Métodos de detecção e quantificação de Organismos Geneticamente Modificados e seus produtos.

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1 CEPPA Ministério da Educação Universidade Federal do Paraná Setor de Tecnologia Centro de Pesquisa e Processamento de Alimentos CEPPA Métodos de detecção e quantificação de Organismos Geneticamente Modificados e seus produtos. Fábio de Oliveira Pedrosa

2 Métodos baseados no DNA Métodos baseados na Proteína

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4 Aspectos Importantes da Quantificação de OGM s Amostragem e preparo da amostra Procedimento determina a representatividade do resultado. Tamanho da amostra, homogeneidade da amostra e limiar de detecção. Requerimentos estatísticos devem ser satisfeitos. Tipo de material define o método analítico. Materiais não processados (ex. grãos) Ingredientes processados Alimentos processados

5 Materiais de Referência Controles positivos e negativos appropriados. Base para validação do procedimento analítico Procedimento independente Efeitos da matriz e consistência similar para amostragem. Grãos,alimentos, etc Estabilidade temporal, homogeneidade e conteúdo de OGM Métodos baseados no DNA: requerem muitos controles positivos Métodos baseados em Proteínas necessitam de um único padrão. Institute of Reference Materials and Measurement Geel, Belgica - Padrões Fluka. Por que não desenvolvermos Padrões brasileiros? Ahmed, 2002

6 Métodos de análise baseados na detecção de Proteínas Os transgenes codificam para proteínas únicas e diferentes daquelas da planta hospedeira (originalmente não transgênica). Técnicas de Immunoensaios usam anticorpos. Ideais para necessidades qualitativas e quantitativas Detectam proteínas especificas em substratos complexos A proteína alvo deve ser conhecida Interferências devido interações não-específicas com proteínas, surfactantes (saponinas), fenólicos, ácidos graxos e fosfatases Anticorpos policlonais Sensíveis mas apresentam reconhecimento menos específico do antigeno. Reação cruzada Anticorpos monoclonais Altamente específicos, reconhecimento do antígeno ligeiramente menos sensível.

7 Métodos de análise baseados na detecção de Proteínas Western Blot = transferência de proteínas para membranas ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay): 1. Em placas de micropoços (Microwell Plate) 2. Imunocromatográfico em tiras (Lateral Flow Strip Assay) 3. Em Tubos recobertos com anticorpos 4. Imunomagnético

8 Western Blot Teste qualitativo de alta específicidade Indica se a concentração da proteína OGM está acima ou abaixo do limiar de concentração requerido Usado tipicamente para pesquisa Usa eletroforese desnaturante SDS-PAGE Solubiliza e remove agregados de proteínas

9 Western Blot Extrato celular é aplicado em gel SDS PAGE Submetido a eletroforese As proteínas do gel são transferidas para uma membrana e reveladas com anticorpos específicos toalha de papel Membrana de transferência Gel toalha de papel

10 Western Blot 1. Bloquear os sítios de ligação da membrana com leite desnatado 2. Lavar com ddh2o 3. Adicionar anticorpos monoclonais 4. lavar de novo Anticorpos irão ligar à proteína específica 5. Adicionar segundo anticorpo (marcado) contra o primeiro anticorpo. Revelar o anticorpo ligado para desenvolvimento de cor. O aparecimento de cor revela a presença da proteína em estudo

11 ELISA Placa de micropoços Micropoços são revestidos com anticorpo Quantitativo, altamente sensível, econômico, de alta produtividade, e ideal para análises laboratoriais. A proteína não pode estar desnaturada. Detecta 0.25% OGM em sementes & 1.4% em alimento tostado (toasted meal) Tempo de análise: 90 min Necessita leitor óptico de placas para quantificar

12 ELISA em Placa de micropoços Procedimento: 1. Fixar anticorpo monoclonal específico para a proteína OGM. Eliminar excesso de anticorpo. Bloquear sitios de ligação com proteínas de leite. 2. Adicionar extrato total do material em análise. Remover excesso por lavagem. Proteína OGM fica ligada ao anticorpo. 3.Adicionar segundo anticorpo específico para a proteina OGM 4. Adicionar anticorpo anti-anticorpo específico marcado com enzima (HRPeroxidase ou fosfatase alcalina). Remover excesso do segundo anticorpo. 4. Revelar poço Proteína OGM proteína bloqueadora Intensidade da cor é dependente da concentração da proteína GMO

