos, melhoramento na nutrição e utilização dos alimentos, entre outros fatores (Milazzotto et al., 2008). Além da análise do genoma estrutural, a análise de expressão em escala genômica, também denominada genética genômica ou mapeamento de transcriptoma, tem permitido a identificação de variação no padrão de expressão de conjuntos de genes expressos; a análise dessa variação na expressão, aliada à análise de marcadores, possibilita identificar regiões do genoma responsáveis pelas mudanças na expressão desses genes e a integração de informações estruturais e funcionais deverá permitir melhor conhecimento do controle genético das características de interesse econômico e auxiliar as decisões do melhoramento e nutrição (Kadarmideen et al., 2006). O termo transcriptoma refere-se ao conjunto de RNAs, ou seja, os transcritos de uma célula num dado momento de seu ciclo. Como são os RNAm os responsáveis pela codificação da síntese de proteínas e, portanto, os mais importantes no estudo da expressão do genoma, geralmente entende-se que o transcriptoma é o conjunto dos RNAm. Mas é oportuno lembrar que tanto os RNAs transportadores (RNAt) e os RNAs ribossômicos (RNAr) devem ser incluídos no conceito de transcriptoma apesar de não serem codificadores de proteínas (Sevignani et al., 2006). Até recentemente, as ferramentas para a identificação de genes responsáveis por diferenças entre indivíduos ou populações ainda não estavam disponíveis. A difusão do conhecimento na área da biologia molecular tem mudado esta situação e tem permitido a identificação de genes em humanos, plantas e animais em estudos de associação (Bovenhuis et al., 1997). Por esta razão, os estudos estão voltados para a elucidação dos mecanismos bioquímicos mediados pela expressão de genes específicos, responsáveis pela manifestação de determinados fenótipos de interesse, área denominada seleção assistida por marcadores ( marker assisted selection - MAS ), na qual algumas técnicas foram desenvolvidas e vêm sendo utilizadas com grande sucesso. Para a obtenção desses marcadores pode se recorrer à busca de genes principais, onde se objetiva estudar os mecanismos fisiológicos envolvidos com a manifestação das características de produção de interesse, na tentativa de pesquisar variações de genes específicos entre indivíduos que apresentem fenótipos diferentes (Womack, 1993). Para que uma compreensão mais clara da expressão gênica global ao nível de transcrição seja investigada são utilizadas algumas ferramentas biotecnológicas, dentre elas as técnicas de PCR (reação em cadeia da polimerase, do inglês, polymerase chain reaction), microarranjos e marcadores moleculares. Tais ferramentas apresentam caráter aditivo e não substitutivo. Com isso, o objetivo desta revisão é avaliar o uso destas ferramentas e seus benefícios dentro da produção. FERRAMENTAS BIOTECNOLÓGICAS DE APLICAÇÃO EM SISTEMAS DE PRODUÇÃO ANIMAL PCR O advento da biologia molecular foi certamente um dos maiores passos das ciências biológicas durante o século XX. A descoberta da Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction PCR) trouxe 1591

5 enormes benefícios e desenvolvimento científico como o sequenciamento genômico, expressão de genes em sistemas recombinantes, o estudo da genética molecular e o diagnóstico de doenças infecciosas, identificação de patógenos (Novais e Alves, 2004). Segundo Malone et al. (2006), outra aplicação especialmente útil para a PCR é a clonagem de um fragmento de DNA, que pode ser um gene e o conhecimento do DNA codificante (cdna) obtido da molécula de RNA, o que permite o estudo da expressão dos genes. A PCR é uma metodologia que pode ser executada in vitro, desenvolvida em meados da década de 80 por Kary Mullis, que recebeu em 1994, o prêmio Nobel. Através desta técnica é possível a síntese de fragmentos de DNA, a partir do DNA genômico, usando a enzima DNA polimerase que sintetiza uma sequência complementar de DNA desde que um pequeno fragmento, o primer ou iniciador, já esteja ligado a uma das cadeias de DNA. Os iniciadores definem a sequência a ser replicada, diante disto, obtém-se a amplificação de uma determinada sequência de DNA com bilhões de cópias (Mullis, 1990). A partir desta técnica, tornou-se possível obter a duplicação de forma exponencial de um determinado segmento de DNA. O princípio básico da PCR envolve etapas que se repetem em ciclos, subsequentes, com a utilização de um termociclador: 1 - Desnaturação térmica da fita de DNA molde temperaturas elevadas (situam-se em torno de 90ºC), separando em dois a dupla fita dupla de DNA. Segundo Uhlmann et al. (2008), a ligação destes filamentos, mantidas por pontes de hidrogênio, rompem-se facilmente a esta temperatura, contudo, as ligações entre as moléculas de fosfato e desoxirribose, de natureza covalente, não são afetadas. Numa reação de PCR são incluídos dois primers, um para cada cadeia simples de DNA que foi produzida durante o passo de desnaturação. O início da sequência de DNA alvo é marcado pelos primers que se liga com a sequência complementar. 