Um Sistema Computacional para Diagnosticar. Construção de Primers Espécie-Específicos

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1 Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de Tecnologia Programa de Pós-Graduação em Engenharia Elétrica Dissertação de Mestrado Um Sistema Computacional para Diagnosticar Viroses de Plantas Usando a Técnica de PCR com Construção de Primers Espécie-Específicos AUTOR: Kliger Kissinger Fernandes Rocha ORIENTADOR: Prof. Dr. Luiz Marcos Garcia Gonçalves CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Paulo Sérgio Marinho Lúcio Natal/RN Brasil Abril de 2005

2 Um Sistema Computacional para Diagnosticar Viroses de Plantas Usando a Técnica de PCR com Construção de Primers Espécie-Específicos Kliger Kissinger Fernandes Rocha Aprovada, em 04 de abril de 2005, pela Comissão Examinadora formada pelos seguintes membros: Profa. Dra. Eliana Silva de Almeida TCI-UFAL Prof. Dr. José Alfredo Ferreira da Costa UFRN Prof.Dr.PauloSérgioMarinhoLúcio UFRN(Co-Orientador) Prof. Dr. Luiz Marcos Garcia Gonçalves UFRN (Orientador) NATAL, RN BRASIL Abril de 2005.

3 Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de Tecnologia Programa de Pós-Graduação em Engenharia Elétrica Kliger Kissinger Fernandes Rocha Um Sistema Computacional para Diagnosticar Viroses de Plantas Usando a Técnica de PCR com Construção de Primers Espécie-Específicos Dissertação submetida ao Programa de Pós- Graduação em Engenharia Elétrica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos necessários para obtenção do grau de Mestre em Ciências (M.Sc.). ORIENTADOR: Prof. D.Sc. Luiz Marcos Garcia Gonçalves CO-ORIENTADOR: Prof. D.Sc. Paulo Sérgio Marinho Lúcio Natal/RN Brasil Abril de 2005

4 A Deus onde sempre encontro forças para superar as dificuldades. Aos meus pais; Consuelo Fernandes Rocha e ManoelFerreiradaRocha(in memorian), exemplos de vida, mentores da minha evolução profissional e moral. As minhas irmãs, Kelly Cristina Fernandes Rocha e Janine Fernandes Rocha, facilitadoras de meu aprendizado, minha paz e felicidade.

5 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE Date: abril de 2005 Author: Kliger Kissinger Fernandes Rocha Title: Um Sistema Computacional para Diagnosticar Viroses de Plantas Usando a Técnica de PCR com Construção de Primers Espécie-Específicos Department: Programa de Pós-Graduação em Engenharia Elétrica Degree: M.Sc. Convocation: May Year: 2005 Permission is herewith granted to Federal University of Rio Grande do Norte to circulate and to have copied for non-commercial purposes, at its discretion, the above title upon the request of individuals or institutions. THE AUTHOR RESERVES OTHER PUBLICATION RIGHTS, AND NEITHER THE THESIS NOR EXTENSIVE EXTRACTS FROM IT MAY BE PRINTED OR OTHERWISE REPRODUCED WITHOUT THE AUTHOR S WRITTEN PERMISSION. THE AUTHOR ATTESTS THAT PERMISSION HAS BEEN OBTAINED FOR THE USE OF ANY COPYRIGHTED MATERIAL APPEARING IN THIS THESIS (OTHER THAN BRIEF EXCERPTS REQUIRING ONLY PROPER ACKNOWLEDGEMENT IN SCHOLARLY WRITING) AND THAT ALL SUCH USE IS CLEARLY ACKNOWLEDGED. ii