13 Detecção Imunocromatográfica de OGM Amostra OGM proteína Anticorpo específico marcado linha teste linha controle Segundo Anticorpo anticorpo específico específico capturado por anticorpo (a) vista lateral do ELISA Resultado negativo Resultado positivo (b) vista vertical da tira Um variante do ELISA com dois anticorpos específicos à proteína expressa sendo um imobilizado e outro livre, que é acoplado a um reagente de cor. Rápido, econômico, transferable & good for initial screening

14 Protocolo de imunocromatografia para folhas Corte disco de folha 2. Adicionar a tubo, e macerar 3. Inserir uma flow tira de teste Testes para CryI(Ab) & CP4 EPSPS Orgãos vegetais & sementes.

15 Protocolo de imunocromatografia para grãos 1. Contar ou pesar grãos equivalentes a 1000 grãos 2. Colocar no copo do liquidificado 3. Adicionar 1000 ml de água destilada 4. Liquidificar 5. Deixar decantar 6. Pipetar 0,5 ml para tubo plástico de 1,5 ml 7. Inserir tira imunocromatográfica 8. Incubar por 5 min à temperatura ambiente 9. Ler o resultado 1. Uma banda colorida = Negativo 2. Duas bandas coloridas = Positivo

16 Experiência no CEPPA Detecção imunocromatográfica - tiras Kits reagentes da Strategic Diagnostics Inc. USA, soja RR (GR Bulk Soybean test kit) = LOD 0,1% milho (Bt1 Corn Grain test kit) = LOD 1% farelo de soja tostado (RUR Toasted Meal test kit) = LOD 0,9% Limites de detecção encontrados: Soja - limite de detecção: 0,1% de OGM (ou 1 semente de soja transgênica RR em 1000). Confiabilidade de 99% (3 sub-amostras)

17 CEPPA Ministério da Educação Universidade Federal do Paraná Setor de Tecnologia Centro de Pesquisa e Processamento de Alimentos CEPPA Ensaio Imunocromatográfico (Tiras) Controle Teste Razão soja GM/soja % Soja GM 1 /1000 0,1 2 /1000 0,2 5 /1000 0,5 10 / Kit de reagentes GR Bulk Soybean test kit Soja RR 100 /1/900 10

18 ELISA Imunomagnético Particulas Magnéticas como superfícies de suporte sólido Revestidas com anticorpos de captura e colocadas em tubos. Separação usando um magneto exclui reagentes não ligados. Cinética e precisão superiores devido à uniformidade das partículas. VS. Anticorpos Anticorpos livres para mover em solução.

19 Considerações sobre os ensaios ELISA Otimização e validação são importantes aspectos da padronização das técnicas de detecção de OGM s Devido a grande diversidade de tipos de alimentos otimização e validação são imperativos. Fatores afetado a otimização são: 1. Parâmetros como: qualidade dos kits reagentes disponíveis comercialmente métodos para testar proteínas modificadas tempos de incubação, etc. 2. Limites de detecção (positivo/negativo) ou % 3. Rigor nos controles 4. Experiência do laboratório, problemas potenciais de contaminação do ambiente e de pessoas.

20 Considerações sobre os ensaios ELISA Fatores afetando a Validação incluem: 1. Eficiência do método de extração da proteína OGM 2. Acurácia dos resultados 3. Precisão e habilidade do operador em distinguir entre valores muito próximos 4. Sensibilidade, limite de detecção 5. Especificidade (anticorpo monoclonal) 6. Reproducibilidade 7. Consistência e confiabilidade de detecção

21 Conclusões sobre os ensaios ELISA ELISA é o método preferido para análise preliminar, qualitativa, de um OGM particular em material não processado, alimentos semi-processado e ingredientes processados, desde que a proteína expressa não esteja degradada e possa ser detectada. Como ELISA tem menor poder de detecção que métodos envolvendo DNA, (métodos de PCR), ele é menos sensível para testar alimentos terminados contendo muitos ingredientes, especialmente se o limite de detecção for baixo. Alguns OGMs não expressam níveis detectáveis de proteína (NÃO É O CASO COM OS OGMs MAIS COMUNS)