2- Hibridização ou Annealing: Kim et al. (2007), afirmam que a temperatura de annealing ou hibridização situa-se entre 40 ºC e 65 ºC, dependendo do comprimento dos primers (ou iniciadores) e da sua sequência. A escolha criteriosa desta temperatura permite que estas sequências se liguem à sequência alvo com elevada especificidade. Após a ligação dos primers ou iniciadores às sequências complementares de DNA, a temperatura é elevada em torno dos 72ºC e a enzima Taq polimerase procede à replicação. Segundo Gibbs (1990), o principal entrave ao avanço da técnica era a utilização da enzima polimerase de Escherichia coli, a qual era desnaturada quando submetida à temperatura necessária para a reação, de modo que era necessário proceder a um reabastecimento da carga de enzimas após o estágio de aquecimento de cada ciclo. Saiki et al. (1988) relatam que esta situação foi contornada com eficácia quando do isolamento de organismos termofílicos, como bactérias nativas de fontes termais ou de chaminés vulcânicas do fundo do mar. A purificação da Thermus aquaticus proporcionou aumento no que tange à especificidade e sensibilidade da reação, assegurando que os iniciadores estão anelados perfeitamente somente às suas sequências homólogas. Outro ganho é obtido em relação à eficiência da reação, proporcionando maior rendimento do produto amplificado e, também, a possibilidade de amplificação de fragmentos de DNA de maior tamanho. Outras DNA polimerases com características de termoestabilidade foram isoladas de outros organismos e encontram-se comercialmente à disposição para a realização da PCR, como: Tbr (isolada de Thermus brocianus), Tth (isolada de Thermus thermophllus) e a BstI (isolada de Bacillus Stearothermophilus) (Haki e Rakshit, 1592

6 2003). 3. Extensão ou amplificação: O processo de síntese é iniciado numa zona com cadeia dupla (onde estão ligados os primers), incorporando os nucleotídeos complementares à sequência alvo e utilizando os dntps (desoxirribonucleotídeos trifosfatos) que funcionam como substrato para reação de polimerização, em solução. A extensão inicia-se sempre no extremo 3 do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples. A Taq polimerase sintetiza exclusivamente na direção 5 para 3 (Haki e Rakshit, 2003). Deste modo, obtém-se a duplicação do segmento de DNA compreendida entre as regiões delimitadas pelos primers. Assim, a cada novo ciclo, repetem-se estas três etapas, proporcionando uma duplicação exponencial do fragmento específico de DNA. A reação em cadeia da polimerase ocorre no termociclador, aparelho capaz de controlar e alternar a temperatura durante os períodos programados de tempo para o número apropriado de ciclos de PCR. O passo final é a análise do produto de reação, conhecido como amplicon. Esta pode ser feita através de eletroforese em gel de poliacrilamida posteriormente corado pela prata ou em gel de agarose, corado por brometo de etídio, ambas (agarose e poliacrilamida) compostas por polímeros. Géis de agarose a 2% normalmente são suficientes para a visualização de fragmentos de 50 a 500pb, sendo possível um aumento na visualização e sensibilidade pelo uso de géis de poliacramida em concentração compreendida entre 6 10% (Kubista et al., 2006). Em qualquer uma delas, o material amplificado é visualizado como uma banda, a ser analisada de acordo com o seu peso molecular. Tanto na eletroforese com gel de poliacrilamida como na com gel de agarose, a separação das moléculas terá sua eficácia determinada tanto pela concentração do polímero como pela intensidade da voltagem e amperagem aplicadas. PCR EM TEMPO REAL PCR em tempo real (real time), também chamada PCR quantitativa, permite o monitoramento da reação de amplificação em tempo real (ciclo a ciclo), em sistema fechado, sem interferências externas no progresso da reação (Berdal e Holst-Jensen, 2001), aumentando a objetividade da interpretação (Krenke et al., 2005). Neste processo, usam-se corantes fluorescentes que são intercalados ao DNA. O ponto que detecta o ciclo no qual a reação atinge o limiar da fase exponencial é chamado Cycle Thereshold, no qual torna-se possível a quantificação exata e reprodutível baseada na fluorescência (Novais et al., 2004). Entre os principais compostos fluorescentes utilizados está o SYBR Grenn e o TaqMan. O SYBR Green liga-se entre a dupla fita de DNA e, após sofrer a excitação da luz emitida pelo sistema do termociclador, emite uma