[Escrever texto] GHJMKMTFRFRF CIÊNCIA À EXPERIÊNCIA 2010/2011. Trabalhos Experimentais

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1 CIÊNCIA À EXPERIÊNCIA 2010/2011 [Escrever texto] GHJMKMTFRFRF Escola Básica e Secundária Oliveira Júnior Ano Lectivo 2010/2011

2 As actividades seguintes destinam-se aos alunos do 10º e 11º anos na disciplina de Biologia e Geologia e 12º ano na disciplina de Biologia. Têm como objectivo principal a aquisição de competências relacionadas com técnicas de laboratório e pretendem que os alunos se familiarizem com o trabalho dos investigadores na área da Biologia e da Genética. Os protocolos experimentais foram elaborados sob a orientação das Professora Doutora Olinda Carnide e Professora Doutora Manuela Matos do Departamento de Genética e Biotecnologia da UTAD e da Professora Doutora Susana Pereira da FCUP. Nem todas as actividades foram realizadas pois considerou-se importante a concretização das actividades relacionadas com o Projecto. As restantes actividades poderão ser desenvolvidas futuramente enquadradas num contexto semelhante. Página 2

3 Índice Título da actividade: Observação de cromossomas em Metáfase... 4 Título da actividade: Selecção de Plantas tolerantes a stresses abióticos... 6 Título da actividade: Indução da poliploidia... 9 Título da actividade: Utilização da Micropipeta no Laboratório Título da actividade: Electroforese de Corantes Título da actividade: Extracção de DNA genómico de Plantas Título da actividade: Quantificação do DNA Título da actividade: Amplificação por PCR do DNA genómico com Marcadores Moleculares ISSRs (Inter microsatélites) Título da actividade: Enzimas de Restrição Título da actividade: Transformação de células vegetais por Agrobacterium tumefaciens Página 3

4 Título da actividade: Observação de cromossomas em Metáfase O objectivo desta actividade é a execução de esfregaços de ápices radiculares para posterior observação dos cromossomas ao microscópio. Neste trabalho utilizar-seão ápices radiculares de centeio Secale cereale L. É na zona do ápice radicular que se localizam tecidos meristemáticos constituídos por células que se encontram em divisão mitótica. Os cromossomas são mais visíveis em metáfase e, por isso, é necessário um pré-tratamento com gelo com o objectivo de parar a divisão mitótica e aumentar o número de metáfases. Material/Equipamentos: Reagentes/Soluções: - Sementes - Lixívia - Placas de Petri - Água Destilada - Algodão - Gelo - Papel de Filtro - Álcool Absoluto - Tubos de Vidro - Ácido Acético - Tubos de Eppendorf - Carmim Acético - Vidros de Relógio - Ácido Clorídrico - Pinças - Agulhas de Dissecação - Lamparina - Lâminas e Lamelas - M.O.C - Estufa - Frigorífico Página 4

5 Procedimento: 1. Desinfectar as sementes que vão ser colocadas a germinar com lixívia durante, aproximadamente, 10 min e lavar, em seguida, com água destilada. 2. Cortar uma circunferência de papel de filtro com o tamanho da placa de Petri na qual se desenha uma grelha que permita separar as sementes para a germinação. 3. Revistar as placas de Petri com algodão e com o papel de filtro. Humedecer com água destilada e colocar as sementes. 4. Colocar as sementes a germinar na obscuridade a uma temperatura de, aproximadamente, 24ºC. 5. Ao 3ºdia colher três raízes por semente que apresentem um comprimento de 10 a 15 mm. 6. Colocar as raízes, em tubos apropriados com água destilada, em gelo fundente, durante 24 horas. 7. Após este tratamento, passar as raízes para tubos Eppendorfs realizando a fixação com álcool acético (3 partes de álcool absoluto e uma parte de ácido acético). 8. Deixar actuar durante, pelo menos, 24 horas. 9. Para a observação ao M.O.C deve proceder-se à coloração: 9.1. colocar os ápices em carmim acético a 2% durante 48 horas; 9.2. realizar os esfregaços colocando os ápices num vidro de relógio com nove gotas de carmim acético e uma gota de ácido clorídrico; 9.3. aquecer à chama de uma lamparina até se observar a libertação de vapores; 9.4. colocar uma ou duas gotas de carmim acético no centro da lâmina e em seguida a raiz; colocar uma lamela próximo da gota e outra, sobreposta a esta, numa das extremidades; 9.5. efectuar o esmagamento, através de leves batimentos com a agulha de dissecação ou um palito, de forma a destruir a membrana e libertar os cromossomas; 9.6. retirar a lamela inferior e passar a preparação pela chama de uma lamparina. 10. Observar os cromossomas ao microscópio. Página 5

6 Título da actividade: Selecção de Plantas tolerantes a stresses abióticos O comportamento das plantas é influenciado por muitos factores ambientais. A reacção das plantas ao alumínio, presente nos solos, depende do ph. Em solos ácidos, o alumínio torna-se tóxico e interfere no normal desenvolvimento e crescimento das plantas. De entre todos os cereais, o centeio é a espécie mais tolerante ao alumínio desenvolvendo-se em solos com algum nível de acidez. O conhecimento desta característica é importante pois, como a maioria dos solos em Portugal são ácidos, condiciona a escolha do cereal a plantar. O método mais utilizado para determinar as espécies mais tolerantes ao alumínio é a avaliação do recrescimento das raízes, após exposição temporária ao alumínio. Este método tem permitido estabelecer uma relação directa entre os recrescimentos e a tolerância a este elemento: quando o alumínio não destrói o meristema apical da raiz, a zona da raiz que cresce (após tratamento com o alumínio) permanece branca, enquanto as raízes que forem afectadas pelo alumínio ficam coradas de rosa, indicando que não houve crescimento. Material/Equipamentos: Reagentes/Soluções: - Provetas - Água Destilada - Balança - Solução Nutritiva - Estufa - Solução de Alumínio - Placas de Petri - Solução de Coloração - Algodão - Lixívia - Papel de Filtro - Fitas para medição do ph - Estrutura com malha de Polietileno Página 6

