Universidade Federal de Rondônia Núcleo de Saúde Mestrado em Biologia Experimental. Caracterização do vírus dengue circulante no Estado de Rondônia

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1 Universidade Federal de Rondônia Núcleo de Saúde Mestrado em Biologia Experimental Caracterização do vírus dengue circulante no Estado de Rondônia Leonir Santos de Souza Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental, da Universidade Federal de Rondônia, como requisito à obtenção do título de Mestre em Biologia Experimental. Porto Velho - RO 2005

2 1 Universidade Federal de Rondônia NÚCLEO DE SAÚDE Mestrado em Biologia Experimental Caracterização do vírus dengue circulante no Estado de Rondônia Leonir Santos de Souza Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental, da Universidade Federal de Rondônia, como requisito à obtenção do título de Mestre em Biologia Experimental. Orientador: Prof. Dr. Luiz Hildebrando Pereira da Silva Apoio: WHO/DR Special Programme for Research and training in tropical Disease, Financiadora Nacional de Projetos FINEP e a Rede da Amazônia Legal de Genoma REALGENE. Porto Velho RO 2005

3 2 FICHA CATALOGRÁFICA De Souza, Leonir Santos Caracterização do Vírus Dengue no Estado de Rondônia / Leonir Santos de Souza. nº pág.61. Dissertação (mestrado) Fundação Universidade Federal de Rondônia. Porto Velho, Área de concentração: Virologia Orientador: Profº Dr. Luiz Hildebrando Pereira da Silva. 1. Dengue 2. Diagnóstico molecular 3.Rondônia

4 3 DEDICO À minha mãe Maria e ao meu pai José, que apesar das limitações sempre valorizaram o estudo e a construção do conhecimento investindo suas energias e incentivos a todos os filhos. Aos meus dois queridos filhos, Henrique e Lívia que enchem minha casa de alegria e novidade.

5 4 AGRADECIMENTOS Ao meu DEUS Jeová,הוהי a quem recorro em oração em todos os momentos da vida. À Leonardo da Vinci Monteiro, meu marido e companheiro a treze anos, pelo seu bom humor e paciência. inestimável. À Glauciane por disponibilizar seu tempo no laboratório e pela ajuda família. Aos meus irmãos Leina, Leon, Moisés e José que são minha referência de À Denaia, que aceitou o desafio de cuidar da minha casa, dos meus filhos, trazendo tranqüilidade e organização ao meu dia-a-dia. À Maria Antônia, Lúcia Helena e Marisete que ficaram e cuidaram das crianças nas horas que precisei. e Soraya. Aos colegas da Unidade de Virologia: Belgrano, Eduardo, Jaylson, Kellen, Aos colegas de trabalho da Escola Estadual José Otino de Freitas.

6 5 AGRADECIMENTOS ESPECIAIS Ao Professor Dr. Luís Hildebrando Pereira da Silva pela oportunidade e por proporcionar melhores condições para realização dessa pesquisa. Ao MSc. Weber Cheli Batista que abriu as portas do laboratório de Virologia e dispensou do seu tempo e energia para cooperar com o meu trabalho. À MSc. Deusilene Souza Vieira que ajudou incondicionalmente, acompanhando o meu trabalho de perto, dando sugestões e esclarecimentos.

7 6 RESUMO O dengue é a virose de transmissão vetorial mais relevante em termos de morbidade e mortalidade, apresentando quatro sorotipos distintos. O Estado de Rondônia apresenta um número crescente de casos de dengue. Portanto, a caracterização molecular e a subtipagem do vírus dengue além de deteminar o sorotipo circulante na região e a origem do vírus, nos auxilia no estabelecimento de uma correlação de virulência das amostras estudadas. Para identificar os sorotipos da dengue circulante no Estado de Rondônia coletaram-se oitenta e quatro amostras de soros de pacientes entre os meses de janeiro de 2004 a fevereiro de Isolou-se em células C6/36. Todas as amostras foram submetidas à extração pelo método TRIzol. Em seguida, realizou-se RT-PCR com os primers universais FG1 e FG2 que identifica Flavivirus. Para caracterizar os sorotipos, os amplicons foram submetidos a Hemi-Nested PCR utilizando os primers nden-1, nden-2, nden-3 e nden-4. Das oitenta e quatro amostras, quarenta e quatro foram positivas para Flavivirus e quarenta negativas, sendo todas as positivas sorotipadas como dengue tipo 3. Cinco amostras das quarenta e quatro foram escolhidas aleatoriamente, sendo seqüenciadas e comparadas com o DENV-3 circulante no Brasil pelo programa Clustal W, também construiu-se uma árvore filogenética através do método neighbouring joining, indicando que DENV-3 de Rondônia é a mesma que circula em outras regiões do Brasil. Todas as amostras caracterizadas como DENV-3 foram submetidas a RSS-PCR, para se saber a origem da cepa circulante no Estado, quarenta e três é do tipo C de origem na América Central, Sri Lanka ou Indonésia e uma do tipo B de origem nas Filipinas ou Indonésia.

