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1 TÉCNICA E APLICAÇÃO DA REAÇÃO DA POLIMERASE EM CADEIA NA ÁREA ODONTOLÓGICA TECHNIQUE AND APPLICATION OF POLYMERASE CHAIN REACTION IN DENTISTRY. Patricia Ramos CURY 1 Cristiane FURUSE 2 Ney Soares ARAÚJO 3 RESUMO A Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) mudou o curso da ciência e, hoje, esta técnica é tão importante que é difícil pensar em Biologia Molecular sem ela. Seu conceito básico, de amplificação de seqüências específicas dos ácidos nucléicos, tem hoje aplicações em diversos campos na odontologia, tal como, ciência forense, histopatologia, diagnóstico microbiológico, entre outras. O objetivo desta revisão é apresentar a essência da técnica de PCR, os procedimentos para a preparação das amostras e otimização da reação, e relacionar sua aplicabilidade em odontologia. UNITERMOS: Reação em cadeia da polimerase. INTRODUÇÃO A reação da polimerase em cadeia, do inglês PCR, possibilita a amplificação de pequenas amostras de DNA até um nível grande o suficiente para permitir a identificação. Embora criada por Mullis 12, e descrita por Saiki et al. 14, o princípio da reação da polimerase em cadeia (PCR) foi descrito uma década anteriormente, em 1971, por Kleppe et al. 7. O conceito da amplificação do DNA por essa técnica é simples, entretanto, seu impacto nas ciências biológicas foi extraordinário, tanto que, em 1993, KARY MULLIS recebeu o prêmio Nobel de Química. Para a PCR, um par de iniciadores ou primers (uma única fita curta de DNA, específica para o gene que se quer estudar) que complementam a fita oposta da seqüência de DNA a ser amplificada (uma amostra de DNA a ser identificada) são empregados. Depois da desnaturação do molde de DNA mediada pelo calor, os iniciadores ligam-se a sua seqüência respectiva no molde de DNA, o que é denominado de anelamento, e então uma enzima, DNA-polimerase, sintetiza uma fita complementar em direção à extensão 5 e 3. Os ciclos de desnaturação, anelamento e extensão são repetidos várias vezes. Teoricamente, em cada ciclo a quantidade de moldes de DNA dobra, pois os produtos de um ciclo servem de molde para o ciclo seguinte e, portanto, depois de 10 ciclos a seqüência alvo dentro do molde de DNA é multiplicada por e, após 20 ciclos, é multiplicada por Entretanto, existe um platô acima do qual, ciclos adicionais não resultaram em amplificação adicional, devido à exaustão dos reagentes. A temperatura na qual cada um dos passos (desnaturação, anelamento e extensão) ocorre é diferente e, portanto, um aparelho termociclador é necessário para que as temperaturas sejam reguladas automaticamente, assim como seus ciclos sejam padronizados. O objetivo deste trabalho é apresentar a essência da técnica de PCR, os procedimentos para a preparação das amostras e otimização da reação, e relacionar sua aplicabilidade em odontologia. 1 PREPARO DA AMOSTRA O primeiro fator a determinar o sucesso da PCR é a preparação do ácido nucléico que contém a seqüência de DNA alvo da amplificação. Diversos protocolos têm sido desenvolvidos para extração de DNA, entretanto, enquanto a PCR é rápida e prática, os protocolos de extração são trabalhosos, requerem grande quantidade de solventes e materiais tóxicos e nenhum deles é aplicável universalmente para qualquer amostra. Alguns kits de extração estão disponíveis no mercado, mas o custo destes kits pode ser um fator limitante para seu uso. A amostra de DNA pode ser extraída, por exemplo, de tecidos frescos, biofilme dental, saliva e também de tecidos incluídos em parafina ou secções coradas em hematoxilina e eosina. Em 1 - Doutora em Periodontia, Professora de Microbiologia/Imunologia e Periodontia, Centro de Pesquisas Odontológicas São Leopoldo Mandic, SP. 2 - Doutora em Patologia Bucal, Professora de Patologia Bucal, Centro de Pesquisas Odontológicas São Leopoldo Mandic, SP. 3 - Professor Titular, Disciplina de Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia da USP, SP. 34 TÉCNICA E APLICAÇÃO DA REAÇÃO DA POLIMERASE.pmd 1