7 Preparação das soluções a utilizar: 1. Solução Nutritiva 1.1. Solução stock (que vai ser utilizada como cultura hidropónica): ml de água destilada ,2 g de CaCl ,86 g de KNO ,41 g de MgCl 2.6H 2 O ,66 g de (NH 4 ) 2 SO ,60 g de NH 4 NO Perfazer com água destilada até 1 litro e colocar no frigorífico Diluir 2 ml desta solução nutritiva em 1 litro de água destilada; ajustar o ph a 4,0. 2. Solução de Alumínio 2.1. Dissolver 8,94 g de alumínio Cl 3.H 2 O em 900ml de água destilada; 2.2. Perfazer com água destilada até 1 litro e colocar no frigorífico. 3. Solução de Coloração 3.1. Utilizar Eriochrome cyanine R ( C 23 H 15 Na 3 O 95 ) a 0,1% ( em 1,5l de água adicionar 3 g de Eriochrome cyanine R). Procedimento: 1. Desinfectar as sementes que vão ser colocadas a germinar com lixívia durante, aproximadamente, 10 min; lavar com água destilada; 2. Colocar as sementes numa placa com papel de filtro embebido em água durante a noite no frigorífico; 3. Retirar do frigorífico e colocar na estufa a 24ºC durante 24 h, até as raízes atingirem um comprimento aproximado de 0,5 cm; 4. Transferir as sementes para uma estrutura com uma malha de polietileno e colocar esta estrutura a flutuar na solução nutritiva, durante 2 dias; Página 7

8 5. A temperatura deverá ser de 25ºC e as sementes deverão estar iluminadas com luz incandescente contínua a 12 W/m 2 com um fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de obscuridade (esta solução deverá estar perfeitamente arejada); 6. Transferir para a solução alumínio com a concentração de 20 ppm (1 ppm de alumínio = 1 ml de solução de alumínio / 1 L de solução nutritiva). 7. Manter as plântulas durante 24 horas nesta solução nas condições ambientais anteriores; 8. Remover as plântulas e lavar as raízes com água destilada; 9. Proceder à coloração com Eriochrome cyanine R durante 30 min; 10. Retirar o excesso de corante com água destilada; 11. Colocar as plântulas numa nova solução nutritiva durante 24 horas: 12. Medir o recrescimento de três raízes de cada planta (medir a parte que não está corada). 13. Agrupar as plantas em tolerantes e sensíveis (as plantas sensíveis não apresentam recrescimentos pois o meristema apical foi destruído). Página 8

9 Título da actividade: Indução da poliploidia Para além da selecção efectuada pelo Homem as plantas sofrem, de forma natural, o processo de especiação por poliploidia. A maioria das Angiospérmicas são poliploides apresentando grande variabilidade genética mesmo dentro da mesma espécie. Este facto tem contribuído para que determinados genes se tenham perdido ao longo da evolução, em detrimento de outros que se têm fixado. A poliploidia espontânea é pouco frequente e, por isso, a indução da poliploidia tem desempenhado um papel cada vez mais importante nos programas de melhoramento de plantas. As células dos indivíduos poliploides são maiores do que as dos seus progenitores diplóide originando fenótipos gigas, por exemplo, podem originar frutos de maior tamanho. A aplicação da colquicina a plantas de centeio diploides vai permitir a indução da poliploidia obtendo-se novas espécies tetra e hexaplóides. Material/Equipamentos: Reagentes/Soluções: - Sementes - Colquicina - Placas de Petri - Jiffy 7 - Tubos de Ensaio - Vasos Procedimento: 1. Colocar as sementes de centeio diplóide a germinar em placas de Petri a uma temperatura aproximada de 24ºC; 2. Após bom desenvolvimento radicular transplantar as plântulas para Jiffy 7 até desenvolverem 3 a 5 folhas; 3. Retirar as plântulas, lavar as raízes e cortá-las a cerca de 3cm; 4. Colocá-las em tubos de ensaio com 5 cm 3 de uma solução aquosa de colquicina de forma a ficarem imersas as raízes; Página 9

10 5. Colocar os tubos de ensaio, durante um período de 6 horas, à temperatura de 24ºC e sob a acção directa da luz; 6. Lavar as raízes das plântulas em água corrente e cortar as folhas a cerca de 4 cm, para estimular novos rebentos; 7. Transplantar as plântulas para vasos e colocá-los em condições de temperatura e luz adequadas ao desenvolvimento da planta; 8. Em finais de Julho/Agosto proceder à colheita do grão. 9. Colocar a germinar para obter a descendência e proceder à técnica para contagem de cromossomas para comprovar a poliploidia. 10. Seleccionar as plantas poliploides. Página 10

11 Título da actividade: Utilização da Micropipeta no Laboratório A micropipeta é um instrumento de laboratório utilizado para medir volumes em microlitros sendo imprescindível nas técnicas de Genética Molecular. Existem diferentes tipos de micropipetas, dependendo do volume que se pretende pipetar. Esta actividade permite aprender a manusear este instrumento e compreender como, em Ciência, se podem utilizar volumes muito pequenos e precisos. É um instrumento caro e, por isso, deve ser manuseado com cuidado e respeitar as indicações fornecidas. Assim, para cada volume, deve ser escolhida a micropipeta certa. Por exemplo, para um volume de 7 µl deve ser escolhida a micropipeta de 20 µl e não a de 100 ou 1000 µl Como forma de avaliar a aquisição da técnica pode proceder-se da seguinte forma: Pedir a cada aluno que retire 9 µl de água corada eliminando-a num pedaço de papel de filtro. Comparar o tamanho das gotas obtidas e verificar se são, ou não, do mesmo tamanho. Material/Equipamentos: - Micropipetas de 20 µl - Tubos de Eppendorf - 1 ml de água corada de vermelho - Suporte para os tubos - 1 ml de água corada de verde - 1 ml de água corada de azul - 1 ml de água corada de amarelo - Proveta de 50 ml de água corada. Página 11