8 7 ABSTRACT Dengue is the most relevant virus of vectorial transmission when it comes to morbidity and mortality, showing four different serotypes. The State of Rondônia presents an increasing number of dengue cases. Thus, the molecular characterization and the subtype of the virus, besides determining the serotype which is surrounding the region and the virus origin, helps us to establish a kind of correlation among the virulence of the samples. Eighty-four samples of patients serum were collected between January 2004 and February 2005, in order to identify the surrounding dengue serotypes in the State of Rondônia. They were isolated in C6/36 cells. All samples were submitted to extraction by TRIzol method. Subsequently, RT-PCR was made with the universal primers FG1 and FG2, which identify the Flavivirus. The amplicons were submitted to PCR Hemi-Nested, in order to mark the serotypes, using nden-1, nden-2, nden-3 e nden-4 primers. From the eighty-four samples, forty-four were positive to Flavivirus and forty negative, though all positive samples were serotyped as dengue type 3. Five out, from the forty-four samples were randomly chosen, sequenced and compared to DENV-3 surrounding in Brazil, by Clustal W program. A philogenetic tree was also built through the neighbouring joining method, showing that the Rondônia DENV-3 is the same one which circles other regions in Brazil. All the samples marked as DENV-3 were submitted to RSS-PCR, in order to identify the origin of the surrounding family in the State. Forty-three are type C, from Central America, Sri-Lanka or Indonesia and one is type B, from the Philippines or Indonesia.

9 8 LISTA DE FIGURAS Figuras nº Página 01 Mapa político do Estado Rondônia Esquema de um Vírion de Dengue Esquema da cadeia de leitura (ORF) e sua ordem de tradução Mapa de Rondônia das áreas amostrais Gel de agarose mostrando os amplicons da RT-PCR Gel de agarose mostrando os amplicons da Hemi-Nested-PCR para caracterização do DENV Seqüência gênica do DENV3 do Estado de Rondônia Alinhamento das amostras de Rondônia Árvore filogenética Gel de agarose mostrando o produto da RSS-PCR para subtipagem do DENV

10 9 LISTA DE TABELAS Tabelas nº Página 01 Seqüência dos primers e região de anelamento no genoma DENV Referencia do seqüenciameno gênico dos DENV Seqüência dos primers e região de anelamento na RSS-PCR Origem dos subtipos de DENV3 identificados na RSS-PCR Resultados das amostras analisadas com primers FG1 e FG Resultados das amostras analisadas através da Hemi-Nested-PCR 40

11 10 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS C Proteína do capsídio. cdna DNA complementar. CEPEM Centro em Pesquisa em Medicina Tropical. CIVD Coagulação intravascular disseminada. DENV Vírus Dengue. DENV1 Vírus Dengue tipo 1. DENV2 Vírus Dengue tipo 2. DENV3 Vírus Dengue tipo 3. DENV4 Vírus Dengue tipo 4. DNA Ácido Desoxirribonucléico. DHF Febre Hemorrágica do Dengue. DSS Síndrome do Choque da Dengue. E Proteína do envelope. ELISA Ensaio Imunoenzimático. FC Fixação do complemento. IFI Imunofluorescência indireta. IH Inibição da hemaglutinação. LACEN Laboratório Central de Rondônia. LCR Liquor céfalo raquidiano. Min. Minutos. NS Não estrutural. NS1 Proteína não estrutural 1. NS2a Proteína não estrutural 2a.

12 11 NS2b Proteína não estrutural 2b. NS3 Proteína não estrutural 3. NS4a Proteína não estrutural 4a. NS4b Proteína não estrutural 4b. NS5 Proteína não estrutural 5. OMS Organização Mundial de Saúde. ORF Cadeia aberta de leitura. PAHO Organização da Saúde Pan Americana. PCR Reação em Cadeia de Polimerase. prm Proteína pré de Membrana. RNA Ácido Ribonucléico. RNC Região não codificadora. RSS Restrição de Sítio específico. RT Transcriptase reversa. SESAU Secretaria Estadual de Saúde do Estado de Rondônia. SVS Secretaria de Vigilância em Saúde. TN Teste de Neutralização. YFV Vírus da Febre Amarela.