fluorescência verde. As moléculas não ligadas do SYBER Green apresentam baixa fluorescência, não sendo considerados durante a análise realizada pelo computador (Vitzthum et al., 1999). O TaqMan é baseado na utilização de três primers:dois específicos para os genes de interesse e o terceiro, que pareia entre os dois primeiros (Wiseman, 2002). O terceiro primer contém dois compostos especiais: um fluorescente e outro denominado quencher. Este é degradado pela atividade da enzima Taq polimmerase, visando a diminuição da fluorescência entre o corante e o referido primer (Berdal e Holst, 2001). A PCR em tempo real necessita de um termociclador com sistema ótico para excitação da fluorescência e um computador com software para aquisição de dados e análise final da reação (Novais et al., 2004). Permite a constante detecção e monitoramento dos produtos de amplificação durante toda corrida (emissão de fluorescência). A 1593

7 fluorescência é proporcional à quantidade de produto formado, permitindo registrar o número de ciclos de amplificação necessários para obter uma determinada quantidade de moléculas de DNA (Kubista et al., 2006). Porém, apresenta custo elevado e requer treinamento especializado (Wiseman, 2002). Apresentando como vantagem a quantificação, o acompanhamento da reação e a apresentação dos resultados de forma mais precisa e rápida, pois não mais requer a detecção em gel de eletroforese e, segundo Rodríguez-Lázaro (2007) a PCR, em tempo real, possibilita o monitoramento da síntese de produtos de amplificação no decorrer da própria reação de síntese PCR e não apenas no final da reação como ocorre na PCR qualitativa. EXEMPLOS DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA EM PRÁTICA ZOOTÉCNICAS As aflatoxinas são contaminantes naturais dos alimentos e estão entre as mais importantes micotoxinas, sendo que a maioria das micotoxicoses são causadas por produtos agrícolas infectados, tais como: trigo, milho, arroz, sorgo e aveia (Kedera et al., 1999). Entre os efeitos da aflatoxina no organismo animal estão: carcinogenicidade, mutagenicidade e hepatotoxicidade (Bradburn e Coker, 1993). Estas toxinas são frequentemente encontradas em grãos utilizados na alimentação animal, como por exemplo, o milho, que desempenha papel fundamental na alimentação, visto que compõe cerca de 60% da ração inicial de frangos de corte, o que corresponde a aproximadamente 65% da energia metabolizável e 22% da proteína na fase inicial. Visando investigar a potencialidade da PCR para detectar fungos aflatoxigênicos em farinha de milho, Shapira et al. (1996) inocularam neste cereal seis espécies diferentes de fungos, das quais quatro eram não toxigênicas e duas toxigênicas. Logo, o DNA foi extraído da mistura fungo-farinha e a PCR foi realizada com primers que reconhecem genes que participam da via biossintética da aflatoxina. Produtos de amplificação foram detectados somente em amostras nas quais as espécies aflatoxigênicas, Aspergillus parasiticus e A. flavus, haviam sido inoculadas, evidenciando a especificidade do método e alta sensibilidade, pois resultados positivos foram obtidos para amostras inoculadas com 100 esporos por grama e 24 horas de incubação. Nos Estados Unidos, o método de PCR em tempo real, vem sendo utilizado em associação aos testes de microscopia em alimentos para animais, no sentido de garanti-los livres de substâncias proibidas, segundo Dick (2010), o método aumenta a capacidade do FDA (órgão americano responsável pelo controle de alimentos e medicamentos, do inglês, Food and Drug Administration) em assegurar rações livres de agentes capazes de causar a encefalopatia espongiforme bovina, popularmente conhecida como doença da vaca louca. Desde que foi detectada pela primeira vez, em 1986, estudos comprovaram a associação entre os surtos da referida doença e a utilização de alimentos para fabricação de rações que contenham proteínas de origem bovina e outros ruminantes como ovinos e caprinos. Dois anos depois, o Reino Unido proibiu o uso de farinha de carne e ossos (FCO) na alimentação de ruminantes. Em 2008, o FDA reforçou tal proibição além de estendê-la para alimentos destinados a animais de estimação. O método mais recente de PCR (2009) permite a detecção de proteínas de mamíferos em concentrações à partir de 0,1%, além de continuar garantindo a especificidade e sensibilidade que caracterizam o método e garante maior rapidez do processo: em menos de 2,5h já é possível a detecção de materiais oriundos de ruminantes (Dick, 2010). 1594