12 Procedimento: 1. Seleccionar 10 µl com o botão indicador do volume: Dezenas Microlitros Décimas 2. Colocar a ponta adequada na micropipeta. Pressionar, ligeiramente, a micropipeta sobre a ponta para que esta fique segura. 3. Pressionar o botão 1 até à primeira paragem. Segurar na micropipeta na vertical e imergir ligeiramente a ponta no líquido corado da proveta. 4. Aliviar a pressão do polegar no botão para o líquido ascender. 5. Colocar lentamente o líquido num microtubo vazio pressionando lentamente o botão (1). Para isso deve colocar-se a parte final da ponta contra a parede lateral do microtubo vazio apertando o êmbolo até à primeira paragem. 6. Esperar uns segundos e pressionar o botão até ao segundo stop, forçando a saída da totalidade do líquido. 7. Com o êmbolo totalmente pressionado, retirar a micropipeta e descartar a ponta num recipiente próprio premindo o botão ejector (2). 8. Marcar 3 microtubos vazios (A, B e C). 9. Adicionar os volumes das diferentes soluções de água corada, referidos no quadro seguinte, a cada um dos microtubos. Tubos Solução vermelha Solução amarela Solução azul Solução verde Volume total A 4 µl 5 µl 2 µl 0 µl B 6,5 µl 2,5 µl 0 µl 10 µl C 3 µl 0 µl 12 µl 2,5 µl 10. Obter o volume total do tubo A. Verificar se o volume total está correcto utilizando a micropipeta. Definir o volume na micropipeta e retirar todo o líquido do tubo A sem deixar entrar ar para a ponta da micropipeta. Descartar a ponta num recipiente próprio. 11. Efectuar o mesmo procedimento para os tubos B e C. ( Adaptado de Biothechonology in the Classroom, 2009, Página 12

13 Título da actividade: Electroforese de Corantes A técnica de electroforese é utilizada para separar moléculas de diferentes tamanhos e com cargas eléctricas diferentes, como as proteínas e os ácidos nucleicos. Para a execução desta técnica é necessário: um meio para separar as moléculas, uma corrente eléctrica e uma solução tampão. Na electroforese em gel de agarose os fragmentos moleculares migram através do gel, quando exposto a uma corrente eléctrica. O gel possui poros possibilitando a separação dos fragmentos moleculares. O material necessário para a electroforese consta: Tina de electroforese (2). Cabos para ligação à corrente eléctrica (1- pólo positivo e 5 - pólo negativo). Tabuleiros de diferente capacidade (4). Pentes de diferente tamanho (3) Material/Equipamentos: - Tina de Electroforese - Luvas - Tabuleiro e Pentes para 6 poços - Gerador - Suporte para Microtubos - Banho-maria - Micropipeta de 20 µl e Pontas - Pipetas Descartáveis - Proveta de 50 ml e 250 ml - TBE 1X - Água Destilada - Agarose Página 13

14 - Amostras dos seguintes corantes: - Azul de Bromofenol; - Pironina Y; - Orange G; - Safranina O; - Xileno Cianol - Mistura Desconhecida Procedimento: 1. Colocar 25 µl de cada corante em microtubos previamente identificados. 2. Verificar se o tabuleiro onde se coloca o gel de agarose possui todos os lados. Caso seja necessário utilize fita adesiva para selar convenientemente o tabuleiro. 3. Colocar o pente no meio do tabuleiro. 4. Para o gel de agarose a 0,7% tendo o tabuleiro 100 ml de capacidade, pesar 0,7 g de agarose e adicionar 100 ml de TBE 1X. 5. Colocar no microondas uns minutos até a solução ficar transparente. Deixar arrefecer. 6. Verter, com cuidado o gel no tabuleiro e remover com uma pipeta descartável qualquer bolha do gel. Deixar repousar até polimerizar. 7. Retirar com cuidado o pente e colocar o tabuleiro com o gel na tina de electroforese onde, previamente, foi colocado TBE 1X. O gel deve ficar completamente coberto com o tampão TBE 1X (o gel pode permanecer durante algumas horas até ser carregado com as amostras). 8. Carregar os poços do gel com 10 µl de cada um dos corantes utilizando, para cada um deles, pontas diferentes. Identificar cada poço tendo em conta o corante utilizado. 9. Ligar os cabos à fonte colocando o cabo vermelho no terminal vermelho (pólo positivo) e o cabo preto no terminal preto (pólo negativo). Ligar a fonte a uma voltagem de 100 V e verificar o aparecimento de bolhas. 10. Deixar o gel correr durante 20 a 30 minutos. Deixar que os corantes cheguem, aproximadamente, a 2 cm do final do gel. 11. Retirar o tabuleiro, com o gel, da tina e observar os resultados. Página 14

15 Como forma de avaliar a aquisição da técnica pode proceder-se da seguinte forma: 1. Esquematizar na figura onde se colocaria o pente caso tivesse sido realizada uma electroforese de DNA. Tina - + Tabuleiro 2. Justificar a colocação do pente no centro do tabuleiro para a realização desta actividade. 3. No diagrama representado esquematizar os resultados obtidos com a separação electroforética dos corantes: Identificar os corantes que constituem a mistura desconhecida. 5. Referir qual o corante com carga negativa que apresenta a molécula de menor tamanho. 6. Listar os corantes que possuem carga negativa. 7. Explicar como funciona a electroforese em gel de agarose. ( Adaptado de Biothechonology in the Classroom, 2009, Página 15

