7.28 Spring 01 Respostas do Conjunto de Problemas #1

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1 1. Você tem em um DNA template dupla fita linear com 2000 bases, uma região de 1000 bases a qual você gostaria de amplificar usando a reação de polimerase em cadeia (PCR). Além do template, você adiciona os primers apropriados (veja diagrama abaixo), uma polimerase termoestável de DNA (Taq), e os outros componentes necessários para a reação. Primer 1 3' 5' 5' 3' Primer 2 O ciclo que você programou a máquina é para: 1) 92 o C por 30 seg. (desnaturação) 2) 56 o C por 30 seg. (anelamento primer-template) 3) 72 o C por 30 seg. (alongamento) Para executar a reação de PCR completa, esta sequência de variações de temperatura é repetida 20 vezes. a) Leva 1 segundo para Taq polimerase achar um primer ligado a um template de fita simples, mas só 1 milissegundo para adicionar uma base. Se a Taq polimerase tiver uma processabilidade de bp, ela poderá sintetizar bastante DNA para um PCR produtivo acontecer durante o tempo dado (etapa 3 = 30 segundos.)? E se Taq polimerase tivesse um uma processabilidade de 100 bp? Se a Taq polimerase tivessem uma processabilidade de bp, a Taq polimerase sairia do template a cada bases e levaria, aproximadamente, 1 segundo para a Taq achar a junção do template-primer novamente. Vamos usar 20 bp como processabilidade. O template tem 1000 bp. 1000/20=50. Assim, nós precisaríamos de, aproximadamente 50 eventos de ligação que deveriam requerer, aproximadamente, 50 segundos, mais 1 segundo que precisou sintetizar 1000 bases. Os 30 segundos dados para o alongamento (etapa 3) não são o bastante para sintetizar uma fita de DNA nova, se a Taq tivesse uma processabilidade de bp. Se a Taq polimerase tiver uma processabilidade de 100 bp: 1000/100=10, em média, a enzima Taq só teria que achar a junção de template-primer 10 vezes, assim 10 segundos mais o segundo necessário para adicionar 1000 bases, igual a 11 segundos. Os 30 segundos dados seriam bastante tempo para o PCR produtivo acontecer. b) Você precisa acrescentar uma helicase à mistura de reação? Você precisa de uma topoisomerase? Por que ou por que não? Você não precisa adicionar uma helicase, uma vez que aquecer o DNA a 92 o C (passo 1) desnatura o DNA (separa a dupla fita). Uma topoisomerase não é necessária, já que o template é linear e, portanto, não pode acumular tensão torsional. c) Depois de um ciclo (passos 1-3), esquematize as fitas de DNA que estão presentes no tubo de reação. Indique onde os primers 1 e 2 estão. Esquematize os produtos depois de 2 ciclos, novamente indique a localização dos primers. Como a maioria dos produtos se pareceria, após 20 ciclos? Esquematize um exemplo representativo. 1

2 d)e se você tivesse adicionado nucleotídeos, radioativamente marcados, no começo da reação de PCR? Volte para seus diagramas e indique as fitas de DNA que teriam incorporado os nucleotídeos radioativamente marcados com um asterisco*. Veja diagrama acima. 2. Você montou a análise in vivo de reparo de mau pareamento (mismatch) metil-dirigido em E. coli, que foi discutido na aula, usando um heterodúplex de DNA de fago lambda. a)esquematize os produtos esperados de cada variante, depois de um único ciclo de replicação de DNA de um DNA heterodúplex de lambda se a fita mutante (Z) for metilada e a fita do tipo selvagem (+) não for. Note que dam codifica a enzima que metila o A de uma região GATC em E. coli. 2

3 E. coli tipo selvagem (reparo baseado em fita metilada) Z Z E. coli muts - (sem reparo, apenas replicação. Ambos os tipos de fago liberados de uma única célula de E. coli) Z Z e + + E. coli dam - (justamente como o tipo selvagem, uma vez adicionado o DNA metilado) Z Z b)a sua resposta para a) mudaria se nenhuma fita for metilada? Se sim, como? (se nenhuma fita for metilada, haverá reparo randômico. Células E. coli únicas liberarão um mutante ou fago tipo selvagem, mas não ambos.) Z Z OU + + c) Como as mutações seguintes afetariam a taxa de mutação de E. coli? Explique. mutação nula dam Haverá conserto randômico, e assim a taxa de mutação aumentará, porque a célula não terá nenhum modo de saber qual fita é a fita recentemente reproduzida. superexpressão dam Não haverá nenhum reparo, e assim a taxa de mutação aumentará. 3