2 geral, os protocolos para extração de tecidos frescos envolvem incubação da amostra com proteinase K ou simples fervura em água 11. A incubação com proteinase K consome tempo, de minutos a 24 horas ou mais, mas fornece DNA em alta concentração e boa qualidade. Depois da extração a proteinase k é inativada a 95 0 C por 10 minutos e o DNA é purificado em fenol/clorofôrmio. O DNA purificado é então ressuspenso em um meio para armazenamento, como o tampão Tris-EDTA (ácido acético diaminotetraetileno) ou água destilada estéril. Armazenamento em tampões de fosfato e ou tampões contendo alta concentração de EDTA deve ser evitado devido ao seu efeito na concentração do íon magnésio. A extração de DNA é mais rápida pela fervura da amostra em água estéril destilada por aproximadamente 15 minutos. A qualidade do DNA obtido é boa, mas a concentração e a quantidade são inferiores as obtidas pelo uso da proteinase K 16. Técnicas para extração de RNA para PCR também estão disponíveis, sendo a técnica do TRIZOL a mais empregada. Após a obtenção do RNA, é realizada a síntese de DNA complementar empregando-se uma enzima e a reação de PCR é realizada da mesma forma que a amplificação de DNA 6. 2 COMPONENTES DA REAÇÃO Após a extração do DNA, na PCR padrão, o molde de DNA é adicionado ao desoxinucleotídio trifosfato (dntps), o qual fornece energia e nucleotídeos necessários para a síntese de DNA, a um par de iniciadores, a Taq polimerase (a DNA polimerase que catalisa a reação), além de sais, proteínas e detergentes que ajudam estabilizar os outros componentes (Tabela 1). Volumes de 25, 50 ou 100 µl são utilizados. A reação é normalmente conduzida em tubos de microcentrífuga ou tubos de PCR que contém os reagentes acima 2. TABELA 1- Reagentes e concentrações empregados na reação de PCR. Cada um reagentes acima será descrito à seguir. 2.1 TAQDNA POLIMERASE TaqDNA polimerase é a catalisadora da extensão dos primers. Ela é uma DNA polimerase, termoestável, isolada do eubacterium termofílico Thermus aquaticus. Para muitos ensaios a quantidade ótima é de 0,5 e 2,5 unidades. Aumento da concentração pode resultar em redução da especificidade. 2.2 SOLUÇÃO TAMPÃO O tampão mais freqüentemente utilizado em PCR é o Tris 10mM, com ph variando entre 8,5 e 9,0 a 25 0 C. Com o aumento da temperatura pelo termociclador o ph diminui para 7,4, que é um valor ótimo para atividade da Taq polimerase na temperatura de 72 0 C. A concentração de íons de magnésio também é importante para a máxima atividade da polimerase e, como os dntps se ligam aos íons de magnésio, ele deve estar presente em excesso 2. A concentração de íons de magnésio também influencia a eficiência do primer. Portanto, é possível modificar a concentração dos íons de magnésio, ao invés de aumentar a temperatura de anelamento, para regular a especificidade do primer. Uma concentração ótima pode variar de aproximadamente 0,5 mm a 5 mm. Detergentes, tais como Tween 20, Triton X- 100 ou Nonider P-40 podem ser adicionados à solução tampão para ajudar a prevenir a precipitação de Taq polimerase hidrofóbica em soluções aquosas TRIFOSFATO DESOXINUCLEOTÍDEO (DNTP) O dntp pode ser obtido como soluções secas congeladas ou soluções aquosas. Eles também estão disponíveis com marcadores, radioativos ou não-radioativos, que podem ser úteis para subseqüente hibridização ou sequenciamento dos produtos de PCR. Eles são resistentes ao calor e têm uma meia vida de mais de 40 ciclos de PCR 5. Usualmente, o dntp é usado numa concentração entre 20 µm e 200 µm. Desequilíbrio da misturas de dntp reduz a fidelidade da Taq. O dntp reduz o Mg 2+ livre, interferindo assim com a atividade da polimerase e diminuindo o anelamento do primer. 2.4 INICIADOR Na maioria das aplicações de PCR, é a seqüência do iniciador que determina o sucesso geral do ensaio. Geralmente, os iniciadores são desenhados para serem exatamente complementares as seqüências alvo. Ao se iniciar um estudo, o desenho do iniciador pode ser obtido na literatura ou realizado pelo pesquisador através de programas específicos disponíveis no mercado. Entretanto, quando a seqüência alvo não é conhecida precisamente e, portanto, nesses casos utilizam-se iniciadores que não se combinam exatamente com o DNA do molde. Em outros casos 35 TÉCNICA E APLICAÇÃO DA REAÇÃO DA POLIMERASE.pmd 2

3 ainda, vários iniciadores são utilizados, levando-se em conta mudanças potenciais ou conhecidas de base 2. Sua seqüência geral deveria ter as seguintes características 4 : 1. Entre 15 e 30 bases; 2. Nenhuma estrutura secundária; 3. Estrutura balanceada de sítios ricos em 40-60% G/C e A/T; 4. Ausência de complementaridade entre as extensões 3, para que não ocorra formação de dímeros; 5. Seqüências palindrômicas devem ser evitadas; 6. Temperatura de melting (T m ) entre 55 e 90 0 C; 7. Na confecção dos iniciadores devem-se manter as Tms do foward e reverse próximas e não muito baixas, para evitar ligações inespecíficas. 