13 12 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO Considerações Gerais Aspectos Históricos Aspectos Epidemiológicos DENV nas Américas DENV no Brasil DENV em Rondônia Patogenia da DENV Genoma Viral Proteínas Virais Diagnóstico Laboratorial Testes Sorológicos Isolamento Viral Detecção do Genoma Viral Seqüenciamento Viral JUSTIFICATIVA OBJETIVOS MATERIAIS E MÉTODOS Amostras Biológicas Isolamento Viral Extração do RNA RT-PCR Confecção do cdna... 33

14 PCR e Hemi-nested-PCR Purificação Seqüenciamento do DENV Subtipagem do DENV RESULTADOS Isolamento Viral em Cultura de Célula RT-PCR Caracterização Molecular do DENV Análise de Seqüenciamento do DENV Análise Filogenética Análise da Subtipagem do DENV-3 por RSS-PCR DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXO A ANEXO B... 60

15 14 1. INTRODUÇÃO 1.1 Considerações Gerais O dengue é a virose de transmissão vetorial mais relevante em termos de morbidade e mortalidade, sendo transmitida pela fêmea do mosquito Aedes aegypti (BANCROFT, 1906 apud FOCACCIA & VERONESI, 2002). Esta virose se apresenta nos grandes centros urbanos de várias regiões do mundo, principalmente em áreas tropicais e subtropicais, sob a forma de epidemias de grande magnitude ou sob a forma hiperendêmica, nos lugares onde há um ou mais sorotipos circulantes, como no caso do Brasil (TEIXEIRA et al., 1999). O vírus do dengue (DENV) classifica-se em quatro sorotipos antigenicamente distintos, denominados dengue sorotipo 1 (DENV-1), dengue sorotipo 2 (DENV-2), dengue sorotipo 3 (DENV-3) e dengue sorotipo 4 (DENV-4) (SCHERER, 1968 apud FOCACCIA & VERONESI, 2002). Cada um desses sorotipos possui diversos genótipos que diferenciam entre si por variações na seqüência de nucleotídeos, em nível dos genes da glicoproteína E, e da junção dessa glicoproteína com a proteína NS1(CALISHER et al., 1989). A infecção por qualquer um dos quatro sorotipos pode produzir manifestações que variam desde uma síndrome viral inespecífica e benigna, até um quadro grave e algumas vezes fatal de febre hemorrágica do dengue (Dengue hemorrhagic Fever DHF) ou síndrome do choque do dengue (Dengue Shock Sydrome DSS). São fatores de risco para casos graves: a cepa do sorotipo infectante, o estado imunológico e genético do paciente, a concomitância com outras doenças prévias por outro sorotipo viral da doença (TAUIL, 2001).

16 15 No Brasil, as flaviviroses provocadas principalmente pelo dengue e febre amarela apresentam quadro febril exantemático. Entretanto, a dengue manifesta-se de forma variável quanto ao tipo e à intensidade dos sintomas, na maioria dos casos se desenvolvendo benignamente. 1.2 Aspectos Históricos O DENV e o vírus da febre amarela ( yellow fever virus -YFV) foram os primeiros microrganismos a serem denominados vírus e descritos como agentes filtráveis e submicroscópicos em 1902 e 1907, respectivamente. Durante a primeira década do século XX, o vírus dengue mostrou ser transmitido por artrópodes, mas não foi isolado até 1943 (FIELDS et al., 2001). Somente depois, foi que se alcançaram o conhecimento e a tecnologia necessários para o desenvolvimento de pesquisas laboratoriais com estes agentes. As primeiras evidências do ciclo de transmissão do dengue foram publicadas por Bancroft em 1906 (BANCROFT, 1906 apud FOCACCIA & VERONESI, 2002), que levantou a hipótese de o mosquito da espécie Aedes aegypti ser o vetor da infecção, o que, depois, foi confirmado por Siler e outros pesquisadores (SILER et al., 1926 apud FOCACCIA & VERONESI, 2002) e Simmons e associados (SIMMONS et al., 1931apud FIELDS, 2001). Com isto, foi possível estabelecerem os elos epidemiológicos envolvidos na transmissão da doença resumidos na cadeia: mosquito infectado, homem susceptível, homem infectado, mosquito infectado (MARTINEZ, 1999). O isolamento do DENV só ocorreu na década de 40, por Kimura em 1943 e Hotta em 1944 tendo-se denominado Mochizuki a esta cepa (HOTTA S. & KIMURA R., 1952 apud FIELDS, 2001). Sabin e Schlesinger em 1945, isolaram a cepa Hawaii, sendo que, neste mesmo ano Sabin ao identificar outro vírus em Nova