6 Agradecimentos Agradeço principalmente à Deus, inteligência suprema, causa primária de todas as coisas, por sempre me doar todas as condições necessárias para evoluir como consciência e tantos motivos para agradecer e ser feliz. Aos meus amorosos pais, por vários motivos: pela educação fundamentada na ética e no amor responsável, pelo apoio financeiro, pelos exemplos de seres humanos louváveis na conduta moral, por terem me concebido com muito amor, pelas renuncias, pela paciência, pelas crenças e valores Cristãos... Enfim, por dedicarem-se tanto pela felicidade dos filhos. Às minhas irmãs, pelo convívio amoroso que sempre facilita o meu sucesso e felicidade. Aos prezados orientadores (Prof. Paulo Marinho e Prof. Luiz Marcos), modelos de profissionais, por me aceitarem como orientando, pelas valiosas informações para minha formação profissional, e principalmente por me incentivarem e investirem tanto na minha qualificação profissional. À banca examinadora, pelas importantes contribuições para melhorar este trabalho. À CAPES, pelo apoio financeiro recebido. Aos amigos: Hani e família, Sheila Mara e Susy; por todos os momentos que passamos juntos compartilhando sentimentos e idéias que contribuíram para o meu sucesso neste trabalho. E agradeço também aos colegas: Francisco Cardoso, César e Maristela Holanda. iii

7 A todos os professores do meu histórico como estudante, pelos ensinamentos que contribuíram para uma melhor compreensão deste trabalho, e ampliação da minha visão de mundo. E, nesta fase de Pós-Graduação, agradeço em especial aos seguintes Professores: Dr. Luiz Affonso Henderson Guedes de Oliveira pela orientação no Estágio Docente; e Dra. Patrícia Sommer pelo incentivo e apoio. Aos funcionários da UFRN que colaboraram, principalmente a Santana, por sempre ser prestativo. A todos que, de bom grado, contribuíram direta e indiretamente até em anonimato para a minha formação profissional e não foram citados nestes agradecimentos. iv

8 Conteúdo Resumo Abstract 1 Introdução MotivaçãoparaoTrabalho Organização da Dissertação Os Primers e a Técnica PCR AtécnicaPCR O Problema do Projeto e Escolha de Primers OMétodoTradicional OProblemadeAlinhamento OAlgoritmodeForçaBruta Algoritmo OProblemadaConstruçãodePrimers Temperaturadedesnaturação(Tm)etempo TemperaturadeAnelamento(TA)econstruçãodeprimer Comprimentodoprimer Primersdegenerados TemperaturadeExtensão NúmerodeCiclos Uma Solução Computacional OSistema OMódulodeAlinhamento OMódulodeConstruçãodePrimers Programação,PlataformaeInterface Experimentos e Resultados Experimentos Cenário Cenário Conclusão e Perspectivas 56 Referências Bibliográficas v

9 Lista de Figuras 1.1 EtapasdociclodePCR Interfaces dos locais na Internet usados para alinhamento de seqüências de genomas Primernafita-moldecomhidroxilalivreenucleotídeocomfosfatolivre OsprimeirosquatrociclosdeumaPCR Etapas de PCR (amplificação exponencial em 30 ciclos) Termociclador Ingredientes da reação in vitro dapcr Exemplos de complementaridade inter- e intra-primers que resulta em problemas GeldeEletroforesecomváriostamanhosdefragmentosamplificadosporPCR FuncionamentodoAlgoritmodeForçaBruta Seqüências de primers foram derivadas dos alinhamentos múltiplos de seqüência FormatoFasta Formatodoarquivodeprimersdoprograma Telainicialdoprograma Telamostraemquesequenciaeposiçãodasequenciaseencontraoprimer Teladeresultadosquemostraasregiõesespecificas Teladeresultadosquemostraasregiõesuniversais Tela mostrando os primers da região específica com seus respectivos parâmetros TeladeresultadosdoEntreznoNCBImostrando7genomasdevírusdabatata Tela de Resultados do Blast-N para Potato Vírus V Tela de Resultados do Blast-N para Cherry rasp leaf virus RNA Tela de Resultados do Blast-N para Cherry rasp leaf virus vi