4 3.Você está no processo de mapear os replicadores no cromossomo 13 de levedura. Para este fim, você obteve um conjunto de 220 plasmídeos de levedura com insertos que cobrem o cromossomo 13 inteiro. a)como você determinaria os fragmentos que contêm origens de replicação? Descreva os atributos da estrutura básica de plasmídeo que seria requerida para seu teste (um diagrama é recomendado). Esta foi uma pergunta do exame, e os pontos foram atribuídos como segue: 3 pts: Diagrama do Vetor e menção de 3 entre 4 de: Centrômero, Inserto, Nenhuma Origem de Replicação, Marcador Seletivo. 1 pt: Transforme os plasmídeos nas leveduras. 1 pt: Selecione para o marcador com meio apropriado. b) Você identifica 12 plasmídeos que você pensa conter replicadores. Usando a análise de deleção de cada inserto, você determina que a maioria dos insertos pode ser reduzida a uma região de menos de 200 bp e ainda reter a função replicadora. A exceção é clone 728, que exige para >2000 bp funcionar em seu ensaio. Intrigado por este estrutura replicadora de levedura atípica, você constrói uma série de mutações de substituição nesta região e os testa em seu ensaio de replicadores. Você obtém os resultados seguintes. Replicação Baseado em seus dados, que regiões são necessárias e quais regiões são suficientes para função replicadora. 3 pts: Regiões 2, 4, e 6 cada são necessárias para função replicadora. 2 pts: Regiões 1-7 são as únicas regiões que demonstraram ser suficientes em com base desta experiência. -1 pt: Regiões 2, 4, e 6 são suficientes. Isto não é demonstrado aqui. Você precisaria mostrar que você pode mudar todos as sequências intervenientes e deixar 2, 4, e 6 para demonstrar isto. 4

5 c) Você quer identificar a origem de replicação para o clone 728. Você digere com enzimas de restrição a região e determina o mapa mostrado abaixo. Você testa para função de origem usando o ensaio de gel bi-dimensional. Para sua primeira experiência você digere, com EcoRI, o DNA de células de levedura crescendo ativamente. A sonda para o Southern blot é um fragmento HindIII-XhoI de DNA radioativo. Você obtém o resultado seguinte (este é um autorradiograma): Que conclusões você pode ter sobre o local da origem de replicação baseado nestes dados e os dados em 3a e 3b. 3 pts: O fragmento RI - RI tem uma origem. 3 pts: A origem de replicação fica situada em uma posição que está fora de centro. 4 pts: A origem fica situada ou na região 2 ou 6. Os dados são ambíguos neste ponto. d) Um colega mostra que sua experiência não demonstra definitivamente o local da origem de replicação. Que análise adicional 2-D de gel você poderia fazer que mostraria sem dúvida onde é a origem de replicação? Para cada experiência, descreva a digestão por restrição do DNA da levedura que você usaria, o fragmento de DNA que você vai marcar radioativamente para usar como sonda, e o padrão que você esperaria para cada possível local de origem. Análise para 2 sendo a origem: (2 pts) Corte o DNA com XhoI e RI. (1 pt) Sonde com HIII e XhoI. (2 pt) Explicação de resposta esquemática do auto-radiograma 5

6 Análise para 6 sendo a origem: (2 pts) Corte o DNA com XhoI e RI. (1 pt) Sonde com HIII e XhoI. (2 pts)explicação de resposta esquemática do auto-radiograma. Outras digestões e sondas são possíveis e foram atribuídos pontos semelhantemente. Em ambas partes C e D muitas pessoas estavam confusas se a digestão ou a sonda determinaram o padrão. A digestão sempre determina o padrão observado. A sonda apenas precisa estar dentro da região da digestão que é apropriada. 4)Você está estudando o mecanismo de replicação de DNA, no patógeno recentemente identificado T. assistantus. Você está esperando achar proteínas especificamente envolvidas na replicação do DNA do patógeno, para usar como alvos de drogas. Você decide que os mais prováveis candidatos para proteínas divergentes são aqueles envolvidos na iniciação da replicação na, já identificado, origem do T. de assistantus. Para fazer isto, você adota uma aproximação bioquímica, fracionando extratos celulares e procurando frações de proteína que podem se ligar à origem. 4a) Que ensaio você poderia usar para conferir rapidamente se suas frações contêm proteínas que se ligam uma sequência que contém a origem o DNA? Descreva o ensaio e os resultados esperados para uma fração de proteína que se liga ao DNA e uma que não o faz. Gel Shift Uma resposta completa requereu a informação seguinte: Sonda marcada correspondendo à origem Frações de proteína Corra produtos em um gel não desnaturante e exponha ao filme Explicação/descrição de resultados (palavras ou figura): A mobilidade da sonda marcada deveria ser alterada pela incubação da sonda com as frações de proteína que contêm origem proteínas de ligação. O DNA não marcado deve competir pela proteína; isto conduzirá a uma eliminação da alteração de mobilidade. Considerando que você não sabe a estrutura da origem, você não pode competir pelo sinal especificamente. 4b)Você acha frações múltiplas que se ligam na origem do DNA, e decide usar footprinting com DNAse I, para conferir onde na origem as proteínas se ligam. Os resultados são mostrados abaixo. 6