22 Métodos Baseados no DNA Se baseiam na complementariedade da duas fitas do DNA, que hibridizam de maneira sequência-específica. (A=T; C G) Reação em cadeia da DNA polimerase Requer DNA de alta qualidade 35S promoter CaMV EPSPS CP4 NOS terminator Agrobacterium tumefaciens Diagrama representando a sequência RoundupReady

23 Preparo da amostra de DNA Extração e purificação do DNA A extração e a purificação do DNA são etapas importantes na obtenção de um DNA de qualidade. O DNA obtido apresentar : Alto grau pureza A260/A280 nm superior a 1,8 Massa molecular elevada (>>10000 pb) Baixo grau de dano do DNA é decorrente de: Calor, baixo ph (depurinação), nucleases (degradação enzimática)

24 Preparo da amostra de DNA Amostra para a extração do DNA A amostra laboratorial deve representar a amostra do campo/alimento: material de partida: 1-2,5 kg de sementes de soja mg de amostra finamente moida para purificação. DNA pode ainda ser afetado por contaminantes presentes nos diferentes tipos de alimentos e que nibem a detecção do rdna por PCR, entre eles: Polisacarídeos, lipídeos, polifenois & reagentes de extração do DNA

25 CEPPA Ministério da Educação Universidade Federal do Paraná Setor de Tecnologia Centro de Pesquisa e Processamento de Alimentos CEPPA Métodos de extração e purificação de DNA - Inúmeros Mais utilizados: 1. O método do CTAB (Brometo de cetiltrimetilamônio) - Recomendado pelo Min. Agricultura. 2. O método Wizard da Promega usando resina magnética. 3. O método proprietário PrepMan Ultra da Applied Biosystems (Real time PCR).

26 Requerimentos para extração do DNA Quebrar as paredes celulares Gelo seco ou nitrogênio líquido Romper as membranas celulares Detergentes : CTAB or SDS Inativar nucleases EDTA quela Mg2+ inibindo nucleases. Separar polissacarídeos inibidores Separar constituintes celulares hidrofóbicos lipideos & polifenois com solvente orgânicos Separar o DNA precipitando e lavando-o com alcool. Determinar grau de pureza por espectrometria UV em 230, 260 e 280 nm. Calcular a razão 260/280 nm superior a 1,8

27 Princípios da reação em cadeia da DNA polimerase (PCR) Permite amplificar o DNA alvo milhões de vezes. DNA polimerase faz cópias exatas do DNA alvo Utiliza oligonucleotideos iniciadores 1 (primers) complementares ao gene de interesse 5 6 Permite a Taq-polymerase gerar 7 8 sequências complementares à 9 10 região contida entre os pares de primers O número de sequências cresce exponencialmente 17 Cycles 18 DNA molecules formed ,024 2,048 4,096 8,192 16,384 32,768 65,536

28 Reação em cadeia da DNApolimerase (PCR) Mistura de reação: Tampão de PCR dntps Taq polimerase Primers F (senso) e R (antisenso) MgCl2 DNA (5 µl) Volume Total (25 ou 50 µl/reação)

29 Atividades da Taq polimerase Atividade de DNA polimerase Termoestável Atividade 5 nuclease associada à polimerização Atividade 5-3 nuclease. Não atrapalha PCR convencional dntp Polimerase nuclease 3 5

30 Ciclagem térmica da PCR Perfil de ciclagem térmica Universal (PCR) (o.c) 1x 30-40x :00 0: desnatura DNA desnatura DNA :00 0:30 anela os primers estensão dos primers

31 Mecanismo da reação em cadeia da DNA polimerase (Ciclagem térmica) primers F e R Gen alvo em dupla fita Desnaturar fitas e anelar primers 5 Estender Primers com a Taq Polimerase Desnaturar, Aneal e Estender Primers Produtos: Amplicons Amplificação exponencial = 2n n = número de ciclos

32 mostrar animação pcr.exe

33 Ciclagem térmica : Plateau Amplificação é exponencial, mas o aumento exponencial é limitado levando a um plateau. Causas do plateau? Log DNA alvo Teórico Real Número do Ciclo Inativação progressiva da Taq polymerase, Redução da eficiência da etapa de desnaturação Redução da eficiência do anelamento dos primers devido a competição com o produto (reanelamento do produto) Taq polymerase se torna limitante.