17 16 Guiné, observou que as cepas tinham características antigênicas diferentes das primeiras cepas isoladas (SABIN, 1952 apud FOCACCIA & VERONESI, 2002). Em 1956, no curso da epidemia de DENV no Sudeste Asiático, novos isolados apresentaram características antigênicas diferentes (Martinez, 1999). Em 1968, havia milhares de isolamentos do DENV e uma grande confusão com relação à classificação dos mesmos. Scherer sugeriu ao comitê da Organização Mundial de Saúde (OMS) a classificação dos vírus do dengue em quatro tipos distintos, agrupados com base no relacionamento antigênico, assim denominou-se às primeiras cepas sorotipo 1, à Nova Guiné sorotipo 2 e aos isolados do Sudeste Asiático como sorotipos 3 e 4 (SCHERER, 1968 apud FOCACCIA & VERONESI, 2002). 1.3 Aspectos epidemiológicos Nas Américas, Aedes aegypti é o único transmissor desse vírus com importância epidemiológica. Esta espécie de mosquito é originária da África, onde se adaptou ao ambiente doméstico criado pelo homem, tornando-se antropofílico (DYE, 1999). Suas larvas são encontradas em depósitos artificiais de águas, tais como caixas d água, pneus velhos, garrafas, enfim tudo o que acumula água. Estas características de adaptação permitiram que se tornassem abundantes nas cidades e facilmente transportados para outras áreas por meios de transportes terrestres, aéreos ou marítimos, o que aumentou sua competência vetorial, ou seja, sua habilidade em se infectar, replicar e transmitir o vírus da dengue (ROSEN, 1988). O Aedes albopictus é uma espécie oriunda das selvas asiáticas e até recentemente restrita àquele continente, nos últimos anos disseminou-se pelas Américas através dos transportes marítimos intercontinentais (RODHAIN et al.,

18 ). Não é um mosquito peridomiciliar, prefere ocos de árvores para depositar seus ovos e tem hábitos antropofílicos e zoofílicos diurnos, no entanto, sua importância epidemiológica como transmissor da dengue se restringe apenas ao continente asiático (METSELAAR et al., 1980). A distribuição e a freqüência das infecções pelo DENV estão intrinsecamente relacionadas com a plasticidade de adaptação do Aedes aegypti ao ambiente habitado pelo homem, e distingue-se das outras doenças infecciosas e parasitárias, porque a ocorrência dela não está relacionada com as más condições sociais e econômicas das populações (BARRETO et al., 1994; TEIXEIRA et al., 2003). Portanto, é complexa a inter-relação dos fatores envolvidos na dinâmica da circulação dos quatro sorotipos do DENV, o que gera incertezas sobre os determinantes das suas apresentações epidemiológicas DENV nas Américas Os registros da circulação do DENV nas Américas, data do século XVIII, a primeira descrição foi feita por Benjamin Rush, em 1780 nos EUA, embora se suspeite que o vírus venha causando epidemias, há vários séculos (SILER et al., 1926 apud FOCACCIA & VERONESI, 2002). A partir de 1826, epidemias de dengue foram registradas em intervalos irregulares no Sudeste dos EUA e países da Bacia do Caribe. Os sorotipos envolvidos nessas epidemias não eram conhecidos até 1953, quando foram isoladas as primeiras amostras de DENV-2 em Trinidad. Dez anos depois, foram isoladas as primeiras amostras de DENV-3 em Porto Rico, sendo estes dois sorotipos responsáveis pelas epidemias ocorridas no continente na década de 60 (GUBLER, 1987).

19 18 Desde a década de 70 até os dias atuais, os problemas com as epidemias do DENV agravam-se, particularmente, nos países localizados entre as linhas dos trópicos, tendo sido estimado um número maior que 10 milhões de infecções por ano. Enquanto que, na década de 80, ocorre em Cuba o acontecimento mais relevante na história do DENV, com a primeira epidemia de DHF/DSS descritas nas Américas. O vírus DEN-2 é associado a esta epidemia, que foi precedida por outra causada pelo vírus DEN 1, em 1977 (KOURI et al., 1986). Nesta mesma década, o DENV-1 foi responsável por grandes epidemias em países da América do Sul, como: Brasil, Bolívia, Paraguai, Equador e Peru (GUBLER, 1997). Nos anos 90, o quadro epidemiológico das Américas agravou-se e epidemias de dengue clássica foram freqüentemente observadas em vários centros urbanos, muitas delas associadas à ocorrência de casos de DHF. Atualmente, os quatros sorotipos estão circulando em quase todo o continente, com ocorrência sistemática de casos de dengue hemorrágico (GUBLER, 1992 apud FOCACCIA & VERONESI, 2002; PAHO, 2003) DENV no Brasil A primeira epidemia do vírus dengue com confirmação laboratorial aconteceu em 1982, na cidade de Boa Vista, capital do Estado de Roraima, onde foram isolados DENV-1 e DENV-4. Estes agentes estavam circulando em diversos países do Caribe e no norte da América do Sul e sua introdução, possivelmente, ocorreu por via terrestre, pela fronteira da Venezuela (OSANAI et al., 1986). Na década de 80 a dengue tornou-se um problema de saúde pública nacional quando houve a dispersão por diversos Estados do país do DENV-1 introduzido na cidade de Nova Iguaçu, Estado do Rio de Janeiro (SCHATZMAYR