7 4b i) Indique na molécula onde o DNA está marcado (ao fim ou ao longo, e em qual fita?). Veja o Diagrama. O DNA deve ser marcado na extremidade de apenas uma fita. Para alinhar com o gel mostrado, deve ser marcado a 3' da fita esquerda, como mostrado, ou a 5' da fita direita. 4bii) A Fração B ligou ao DNA no seu primeiro ensaio, mas não está deixando sua pegada (footprinting) neste ensaio. Assumindo que as proteínas nesta fração podem se ligar ao DNA fortemente, que diferença nos dois ensaios poderia explicar isto? Considerando que o gel shift pode descobrir eventos de ligação de proteínas onde só 10% do DNA estão ligados, enquanto que o footprinting só detecta eventos altamente específicos onde 90% do DNA estão ligados, uma possibilidade seria que as proteínas da fração B estão se ligando fracamente. Porém, a pergunta fixou que eles estão ligando fortemente. Então, eles devem estar ligando inespecificamente em lugares diferentes em todos os pedaços do DNA. Você decide que fração B poderia conter histonas. Que ensaio usaria você para conferir isto? Digira o DNA não marcado com MNase, olhe para escada de DNA de 160 bp, corada com brometo de etídeo. Note que, simplesmente, digerir sua sonda marcada na extremidade com MNase ao invés de DNAse e olhar para o filme de raios-x pode não funcionar, já que a informação acima mostra que eles não estão ligando especificamente a um local. 7

8 Se você pensasse que havia outras proteínas interessantes nesta fração, que tipo de coluna você poderia usar para remover as histonas das outras proteínas? Uma vez que as histonas são extremamente carregadas positivamente, você poderia usar uma coluna carregada. Se você usar uma coluna positivamente carregada, por exemplo, as histonas deverão sair no fluxo. (totalmente não aderindo à coluna). 4c) Você quer saber então se quaisquer das proteínas que você tem fracionado estão desenrolando a região rica em AT da origem do DNA quando eles se ligam a ela. 4ci)Que ensaio você usaria? (Note que um ensaio de helicase não descobriria desenrolamentos localizados). Descreva o ensaio e os resultados esperados se o DNA é desenrolado ou se não é. Ensaio de desenrolamento de DNA. Justamente como no footprinting, mas usando uma enzima que corta DNA fita simples, como a nuclease P1. Assim, incube a mesma sonda marcada na extremidade em uma fita usada para footprinting com as frações de proteína, trate com nuclease P1, corra um gel desnaturante e exponha gel seco ao filme. Se o DNA é desenrolado completamente (fita simples), ele será cortado naquela região. Caso contrário, ele permanecerá como uma grande banda no topo do gel. 4cii) Você executa seu ensaio e descobre que quando as frações A, C, e D são todas adicionadas, o DNA desenrola em uma fita, mas não a outra. Como é isto é possível? Talvez uma fita do DNA desenrolado esteja protegida da nuclease por uma proteína ligada a ela. (Isto não é surpreendente, uma vez que você viu uma pegada (footprint) sobre esta região, quando estas frações foram todas sujeitadas ao footprinting com DNAseI acima.) 4d)Para entender qual destas frações de proteínas purificadas são necessárias para formar o complexo de ordem mais elevada na origem, da qual você vê evidência através do footprinting com DNAseI, você executa análises de filtração de gel com um plasmídeo que contém a origem, e as frações de proteína A, C, e D. Esquematize seguintes os resultados: A se liga à origem não importa que outras proteínas estão presentes, C se liga se ambas A e D estão presentes, e D nunca se liga. A curva exibindo as frações nas quais o DNA apenas elui é mostrada primeiro. Apenas DNA: Frações da Filtração do Gel 8

9 A Proteína A está marcada: A Proteína C está marcada: A Proteína D está marcada: e) Intrigado pelo fato de que proteína D parece importante e ainda nunca associou com o complexo, você titula a quantidade de proteína D, e acha que proteína D trabalha mesmo quando adicionada a 1/1000 da concentração das outras proteínas na reação. O que a proteína D pode estar fazendo? Uma possibilidade é que quantidades catalíticas de proteína D carregam a proteína C sobre a origem, talvez mudando a conformação de proteína C. 5. Você está estudando DNA helicase dnab de E. coli e está interessado em definir as regiões da proteína envolvidas em suas interações com outros fatores de replicação. Para este fim, você isola múltiplas mutações termo-sensíveis na proteína de dnab. Para começar a classificar os mutantes de dnab diferentes, você determina a incorporação de timidina [H 3 ] em células que contém cada um dos mutantes. Você identifica duas classes de mutantes. Os resultados de sua experiência são mostrados abaixo. 9