34 Confirmação dos Fragmentos de DNA amplificados por PCR Eletroforese em Gel de agarose tamanho Verificar se o produto amplificado tem o tamanho esperado. Artefatos de mesmo tamanho => falso positivos Ensaio Southern Blot Confiável mas demorado Nested PCR permite discriminação. 2o. par de primers dentro do amplicon Sequenciamento do amplicon Conveniente e demorado

35 Tipos de métodos de PCR para detecção de OGMs 1. Qualitativo 2. Semi-Quantitativo 3. Quantitativo 3.1 Competitivo 3.2 Tempo Real Sistemas de detecção/quantificação: Sondas de transferência de energia fluorescente por ressonância (FRET) - Sistema TaqMan ( 5 nuclease) Sistema SybrGreen I (ligante de DNA dupla fita)

36 PCR Qualitativo Usa dois pares de primers: F; senso ou 5 3 e R; antisenso ou 3 5 Os fragmentos de DNA amplificados (amplicons) são separados por eletroforese em gel de agarose e visualizados por coloração com Brometo de Etídio. HPLC e Eletroforese Capilar Soja, trigo, canola, batata, arroz, milho, tomate, etc.

37 Componentes da Reação de PCR: DNA dupla fita (template ou molde) dntp s (datp, dgtp, dctp, TTP) Par de oligonucleotídeos iniciadores (primers), complementares às bordas externas do gene/transgenes de interesse (alvo) Mg2+ Taq polimerase

38 Legislação da Coordenação de Laboratório Vegetal CLAV/DDIV/SDA/MAPA NORMAS PARA CREDENCIAMENTO DE LABORATÓRIO PARA DETECÇÃO DE MODIFICAÇÃO GENÉTICA EM PRODUTOS E SUBPRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL DOU Nº163 - Seção 1, sexta-feira, 24 de agosto de 2001 INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 32, DE 19 DE JULHO DE 2001 Anexo II ISOLAMENTO DE DNA DE GRÃOS E FARINHAS

39 ISOLAMENTO DE DNA DE GRÃOS E FARINHAS (INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 32, DE 19 DE JULHO DE 2001) MÉTODO CTAB MODIFICADO PARA ANÁLISE DE AMOSTRAS DE ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS. PROCEDIMENTO: 1. Pesar 1 Kg de grãos; 2. Moer os grãos em moedor de café e colher duas sub-amostras (200mg) de farinha em um tubo de microcentrífuga; 3. Acrescentar 750µL de tampão CTAB e 15µL de beta-mercaptoetanol; 4. Agitar em um vortex durante 2 min; 5. Incubar a 65 C por 15 min; 6. Adicionar 520µL clorofórmio: álcool. isoamílico (24:1); 7. Agitar em um Vortex durante 1 min; 8. Centrifugar rpm por 10 min.; CONTINUA

40 9.Transferir o sobrenadante para um novo tubo e acrescentar igual volume de isopropanol e 1/2v de acetato de amônio 7,5M; 10. Centrifugar rpm por 10 min; 11. Desprezar o sobrenadante e lavar o precipitado com etanol 70%; 12. Centrifugar rpm por 5 min.; 13. Desprezar o sobrenadante e secar o precipitado em temperatura ambiente durante 15 min; 14. Solubilizar o precipitado em 50µL de água ultra-pura. 15. Determinar a concentração e qualidade do DNA em espectrofotômetro; 16. Armazenar o DNA a -20 C.