16 Título da actividade: Extracção de DNA genómico de Plantas Nos últimos 20 anos muitas técnicas foram desenvolvidas com a finalidade de manipular, copiar, detectar, localizar e sequenciar o DNA nos cromossomas. Estas técnicas permitiram um progresso muito rápido na identificação de genes associados a doenças ou a características de interesse e avanços biotecnológicos, como na Engenharia Genética de bactérias e outros organismos. O método de extracção de DNA genómico de Plantas é dos que apresenta maior dificuldade na obtenção de DNA de elevada qualidade sendo, por isso, a preparação do tecido vegetal um dos passos mais importantes para se proceder á extracção. Na maior parte dos casos utiliza-se azoto líquido que inibe a actividade enzimática endógena. Este composto é demasiado perigoso para poder ser utilizado na sala de aula e, por isso, o protocolo apresentado não envolve a sua utilização. Qualquer que seja o método utilizado, a extracção do DNA, consiste num conjunto de procedimentos em que se utilizam diferentes tampões cuja finalidade é provocar a lise, precipitação, ligação, lavagem e eluição para se obter no final o DNA alvo íntegro, não degradado, puro e em quantidade suficiente para se proceder, por exemplo, à sua amplificação via PCR. Os passos principais desta técnica são os seguintes: Ruptura da parede celular realizada por maceração, normalmente em azoto líquido; Extracção dos componentes intracelulares (organelos) eliminados através da centrifugação. Como são mais pesados precipitam, enquanto o DNA, o RNA e as proteínas ficam no sobrenadente. Para a eliminação das proteases utilizam-se substâncias químicas como o fenol, clorofórmio e álcool isoamílico que provocam a desnaturação destas moléculas. A centrifugação permite a sua precipitação em soluções aquosas. Degradação do RNA através das ribonucleases (RNAses) que o degradam. Página 16

17 1º Protocolo: Material/Equipamentos: - Folhas jovens de Plantas - Areia de Quartzo - Varetas de Vidro - Espátula - Tubos de 1,5 ml e 15 ml - Balança - Micropipetas e Pontas - Banho a 65ºC - Centrífuga Procedimento: 1. Reduzir a pó as folhas em areia de quartzo, utilizando um microtubo e a vareta de vidro ou, em alternativa um almofariz. 2. Pesar, aproximadamente, 200 mg de tecido e adicionar 200 µl de tampão de extracção (TE) pré-aquecido a 65ºC e homogeneizar. 3. Incubar a 65ºC (banho) durante 10 a 60 minutos. 4. Centrifugar, durante 15 minutos, a 5000 rpm e transferir 300 µl do sobrenadente para um novo tubo. 5. Adicionar 300 µl de isopropanol (precipita o DNA), agitando com cuidado. Incubar 5 minutos à temperatura ambiente. 6. Centrifugar durante 30 minutos (5000 rpm) e remover o sobrenadente. 7. Lavar o sedimento com 200 µl de etanol a 70%. Centrifugar 5 minutos a 5000 rpm e secar o sedimento. 8. Ressuspender o sedimento em 250 µl de TE, aquecer a 50 ºC durante 8 minutos. TE: Tampão de Extracção 200 mm Tris-HCl, ph 7,5, 250 mm NaCl, 25 mm EDTA, 0,5% SDS. Página 17

18 2º Protocolo (NucleoSpin Plant II Midi) As amostras de folhas de plantas são homogeneizadas por tratamento mecânico. Após este tratamento o DNA pode ser extraído com os tampões de lise (PL1 e PL2) que contêm sais caotrópicos (inibidores da formação de cadeias duplas e impedem que o DNA fique aprisionado aos restos celulares), agentes desnaturantes e detergentes (actuam nas membranas celulares tornando todo o conteúdo citoplasmático livre na solução). O tampão de lise PL1 é baseado no método CTAB enquanto o tampão PL2 baseia-se no método SDS. Este último requer a utilização de acetato de potássio para a precipitação das proteínas com a utilização do tampão de precipitação PL3. O lisado bruto obtido pode ser limpo por centrifugação e/ou filtração utilizando os filtros NucleoSpin fornecidos com o Kit de forma a remover polissacarídeos, agentes contaminantes e resíduos celulares. A solução obtida é misturada com o tampão de ligação PC para criar as condições óptimas á ligação do DNA à membrana de sílica. Após esta mistura ter sido carregada na coluna spin, os contaminantes são lavados com os tampões de lavagem PW1 e PW2. Finalmente o DNA genómico pode ser eluído (separação em duas fases, aquosa e fenólica, de modo a que o DNA seja solúvel apenas numa das fases) com o tampão de eluição PE pobre em sal. Material/Equipamentos: - Kit NucleoSpin Plant - Centrífuga - Folhas jovens de Plantas - Banho - Tubos de Eppendorf - Balança - Micropipetas e Pontas - Vórtex 1. Tampão de Lise PL2: Verificar se o SDS se encontra com precipitado. Se necessário incubar durante alguns minutos a 30-40ºC, misturar bem até o precipitado se tornar a dissolver completamente. Página 18

19 2. Tampão de Lavagem PW2: Adicionar 100 ml de etanol (96-100%) ao tampão de lavagem fornecido antes de utilizar (marcar no rótulo do frasco a adição do etanol). Manter a 20-25ºC durante 1 ano. 3. RNase A: Dissolver as 6 mg de RNase liofilizada em 600 µl de água pura. Manter a solução a 4ºC durante 3 meses ou dividir em aliquotas menores e colocar a -20ºC. Procedimento: 1. Homogeneizar 100 mg de material fresco. 2. Proceder à lise celular: 2.1. Com o tampão PL1 (CTAB): transferir o homogeneizado para um tubo Eppendorf e adicionar 400 µl de tampão PL1; homogeneizar a mistura no vórtex; adicionar 10 µl da solução RNase e agitar; incubar durante 10 min a 65ºC (aumentar o tempo de incubação para 30 a 50 minutos pode ser vantajoso); centrifugar durante 5 minutos a X g. 400 µl PL µl de RNase A 2.2. Com o tampão PL2 (SDS): transferir o homogeneizado para um tubo Eppendorf e adicionar 300 µl de tampão PL2; agitar, com auxílio do vórtex, a mistura; adicionar 10 µl da solução RNase e 100 µl de β-mercaptoetanol. Agitar; incubar durante 10 min a 65ºC; Página 19