10 Minutos após a mudança para 42 C a) Você está surpreso por achar que você isolou ambas as mutações de parada rápida e lenta no dnab. Que aspecto de função de dnab em E. coli na replicação de DNA que você suspeita está defectivo, dentro da classe A de mutantes. Brevemente explique em termos moleculares por que um defeito nesta função conduziria a um fenótipo de parada lenta. Os mutantes de classe A em dnab não podem interagir corretamente com dnac, o chaperone de helicase. Após a troca da temperatura, o progresso da replicação não será afetado. A nova iniciação da replicação não acontecerá sem recrutamento e carregamento de dnab na origem através de dnac. Isto leva a um fenótipo de parada lento. b)para olhar mais cuidadosamente para a função da classe B de proteínas de mutante, você purifica várias das proteínas de dnab mutante. Você as analisa para atividade de DNA helicase e acha que mutantes B1 e B2 têm atividade normal de DNA helicase e mutante B3 não tem nenhuma atividade de helicase. Você também pôs estas proteínas mutantes em um oricdependente reconstituído. Análise da replicação de DNA e análise de incorporação de timidina [H 3 ]. Todos os ensaios são executados às 42 C (a temperatura não-permissiva). Você encontra os resultados seguintes: Tempo da Reação 10

11 Que atividades de dnab que você suspeita estarão defectivas nas atividades de B1 e B2. Explique seu raciocínio em cada caso. Mutantes B1 em dnab não podem interagir com a subunidade σ da holoenzima Pol III e não são estimulados a uma alta taxa de atividade de helicase. Isto reduz dramaticamente a velocidade de movimento de do garfo replicação e a taxa de polimerização de DNA no sistema in vitro reconstituído, e conduz a um fenótipo de parada rápida in vivo. Mutantes B2 em dnab perderam completamente a interação com dnag (primase). Sem recrutamento de primase para a origem, não pode haver nenhuma polimerização no ensaio de replicação in vitro. Há um fenótipo de parada in vivo porque a fita retardada requer continuamente a atividade de primase. NOTA: mutantes B1 não podem ter uma afinidade "reduzida" por primase, porque (como foi estabelecido em classe) estas mutações não têm nenhum efeito nas taxas de replicação in vivo, apenas aumentando o tamanho de fragmentos de Okazaki. c)desenhe uma experiência para testar uma de suas duas hipóteses acima. Assuma que você tem acesso a todas as proteínas purificadas envolvidas na replicação de DNA E. coli, um oric que contém plasmídeo, [H 3 ]timidina, e [H 3 ] uridina. Desenhe quaisquer substratos necessários, como você detectaria os produtos, e os resultados que você esperaria para tipo selvagem e proteínas mutantes. Para analisar os mutantes B2 para uma perda da interação de primase, execute um ensaio de atividade de primase: 1. Misture um template de fita única com uma forquilha artificial criada por oligonucleotídeos anelados com primase e helicase mutante B2, ou helicase de tipo selvagem como controle. Se você usasse um plasmídeo dupla fita contendo oric como um template, você precisaria adicionar outras proteínas como dnaa e dnac ou usar extratos de B2 mutante ou células de tipo selvagem para criar uma forquilha de replicação. 2.Inclua [H 3 ] UTP e outras rntps (para fazer RNA) no tampão apropriado. 3. Incube a reação a 42 C, durante vários minutos. 4.Coloque seus produtos de reação em um filtro e lave para remover nucleotídeos livres. Em contador de cintilação, meça a radioatividade que permanece. OU: Separe seus produtos de reação em um gel de acrilamida desnaturante e visualize através de auto-radiografia. 5. Com uma helicase de tipo selvagem, você deve observar retenção de primers de radioativos. Com a helicase B2 mutante, você não deve observar qualquer radioatividade retida no filtro. OU: Para a helicase de tipo selvagem (wt), você dever ver primers de RNA curtos radioativos com, aproximadamente, 10 bases de comprimento no filme. Para a helicase B2 mutante, você não deve observar nenhuma formação de primer. NOTA: Outros ensaios para testar outras hipóteses foram avaliados em uma escala semelhante (i.e. descrevendo substratos, detecção de produto, e ambos os resultados wt e mut) contanto que o ensaio teste sua hipótese com sucesso. 11