41 Amplificação do DNA - Método qualitativo de PCR (INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 32, DE 19 DE JULHO DE 2001) Para cada sub-amostra, 4 tubos de reação de PCR são utilizados em uma reação conforme a descrição abaixo: Água 17,8 ul Tampão de PCR 10X 2,5 ul MgCl2 1,0 ul desoxiribonucleotídeos (dntps) (10 mm) 0,5 ul Primers Tubo 1 Act F (20 um) 1,0 ul e Act R (20 um) 1,0 ul Tubo 2 35S-1 (20 um) 1,0 ul e 35S-2 (20 um) 1,0 ul Tubo 3 35S-3 (20 um) 1,0 ul e 35S-4 (20 um) 1,0 ul Tubo 4 Nos-1 (20 um) 1,0 ul e Nos-2 (20 um) 1,0 ul Taq DNA polimerase (5 U/ul) 0,2 ul DNA (200 ng) 1,0 ul Total 25,0 ul O tubo 1 é um controle interno para verificar a qualidade do DNA vegetal. Os tubos 2, 3 e 4 são para verificar a presença de transgênico, pois amplificam regiões regulatórias comuns aos transgênicos em uso. Outros três controles são agregados durante a PCR: DNA proveniente de grãos não transgênicos (controle negativo), ausência de DNA (controle negativo para verificar contaminação durante a manipulação da amostra) e DNA grãos contendo 0,1% de transgênicos (controle positivo).

42 Método dirigido para detectar promotor 35S e terminador NOS 35S promoter CaMV EPSPS CP4 NOS terminator Agrobacterium tumefaciens Diagrama representando a sequência RoundupReady

43 (INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 32, DE 19 DE JULHO DE 2001) Reação de amplificação em termociclador MJR PTC-100 Desnaturação inicial: 96 C 2 min Desnaturação: 94 C 1 min Anelamento: 62 C 45 seg Extensão: 72 C 45 seg Extensão final: 72 C 45 seg Número de ciclos: 35 A interpretação dos resultados é efetuada através da verificação da presença de fragmentos de DNA nas amostras, observada após a eletroforese em gel de agarose 2% em tampão TBE, com o mesmo tamanho do fragmento observado no controle positivo e ausente nos controles negativos. Para uma amostra ser considerada positiva, os três pares de primers que detectam OGMs deverão resultar em amplificações semelhantes ao controle positivo.

44 PCR Quantitativo Métodos : 1. PCR convencional (semi-quantitativo a quantitativos) 2. Método de PCR Competitivo 3. PCR Quantitativo Tempo-Real

45 PCR convencional Determina a percentagem de OGM no alimento F 5 NOS 35S Promoter Coding region Terminator 3 R ex. determinar a concentração de soja GM (35SCP4 EPSPS) em grãos.

46 PCR QUANTITATIVO CONVENCIONAL As concentrações dos produtos presentes no ponto A (PONTO FINAL) determinados por densitometria após eletroforese em gel de agarose e são grafados em função da percentagem de OGMs presentes na amostra inicial. O resultado demonstra que a proporcionalidade entre a concentração de DNA e os produtos de PCR (faixa dinâmica) é limitada no PCR convencional.

47 Exemplo de determinação quantitativa da concentração de OGM por PCR convencional 1. Padrão de peso molecular 2. 5% soja RR 3. 2% soja RR 4. 1% soja RR 5. 0,5% soja RR 6. 0,1% soja RR 7. Soja não-transgênica 8. Soja não-transgênica 9. Controle sem DNA 10. Amostra OGM 11. Amostra OGM % soja RR Soja RR + controle externo 14. Soja RR + controle externo

48 Exemplo de determinação quantitativa da concentração de OGM por PCR convencional 15. Padrão de peso molecular 16. Amostra + controle externo 17. soja RR + Controle interno(ubiq) 18. Amostra + Controle interno(ubiq) 19. Amostra + Controle interno(ubiq) 20. Soja não-transgênica + Controle interno(ubiq)

49 Processamento posterior das bandas coradas 1. Determinar a intensidade das bandas por densitometria 2. Utilizar os padrões normalizados contra a referência interna para construir curva padrão 3. Determinar as concentrações das amostras desconhecidas utilizando a curva padrão. Duração 1-2 dias

50 Ciclagem Térmica PCR Semi-quantitativo traditional ou Convencional Amplificação Quantitativa de genes alvo Dificuldades: Grande esforço para estabelecer condições ótimas de reação (concentrações de DNA alvo e primers) Difícil de reproduzir, mas não impossível!!!! Difícil desenhar um controle interno (escolher gene conservado ubíquoto tipo pirofosfatase, lectina, zeina, ubiquitina, etc.) mas não impossível!!!! Problemas de especificidade de primers Necessário realizar eletroforese dos produtos de amplificação e todo processamento posterior (densitometria, etc.) Difícil de conseguir alta produtividade