8 A lactase é um dissacarídeo presente no intestino delgado, responsável pela hidrólise da lactose em glicose e galactose e, por isso, tem sua importância reconhecida nos animais alimentados com leite. Assim, Ontsouka et al. (2004), quantificaram os níveis de RNAm lactase no trato gastrointestinal de bovinos de cinco dias de idade alimentados com leite. Utilizando a técnica da RT-PCR, os primers de amplificação de RNAm lactase de bovinos foram projetados nas regiões 100% idênticas de espécies (ratos, coelhos e seres humanos) a partir da qual as sequências de lactase estavam disponíveis. A presença do RNAm lactase no trato gastrointestinal foi avaliada em amostras ao longo de todo intestino, além disso, os níveis de RNAm de lactase foram medidos em camadas da mucosa do jejuno e íleo (principalmente contendo vilosidades ou criptas) e lâmina ileal. A sequência amplificada de lactase parcial bovina apresentou 87% de similaridade com sequências de humanos e coelhos, e 82% de similaridade com a sequência de ratos. Lactase RNAm estava presente em paredes inteiras (composta de mucosa e submucosa) de todo o intestino delgado, mas estava ausente no esôfago, no rúmen, piloro e cólon. Além disso, a lactase RNAm foi detectada em vilos e camadas de cripta do jejuno e íleo. Não houve detecção de RNAm lactase nas camadas de íleo, perfazendo a RT - PCR um método possível para o estudo da RNAm lactase. A disponibilidade de métodos que possibilitem a detecção confiável de farinha de carne e ossos em alimentos destinados à alimentação animal é uma condição importante para reforçar atuais e futuras exigências da legislação europeia sobre a utilização de proteínas animais transformadas na alimentação animal. Dentre os métodos possíveis, aqueles baseados em DNA tornaram-se um instrumento confiável para essa finalidade, pois o DNA é uma molécula bastante termoestável capaz de resistir a tratamentos térmicos severos aplicados na fabricação de farinhas de origem animal. A aplicação de tais métodos pelos laboratórios de controle implica que o método foi validado, incluindo uma avaliação da sua robustez, sendo a transferência bem-sucedida entre os laboratórios, considerado um importante critério de robustez do método. Neste sentido, Prado et al.,(2009) demonstraram a viabilidade de um conceito alternativo que foi aplicado para verificar a possibilidade de transferência de um ensaio qualitativo para a detecção de FCO proibida na alimentação animal ao nível de rastreamento, baseados em PCR em tempo real. O conceito foi baseado em um projeto experimental, conjuntamente com a aplicação da análise de variância (ANOVA), conduzido de forma independente em dois laboratórios e que permite estabelecer os principais fatores que influenciam o resultado da análise. A análise estatística dos resultados reitera a importância da extração do DNA / etapa de purificação utilizada, enquanto que a etapa de PCR mostrou ser um fator menos comprometedor em relação à variabilidade total dos resultados. Além disso, amostras cegas compostas de alimentos adulterados com FCO em 0,1% e alimentos compostos livres de contaminação foram corretamente classificados como "positivo" ou "negativo", confirmando assim a adequação do método ao propósito. Esta abordagem pode ser interessante para outros grupos de pesquisa trabalhando no desenvolvimento de métodos de PCR em tempo real e na sua utilização pelos laboratórios de controle. Segundo Mullis (1990), uma importante vantagem no uso da PCR reside na capacidade que a mesma apresenta em amplificar uma sequência precisa de DNA aliada ao seu rigor, elevada sensibilidade e especificidade. Não é necessário isolar o DNA que se pretende amplificar (mesmo que se encontre misturado 1595

9 com DNA de outras espécies), uma vez que a especificidade da PCR é dada pelos primers (Kubista et al., 2006). É uma técnica rápida e segura. Contudo, a PCR também tem limitações, como a necessidade de conhecer a sequência de DNA a amplificar para que possam ser sintetizados primers específicos. Outra desvantagem é a relativa facilidade com que ocorre contaminação da amostra por DNA estranho (uma vez que se trata de uma técnica muito sensível) (Mullis, et al., 1990) MICROARRANJOS Na última década, a genômica funcional tem fornecido as ferramentas que podem ser usadas para obter uma compreensão mais clara da expressão gênica global ao nível de transcrição. Provavelmente uma das mais importantes ferramentas disponíveis é centrada nas tecnologias dos microarranjos. Esta técnica permite o exame do DNA, em larga escala, de perfis de expressão gênica ao nível da transcrição e permite a avaliação quantitativa dos principais processos de regulação do metabolismo que pode ser influenciado pelo ambiente, por doenças e/ou pela dieta. É baseada em uma análise quantitativa do RNA mensageiro (RNAm) produzido durante a transcrição de genes específicos. A transcrição do RNA em tecidos é dependente da regulação da expressão gênica