10 5.5 Tela de Resultados do Blast-N para Potato Vírus Y Tela de Resultados do Blast-N para Narcissus mosaic virus Tela de Resultados do Blast-N para Potato Vírus M Tela de Resultados do Blast-N para Potato Vírus A TeladeresultadosdoEntreznoNCBIcom4genomasdevírusdemeloeiro Tela de Resultados do Blast-N para Cucurbit yellow stunting disorder virus RNA Tela de Resultados do Blast-N para Cucurbit yellow stunting disorder virus RNA Tela de Resultados do Blast-N para Melon chlorotic leaf curl virus Tela de Resultados do Blast-N para Melon necrotic spot virus vii

11 Lista de Gráficos, Diagramas e Tabelas 3.1 GráficodeTempodeExecuçãodeForçaBruta GráficodeperformancedaúltimaversãodoalgoritmodeForçaBruta DiagramadeAcessibilidadeaobancodedados DiagramadeArquiteturadoSistema DiagramadoMódulodeAlinhamento DiagramadoMódulodeConstruçãodePrimers SoluçõesdoSistemaDadasaosDiversosProblemasAbordados TabeladePrimersdeEspéciesdeVirosesdeBatataObtidaPeloProgramaProposto Tabela de Primers de Espécies de Vírus do Meloeiro Obtida Pelo Programa Proposto. 50 viii

12 Resumo Propõe-se uma solução computacional baseada no desenvolvimento de um software para construir primers espécie-específicos, usados para melhorar o diagnóstico de viroses de planta por PCR. Primers são indispensáveis à reação PCR, além de proporcionar a especificidade do diagnóstico. Um primer é um fragmento de DNA sintético, curto e de fita simples, utilizado como um iniciador na técnica PCR que flanqueia a seqüência que se deseja amplificar. Primers espécie-específicos são primers que só indicam a região bem conhecida de início e término onde a enzima polimerase vai amplificar, de uma determinada espécie, ou seja, é específica para somente uma espécie. Assim, o objetivo principal deste trabalho é automatizar o processo de escolha de primers, otimizando a especificidade dos primers escolhidos pelo método tradicional. Palavras chaves: Design de Primer, PCR, Bioinformática ix

13 Abstract It proposes a established computational solution in the development of a software to construct species-specific primers, used to improve the diagnosis of virus of plant for PCR. Primers are indispensable to PCR reaction, besides providing the specificity of the diagnosis. Primer is a synthetic, short, single stranded piece of DNA, used as a starter in PCR technique. It flanks the sequence desired to amplify. Species-specific primers indicate the well known region of beginning and ending where the polymerase enzyme is going to amplify on a certain species, i.e. it is specific for only a species. Thus, the main objective of this work is to automatize the process of choice of primers, optimizing the specificity of chosen primers by the traditional method. Keywords: Primer Design, PCR, Bioinformatics x

14 Capítulo 1 Introdução A Bioinformática visa compreender problemas em que questões biológicas delineiam questões algorítmicas, bem como propor suas soluções. É uma área de pesquisa relativamente nova, com um crescimento substancial de trabalhos. Na primeira metade da década de 80, foi desenvolvido um método de amplificação de seqüências de DNA que revolucionou a análise genética nestes últimos anos: a reação em cadeia da polimerase (ou PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction). Esta técnica possibilita que múltiplas cópias de uma molécula de DNA sejam geradas por meio da amplificação enzimática de uma seqüência de DNA escolhida. A técnica baseia-se na capacidade que a enzima DNA polimerase tem de replicar seqüências de DNA, em certas condições laboratoriais, a partir de um par de pequenos fragmentos iniciadores da fita molde, denominados de primers. Figura Etapas do ciclo de PCR [41]