51 PCR Quantitativo Normaliza um marcador de OGM (ex. 35S) a um gene de referência específico da planta (ex. Lectina). Combina 2 reações de quantificação absoluta; mede a concentração de DNA da amostra e permite Determinar o número de cópias/genoma de ambos os genes (transgene e referência) Determinar = % de OGM s na amostra. PCR Multiplex Ambos pares de primers na mesma reação Razão entre número de cópias do genoma GM/número de cópias total do genoma

52 Método de PCR Competitivo Co-amplificação da sequência alvo (transgene) e do padrão interno (ex. lectina para soja; zeina para milho) Gene alvo específico de concentração desconhecida e molde controle de concentração conhecida. (1%) Uso preferencial dos mesmos primers que amplificam sequências de 2 tamanhos diferentes. Duplo QC-PCR usa 2 reações diferentes GM alvo e gene específico ex. gene da lectina (lel) em soja para RRS Concentração do gene competidor equivalente a 1% da soja geneticamente modificada (+/-)

53 QC-PCR Adapted from Hübner et al.,

54 PCR EM TEMPO REAL Detecção em tempo Real dos produtos de amplificação de DNA alvo (gene) pela reação em cadeia da DNA polimerase. PCR em tempo Real (Real-Time PCR) usa fluorescência o que permite a medida direta e a quantificação dos produtos da reação amplificação. Permite a quantificação precisa e reproduzível dos ácidos nuclêicos.(dna e RNA)

55 Vantagens do PCR em Tempo Real Ampla faixa dinâmica de detecção (faixa de sensibilidade) Química em tubos fechado Dispensa electroforese Dispensa processamento posterior dos produtos de PCR (gel, coloração, hibridização, densitometria, autoradiografia, etc.) Alta produtividade de análises Utiliza placas de micropoços (microwell plate) de 96 poços

56 PCR em Tempo Real Aplicações: Determinação de Transgênicos (OGMs) Expressão gênica Quantificação de Cancer Detecção de dano do DNA Controle Qualidade Quantificação de Patógenos Entre outras.

57 Etapas do PCR em Tempo Real Detecção de curvas de PCR tempo Real Preparo da amostra Termo Ciclagem Detecção da Fluorescência Análise dos Dados Único Instrumento Análises Gerais Análises de Aplicações Específicas

58 Preparo da amostra Purificar DNA Purificado Vários métodos Kit PrepMan Ultra Applied Biosystems 35S promoter CaMV DNA dupla fita EPSPS CP4 NOS terminator Agrobacterium tumefaciens

59 Ciclagem Térmica Detecção de curvas de PCR tempo Real Preparo da amostra Termo Ciclagem Detecção da Fluorescência Análise dos Dados único instrumento Análises Geral Análises de Aplicações Específicas

60 Ciclagem Térmica 2 Químicas Ensaio Fluorogênico 5 Nuclease, Sondas Taqman Vantagem: a especificidade é garantida pela sonda Taqman SYBR ligante de DNA dupla fita Todos dsdna produtos são detectados necessário realizar análise de dissociação (Tm)

61 Ensaio Fluorogênico 5 Nuclease Sonda Fluorescente Taqman Única para cada gen alvo Anela entre os 2 primers a 10 C acima dos primers Aumenta a especificidade da reação Aplicações: Quantificação de OGM s Detecção de polimorfismo Quantificação de ácidos nuclêicos por PCR Tempo Real

62 Ciclagem Térmica Taqman usa FRET Fluorescent Resonant Energy Transfer

63 Estrutura das sondas Taqman R Reporter (FAM,VIC) Q Quencher (Tamra) Taq polimerase (5 Nuclease) R Q R Q Fluoresce Sonda (não fluoresce) Clivada

64 Atividade 5 nuclease da Taq polimerase Atividade associada à polimerização dntps polimerase nuclease 3 5

65 Ensaio Fluorogênico 5 Nuclease Polimerização 5 Taq Não fluoresce primer Q R 5 3 Deslocamento 5 3 R Não fluoresce Q 5

66 Ensaio Fluorogênico 5 Nuclease Clivagem R Fluoresce Q Polimerização Completada Fluoresce R Q

67 SYBR corante para fita dupla de DNA SYBR green 1 DYE SYBR fluoresce ao se ligar ao DNA dupla fita Qualquer DNA dupla fita NON-specific Usado para ensaios de identificação de genes alvo (screening) Baixo custo Problema: dimeros dos primers ou produtos de PCR não-específicos também fluorescem.