20 adicionar 75 µl de tampão PL3, agitar e incubar durante 5 minutos no gelo para precipitar o SDS completamente. 300 µl PL µl de RNase A µl de B-ME + 75µl de PL3 3. Proceder à filtração/clarificação do lisado: 3.1. transferir o lisado para a coluna (cor de rosa, Nucleospin filter L.); colocar num tubo de recolha; centrifugar durante 2 min a x g; 3.2. eliminar a coluna e ficar com o filtrado (caso todo o liquido não tiver passado no filtro, repetir a centrifugação). 11.ooo x g 2 min Tubo sem coluna Tubo com coluna rosa Tubo sem coluna 4. Adicionar 450 µl do tampão PC ao tubo de recolha e misturar rapidamente no vórtex durante 30 segundos (ou misturar com a micropipeta). 450 µl de PC e vórtex (30 seg.) 5. Isolamento do DNA - Colocar a amostra numa nova coluna Nucleospin (coluna verde) com um novo tubo de recolha. Tubo com coluna verde Página 20

21 6. Centrifugar durante 1 minuto a x g e eliminar o líquido reaproveitando a coluna (a capacidade máxima do tubo com coluna é de 700 µl, por isso, volumes maiores requerem a repetição deste passo); 11.ooo x g 1 min Tubo com coluna verde DNA está retido na coluna 7. Lavagem do DNA Colocar a coluna no tubo de recolha. Para lavar e secar a membrana adicionar 700 µl de tampão PW2 ao tubo com a coluna. Centrifugar durante 1 min a x g e eliminar o liquido. 700 µl de PW2 11.ooo x g 1 min 8. Proceder à segunda lavagem adicionando 200 µl do tampão PW1 ao tubo com a coluna. Centrifugar durante 2 min a x g para remover o tampão de lavagem e secar completamente a membrana de sílica da coluna. Eliminar o tubo de recolha. 200 µl de PW1 11.ooo x g 2 min 9. Eluição do DNA Proceder à eluição do DNA colocando a coluna do Nucleospin dentro de um novo tubo de 1,5 ml. Novo tubo Página 21

22 10. Pipetar 70 µl de tampão PE (70ºC) para a membrana. Incubar o tubo com a coluna durante 5 min a 70ºC. Centrifugar durante 1 min a x g para eluir o DNA. 75 µl de PE 11.ooo x g 1 min 11. Pipetar 50 µl de tampão PE à coluna e incubar durante 5 minutos a 70ºC. Centrifugar durante um minuto a x g. 11.ooo x g 1 min 50 µl de PE Tubo com DNA Página 22

23 Título da actividade: Quantificação do DNA Os ácidos nucleicos absorvem luz UV num comprimento de onda de 250 a 280 nm com um máximo a 260 nm. Quando as amostras obtidas possuem um grau de pureza elevado (com pouca contaminação de proteínas, fenóis, polissacarídeos, álcool, ou outros ácidos nucleicos) a quantificação por espectofotómetro, determinada por a absorvência das bases a 260 nm, é um método rápido e preciso. A razão entre a leitura a 260 e 280 nm fornece uma estimativa da pureza dos ácidos nucleicos. Soluções puras de DNA e RNA possuem valores de DO 260 /DO 280 de 1,8 e 2, respectivamente. Quando existe contaminação por fenóis ou proteínas, a razão DO (densidade óptica) será muito menor, indicando quantidades de ácidos nucleicos baixas. Nas plantas lenhosas ocorre uma grande probabilidade de contaminação por polifenóis e polissacarídeos e a quantificação por espectofotometria não permite uma determinação precisa da concentração de DNA. A quantificação por electroforese em gel de agarose dos ácidos nucleicos possui um papel importante quer analítico quer preparativo pois separa e permite a visualização de fragmentos de DNA. O DNA apresenta carga negativa devido à presença do ácido fosfórico. Assim, quando se submete o DNA a uma corrente eléctrica, em ph neutro, as moléculas de DNA são atraídas para o pólo positivo. Os ácidos nucleicos migram num suporte como o gel de agarose em função das diferenças de peso molecular e estrutura tridimensional (conformação espacial). Assim, fragmentos de peso molecular maior migram menos enquanto fragmentos de peso molecular menor ficam mais perto do pólo positivo. A utilização de marcadores de peso molecular conhecido permitem determinar o tamanho dos fragmentos de DNA da amostra. Existem alguns factores que influenciam a mobilidade do DNA em gel de agarose: Concentração de agarose a concentração de agarose que deve ser utilizada situa-se entre valores de 0,5% a 2%. Quanto maior for a concentração de agarose menor é a separação de fragmentos de DNA de maior tamanho e, por isso, concentrações menores de agarose facilitam a separação de fragmentos de maior peso molecular; Gradiente de voltagem adequada ao tampão utilizado e ao objectivo pretendido. Página 23

24 Material/Equipamentos: - Tina de Electroforese - Gerador - Balança - Agarose - TBE 1X Procedimento: 1. Pesar 0,7g de agarose para 100 ml de TBE 1X ou outro tampão adequado (SB ou TAE). 2. Misturar e colocar no microondas até entrar em ebulição e ficar completamente transparente. 3. Deixar arrefecer até uma temperatura cerca de 50-65ºC e colocar no molde previamente preparado. 4. Deixar polimerizar e colocar o gel na tina de electroforese, submerso em TBE 1X. (ou outro tampão sendo que a agarose deve ser dissolvida no mesmo) 5. Preparar as amostras de DNA colocando, numa superfície seca e plana, um pedaço de parafilme e sobre ele 2 a 3µL de tampão de deposição. As gotas do tampão devem estar devidamente espaçadas e corresponder ao número de amostras de DNA. 6. Adicionar a cada uma das gotas anteriores 5µl das amostras de DNA e, a uma delas, a mesma quantidade de um marcador de peso molecular conhecido (por ex: DNA de fago lambda digerido com HindIII). OU em alternativa aos passos 5 e 6: - Colocar 5 µl das amostras de DNA em tubos de Eppendorf e adicionar 2 a 3 µl de tampão de deposição; - Colocar 5 µl de marcador de peso molecular conhecido num tubo de Eppendorf e adicionar 2 a 3 µl de tampão de deposição. Página 24