e pode ser medida indiretamente após a criação de uma cadeia complementar de ácidos nucleicos (Dawson e Harrison, 2007). Nesta técnica, um microarranjo de DNA, composto por fragmentos gênicos de DNA, oligonucleotídeos ou produtos de PCR depositados em uma matriz sólida (geralmente lâminas de vidro ou substrato de nylon), é utilizado para quantificar a abundância relativa dos RNAms presentes num determinado tipo de célula ou tecido. Geralmente, cada posição no microarranjo (chamada de spot ) representa um gene diferente, embora o mesmo gene possa estar representado em mais de um spot (Schena et al., 1995). Em experimentos de comparação de classes, os cdnas de duas amostras, produzidos a partir de concentrações equimolares de RNAm, são marcados com fluoróforos que emitem fluorescências com diferentes comprimentos de onda (verde e vermelho). As amostras são hibridadas no mesmo microarranjo, no que se convencionou chamar de hibridação competitiva, sendo posteriormente analisado por um escâner acoplado a um fluorímetro. Ao ser exposto aos raios laser, cada spot emitirá a fluorescência correspondente a cada uma das cores ou as variações de tonalidades resultantes das combinações entre elas. Em princípio, quanto maior a expressão de um determinado gene, maior será a quantidade de cdnas marcada com o fluoróforo e, consequentemente, maior será a intensidade da fluorescência do complexo sonda-alvo após a hibridação (Hiendleder et al., 2005). A quantificação das fluorescências detectadas entre as classes comparadas, bem como a interpretação das imagens obtidas, são realizadas com o auxílio de programas específicos (Rosa et al., 2007). Usando essa técnica, é possível determinar quantitativamente quais os genes e processos metabólicos são regulados para cima (up regulatedativo) ou para baixo (down regulatedinativo) como resultado de manipulações biológicas específicas. Isto torna possível comparar quantitativamente os padrões de expressão gênica em dois grupos distintos de tecido ou animais, e comparar os efeitos do ambiente ou da nutrição sobre os passos básicos de regulação do metabolismo animal. Usando técnicas de robótica para a produção de microarranjos em uma escala de minutos, é possível examinar rapidamente a expressão de milhares de genes ao mesmo tempo e produzir uma descrição detalhada dos 1596

10 padrões de expressão gênica. Esta é uma ferramenta extremamente poderosa que pode ser usada para estudar a regulação de processos metabólicos em um nível muito básico (Dawson e Harrison, 2007). Esta abordagem tem sido largamente empregada na determinação de genes ou conjunto de genes diferencialmente expressos em amostras procedentes de uma mesma condição experimental e/ou condições contrastantes (Robinson et al., 2000), bem como na monitoração de genomas de uma forma abrangente, permitindo assim, a melhor compreensão das interações que ocorrem entre milhares de genes simultaneamente (Shi, 2000). Como vantagens adicionais dos microarranjos de DNA ressalta-se a possibilidade de elucidar, de forma holística, as vias moleculares afetadas por nutrientes e compostos bioativos dos alimentos e, além disso, o estabelecimento de novas hipóteses de estudo, mais direcionadas e que, muitas vezes, não seriam consideradas a princípio (Kussmann et al., 2006; Mutch et al., 2005). EXEMPLOS DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA EM PRÁTICAS ZOOTÉCNICAS A tecnologia de microarranjos tem sido muito importante para decifrar a complexa interação existente entre os componentes químicos das dietas (nutrientes) e o material genético dos indivíduos (genótipo), ou seja, dos mecanismos moleculares envolvidos na interação nutrientes-genótipo e a maneira como estas afetam o fenótipo (Kaput e Rodriguez, 2004). O fígado tem uma função central na regulação do status metabólico, partição de nutrientes e gasto de energia. Assim, com o objetivo de melhorar os conhecimentos sobre a regulação das vias metabólicas que ocorrem neste órgão, Ponsuksili et al. (2007) comparam os perfis de expressão gênica em amostras do fígado de suínos pertencentes a raças que possuem características de carcaça divergente (obesa e magra), coletadas em diferentes estágios do desenvolvimento. Utilizando microarrays de oligonucleotídeos de cadeia longa (representando genes específicos de suínos), estes autores evidenciaram diferenças marcantes nos padrões de expressão gênica, tanto na comparação entre as raças, como entre os estágios de desenvolvimento, identificando diversos genes candidatos para estudos funcionais relacionados com características de carcaça. A adiposidade excessiva em frangos de corte é a consequência de muitos anos de seleção para elevadas taxas de ganho de peso, que hoje está sendo um dos