15 A Figura 1.1 ilustra a técnica. Através de variações alternadas e cíclicas de temperatura que permitem a desnaturação (ex. 92ºC, abertura da fita dupla de DNA), anelamento (ex. 54ºC, pareamento dos primers ou iniciadores) e extensão (ex. 72ºC, cópia da fita dupla original pela incorporação de nucleotídeos nas fitas complementares). Assim, uma determinada seqüência de DNA é replicada, ciclo após ciclo, em progressão geométrica (figura 2.3), o que torna possível sua visualização em gel de eletroforese na forma de uma banda (figura 2.7). O desenvolvimento dessa técnica e suas aplicações concederam ao americano Kary Mullis o Prêmio Nobel em Química em As aplicações da técnica são inúmeras, conforme pode ser verificado em revisão feita por Mullis, Rerré e Gibbs [23]. A PCR tem sido utilizada, por exemplo, desde experimentos relacionados ao seqüenciamento de DNA até aplicações comerciais na área de diagnose. Algumas variações da PCR levaram ao desenvolvimento de outras técnicas poderosas na análise de diversidade genética, como: AFLP, RAPD, SAMPL e SSR. # % ) %, / 0 O trabalho desenvolvido foi inicialmente motivado pela necessidade de se estabelecer condições técnicas de identificação por PCR de viroses em plantas no Estado do Rio Grande do Norte. Especificamente, procurou-se desenvolver uma ferramenta em bioinformática que aperfeiçoasse a escolha de primers ou oligonucleotídeos para a reação de PCR. Neste trabalho, o aplicativo desenvolvido e otimizado evitaria a fabricação de oligonucleotídeos pouco eficientes na identificação das viroses em plantas caso fossem escolhidos manualmente. Para o desenvolvimento da ferramenta foi necessário, no entanto, especificar quais os parâmetros que influenciariam na qualidade da amplificação por PCR. Estes parâmetros têm uma influência direta na construção de primers. Por outro lado, há que considerar que a região do genoma viral tem que garantir a especificidade do diagnóstico em nível de espécie do agente causador da virose. Uma das principais motivações que encontramos é a tentativa de diminuir ou eliminar o prejuízo na fruticultura do Estado do Rio Grande do Norte, onde plantadores têm queimado plantas em áreas agrícolas por causa de suspeita de apenas um ou alguns exemplares da planta com virose. O problema é que muitas vezes não é virose, podendo ser outro agente patogênico ou deficiência ou mesmo o excesso de nutrientes. Mas, para evitar o risco de uma epidemia, infelizmente, quase sempre é preferido o modo drástico de resolver o problema; queimando toda a área plantada. Isso gera prejuízo na agricultura de exportação do Estado, e do país. 2

16 A motivação biológica de ser um programa de primers para vírus é o fato de que, por serem organismos altamente instáveis, compostos por genes mutantes e recombinantes, os vírus pesquisados apresentam problemas quanto a sua erradicação. Basicamente, o software contempla dois módulos: um módulo de alinhamento dos genomas de vírus para separar as áreas polimórficas, e o segundo módulo é de construção de primers específicos para diagnosticarem uma determinada espécie de vírus por PCR. Testes e experimentos foram realizados e os resultados foram satisfatórios para genomas pequenos como os de vírus. O presente trabalho já publicou resultados parciais em pôster no SIBGRAPI 2003 [44], e em artigo completo no 4th IEEE International Symposium on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE 2004) [45]. Mesmo usando o Algoritmo da Força Bruta [12], considerado um método simples, uma intensa modificação realizada foi no sentido de evitar comparações desnecessárias e melhorou em 75% a performance de tempo do programa. A principal questão deste trabalho é propor uma estratégia de escolha de primers eficiente para diagnosticar um patógeno (agente biológico capaz de causar doença) suspeito. A resposta a esta questão avança a metodologia de diagnóstico molecular em nível de espécie, facilitando no processo de tratamento. Como contribuições deste trabalho podem-se citar a construção de um banco de dados, contendo seqüências de vírus de plantas, e um sistema para alinhar e separar domínios de seqüências. O banco de dados que este trabalho se refere é uma coleção ordenada de arquivos semelhantes, em conformidade com um formato padrão de conteúdo. O banco de dados de arquivos simples pode ser pesquisado devido à indexação. Contudo, à medida que a coleção de arquivos simples fica cada vez maior, torna-se ineficaz trabalhar com ela. Esta estratégia melhora a mineração de dados no banco de dados, encontrando seqüências e gerando múltiplos alinhamentos. Essas seqüências podem compartilhar similaridades com domínios e diferenciar entre domínios polimórficos. Trabalhou-se com domínios polimórficos para construir primers com especificidade elevada. Além disso, o programa desenvolvido possibilita também um estudo de polimorfismo por possuir um módulo de alinhamento indicando regiões com polimorfismo e regiões similares entre duas ou mais espécies de vírus. A construção de um banco de dados contendo arquivos de vírus de plantas é também uma necessidade do sistema, além de otimizar o acesso e a mineração de dados para tomada de decisões pelo pesquisador, pode ser fonte de pesquisa para o pesquisador descobrir aspectos importantes da Filogenia de vírus. A Filogenia descreve a origem e a evolução das espécies. 3