20 19 et al., 1986). A situação da dengue foi agravada pela introdução do DENV-2 no Estado do Rio de Janeiro no ano de 1990, que resultou no aparecimento das formas mais graves da doença (NOGUEIRA et al.,1990). No período compreendido entre 1986 e 1993, as epidemias atingiram mais os grandes centros urbanos, porém, a ausência de uma política nacional eficaz de combate ao vetor resultou na rápida dispersão do vírus pelo país e conseqüentemente na ocorrência de epidemias em diversos Estados (Boletim Epidemiológico - Fundação Nacional de Saúde, Ministério da Saúde, 1999). O DENV-3 foi introduzido no Brasil em 1998, oriundo de casos importados em São Paulo e se disseminou por todo país de forma rápida e desde então várias epidemias vêm ocorrendo simultaneamente em todo o país. Dois anos depois, o mesmo sorotipo viral causou epidemias no Estado do Rio de Janeiro com confirmação laboratorial de 91 casos em três diferentes municípios (ROCCO et al., 2001) DENV em Rondônia O Estado de Rondônia, localizado totalmente na Amazônia Legal e na Região Norte do Brasil, possui ,80 km 2. Faz fronteira com Bolívia em uma extensão de km de linha divisória em sua totalidade delimitada por rios. Os limites territoriais são: ao norte, nordeste e noroeste com o Estado do Amazonas; ao leste e sudeste com o Mato Grosso; ao sul e sudoeste com a República da Bolívia. Possui 32 municípios localizados na Amazônia Legal e 20 municípios situados em faixa de fronteira. Tem uma população estimada em habitantes (IBGE, 2004).

21 20 A Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS) do Ministério da Saúde registrou no Estado de Rondônia casos suspeitos de dengue durante o ano de 2004, com importante aumento no número de notificações a partir do mês de setembro, relativo a semana epidemiológica 44. Em janeiro de 2005 foram notificados casos e em fevereiro 1.345, demonstrando um declínio no número de casos notificados a partir de fevereiro. (SVS, boletim de 14/02/2005) Os municípios em situação de epidemia, e que registraram mais de casos da doença em 2005, foram: Jaru, Cacoal, Ariquemes, Pimenta Bueno, Vilhena, Ji-Paraná, Outro Preto D Oeste e Rolim de Moura. Nestes municípios estão concentrados 91,3% dos casos notificados. Em três deles, Cacoal, Jaru e Ouro Preto D Oeste, ocorreram 18 casos de dengue com manifestações neurológicas. Todos são investigados pela SVS. (SVS, boletim de 18/02/2005) FIGURA 1 Mapa político do Estado de Rondônia, com ênfase na BR-364 e na fronteira delimitada com o Rio Mamoré. (Fonte: SEDAM/2004)

22 Patogenia do DENV O dengue clássico apresenta-se com febre alta, acompanhada de cefaléia, dor retrocular, mialgias, artralgias afetando os punhos, dedos, tornozelos e artelhos, embora as articulações maiores também possam ser atingidas, algumas vezes apresenta anorexia, náuseas e vômito. Observa-se o aparecimento de exantema, epistaxe e petéquias após o terceiro dia, sendo proeminente no tórax, dorso, braços e pernas (KURANE et al., 1992; MONATH & HEINZ, 1996 apud FIELDS, 2001). Acredita-se que existam duas formas opostas de resposta imune ao dengue, a primeira previne e propicia a recuperação nas infecções e a segunda relaciona-se a imunopatologia do dengue hemorrágico (HALSTEAD, 1988). A primeira forma de reposta esta relacionada com a infecção primária por dengue que estimula a produção de anticorpos IgM, detectáveis a partir do quarto dia, após o início dos sintomas, atingindo os níveis mais elevados por volta do sétimo ou oitavo dia e declinando lentamente, passando a não serem detectáveis após alguns meses. As IgG são observadas, em níveis baixos, a partir do quarto dia após o início dos sintomas, elevam-se gradualmente atingindo altos valores em duas semanas e mantêm-se detectáveis por vários anos, conferindo imunidade contra o sorotipo infectante, provavelmente por toda vida. A segunda forma de resposta imune aos vírus do dengue é paradoxal, pois prejudica os hospedeiros previamente infectados, sendo responsável pela DHF/DSS (HALSTEAD, 2002; KURANE et al., 1992; MONATH, 1986; MONATH et al., 1996). O quadro clínico da DHF inicia-se de forma similar ao dengue clássico, com febre alta, náuseas, vômitos, mialgias e artralgias. Os fenômenos hemorrágicos surgem no segundo ou terceiro dia da doença, com petéquias na face, véu palatino,