12 6.Para determinar o mecanismo por atrás da processabilidade da montagem da cromatina, você procura proteínas associadas com CAF1. Uma das proteínas interativas, CIP1, é de particular interesse para você. Para estudá-la posteriormente você faz uma forma da proteína radioativamente marcada. a)suspeitando que CIP1 poderia ser uma proteína de ligação com DNA você acrescenta CIP1 e CAF1 radioativas a qualquer DNA circular, o mesmo DNA linearizado com uma enzima de restrição (corte cego), ou nenhum DNA. Depois de incubar durante 15 minutos, você separa a reação de ligação em um gel de acrilamida não-desnaturante e expõe o gel ao filme de raios-x, para ver onde a CIP1 radioativa migrou no gel. Dado que CIP1 forma um complexo estável com DNA circular, mas não com DNA linear de mesma sequência de DNA, a CIP1 é uma proteína ligação com DNA sequência-específica? Como você poderia explicar a diferença em seus resultados com DNA linear e circular. (Sugestão: Você obtém o mesmo resultado se o DNA circular é superenrolado ou relaxado). Não, CIP1 não está reconhecendo a sequência do DNA. Ao invés disso, está reconhecendo a estrutura do DNA. Ela pode interagir com DNA circular, mas não o DNA linear da mesma sequência. Uma explicação para isto é que a proteína é topologicamente unida ao DNA, e cai ao fim de uma molécula de DNA linear. (Nota, também é uma possibilidade formal que a proteína reconhece o sítio de ligação específico, que acontece ter o sítio de restrição da enzima que linearizou bem no meio deste. Isto é altamente improvável, mas poderia ser testado cortando com uma enzima diferente.) (Esta também é uma pergunta velha de exame.) 12

13 b)você faz a mesma experiência, exceto que você omite CAF1 e você obtém o seguinte resultado: O que você pensa que ser o papel de CAF? A CIP1 não se associa ao DNA sem CAF1 por perto, assim CAF1 deve ser um fator de carregamento para CIP1. Isto é análogo ao complexo gama que carrega a braçadeira beta em E. coli, ou RFC que carrega PCNA em eucariotas. c)como as propriedades de ligação com DNA de CIP1 ajudam a explicar seu papel na processabilidade da montagem da cromatina. Por topologicamente unir CAF1 ao DNA, a CIP1 pode impedir CAF1 de cair, portanto aumentando sua processabilidade. Isto é como a braçadeira beta em E. coli, a PCNA em eucariotas, e a tioredoxina em fago de T7 aumentam a processabilidade da polimerase. 7. A maioria do células codifica múltiplos processos para consertar erros de pareamento e danos de DNA. Você isolou uma variante bacteriana, previamente, não caracterizada e deseja determinar quais processos de reparo são funcionais neste organismo. Para este fim, você faz para um extrato celular e caracteriza o reparo de substrato DNA diagramado abaixo. Nota: a enzima de restrição HindIII cliva a sequência: AAGCTT TTCGAA 13

14 Para analisar o reparo pelo extrato, você incuba este substrato sob de três condições: (1)o DNA, nenhum extrato celular, +ATP, +dctp. (2)o DNA, + extrato celular, +ATP. (3)o DNA, extrato celular, +ATP, +dctp. Depois destas incubações, você recupera o DNA, o submete a digestão de restrição (com a enzimas indicadas sobre as pistas de gel), e corre os produtos em um gel de agarose nativo. Todos os fatores de proteína são removidos do DNA antes da electroforese. Um diagrama do gel resultante é mostrado. a) Baseado nos resultados desta experiência, que tipo de reparo de DNA parece estar acontecendo no extrato celular? Dê duas observações específicas que o conduzem a esta conclusão. Os dados obtidos indicam que: O substrato de plasmídeo que você está usando é completamente metilado. (DpnI pode clivar o plasmídeo.) Na condição dois (quando não há nenhum dntps disponível), o DNA do plasmídeo é cortado. O DNA do plasmídeo corre muito mais alto que o DNA superenrolado e linearizado. Há duas explicações para isto o plasmídeo foi cortado (nicked) ou fatores protéicos estão associados com o DNA. Considerando que o problema lhe diz que todos os fatores protéicos foram afastados do DNA, você pode concluir que a mudança foi do plasmídeo cortado. Na condição três (quando dctp é adicionado), o reparo dirigido acontece substituindo nucleotídeos únicos, dctp. O padrão de clivagem produzido por digestão com HindIII lhe dá bandas de 1500bp e 2500bp, que indicam que a fita interna do plasmídeo é seletivamente reparada. O reparo não é randômico já que no reparo randômico você esperaria ver três fragmentos: DNA linear, 1500bp e fragmentos de 2500bp. 14