17 3 5 % 7 : ; B % O Capítulo 2 trata dos trabalhos relacionados, discutindo a contribuição deste trabalho comparado às publicações estudadas. Um apanhado do estado da arte é apresentado, incluindo informações teóricas básicas, necessárias ao entendimento do problema tratado. No Capítulo 3, apresentamos o histórico, especificação e detalhamento do problema abordado, incluindo um estudo dos parâmetros necessários à técnica PCR. O capítulo 4 aborda a solução teórica encontrada, apontando para possíveis formas de resolver o problema. Neste Capítulo, apresentamos também a solução computacional adotada para solucionar o problema e os módulos do programa implementados. No capítulo 5 são mostrados os resultados de diversos experimentos e testes realizados para validar o sistema computacional proposto. Por fim, no Capítulo 6 é apresentada a conclusão sobre o trabalho, e perspectivas futuras relacionadas ao projeto. 4

18 Capítulo 2 Os Primers e a Técnica PCR Muitos trabalhos na área de Biologia Molecular estão relacionados com a construção e escolha de primers para diagnóstico, sendo alguns deles estudados neste trabalho [01 a 11]. A maioria desses usa programas somente para construção de primers sem prever por alinhamento que região do genoma a ser amplificada seria ideal. A proposta deste trabalho é automatizar e aperfeiçoar o processo com a estratégia do alinhamento antes da construção de primers. Alguns métodos computacionais ou programas estão disponíveis atualmente para a construção de primers [01,02,03], com uma finita probabilidade de produzir erros. Os trabalhos encontrados na literatura descrevem os passos envolvidos no processo e os esforços dispensados para automatizá-lo. A proposta geral é selecionar uma região para construir um primer onde a probabilidade de erro de diagnóstico usando PCR seja baixa [01,03], considerando não somente as regiões selecionadas visualmente, mas também regiões examinadas estatisticamente. Convém ressaltar que, em relação aos programas disponíveis na Internet, públicos e privados, o programa proposto neste trabalho tem várias vantagens, sendo a automação do processo de diagnóstico para um usuário sem muitos conhecimentos técnicos de computação uma das principais delas. O programa desenvolvido lista vários primers candidatos com os respectivos atributos para a correta decisão do especialista. No modo como são listados os primers, pode-se distinguir facilmente as vantagens dos candidatos. No módulo de alinhamento do programa proposto, deseja-se comparar duas ou mais seqüências genéticas, sendo esta, tradicionalmente, a operação básica de bioinformática. Através da comparação de seqüências, podem-se obter várias informações, tais como: similaridade (medida numérica que indica quão similares são duas seqüências); presença ou não de homologia (indica se dois ou mais genes possuem uma história evolutiva comum); alinhamento entre seqüências (forma de se colocar uma seqüência "em cima" da outra, de maneira a evidenciar a correspondência entre caracteres ou subcadeias similares das seqüências); entre outras. Esta 5