23 22 axilas e extremidades. Podem ocorrer púrpuras e grandes equimoses na pele, epistaxes, gengivorragias, metrorragias e hemorragias digestivas moderadas. A esplenomegalia, hematêmese e dor abdominal indicam mau prognóstico, com provável evolução para choque (Secretária Estadual de Saúde-RJ, 1988). Os sintomas relacionados a DSS costumam surgir entre o terceiro e o sétimo dia da doença, mantendo-se este estado crítico por 12 a 24 horas. Os pacientes mostram-se agitados e em alguns casos referem dor abdominal, posteriormente, tornam-se letárgicos, afebris e com sinais de insuficiência circulatória: pele fria manchada e congestionada, cianose perioral, pulso rápido e sudorese fria. A pressão arterial mostra-se convergente, baixa ou imensurável. Instala-se acidose metabólica e coagulação intravascular disseminada (CIVD), com ausência de tratamento, o óbito costuma ocorrer em quatro a seis horas (NOGUEIRA et al., 1991; VASCONCELOS et al., 1994). A DHF/DSS tem como base fisiopatológica uma resposta imune anômala envolvendo leucócitos, citocinas e imuno-complexos, causando aumento da permeabilidade por má função vascular endotelial sem destruição do endotélio, causando queda da pressão arterial e manifestações hemorrágicas, associadas a trombocitopenia (HOBER et al., 1993). Apesar da similaridade de certas manifestações sistêmicas e hemorrágicas, observam-se peculiaridades clínicas que, seguramente, ocorrem por conta do tropismo dos agentes etiológicos pelos diferentes órgãos do hospedeiro. Nas formas graves de dengue o quadro choque é um componente clínico dominante. Portanto, as febres hemorrágicas de origem viral exibem características diferentes quanto a sua etiologia, epidemiologia e patogênese.

24 Genoma viral O DENV pertence ao gênero Flavivirus; seu material genômico é composto por uma fita única de RNA com polaridade positiva e o seu comportamento é de RNAm; com aproximadamente 11Kb. Sua estrutura é esférica, medindo aproximadamente nm de diâmetro, o envelope tem a mesma composição da membrana plasmática das células eucarióticas e possui projeções em sua superfície conforme mostrado na figura nm. Envelope E (55-60 KDa) Membrana M (9 KDa) Cápside C (14KDa) RNA fita simples (+) (11KDa) Figura 2 Esquema de um vírion de dengue. Vírus esférico, envelopado de capsídeo icosaédrico constituído das proteínas estruturais E, M e C com RNA de polaridade positiva. Fonte: RICE, O genoma do vírion do dengue possui 10 genes contidos em uma cadeia aberta de leitura (ORF open reading frame) que codificam três proteínas estruturais e sete não-estruturais. O genoma é precedido por uma região 5 não codificante (RNC5 ) e sucedido por uma região 3 não codificante (RNC3 ) e não possui cauda de poli-a. Os genes estão na seguinte ordem: 5 -C-preM-E-NS1- NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3, conforme representado na figura 3 (Rice, 1996). A tradução da ORF resulta em uma poliproteína que é processada por signal-peptidase da célula hospedeira em três proteínas estruturais (E, prm e C) que têm papel importante na biologia do vírus uma vez que são responsáveis por

25 24 várias atividades biológicas, incluindo montagem dos vírions (maturação), fusão celular, imunogenicidade, induzindo a produção de anticorpos neutralizantes e anticorpos inibidores da hemaglutinação. As sete proteínas não estruturais (NS1- NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5), são responsáveis pela replicação dos vírus e processamento da poliproteína (RICE et al., 1985). Cadeia Aberta de Leitura 5 ESTRUTURAL NÃO ESTRUTURAL 3 Tradução POLIPROTEÍNA C prm E 1 2A 2B 3 4A 4B 5 COOH Figura 3 Esquema mostrando a cadeia aberta de leitura (ORF) e sua tradução em uma poliproteína com as 3 proteínas estruturais (C, prm e E) e 7 não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5). Fonte: RICE, Proteínas Virais A proteína C, com peso molecular de 14 Kda forma juntamente com o RNA viral o nucleocapsídio (KHROMYKH et.al., 1997). A glicoproteína pré M (prm) com cerca de 140 aminoácidos e 18,1 a 19,1KDa, dá origem à proteína M de aproximadamente 8,5 a 9KDa, é produzida durante o processo de maturação viral. A proteína E é uma glicoproteína com cerca de 55 a 60KDa, constitui o principal componente do envelope viral e representa o mais importante alvo do sistema imune, estando diretamente relacionada com a imunogenicidade das cepas, além