15 As últimas duas observações deveriam conduzir à conclusão que o DNA que foi reparado com o uso de reparo de excisão de bases. No reparo de excisão de bases, a base danificada é removida por uma glicosilase específica. Neste caso, o T do G-T pareado incorretamente foi, provavelmente, removido pela timidina glicosilase, que especificamente remove só T em de G-T pareado incorretamente gerando um sítio AP. Depois que a base foi removida, a AP endonuclease entra e corta 5' do sítio de AP cortando, desta forma, o esqueleto molecular (backbone). A exonuclease de DNA fita simples podem entrar então e remover a parte de carboidrato. Quando dctp estiver disponível, a DNA polimerase adicionará nucleotídeos únicos para preencher a abertura. Na condição dois, uma vez que não há nenhum dctp disponível, o DNA permanece cortado, já que a polimerase não pode preencher o buraco. Quando o dctp é fornecido na condição três, esta abertura é preenchida, eliminando o corte e restabelecendo a sensibilidade a HindIII. b) Você também deseja testar se estas células têm um sistema de reparo de contorno (bypass) de lesão. Abaixo, esquematize um substrato que você poderia usar para analisar para a presença deste sistema enzimático. Esquematize (e claramente assinale) os produtos que você esperaria ver (por exemplo, em um auto-radiograma de um gel desnaturante) se o extrato de célula executa ou não o contorno da lesão. Havia muitas experiências diferentes e criativas descritas que lhe permitiriam testar se as células têm um sistema de reparo por contorno de lesão. Os fatores fundamentais para se lembrar são que: 1) para conseguir um sistema de reparo por contorno de lesão, você precisa de transcrição. O sistema de reparo por contorno de lesão acontece quando a polimerase atinge uma lesão que não pode ler, durante transcrição. Em lugar abortar a transcrição (que seria letal), a célula usa o sistema de reparo por contorno, para apenas replicar por cima do DNA ilegível, adicionando adeninas. 2) o substrato que você escolher deverá conter uma lesão que teria necessidade do sistema de reparo por contorno de lesão. A melhor possibilidade seria um dímero de pirimidina, um sítio apurínico, ou sítio apirimidínico. Uma mutação de pareamento incorreto não é uma escolha boa, já que não bloquearia a polimerase durante replicação, uma vez que ambas as fitas poderiam ser reproduzidas. Um pedaço de DNA com uma única fita partida também não é uma escolha boa, já que a sua polimerase cairia da fita partida enquanto replica. Um exemplo de uma resposta apropriada seria fazer um ensaio de extensão de primer que usa um template com um dímero de pirimidina. 15

16 Seu primer seria marcado com radioatividade e então você adicionaria sua extrato celular, dntps não marcados, e permitiria a transcrição acontecer. Você correria seus produtos de transcrição em um gel desnaturante e exporia o filme ao gel para detectar a radioatividade. Se você o sistema de reparo por contorno de lesão ocorrer, a fita inteira do template será replicada (300bp) e o sem sistema de reparo por contorno de lesão, a replicação será bloqueada no dímero de pirimidina. (100bp) c) Usando o ensaio em 5b, você achou que seu extrato celular não possui contorno de lesão. Porém, um extrato de células de E. coli tipo selvagem que você preparou também não teve nenhuma atividade, embora você saiba que esta variante codifica as enzimas necessárias para o contorno de lesão. Ao ver este resultado, como você poderia mudar o modo que você preparou os extratos celulares para aumentar suas chances de achar a atividade de o contorno de lesão? A explicação mais provável para o fato de que você não descobriu atividade de contorno de lesão nos seus extratos celulares é que as células de tipo selvagem que você usou para preparar os seus extratos não estavam expressando as proteínas de reparo por contorno de lesão. As proteínas envolvidas em reparo de lesão por contorno (RLC) são estimuladas por dano de DNA, então você poderia aumentar a atividade de contorno de lesão, tratando suas células com irradiação UV, antes da lise. Outra possibilidade seria começar com uma linhagem celular mutante como fotoliase mutante ou uvra mutante, que causaria um aumento de dano de DNA, desta forma estimulando o sistema de RLC. Muitas pessoas sugerem o fracionamento e purificação da atividade de RLC. Esta é uma possibilidade e uma aproximação razoável, porém se você não tiver nenhuma atividade nos extratos originais, devido a uma falta de expressão proteínas de RLC, não terá êxito. 8. Seu curso de introdução ao laboratório montou um experimento teste de Ames para você conduzir. Você recebeu duas variantes para estudar. A variante A tem uma única substituição de base, enquanto a Variante B tem duas mutações de mudança de quadro de leitura (frameshift). Ambas as mutações das variantes estão em genes requeridos para sintetizar histidina. Logo, as variantes mutantes não crescem em meios, nos quais falta este aminoácido. Você plaqueou as células de cada variante sobre placas de meio mínimo, sem histidina, e então as expõe ao mutagênico indicado. 16