maiores problemas desse setor da avicultura. Entretanto, pouco se sabe sobre os mecanismos genéticos que regulam as vias metabólicas e fisiológicas envolvidas na manifestação dessa característica. Sendo assim, Bourneuf et al. (2006) utilizaram microarrays de cdna contendo sondas tecido-específicas para estudar a expressão gênica no fígado de frangos pertencentes a linhagens que apresentam diferentes teores de gordura na carcaça (alta e baixa adiposidade), identificando diversos genes que podem estar relacionados com a ontologia da obesidade em frangos de corte. O desenvolvimento dos depósitos de gordura corporal está estreitamente associado ao aumento no número de adipócitos que ocorre ao longo da vida e, no caso dos animais que têm predisposição genética para desenvolver o marmoreio, a proliferação dessas células nos depósitos intramusculares ocorre numa taxa sensivelmente maior do que nos demais depósitos do organismo. Com o objetivo de melhor entender as bases genéticas dessa característica, Wang et al. (2005) estudaram a expressão gênica no músculo Longissimus dorsi de bovinos da raça Japanese Black, que se 1597

11 caracteriza pela notável propensão de depositar grandes quantidades de gordura de baixo ponto de fusão nos depósitos intramusculares. Utilizando microarrays de cdna contendo sequências tecido-específicas, detectaram diferenças nos padrões de expressão gênica que forneceram pistas importantes sobre a regulação de algumas características particulares da raça Japanese Black, especialmente no que se refere ao início do desenvolvimento e taxa de deposição do tecido adiposo, vias metabólicas preferenciais e mecanismos de sinalização envolvidos na conversão de carboidratos em lipídeos, que deverão contribuir para o avanço nas pesquisas nesta área. Com o objetivo de identificar transcritos diferencialmente expressos na glândula da casca em duas linhagens de galinhas (alta e baixa produção de ovos), Yang et al. (2006) desenvolveram um microarray de cdna representando transcritos, com o qual identificaram 85 genes que são expressos de forma diferente nestas duas linhagens, alguns deles com potencial para serem utilizados como marcadores moleculares nos programas de seleção para produção de ovos. Apesar das vantagens da técnica de microarranjos de DNA, existem, ainda, importantes limitações para aplicação dessa ferramenta na área de nutrição animal. Uma delas se refere à necessidade de quantidades significativas de tecidos para o isolamento do RNAm, apesar de o uso de células sanguíneas representar alternativa, tem-se verificado, nesse caso, amplas variações interindividuais no perfil de expressão gênica, o que limita a análise do efeito de intervenções nutricionais (Zhang et al., 2008). A necessidade de repetições para obter resultados significantes e o alto custo da técnica resultam também em limitação econômica. Também a pequena reprodutibilidade dos resultados utilizando-se plataformas de diferentes fabricantes (Kussmann et al., 2006) tem estimulado iniciativas para padronizar, por meio de boas práticas analíticas, os experimentos de microarranjos de DNA na área de nutrição (Garosi et al., 2005). MARCADORES MOLECULARES Desde a redescoberta dos princípios de Mendel, no início do século XX, o foco da atenção dos geneticistas passou a ser o gene como unidade fundamental da variação biológica. Com o desenvolvimento da genética de populações, surgiu o conceito de utilização de genes individuais como marcadores, com a finalidade de fazer inferências sobre as características de uma população, tais como o conteúdo de variabilidade, os padrões de migração, a seleção e a deriva genética (Regitano e Veneroni, 2009). Os chamados marcadores moleculares, originados das variações no código do material genético (genoma) dos animais, segregam pelas gerações segundo padrão de herança Mendeliana relacionada a características monogênicas ou apresentam distribuição compatível com as esperadas em características poligênicas, são também denominados de marcadores genéticos (Ferreira e Grattapaglia, 1998). As primeiras contribuições ao estudo de marcadores genéticos em animais foram as descobertas dos polimorfismos de antígenos eritrocitários (Stormont e Cumley, 1943). A análise de marcadores foi ampliada com o desenvolvimento de técnicas de eletroforese de proteínas associadas a métodos de coloração histoquímica, as quais permitiram que a variação genética das proteínas passasse a ser estudada (Smithies, 1955). Porém, com o desenvolvimento das técnicas de análise de DNA, a possibilidade de analisar variações individuais nas sequências de DNA, independentemente de corresponderem a um peptídeo ou não, permitiu o desenvolvimento de 1598