19 metodologia não é aplicada pela maioria dos programas para projetar primers estudados neste trabalho. O programa público Gene Fisher tem a mesma metodologia [40] de busca, mas usa o CLUSTALW ou DCA como programa de alinhamento, dependendo da demora na Internet o processo é moroso e não é considerado totalmente automatizado. Ainda, o programa proposto neste trabalho não tem somente uma funcionalidade básica (construção de primers espécieespecíficos), mas também permite ao pesquisador estudar o polimorfismo de vírus em uma mesma família, e entre taxonomias diferentes. Existem alguns problemas no caso múltiplo que não existem no caso básico: a pontuação dos alinhamentos; complexidade da abordagem que utiliza programação dinâmica pura (trata-se de um problema NP - completo); criação de heurísticas que aumentem a velocidade da computação; etc. Existem tanto estudos teóricos que atacam esses problemas quanto algoritmos que implementam essas heurísticas (métodos de alinhamento em estrela, em árvore, e outros), tornando possível, assim, viabilizar o alinhamento de múltiplas seqüências. O estudo de algoritmos de Bioinformática teria sido incompleto se não fosse abordado um tema cuja importância aumenta a cada dia: a comparação de seqüências genéticas em bancos de dados. A busca de seqüências em bancos de dados permite determinar quais das centenas de milhares de seqüências presentes no banco podem estar relacionadas a uma dada seqüência. Nesse tipo de ambiente, a operação básica consiste em alinhar uma seqüência de consulta com as seqüências do banco de dados. Os atuais bancos de dados de seqüências já são gigantescos, e continuam a crescer numa taxa exponencial, como por exemplo o Genbank em 2004 publicou pares de bases e seqüências [43]. Isso torna a aplicação de programação dinâmica pura inviável, obrigando o uso de heurísticas, que aumentam bastante a velocidade dos alinhamentos (mas com uma pequena probabilidade de perder alinhamentos verdadeiros). Os dois programas de busca de seqüências mais usados na atualidade são o FASTA e o BLAST (vide Figura 2.1). O FASTA foi o primeiro de todos os programas do tipo a ser amplamente utilizado, enquanto o BLAST, posteriormente introduzido, trouxe uma série de refinamentos. Quando de uma busca, ambos aplicam em primeiro lugar métodos heurísticos e, após a obtenção de uma lista inicial de seqüências, métodos baseados em programação dinâmica são usados para, finalmente, gerarem a lista final de hits. Esta palavra hits pode ser identificada rapidamente pre-indexando todas as palavras da query e então consultando o índice na medida que o BD é pecorrido. A Figura 2.1 mostra as telas de entrada de dados do FASTA e do BLAST, respectivamente, acessíveis por seus web sites [42,43]. 6