68 SYBRGreen Corante para fita dupla de DNA Sequência alvo DNA Desnaturação

69 SYBRGreen Corante para fita dupla de DNA Polimerização Polimerização Completa

70 Ciclagem térmica Perfil de ciclagem térmica Universal (PCR) (o.c) 1x 1x :00 0:15 40x : :00 UNG ativação da Taq Gold Perfile de Dissociação entre 60 to 95C 0.5C /cicle SYBR GREEN

71 Um único Instrumento Detecção de curvas de PCR tempo Real Preparo da amostra Termo Ciclagem Detecção da Fluorescência Análise dos Dados Único instrumento Análises Gerais Análises de Aplicações Específicas

72 Único Instrumento Mecanismos de detecção e instrumentos diferem dependendo do fabricante. Instrumento mais vendido e usado. Applied Biosystems CEPPA Outros Fabricantes de Termocicladores Tempo Real Biorad (similar ao AB) Westburg

73 ABI 7000/7700

74 Detecção Fluorescente Real time detection of PCR curves Preparo da amostra Ciclagem térmica Detecção Fluorescente Único instrumento Análises de aplicações específicas

75 Detecção Fluorescente Lâmpada Excitation Filter Fold Mirror CCD Camera Fresnel Lens Dichroic Mirror MultiElement Lens Well Lenses Filter Wheel 96-Well Plate Peltier-based block thermal cycling system

76 Análise dos Dados Real time detection of PCR curves Preparo da amostra Ciclagem térmica Detecção Fluorescente Análises dos dados In single instrument Análise Geral Análises Específicas

77 Desenho Experimental Mistura de reação: Universal master mix (taqman or SYBR green) Tampão de PCR + dntps Amplitaq Gold polimerase UNG (evita contaminação, não necessário) ROX reporter = referência fluorescente interna Primers F (senso) e R (antisenso) do gene alvo Primers F (senso) e R (antisenso) do controle interno Sonda Taqman Volume Total (25 ou 50 µl/reação) Pipetar mistura para os micropoços (Amostra em triplicata) Adicionar DNA (5 µl) Centrifugar a placa para eliminar bolhas de ar

78 Desenho Experimental Definir distribuição das amostras na placa Serão: 6 concentrações de amostras padrão =18 poços Controle positivo = 2 poços Controle negativo = 2 poços 37 Amostras desconhecidas (2X) = 74 poços Custo dos R$ 4000,00

79 PCR terminado, Análise dos Dados ABI prism coleta dados primários em 4 filtros A Fluorescência dos corantes é calculada usando um algorítmo multicomponente. Reporteres são normalizados contra a referencia interna o fluoróforo ROX Correções da linha de base Curva de dissociação (SYBR green 1) Resultados dependente da aplicação Quantificação da reação de PCR pelo Ciclo limiar (Cycle Threshold) Medidas de Ponto Final

80 Espectros brutos Dados coletados no final de cada ciclo. FAM/SYBR A VIC/JOE TAMRA/NED B C ROX D

81 Algoritmo calcula automaticamente a contribuição de cada fluoróforo.

82 Referência Fluorescente Rox ROX é uma referênca fluorescente passiva presente no tampão. Sinais dos Reporteres são normalizados contra ROX para eliminar variações operacionais Níveis de Fluorescência são diferentes no meio e laterais da placa Amostra1 FAM ROX FLUORESCENCIA FLUORESCENCIA Diferenças ópticas nos plásticos das placas Erros de pipetagem Amostra2 FAM ROX

83 Gráfico das Fluorescências da Amplificação Normalizado Sinal normalizado do reporter (FAM) contra ROX Rn Rn = Número do ciclo Sinal do Reporter ROX

84 Correção da linha de base Sinal do reporter normalizado e linha de base corrigida Rn Linha de base Cicle 3-14 Todos os dados começam no 0 Rn = Cycle number Reporter signaln Reporter signal6-16 ROXn ROX6-16

85 Curva de dissociação Immediatamente depois do PCR, aumenar a Temperatura de 60 a 95 C Produtos do DNA (amplicons) irão desnaturar. Fluorescência do SYBR green cairá durante a desnaturação Fluorescência SYBR fluorescência SYBR dissocia dos dsdna Temperatura

86 Curva de Dissociação Primeira derivada dos dados brutos Pico = Tm do amplicon Segundo pico observado na temperatura menos indica: Dimeros dos primers Amplificação não específica.