12 diversos tipos de marcadores moleculares. Nesse caso, cada segmento do DNA constitui um lócus e os padrões correspondentes às variações de sequência nesse segmento são fenótipos moleculares. A utilização de muitos desses marcadores se baseia na técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), que permitiu a automação e a simplificação das etapas de obtenção dos padrões moleculares (Regitano e Veneroni, 2009). Os diversos tipos de marcadores moleculares revelam variações de sequência oriundas de diferentes mecanismos de mutação e a escolha do tipo de marcador a ser utilizado depende essencialmente da aplicação, mas deve levar em conta dificuldade técnica, custo para a obtenção do número necessário de genótipos, informatividade, distribuição pelo genoma e tipo de interação alélica. Os principais marcadores moleculares descritos são: 1) as inserções e deleções (Indels), 2) os polimorfismos de base única (SNP, do inglês: single nucleotide polymorphism) e 3) as regiões repetitivas (Vignal e Milan, 2002). Recentemente, foram introduzidos na análise genética os marcadores bialélicos, entre eles destacam-se os polimorfismos de base única (SNPs; Hinds, 2005) e os polimorfismos de inserção-deleção (Indels; Weber et al., 2002). Os SNPs são marcadores atraentes para a análise genética, por se encontrarem em praticamente qualquer região do genoma ou em qualquer sequência de interesse, por exemplo, em éxons de genes; isso pode acarretar em implicações diretas nas funções da proteína correspondente. Outras características importantes são a maior estabilidade, quando comparada à dos marcadores de microssatélites, além da possibilidade de automação (Weber et al., 2002). O polimorfismo dos Indels varia de poucas bases até grandes pedaços do cromossomo. As Indels localizadas no interior de regiões codificadoras de algum gene podem causar alterações na fase de leitura ou adição/subtração de algum códon o que, consequentemente irá alterar o produto proteico. Além disso, os Indels em regiões não traduzidas podem afetar a estrutura e estabilidade da molécula de DNA ou comprometer a expressão de RNAs regulatórios não codificadores. Evidências genéticas sugerem que os Indels constituem uma fonte considerável de defeitos genéticos, ou seja, uma força produtora de mudanças evolutivas significantes (Britten, 2003). Mas, ao contrário dos SNPs, ainda não foram avaliadas com intensidade, apesar de responder por uma grande parcela da variação genética de uma espécie. Alguns autores consideram um indels de pares de base (inserções ou exclusões) como SNPs, embora eles certamente ocorre por um mecanismo diferente (Mills, 2006). Os microssatélites são caracterizados por repetições em tandem de um mono-, di-, tri- ou tetranucleotídeo, localizadas dentro de regiões de sequência única. Cada bloco de repetições tem geralmente até 100 pares de nucleotídeos (Tautz, 1989). Do mesmo modo que outras regiões repetitivas do genoma, a variação do número de repetições em cada lócus é provavelmente resultante de erros no deslocamento da DNApolimerase durante a replicação do DNA (Drobnic e Budowle, 2000). O polimorfismo de marcadores microssatélites pode ser determinado pela amplificação por PCR da região desejada, seguida de separação eletroforética, revelando padrões de banda variáveis de acordo com o número de elementos repetitivos (Neuenschwander, 2001). Os marcadores microssatélites estão amplamente distribuídos em todo o genoma de eucariotos, apresentam elevado grau de polimorfismo, padrão de herança Mendeliana, codominância e facilidade na detecção por PCR e consequente determinação dos alelos e genótipos, sendo atualmente a ferramenta de eleição para execução 1599

13 de testes de paternidade (Page e Holmes, 1998). EXEMPLOS DA APLICAÇÃO DA TÉCNICA EM PRÁTICAS ZOOTÉCNICAS Vários grupos de pesquisadores estão empenhados no desenvolvimento de mapas genômicos em diferentes espécies animais, dentre as quais se destacam: bovinos, aves e suínos. O objetivo é a obtenção de marcadores moleculares para todos os cromossomos, possibilitando que o potencial genético de um animal seja determinado antes mesmo da expressão do seu fenótipo, ou seja, sem avaliar a sua produção ou sua progênie. A indústria suinícola tem usado de forma extensiva a informação gerada pelos marcadores genômicos em combinação com informações tradicionais de performance para incrementar a produção por meio da seleção assistida por marcadores. As técnicas de seleção baseadas em marcadores moleculares têm sido fundamentais, principalmente, para seleção de caracteres de baixa herdabilidade como o número e peso de leitões nascidos e desmamados (Rothschild e Bidanel, 1998). Com o desenvolvimento de métodos melhoramento genético animal, a importância do parentesco tem sido