26 25 de participar do processo de adesão e penetração do vírus junto à membrana da célula hospedeira, estimula o sistema imune através da indução de anticorpos neutralizantes, proliferação de monócitos e macrófagos (HENCHAL et al., 1990; RICE, 1996). A proteína não estrutural 1 (NS1), com peso molecular aproximado de 40 KDa, possui atividade na maturação viral, sendo responsável pela fixação do complemento (MACKENZIE et al., 1996). Esta é inserida no lúmen do retículo endoplasmático via um peptídio sinal que é clivada pela ação de signalases celulares geradas na porção N terminal da proteína (CHAMBERS et al., 1990). Estudos sugerem a participação da NS1 na fase precoce da replicação viral bem como na virulência (PLETNEV et al., 1993). A proteína NS2 é dividida nas porções NS2a e NS2b. A porção NS2a, com aproximadamente 24KDa, hidrofóbica, não tem função totalmente conhecida (NESTOROWICZ et al.,1994). A porção NS2b com aproximadamente 27KDa, é portadora de atividade proteolítica, forma um complexo com a NS3, necessária para a função serino-protease da NS3 (JAN et al.,1995). A NS3 é uma proteína citoplasmática relativamente grande com 70 KDa, funciona como serino-protease envolvida na clivagem pós-translacional da poliproteína viral (GORBALENYA et al.,1989). A NS4 é clivada em duas porções: NS4a e NS4b, ambas com aproximadamente 27KDa. Estas duas porções juntamente com as proteínas NS2a e NS2b associam-se à membrana da célula infectada durante o processo de maturação viral (MONATH et al., 1996). A proteína não estrutural 5 (NS5) é uma provável RNA polimerase dependente de RNA de origem viral (RdRp), com aproximadamente 104KDa, sendo a mais conservada e essencial para a replicação viral (RICE et al.,1985; VICKY et al., 1999).

27 Diagnóstico Laboratorial A confirmação diagnóstica da infecção causada pelo vírus dengue pode ser feita somente em laboratório usando para isso: testes sorológicos, isolamento viral ou detecção do genoma viral (KING et al.,1991; GUZMAN et al., 1996) Testes Sorológicos Atualmente é usado o ensaio imunoenzimático (ELISA) para detectar a presença de anticorpos anti-dengue no soro do paciente. O ELISA e suas variantes, como por exemplo, o MAC-ELISA, discrimina anticorpos do tipo IgM e IgG indicando uma primo-infecção ou não. Outros testes sorológicos menos utilizados por sua complexidade técnica são: inibição da hemaglutinação (IH), fixação do complemento (FC), teste de neutralização (TN) (CHUNGUE et al., 1989) Isolamento Viral Diferente dos testes sorológicos o isolamento viral somente é realizado em laboratórios estruturados para tal evento. Três métodos são rotineiramente empregados: inoculação intracerebral em camundongos recém-nascidos, inoculação intratorácica em mosquitos do gênero Toxorhynchities sp e cultivo em células de mosquito e/ou mamíferos. A inoculação intracerebral em camundongos recém-nascidos apresenta uma grande desvantagem como, elevado custo, demora para o isolamento e baixa sensibilidade em relação ao DENV (GUBLER et al., 1988; HAMMON et al., 1960; SABIN, 1952 apud FOCACCIA & VERONESI, 2002). O cultivo em células de mamíferos apresenta as mesmas desvantagens que a inoculação intracerebral em