87 PCR completado, Análise dos Dados ABI prism coleta dados primários em 4 filtros A Fluorescencia dos corantes é calculada usando um algorítmo multicomponente. Reporteres são normalizados contra a referência interna o fluoróforo ROX Correções da linha de base Curva de dissociação (SYBR green 1) Resultados dependente da aplicação Quantificação da reação de PCR pelo Ciclo limiar (Cycle Threshold) Medidas de Ponto Final

88 Ciclo limiar (Cycle Threshold) Ciclo limiar Ct Número de ciclos de amplificação necessário para a fluorescência ultrapassar o limiar (fluorescência mínima) O Liminar (Threshold) é determinado na fase exponencial: o meio da parte linear quando a fluorescência é grafada logaritmicamente exponential threshold exponential threshold

89 Faixa Dinâmica e curva padrão Amplificação de diluições seriadas de amostra padrão Curva padrão mostrando unidades 8 logs da faixa dinâmica linear

90 Quantificação absoluta Resultados de amplificação do DNA de amostras de concentrações conhecidas como curva padrão: Ct versus concentração Calcular a concentração da amostra desconhecida com a curva padrão. A inclinação da curva padrão dá informação sobre a eficiência do PCR. 100% eficiência inclinação (tg) = Correlação R da indicação da reproducibilidade da pipetagem e deve ser 0.99 Inclinação= R 0.99

91 PCR em tempo real A concentração dos produtos é determinada continuamente por medidas de fluorescência. Na reação de PCR em tempo real (RT-PCR) a amplificação é proporcional ao número do ciclo durante a fase exponencial do PCR. Em contraste com o PCR convencional existe uma relação linear entre a concentração dos produtos de PCR e a concentração de DNA durante a fase exponencial do RT-PCR. Determinar ponto de amostra conhecida que é o mesmo e referencia-lo a fragmento GM desconhecido.

92 Resumo dos métodos de detecção de produtos de OGMs Parâmetro Baseados na Proteina Western blot ELISA Imunocromatográfico (tiras) Facilidade de uso Dificil Moderada Simples Necessita equipamento special Sim Sim não Sensibilidade Alta Alta Alta Duração 2 dias min 10 min Custo/amostra (US$) 150,00 5,00 2,00 Fornece resultados Quantitativos? Não Sim Não Apropriado para teste de campo? Não Sim Sim Empregado principalmente em: Pesquisa Laboratórios de análise de rotina CEPPA Teste em Campo Ahmed, 2002

93 Resumo dos métodos de detecção de produtos de OGMs Parametro Baseados no DNA Southern blot PCRQualitativo -PCR Competitivo PCR em Tempo Real Facilidade de uso Dificil Dificil Dificil Dificil Necessita equipamento special Sim Sim Sim Sim Sensibilidade Moderada Muito Alta Alta Alta Duração 6 horas 1,5 dias 2 dias 1 dia Custo/amostra (US$) 150,00 250,00 350,00 450,00 Fornece resultados Quantitativos? Não Não Sim sim Apropriado para teste de campo? Não Não Não Não Empregado principalmente em: Pesquisa Laboratórios de análise de rotina CEPPA Laboratórios de análise de rotina Laborat órios de análise de rotina CEPPA Ahmed, 2002

94 Outros métodos em desenvolvimento 1. Espectrometria de infra vermelho próximo (NIR) 2. Microarranjos de DNA - DNA chips

95 Agradecimentos CEPPA: Ariene Costa Prado Yoshiyasu Fabiana Nicol Barbieri Arion Zandoná Filhos Mundo: Darcy Pawlik Farid E. Ahmed B. Leyman

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