20 Figura 2.1: Interfaces dos locais na Internet usados para alinhamento de seqüências de genomas. 7

21 O programa desenvolvido neste trabalho compara as seqüências obtidas de um banco de dados com uma seqüência padrão, identificando e numerando as alterações encontradas. Além disso, é possível no sistema concluir informações importantes cruzando estes resultados de alinhamento com os dados dos respectivos vírus estudados. O sistema desenvolvido forma uma parte do elo de ligação entre os dados biológicos de vírus, de um lado, e as informações de seqüências genéticas, de outro, recebendo dados tanto de arquivos Fasta de seqüenciadores quanto dos bancos de dados genéticos de vírus de plantas. Esta ferramenta computacional é extremamente útil em comparação às outras de domínio público, ao permitir um controle muito mais acurado no projeto de primers específicos, e uma mineração de dados pelo relacionamento com o banco de dados de vírus. D E G H I J K L N K O P Q S A técnica de PCR (do inglês Polymerase Chain Reaction, reação em cadeia da polimerase) consiste numa reação em que uma região pequena e específica do genoma é amplificada por síntese, pela polimerase de DNA. A reação em cadeia da polimerase possibilita a amplificação de uma seqüência rara de DNA a partir de uma mistura complexa, sem a necessidade de clonagem molecular. Esta técnica é amplamente utilizada em pesquisa básica, em medicina forense e no diagnóstico de doenças genéticas e infecciosas. Inicialmente, é necessária a construção por síntese química de dois oligonucleotídeos de DNA ou primers (iniciadores) complementares, as extremidades de cada fita de DNA, flanqueando a região de interesse. Estes oligonucleotídeos servem como iniciadores da síntese de DNA in vitro, que é catalisada pela DNA polimerase, devido ao primer fornecer uma extremidade de hidroxila livre onde a DNA polimerase catalisará a reação deste composto com o grupo fosfato de um nucleotídeo correspondente à base nitrogenada da fita-molde (vide Figura 2.2). Um ciclo de PCR começa com a desnaturação por calor (95 C), promovendo a separação da fita dupla de DNA. A reação é resfriada na presença de um excesso dos dois oligonucleotídeos, possibilitando a hibridização dos dois iniciadores com a seqüência complementar presente no DNA alvo. Em seguida, a reação é incubada para atividade da DNA polimerase, produzindo novas fitas de DNAs a partir dos iniciadores e utilizando quatro desoxirribonucleotídeos (datp, dctp, dgtp e dttp) (vide Figura 2.6) [24]. Cada novo ciclo da reação inicia-se com o aquecimento para desnaturação da dupla fita de DNA, seguido de resfriamento para hibridação dos iniciadores e síntese de uma nova fita pela 8

22 DNA polimerase a partir dos iniciadores, sendo que as fitas de DNA recém sintetizadas servem de molde no ciclo seguinte. Portanto, em cada ciclo é sintetizado o dobro do DNA produzido no ciclo anterior. A Figura 2.3 mostra no terceiro ciclo, duas duplas fitas que apresentam o tamanho correto sendo copiadas (as duas fitas com o mesmo tamanho). No quarto ciclo, 8 duplas fitas que apresentam o mesmo tamanho são copiadas. Usualmente, são realizados entre 20 e 30 ciclos para amplificação de um segmento de DNA específico dentro de um genoma (Figura 2.4) usando uma máquina termocicladora (máquina que varia a temperatura da PCR em segundos, vide Figura 2.5) e os ingredientes dentro de um tubo onde ocorre a reação mostrada na Figura 2.6. Fita-molde Grupo fosfato Hidroxila Primer Figura 2.2: fita-molde com hidroxila livre e nucleotídeo com fosfato livre Primer na Figura 2.3: Os primeiros 4 ciclos de uma PCR ( allserv.rug.ac.be/ ~avierstr/index.html) 9

23 Figura 2.4: Etapas de PCR (amplificação exponencial em 30 ciclos) Figura 2.5: Termociclador Figura 2.6: Ingredientes da reação in vitro da PCR 10

24 Nas primeiras iniciativas para amplificar fragmentos de DNA, utilizava-se a enzima DNA polimerase da Escherichia coli, que possui atividade máxima a 37 C. Esta enzima deveria ser adicionada a cada ciclo, pois o passo de desnaturação inativa a enzima. Um importante avanço ocorreucomadescobertadeaenzimataqdnapolimerase[25]oriundadabactériathermus aquaticus. A Taq DNA polimerase possui atividade ótima a 72 C e permanece razoavelmente estável mesmo a 95 C e com isto, a enzima é adicionada somente no inicio do processo. 11