25 7. Carregar o gel com todas as amostras. 8. Proceder à electroforese a uma voltagem constante de 80 V (voltagem adequada para a separação do DNA genómico). 9. Corar o gel com diferentes substâncias (por ex: Azur, GelRed). Nota: A quantidade de agarose em gramas é obtida através da concentração do gel em %, multiplicado pelo volume de gel desejado. Para calcular o volume de gel deve ter-se em conta a largura, altura e comprimento do tabuleiro que se utiliza para o molde. Assim, por exemplo para um gel de 1% (1g de agarose por 100 ml de TBE 1X) e a capacidade do tabuleiro a utilizar for de 200 ml deve pesar-se 2 g de agarose e adicionar 200 ml de TBE 1X. Página 25

26 Título da actividade: Amplificação por PCR do DNA genómico com Marcadores Moleculares ISSRs (Inter microsatélites) A reacção em cadeia da Polimerase (PCR) é uma das técnicas moleculares mais importantes pois permite a amplificação exponencial de uma sequência específica de DNA. Esta técnica requer apenas uma pequena quantidade inicial de DNA e baseia-se no processo natural de replicação desta molécula. Utiliza uma enzima termoestável, DNA polimerase, designada Taq DNA polimerase extraída e purificada da bactéria Thermus aquaticus. Esta reacção ocorre segundo um processo cíclico sendo controlada pela temperatura da mistura da reacção. Em cada ciclo, as duas cadeias de DNA são separadas, copiadas e as cadeias filhas resultantes emparelham de novo. Um ciclo compreende os processos de desnaturação (separação da cadeia dupla de DNA), hibridação (emparelhamento dos primers) e extensão (síntese do DNA pela Taq polimerase). No final da reacção obtém-se a amplificação das sequências de DNA delimitadas pelos primers usados nessa reacção. Em síntese, para a DNA polimerase iniciar a cópia do segmento de DNA alvo é necessário que ocorra: Separação das cadeias do DNA - a desnaturação resulta da incubação do DNA a uma temperatura de 95ºC; Emparelhamento dos primers - segmentos curtos de DNA, designados por iniciadores (primers), emparelham com zonas complementares nas extremidades 3 do segmento de DNA alvo, flanqueando-o, por diminuição da temperatura para cerca de 55ºC (esta temperatura varia de acordo com o tipo de primer e da sua complementaridade); Síntese do DNA a Taq polimerase efectua o elongamento dos primers a uma temperatura de 72ºC, utilizando como molde a cadeia a que cada primer está emparelhado. A mistura da reacção é constituída: Taq Polimerase, Buffers (Soluções-Tampão) e MgCl 2 ; Primers ISSRs; DNA molde; DNTPs (A, T, C, G) Página 26

27 Água Material/Equipamentos: - Termociclador - Tubos para PCR - Primers - DNA alvo - Taq DNA Polimerase - Água - Taq Mix (mistura da reacção com todos os elementos essenciais) Procedimento: 1. Colocar em cada tubo de PCR 1 µl de DNA de cada uma das plantas. 2. Fazer a MIX com: - H 2 O 8 µl x 3 = 24 µl - Primer 1 µl x 3 = 3 µl - TaQ Mix 10 µl x 3 = 30 µl 3. Homogeneizar no Vortex e efectuar uma centrifugação rápida (alguns segundos). 4. Colocar 19 µl da mistura em cada tubo de PCR. 5. Colocar no termociclador (tempo 3h e 30 min) - 94ºC, 5 min desnaturação inicial; - 94ºC, 30 seg desnaturação - 52ºC, 45 seg hibridação - 72ºC, 2 min extensão 46 X ciclos - 72ºC, 10 min extensão final - 4ºC, pausa 6. Colocar a 4ºC até análise por electroforese em gel de agarose a 1,8%. Página 27

28 Título da actividade: Enzimas de Restrição As enzimas de restrição actuam no DNA fragmentando-o em sequências nucleotídicas específicas. O nome destas enzimas relaciona-se com o organismo de onde foram isoladas. Existem naturalmente em bactérias que as utilizam como meio de defesa aos ataques de vírus. Os vírus introduzem o DNA no interior das células bacterianas para se reproduzirem. Estas enzimas destroem o DNA dos vírus que as invadem, inactivando-os através do reconhecimento de sequências específicas de DNA. A catálise é efectuada pela destruição da ligação fosfodiéster entre dois nucleótidos consecutivos ligados a determinadas bases. Os nucleótidos onde ocorre a hidrólise encontram-se no interior dessas mesmas sequências específicas de reconhecimento. A descoberta destas enzimas, no início dos anos 70 do século XX, permitiu o rápido desenvolvimento da Engenharia Genética. Nesta actividade utilizam-se amostras de DNA do vírus bacteriófago λ que possui, aproximadamente, 48,514 pares de bases. O DNA é fragmentado com 4 enzimas de restrição. Aos alunos são fornecidas indicações sobre três destas enzimas. As figuras seguintes mostram os locais de clivagem das enzimas no DNA λ em gel de agarose a 0.7%. EcoRi BamHI HindIII Página 28

29 1ª Aula: Material/Equipamentos: - 4 microtubos - Luvas - Suporte para os microtubos - Microcentrifuga - Micropipeta de 20 µl e respectivas pontas - Gelo - 20 µl de 0,1 µg/µl (λ) DNA - TBE 1X - 25 µl 2X de Tampão de Restrição - Frigorífico - 4 µl de Enzima de Restrição EcoRI - Água Destilada - 4 µl de Enzima de Restrição BamHI - Banho-Maria (37ºC) - 4 µl de Enzima de Restrição HindIII - UV Transiluminador - Amostra desconhecida de DNA digerido - 10 µl de Água Destilada Procedimento: 1. Toda a actividade deve ser realizada com luvas e as enzimas e o DNA devem manter-se em gelo até ao passo Marcar os microtubos com a seguinte legenda: B, E, H e C. 3. Pipetar de acordo com as indicações do quadro seguinte, tendo o cuidado de mudar de ponta e, verificar se os reagentes foram devidamente depositados nos tubos respectivos. Tubos Tampão DNA BamHI EcoRI HindIII Água Estéril Tubo B 5 µl 4 µl 2 µl Tubo E 5 µl 4 µl - 2 µl - - Tubo H 5 µl 4 µl µl - Tubo C 5 µl 4 µl µl Página 29