17 Média de colônias por placa Agente Mutagênico Variante A Variante B Controle (sem mutagênico) 35 ~5 UV (1 seg) UV (5 seg) UV (10 seg) MMS aminoacridina a) Nesta experiência, você está expondo as células aos mutagênicos, contudo o ensaio contabiliza as colônias que crescem, e para crescer as células não podem ser mutantes. Por favor, explique esta contradição aparente. Você está usando os mutagênicos para fazer mutações que revertem às mutações originais nas variantes A e B. A Contagem das colônias que crescem lhe diz quantas mutações foram feitas, porque as mutações estão RESTAURANDO os genes nas sequências de tipo selvagens deles. Isto é por que as células podem crescer e serem contadas. NOTA: A reversão não tem que restaurar a sequência exata do tipo selvagem. A mutação compensatória também poderia restaurar a via da histidina e lhe dar o fenótipo de crescimento. b) Por que você vê colônias aparecendo nas placas de controle? Proponha uma explicação para a diferença nas frequências de controle observadas entre as Variantes A e B. Estas colônias surgem de reversões espontâneas. A Variante A teve uma única substituição de base, enquanto a Variante B teve duas mutações de mudança de quadro de leitura. Logicamente, deveria ser mais fácil de reverter a única substituição de base que as duas na mudança de quadro de leitura. Isto explica a incidência mais alta de reversões espontâneas na Variante A. 17

18 c) Uma substância química é classificada como um mutagênico se produzir duas vezes o número de mutantes que acontecem espontaneamente. A partir dos dados acima, sugira se a luz UV, MMS, e 9-aminoacridina atuam, como mutagênicos efetivos para cada variante. O que indicam estes resultados sobre os tipos de mutações induzidos por eles, em cada um destes tratamentos? Para Variante A, +5 segundos de luz UV e MMS, ambos atuam como mutagênicos efetivos. Para Variante B, +1 segundo de luz UV e 9-aminoacridina, ambos são mutagênicos bons, enquanto o MMS é marginal. Isto provavelmente indica que MMS induz substituições básicas, enquanto a 9-aminoacridina induz mudança de quadro de leitura. A luz UV é, aparentemente, capaz de induzir ambos os tipos de mutações. d) Seu colega de laboratório lhe pergunta por que você não começa com apenas células tipo selvagem (His+), induz mutações nelas, e procura pela células -His. Como você justifica o uso dos estudos de reversão de mutante, em vez da abordagem sugerida por ele? Identifique um par de vantagens específicas à abordagem de análise de reversão. Quais são as limitações da determinação das especificidades do mutagênico (i.e. de decidir se algo é ou um não mutagênico), através de estudos de reversão? A sugestão seu colega de laboratório é muito mais difícil e menos quantitativa. Imagine começar com uma camada de células que são todas do tipo selvagem. Quando você aplica o mutagênico, algumas morrerão das suas mutações, mas como você acha essas células? O estudo das reversões lhe permite identificar uma mutação, baseado no fato de que a célula pode produzir uma colônia grande, visível de células, que é indicativa de um evento de reversão. Os estudos de reversão são frequentemente bastante sensíveis, porque eles fornecem uma seleção simples genética para mutantes, em um gene designado específico (por exemplo, no teste de Ames, a seleção é para His+). Eles também lhe permitem testar tipos específicos de mutações (as partes anteriores da pergunta tiveram a sua distinção entre mutagênicos que fazem mutações de mudança de quadro e aqueles que fazem substituições de base, por exemplo). O fato de que qualquer tipo particular de mutação só será revertido por certas classes de mutagênicos também pode ser uma limitação aos estudos de reversão. Portanto, é necessário testar a reversão de vários tipos diferentes de alelos mutantes. 9. Um colega da Califórnia solicita sua perícia em reparo de DNA. Ele está estudando duas variantes novas de bactérias, P. outageous e B. outus cujos genomas são semelhantes em tamanho ao de E. coli. Ele pôde averiguar que a taxa de mutação era igual a aquela vista em E. coli, ~1 x mutações por turno de replicação. Porém, ele está preocupado porque as variantes dele estão acumulando mutações agora a uma taxa elevada. Seu colega lhe fala que o problema é causado por mutações em genes que codificam exonucleases. Ele envia para você a variante mutante dele, como também as exonucleases de tipo selvagem purificadas dele. a) Você decide examinar a taxa de mutação nas variantes enviadas a você, monitorando a reversão espontânea de uma mutação pontual em um gene necessário para biossíntese de histidina. Você plaqueou culturas múltiplas independentes de cada variante e calcula o número de mutações/ turno de replicação como o seguinte: P. outrageous B. outus n o de mutações/turno de replicação: 1 x x