28 27 camundongos: elevado custo, demora para o isolamento e baixa sensibilidade (GUBLER et al.,1988; VORDAM et al., 1997). A inoculação intratorácica em vetores adultos é o método mais sensível para o isolamento do vírus. As espécies de vetores mais utilizadas para o isolamento viral: Toxorhynchities amboinensis e Toxorhynchities splendens (GUBLER et al., 1988). As desvantagens desta técnica são o intenso trabalho e a necessidade de insetário para a produção de um grande número de mosquitos para a inoculação (KUBERSKI et al.,1977; GUBLER et al., 1988). O cultivo em células de mosquito é uma das metodologias mais empregada no isolamento do DENV. A linhagem mais utilizada é a C6/36 ou AP61, originárias de larvas do Aedes albopictus. O uso destas linhagens celulares tem proporcionado um resultado rápido, sensível e econômico para o isolamento do vírus (FIGUEIREDO et al., 1992; GUBLER et al., 1988). A detecção da presença do vírus é feita através de imunofluorescência indireta (IFI) dos tecidos do mosquito, ou das células cultivadas in vitro Detecção do Genoma Viral Nas décadas de 80 e 90, com o surgimento da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) precedida da extração e da transcrição reversa (RT- PCR), a identificação de vírus tornou-se mais rápida (CHOMCZYNSKI & SACCHI, 1987). Diversos primers foram desenvolvidos e metodologias complementares, tais como a nested-rt-pcr foram incluídas na detecção do genoma do dengue (DEUBEL et al., 1997; HENCHAL et al., 1991; LANCIOTTI et al., 1992; MORITA et al., 1991; MULLIS et al., 1987; TANAKA et al., 1993).

29 28 Além de se detectar e sorotipar o genoma do dengue, pode-se fazer a identificação do subtipo das cepas utilizando uma técnica relativamente simples e rápida que utiliza o método do RSS-PCR para subtipagem, distinguindo-se a cepa por restrição de sítio específico da proteína E do cdna viral (HARRIS et al., 1999) Através desta técnica que tipa os patógenos baseados em diferenças genéticas, é possível revelar importantes informações na transmissão e diferenças na manifestação da doença. A habilidade de se detectar genótipo particular em comunidades, pode identificar fatores de riscos associados com a cepa (Harris et al., 1999) Seqüenciamento viral Desde a década de 80, o genoma completo de vários Flavivirus vem sendo seqüenciado, começando pelo YFV, seguido pelo 4 tipos de DENV (MASON et al., 1987; RICE et al., 1985, HAHN et al., 1988; OSATOMI et al., 1990). Através do seqüenciamento pode-se fazer o alinhamento dos nucleotídeos usando o programa Clustal W e construir árvore filogenética com finalidade de analisar e comparar os sorotipos seqüenciados. Atualmente o seqüenciamento do genoma do DENV é utilizado não apenas para indicar a origem do vírus, mas também, mutações que provavelmente podem causar diferença em sua patogenia (AQUINO et al., 2005). A detecção de diferenças no alinhamento genético do agente infeccioso pode ajudar na identificação desses patógenos associados a diferentes manifestações da doença (HARRIS et al., 1999).

30 29 2 Justificativa Justifica-se a identificação e caracterização molecular do DENV no Estado de Rondônia para se determinar o sorotipo circulante na região, numa tentativa de se estabelecer uma correlação de virulência das amostras, seu impacto sobre a população e sua importância epidemiológica.

31 30 3 Objetivos Geral: Identificar quais sorotipos do vírus da dengue circulantes no Estado de Rondônia através de métodos moleculares. Específico: Testar diferentes primers para caracterização molecular do vírus da dengue. Seqüênciar os vírus dengue isolados no estado. Realizar o RSS-PCR para identificar a origem geográfica do vírus circulante no estado. Fazer análise interpretativa dos resultados da subtipagem por RSS-PCR. Inferir dados filogenéticos sobre a origem e mutações de nucleotídeos dos diversos vírus isolados em Rondônia.

32 31 4 Materiais e Métodos 4.1 Amostras Biológicas As amostras biológicas de sangue, foram coletadas com o Laboratório Central de Rondônia (LACEN) e na Unidade de Virologia do Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de Rondônia CEPEM, entre o período de Janeiro de 2004 a Fevereiro de Também, nas Unidades Mistas de Saúde de Ariquemes, Jaru, Ouro Preto D Oeste, Cacoal, Colorado D Oeste e Vilhena no período de Janeiro de Os municípios que tiveram o DENV isolado pela Unidade de Virologia estão representados na figura 4 em vermelho. Foi explicado verbalmente para o paciente o destino da amostra, sendo as mesmas coletadas com sua anuência. Selecionou-se pacientes entre o 1º e o 5º dia de sintomas clínicos da doença, onde foram coletadas 84 amostras para o isolamento viral. ÍNDICE 1 Vale do Paraíso 2 Nova União 3 Teixeirópolis 4 Urupá 5 Mirante da Serra 6 Ministro Andreaza 7 Castanheiras 8 Novo Horizonte 9 Rolim de Moura 10 São Felipe 11 Primavera 12 Nova Brasilândia Figura 4 Mapa de Rondônia mostrando em vermelho a localização das cidades onde foram coletados os soros de pacientes com suspeitas de dengue. Fonte Secretaria do Desenvolvimento Ambiental de Rondônia - SEDAM.