30 4. Fechar os microtubos. 5. Colocar os tubos na microcentrifuga e centrifugar durante 3 segundos (spin). 6. Colocar os microtubos em banho-maria a 37ºC durante, pelo menos, 20 minutos (a incubação pode ser durante mais tempo). 7. Colocar os tubos no frigorífico até proceder à electroforese em gel de agarose (as reacções podem manter-se no frigorífico durante um longo período de tempo). 2ª Aula Electroforese: Material/Equipamentos: - Tina de Electroforese - TBE 1X - Fonte de Alimentação - agarose a 0,7% - 10 µl de Tampão de Deposição - Corante SYBR - UV Transiluminador - Água Destilada - Amostra de DNA digerido Procedimento: 1. Preparar o gel de agarose a 0,7% em 25 ml de TBE1X. 2. Colocar no microondas até a solução ficar límpida ou em alternativa em banhomaria durante, aproximadamente 1 hora. 3. Adicionar 1,25 µl do corante Sybr Safe. 4. Preparar o tabuleiro onde o gel será colocado. Verificar se fica bem vedado (pode utilizar-se fita adesiva). 5. Deixar arrefecer um pouco e deitar o gel no tabuleiro. Colocar o pente e deixar polimerizar. 6. Retirar o pente e, caso não seja utilizado de imediato, o gel poderá permanecer dentro da tina coberto com o TBE1X. Página 30

31 7. Retirar os tubos com as amostras, preparados na aula anterior, do frigorífico e adicionar 2 µl de tampão de deposição. 8. Carregar o gel com 10 µl de cada amostra e ligar a fonte. A voltagem deverá ser 100 V. Deixar correr o gel durante, aproximadamente, 30 a 45 minutos (uma corrida mais longa poderá ser útil conduzindo a melhores resultados). A corrida termina quando a banda azul do tampão de deposição (que corresponde ao azul de bromofenol) estiver a 2-3 cm do final do gel. Notas: a) SYBR SAFE O SYBR SAFE é um corante fluorescente utilizado para corar o DNA. Este corante é adicionado directamente ao gel de agarose. A visualização do gel é realizada num transiluminador após a electroforese. Este corante substitui o Brometo de Etídio que é, também, utilizado com esta finalidade mas, possui características mutagénicas e deve, por isso, ser evitada a sua utilização nas salas de aulas. Após a utilização o gel pode ser eliminado no lixo comum e o tampão utilizado na electroforese pode ser eliminado através do lava-louça. No entanto, as precauções com este corante devem ser as que se utilizam para qualquer produto químico e tóxico. b) Outros corantes que podem ser utilizados são o Azul-de-metileno, Azur, Gel Red e Gel Green. c) Tampão de Restrição Universal 2X As enzimas de restrição funcionam sob diferentes condições de ph e sais. Para uma melhor actividade deve ser utilizado um tampão diferente para cada enzima. No entanto, para simplificação do procedimento, utiliza-se um único tampão para as diferentes enzimas. d) Lambda (λ) DNA A purificação do DNA do bacteriófago λ é uma técnica relativamente acessível, pouco dispendiosa e adequada para compreender o conceito de enzima de restrição. O segmento do DNA λ tem, aproximadamente, pares de bases. Estes fragmentos Página 31

32 lineares migram no gel de agarose a uma distância inversamente proporcional ao valor do log 10 do seu peso molecular. e) Amostra desconhecida de DNA λ digerida Esta amostra de DNA λ foi, simultaneamente, digerida pelas enzimas EcoRI e HindIII. Poderá ser utilizada com duas finalidades diferentes nesta actividade: como um marcador conhecido para determinar o tamanho aproximado das bandas obtidas com as restantes amostras ou, como amostra desconhecida onde se poderá determinar que enzima ou enzimas foram utilizadas para produzir as bandas obtidas. Outra alternativa poderá ser converter esta actividade num mistério forense em que a amostra desconhecida representará o DNA de uma criança sendo a mãe representada pela amostra de DNA digerida pela enzima EcoRI. As outras duas amostras de DNA, digeridas pelas enzimas HindIII e BamH1, poderão representar o pai da criança. f) Tampão de Deposição Este corante é adicionado a cada amostra e tem como objectivo permitir a observação da migração do DNA para o pólo positivo e aparece como uma banda azul ou, eventualmente duas bandas. A primeira banda é o corante azul de bromofenol que migra até, aproximadamente 500 pb e a segunda banda é do xilenocianol, aproximadamente equivalente, a 4000 pares de bases. Para se obter uma separação ideal para analisar o DNA, a banda do azul de bromofenol deve migrar até 4 a 7 cm do final do gel (no entanto deve ter-se cuidado para que esta banda não migre para fora do gel). Como forma de avaliar a aquisição da técnica pode proceder-se das seguintes formas: 1ªAlternativa: Na figura seguinte encontra-se esquematizado o mapa parcial de restrição do genoma linear λ. As enzimas que foram utilizadas nesta actividade cortam o DNA em determinadas áreas registadas no mapa. Cada segmento encontra-se identificado por uma letra. Página 32

33 λ DNA Locais de clivagem de BAMHI A B C D E F Locais de clivagem de EcoRI G H I J K L Locais de clivagem de HindIII M N O P Q R S T As figuras seguintes representam o esquema do gel. Escrever, no espaço correspondente, o número de pares de bases de cada segmento. Em seguida colocar no esquema do gel as letras correspondentes aos fragmentos de DNA que se espera obter como resultado da electroforese. O controlo corresponde à amostra de DNA λ não digerida. O primeiro fragmento está esquematizado na figura. Página 33

34 bp BamHI EcoRI HindIII Controlo Tamanho dos fragmentos em bp A A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T Página 34