19 i)baseado nestes dados, você pensa que a exonuclease defectiva em cada variante é envolvida na DNA replicação ou reparo de excisão? Por que? Os dados acima sugerem que a exonuclease mutante em P. outageous é necessária para reparo de pareamento incorreto, durante a replicação de DNA, enquanto a exonuclease em B. outus é necessária para reparo de excisão. A replicação de DNA, na ausência de reparo de pareamento incorreto, cometerá, aprox., 1 erro em 10 7 nucleotídeos. O reparo de pareamento incorreto aumenta a fidelidade, durante replicação de DNA para aprox. 1 erro em nucleotídeos. Desde de que nós estamos monitorando as mutações espontâneas, a frequência de mutações observada em B. outus é baixa, mas ainda mais alta que em variantes de tipo selvagem. II) A E. coli possui três exonucleases (ExoI, ExoVII, e RecJ) que podem prover redundância, quando uma das outras tse torna mutante. Baseado nos dados acima,é provável que P. outageous possua um sistema, semelhantemente, redundante? É improvável que P. outageous possua mais que uma única exonuclease para reparo de pareamento incorreto. Nós estamos assumindo que nossa variante contém uma única mutação. A mudança observada na frequência de mutação, devido a esta única mutação, indica que não há outras exonucleases que possam complementar a atividade da exonuclease mutante. iii) Em E. coli, que frequência de mutação (n o de mutações/turno de replicação) você prediria para mutação nos genes seguintes: muts 1 x 10-7, a muts é responsável pela ligação aos pareamentos incorretos que acontecem, durante replicação de DNA. Logo, uma mutação neste gene causará uma frequência de mutação de 1 x 10-7 mutações/turno de replicação pelas razões estabelecidas acima. uvra 3 x 10-9, uvra é envolvida em reparo de excisão e causará uma frequência de mutação de 3 x 10-9, por razões declaradas na parte i). b) Antes de você começar a caracterizar as proteínas, você decide checar em dobro que as proteínas purificadas enviadas a você são exonucleases. Para fazer assim, você tem que analisar cada proteína para a própria atividade. Projete uma experiência para testar cada proteína para atividade de exonuclease em um substrato de DNA fita dupla. 1. Em um tampão contendo Mg +2, misture uma das suas exonucleases purificadas com um substrato de DNA radioativo, uniformemente marcado (>300bp). Como um controle, prepare outra reação da mesma maneira, sem a adição de exonuclease. 2. Incube durante 5 minutos a 37 0 C. 3. Centrifugue o DNA não digerido e remova o sobrenadante que contém o nucleotídeos radioativo livres. Meça a radioatividade no sobrenadante e compare com a sua experiência de controle. Se sua proteína purificada for uma exonuclease, você deverá descobrir radioatividade no sobrenadante. c) Dado que uma das suas exonucleases é importante durante replicação de DNA, enquanto a outra é importante para o reparo de excisão, você suspeita que a duas exonucleases também diferem em processabilidade. Você decide testar esta hipótese, medindo a processabilidade das exonucleases de tipo selvagem purificadas. Descreva uma experiência que testa a processabilidade destas proteínas. 19

20 1. Em um tampão sem Mg +2, misture uma das suas exonucleases purificadas com um substrato de DNA radioativo, uniformemente marcado (>300bp). A ausência de Mg +2 neste passo impede a reação de seguir adiante. 2. Incube durante 5 minutos para permitir a exonuclease se ligar ao seu substrato. 3. Adicione Mg +2 mais 1000x que o substrato não marcado. Incube 5 min a 37 o C 4. Neste momento, você pode analisar a processabilidade, observando o comprimento do substrato radioativo. Corra o produto da reação em um gel. Seque o gel sobre papel e exponha ao filme de raios-x para fazer um auto-radiograma. Compare esta banda à banda observada da reação, que contém sua outra exonuclease. Uma banda que está perto de 300bp, em comprimento, será esperada de uma exonuclease com baixa processabilidade. Porém, com uma exonuclease altamente processadora, uma banda muito menor será observada. d) Finalmente, você está interessado em estudar o estado de metilação do DNA em suas variantes. Depois de purificar o DNA genômico de cada variante, você digere o DNA com MboI. Você corre o DNA resultante em um gel de agarose não desnaturante e cora com brometo de etídeo. Para sua surpresa, você vê os resultados seguintes: i) Qual é a média dos tamanhos dos fragmentos de DNA na pista 2? (MboI corta na sequência GATC '). 20

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