25 Capítulo 3 O Problema do Projeto e Escolha de Primers Viroses de plantas constituem um sério problema que afeta a produção de plantas tropicais. No caso de algumas plantas como o mamão, por exemplo, eles são responsáveis pelo abandono da área contaminada pelo PRSV (Papaya Ring Spot Virus), PMV (Papaya Mosaic Virus) ou PMeV (Papaya Meleira Virus) [27], como tem recentemente ocorrido no Brasil. Outros vírus de planta poderiam ser citados aqui que apresentem as mesmas conseqüências. O controle de vírus de planta empregado em produção de plantas é baseado na identificação dos sintomas da virose que são visíveis quando a contaminação é potencialmente um risco para outras plantas. Estas plantas são então eliminadas da plantação e normalmente queimadas. A identificação prévia do vírus de planta pelas técnicas da biologia molecular representa uma maneira eficiente para prevenir contaminações de vírus em grande escala e pode ser empregada em muitas situações como a triagem de plantas importadas pelas instituições de segurança de plantas. Estas técnicas moleculares estão baseadas na PCR que permite a amplificação de seqüências de vírus específicos do DNA da planta afetada. Reações de PCR específicas são mais eficientes usando oligonucleotídeos normalmente com um tamanho entre 16 e 30 bases [05]. Estes primers específicos são escolhidos concordando com seqüências conhecidas presentes no DNA amplificado do genoma, que neste caso são regiões do genoma do vírus. Alguns critérios que permitem uma boa escolha de primers devem ser considerados. É importante, por exemplo, evitar as seguintes falhas: formação de dímeros de primers, auto-complementariedade (vide figura 3.1), temperatura de fusão muito baixa, e/ou estabilidade interna incorreta. Primers devem ser construídos com mecanismos de detecção de conteúdo de G+C baixo. Estes critérios podem ser tratados por ferramentas de Bioinformática na escolha de primers sem problemas da fonte de DNA e pode ser produzido pela escolha de qualquer primer para PCR. A 12

26 X escolha de primers específicos para a identificação de vírus de plantas para serem usados no diagnóstico de viroses deveria considerar, tendo em vista os critérios gerais acima, a complexidade de famílias de vírus de plantas e diferentes espécies. Portanto, a construção do primer é o principal fator a ser considerado e todos os outros parâmetros devem ser considerados na sua construção. Por isso, esta abordagem computacional é eficiente para a identificação de vírus de plantas. U V W Y Z \ ] ^ ] ` a b ^ c d c ] f b g A escolha de primers pelo processo tradicional [07] é mais propícia a erros, pois, neste processo, o pesquisador utiliza várias ferramentas diferentes para a escolha do par de primers, conseqüentemente sofre a demora do processo por depender da Internet, e nem sempre os primers escolhidos garantem a eficiência ou especificidade do diagnóstico. Isso acarreta prejuízo com o gasto de primers ineficientes e demora no diagnóstico. O processo tradicional de escolha de primers tem os seguintes passos: 1. O pesquisador deve procurar as seqüências do genoma do(s) vírus desejados em um banco de dados. O banco mundial de dados genômicos é o Genbank [42]. O processo de copiar a seqüência genômica de interesse do Genebank é demorado por ser bastante requisitado via Internet. 2. Em seguida deve-se fazer um alinhamento múltiplo com as várias seqüências genômicas suspeitas usando algum programa disponível na Internet. Isso é necessário para descobrir se existe uma ou mais regiões espécie-específicas. 3. Tal região deve ter um tamanho de no mínimo 150 bases, pois será amplificada na técnica de PCR pela escolha de dois primers. A visualização pela eletroforese torna-se mais eficiente quanto maior for esta região (vide Figura 3.2). Além do tamanho da região a ser amplificada, o pesquisador deve também se preocupar em encontrar de 14 a 20 bases iniciadoras nas extremidades desta região, complementares a primers que tenham características similares. 4. Estas características similares devem ser calculadas cuidadosamente seguindo alguns parâmetros. No entanto, os parâmetros usados para que os primers sejam específicos para uma determinada espécie de vírus de planta não são controlados de modo eficiente pelos programas de construção de primers também disponíveis na Internet. 13