35 2ªAlternativa Verificação da Paternidade : Considerando a hipótese de verificar qual o verdadeiro pai de uma criança poder-se-á realizar esta actividade sugerindo que foram recolhidas amostras de DNA de uma criança, da mãe e de cada um dos potenciais pais. As amostras foram tratadas com as enzimas de restrição e os resultados obtidos após a electroforese em gel de agarose foram os seguintes: Legenda: 1 Mãe 2 Criança 3 Pai 1 4 Pai 2 5 Pai 3 Qual das amostras corresponde ao verdadeiro pai da criança? 3ªAlternativa Um caso de rapto : Supondo-se que duas mulheres foram raptadas no espaço de duas semanas. Foram recolhidas amostras de sangue e de esperma do local do crime. A electroforese foi realizada utilizando as amostras tratadas com a enzima de restrição EcoRI conforme o esquema seguinte: Legenda: 1 Sangue da vítima A 2 Sangue da vítima B 3 Esperma recolhido da vítima A 4 Esperma recolhido da vítima B 5 Sangue do suspeito X 6 Sangue do suspeito Y 7 Sangue do suspeito Z Página 35

36 Analisando a figura determinar se as duas mulheres foram, de facto, agredidas pelo mesmo homem e verificar se algum dos suspeitos está envolvido no crime. (Adaptado de Biothechonology in the Classroom, 2009, Título da actividade: Transformação de células vegetais por Agrobacterium tumefaciens As bactérias podem transferir genes segundo um processo natural. Este mecanismo, provavelmente resultou do processo evolutivo como forma de adaptação às mudanças ambientais. Os genes que apresentam, em geral, maior mobilidade estão localizados nos plasmídeos DNA circular que se replica independentemente do cromossoma bacteriano. As bactérias possuem três mecanismos naturais de transferência de genes: o Transformação recolha de DNA livre das células vizinhas; o Transdução - movimento de DNA de uma célula para outra através da intervenção de um bacteriófago; o Conjugação transferência de plasmídeos especializados (F plasmídeos) através do tubo de conjugação sexual que liga duas células bacterianas. Estes mecanismos são utilizados em Engenharia genética para transferir genes seleccionados na bactéria. A Agrobacterium tumefaciens (do latim: ágar = terra; tumour = inchaço; facere = fazer) é uma bactéria do solo fitopatogénica que transforma geneticamente células vegetais de forma natural originando tumores que interferem com o crescimento normal da planta infectada. É uma doença que afecta plantas com interesse agronómico como as videiras, árvores de fruto e roseiras. O tumor resulta da transferência, integração e expressão de genes de um segmento específico do DNA do plasmídeo, designado por T-DNA, no genoma vegetal. O T-DNA faz parte do tumor de indução (Ti) do plasmídeo provocado pela maioria das estripes de A. tumefaciens. Dependendo da estirpe o comprimento do segmento do T-DNA pode variar entre 12 a 24 pares kb (kilobases), (Fig.1). Página 36

37 Fig.1 Página 37

38 Figura 1: Esquema de um plasmídeo Ti. O T-DNA que é transferido para o genoma da planta, representa cerca de 7 a 13 por cento do plasmídeo Ti e é definido pelo limite da sequência à esquerda e à direita. O T-DNA contém genes que codificam enzimas para a síntese de auxina e citocinina e de opinas específicas (moléculas sintetizadas e posteriormente secretadas sendo utilizadas como fonte de carbono pela bactéria). O T- DNA é apenas transcrito e traduzido na célula vegetal. A parte restante do plasmídeo é transcrita e traduzida na bactéria e contém vários genes vir (virulência) e também um único ou vários genes para catabolismo opina. A região ori representa o início da replicação. Nesta actividade a planta Kalanchoe sp é infectada, no caule e na folha, com a estirpe selvagem de Agrobacterium tumefaciens utilizando-se 5 tratamentos diferentes conforme indicado no Quadro I. Material/Equipamentos: - Água Esterilizada - Álcool Etílico - Ansa de inoculação - Adesivo - Bico de Bunsen - Agulha - Papel de Filtro - Planta - Cultura de Agrobacterium tumefaciens Procedimento: 1. Identificar os locais da planta que são infectados, colocando, no caso do caule, um anel de fita adesiva um pouco acima ou abaixo do local. 2. No caso da folha o adesivo deve colocar-se no pecíolo da folha que recebe o tratamento. 3. Após o tratamento as plantas devem ficar num local iluminado e devem se mantidas húmidas. 4. Observar e registar o desenvolvimento do tumor durante as quatro semanas seguintes. Página 38

39 5. Observar os tumores ao M.O.C e comparar com os órgãos que não foram infectados. 6. No final da experiência a planta infectada deve ser destruída e todo o material que esteve em contacto com a bactéria deve ser esterilizado. Quadro 1 Tratamento 1 a) Mergulhar a agulha em álcool e esterilizá-la utilizando o Bico de Bunsen (até ficar ao rubro); b) Ferir a superfície foliar da planta, uma ou mais vezes, com a agulha; c) Esterilizar a ansa de inoculação levando-a ao rubro pelo calor; d) Introduzir a ansa no interior do frasco com a cultura da bactéria e retirar um pouco de material; e) Espalhar o material na ferida e esterilizar, de novo, a ansa. Procedimento Esterilização Tratamento 2 a)ferir a planta do mesmo modo do tratamento 1; b) Infectar a zona ferida, após 24h. Tratamento 3 a) Ferir e infectar a planta como anteriormente; b) Cortar o papel em pedaços e humedecer em água esterilizada. c) Colocar os papéis sobre a ferida fixando-os com fita adesiva; d) Manter, durante dois dias, o papel humedecido. Ferir a planta com uma agulha esterilizada Tratamento 4 a) Ferir a planta no mesmo local que foi utilizado na planta do tratamento 1. b) Ferir a planta num novo local. c) Não infectar as feridas. Infectar a ferida com a bactéria Tratamento 5 a) Não ferir a planta. b) Aplicar a bactéria utilizando a ansa de inoculação esterilizada, em vários locais. (Adaptado de - The European Initiative for Biotechnology Education). Esterilizar a ansa, antes e depois de ser utilizada Cultura da Agrobacterium Página 39