evidenciado, uma vez que são usados para estimar o valor genético dos animais (Gedelman et al., 1986). Diversos autores têm utilizado a técnica de marcadores moleculares, especialmente marcadores do tipo microsatélites, para a realização de testes de paternidade em bovinos, mas ainda existem diversas pesquisas com o objetivo de verificar a eficiência de conjunto de marcadores em testes paternidade (Lara et al., 2005). Para que marcadores moleculares possam ser aplicados em programas de melhoramento de aves visando benefícios para a produção e qualidade do produto, estes primeiramente devem ser identificados e associados com características de interesse para avicultura. O mapeamento de QTL (loci que controlam características quantitativas) e estudos de expressão gênica são procedimentos utilizados para decifrar parte do controle genético de características de interesse econômico. A identificação de marcadores associados a QTLs pode ser feita através de varredura de todo o genoma, utilizando-se marcadores microssatélites (Andersson e Georges, 2004). Kaam et al. (1999a) utilizaram dados de desempenho de cerca de 2000 animais F3 oriundos do cruzamento de duas linhas fêmea de corte. As gerações F1 e F2 foram genotipadas para 420 marcadores microssatélites. Quatro QTLs fomam encontrados. O QTL mais significativo foi localizado no cromossomo 1 para consumo de ração entre 23 e 48 dias, além de apresentar ligação sugestiva para ganho de peso de 23 a 48 dias e peso corporal aos 48 dias. Um segundo QTL foi encontrado no grupo de ligação WAU26 com ligação sugestiva para consumo de 23 a 48 dias. O terceiro QTL foi encontrado no cromossomo 4 que também afeta o consumo de ração. O quarto QTL foi encontrado no cromossomo 2 que afetou o consumo de ração ajustado para o peso corporal. Analisando características de carcaça, Kaam et al. (1999b) identificaram dois QTLs com ligação sugestiva. O mais significativo foi localizado no cromossomo 1, com efeito na porcentagem de carcaça e o outro no cromossomo 2, que afeta a coloração da carne. CONSIDERAÇÕES FINAIS Os avanços nas pesquisas em genômica estrutural e funcional, no mapeamento comparativo dos genes de diferentes espécies e na genética quantitativa estão acelerando o processo de descobrimento da função 1600

14 dos genes. Estas descobertas e estudos têm se mostrado de extrema importância no desenvolvimento de novos conhecimentos na área de nutrição, onde, a partir de agora, pode-se ter acesso a explicações que até então eram desconhecidas. Espera-se que com as intensas pesquisas realizadas atualmente acerca deste assunto, as áreas de nutrição, sanidade e genética tenham um grande desenvolvimento nos próximos anos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Andersson, L. and Georges, M Domestic-animal genomics: deciphering the genetics of complex traits. Nat Rev Gen., 5: Berdal, K.G and Holst-Jensen, A Roundup ready soybean event-specific real-time quantitative PCR assay andestimation of the practical detection and quantification limits in GMO analyses. Eur Food Res Technology., 213(6): Bourneuf, E.; Hérault, F. and Chicault, C Microarray analysis of differential gene expression in the liver of lean and fat chickens. Gene, 372: Bovenhuis, H.; Van Arendonk, J.A.M. and Davis, G Detection and mapping of quantitative trait loci in farm animals. Livest Prod Sci., 52: Bradburn, N. and Coker, R.D Aflatoxin contamination in maize. Trop Sci., 33(44): Britten, R.J Majority of divergence between closely related DNA samples is due to Indels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100(8): Dawson, K.A. and Harrison, G.A. Using Nutrigenomic Approaches for Understanding Forage Quality and Nutrient Restriction. 22nd Annual Southwest Nutrition & Management Conference, February 22-23, 2007, Tempe, AZ 22. Dick, Z.; New PCR-based test replaces microscopy screening of feed. All about feed. 1(1). <www.allaboutfeed.net/.../new-pcr-based-test-replacesmicroscopy-screening-of-feed- id1520.html>. Acessado em: Drobnic, K. and Budowle, B The analysis of three short tandem repeat (STR) loci in the Slovene population by multiplex PCR. J Forensic Sci, 45(4): Gao, Y.; Zhang, R.; Hu, X.X. and Li, N Application of genomic technologies to the improvement of meat quality of farm animals. Meat Sci., 77: Garosi P., Filippo C., Erk M., Rocca-Serra P., Sansone S.A. and Elliott R Defining best practice for microarray analyses in nutrigenomic studies. Br J Nutr.93(4): Gedelman, H., Pieper, U. and Weber, W.E Effect of misidentification on the estimation of breeding value and hereditability in cattle. J.Anim. Sci., 63: Gibbs, R.A Amplificação do DNA pela reação em cadeia da Polymerase. Quim Anal., 62:

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