8. T na extremidade 3 deve ser evitado; 9. Três ou mais Gs e Cs devem ser evitados. Concentrações de primers entre 0,1 e 0,5 µm são geralmente ótimas. Concentrações mais altas podem resultar em acúmulo de produtos não específicos, reduzindo a concentração do produto desejado. Concentrações mais baixas podem ser esgotadas previamente ao final da reação, resultando em baixa concentração do produto desejado 4. A temperatura de anelamento depende do comprimento e composição dos primers. Idealmente, a temperatura de anelamento deve ser 1 a 5 0 C abaixo da T m. Uma temperatura de anelamento baixa demais resulta em anelamento não-específico e, portanto amplificação nãoespecífica. Enquanto, que uma temperatura muito alta resulta em reduzida concentração do produto CAMADA DE ÓLEO MINERAL No passado, uma camada de óleo mineral era empregada sobre a mistura final para prevenir a evaporação do produto durante a PCR. Alternativamente, uma camada de parafina era usada no lugar do óleo mineral. Como a parafina é sólida em temperaturas abaixo de 55 0 C, ela pode ser utilizada não apenas para prevenir evaporação, mas para manter os componentes da reação, primer e molde, separados até que a mistura da reação seja aquecida. Essa separação dos componentes da reação com parafina, denominado PCR de início quente, evita ligações não-específicas durante a desnaturação inicial dos moldes de DNA. Os termocicladores modernos ajustam a temperatura entre os ciclos rapidamente e essa camada de óleo não é mais necessária, além de manterem a temperatura da tampa à 100 o C evitando a perda de produto. 4.6 MOLDE ALVO DE DNA Para o sucesso da PCR, a seqüência gênica a ser amplificada deve estar intacta. Uma qualidade pobre de DNA, tal como a obtida de peças incluídas em parafina, irá freqüentemente conter fragmentos curtos de DNA. Em tais casos, os iniciadores deveriam ser desenhados para amplificar regiões curtas dentro do molde. A proporção iniciador/molde influencia significantemente a PCR e deveria ser otimizada empiricamente. Baixa concentração de DNA é necessária para uma PCR ótima. Excesso de molde pode favorecer o anelamento das duas fitas do molde, mais do que seu anelamento com o par de iniciadores e irá também aumentar a chance de formação de produtos não-específicos; entretanto, quando há muito pouco molde, pode acontecer das seqüências complementares não se encontrarem. Tipicamente, menos de 0,2µg de DNA pode ser suficientemente amplificado em 30 ciclos 2. A pureza do molde também influencia no resultado da reação. 3 EQUIPAMENTO Teoricamente, a PCR pode ser realizada manualmente através de banhos ajustados, mas as múltiplas temperaturas e ciclos repetitivos demandam automação. Portanto, um equipamento específico foi desenvolvido, o termociclador. Um termociclador adequado deve manter as três temperaturas de incubação precisas e reprodutivelmente. A seleção dos tubos de reação também é crítica, pois afeta a taxa de transferência de calor do termociclador para a mistura da reação. Assim, devem-se empregar tubos que são desenvolvidos para PCR e que se encaixem perfeitamente aos poços do termociclador a ser utilizado. 3.1 CICLOS TÉRMICOS DESNATURAÇÃO INICIAL É muito importante para a reação, que as fitas de DNA molde alvo se separem completamente. Um aquecimento inicial da mistura a 95 0 C é suficiente para desnaturar o DNA genômico e permitir o anelamento do iniciador, conforme a temperatura da reação começa a diminuir. Se o molde é apenas parcialmente desnaturado, haverá uma tendência das fitas se juntarem novamente muito rapidamente, evitando a eficiência do anelamento e extensão ou conduzindo a um selfpriming com resultados falso-positivos. Usualmente, 20 a 30 segundos são suficientes, mas o tempo deve ser adaptado para o termociclador e tubos utilizados. A reação é então ciclada vezes ANELAMENTO DO INICIADOR Para a maioria dos objetivos a temperatura de anelamento tem sido otimizada empiricamente. A escolha desta temperatura é talvez o fator mais crítico para a obtenção de uma alta especificidade. Se a temperatura for muito alta, nenhum anelamento ocorrerá, mas se for muito baixa, o anelamento inespecífico aumentará dramaticamente. Em geral, FIGURA 3 - Grupo I (Controle) 24 di trabéculas ósseas espessas eviden ocupadas por tecido conjuntivo sem HE, original, 63x. 36 TÉCNICA E APLICAÇÃO DA REAÇÃO DA POLIMERASE.pmd 3

4 uma temperatura de aproximadamente o C é mantida por segundos EXTENSÃO DO PRIMER A extensão do primer é normalmente conduzida a 72 0 C, temperatura ótima para a ação da TaqDNA Polimerase (explicada adiante). Usualmente, de 20 a 40 segundos de extensão são suficientes (1 minuto para cada Kilobase). Entretanto, esses tempos podem variar e também são alvos de otimização. EXTENSÃO FINAL Usualmente, depois do último ciclo, os tubos de reação são mantidos a 72 0 C por 5-10 minutos para promover completa extensão e anelamento, e complementar de fitas únicas de DNA. 3.2 NÚMERO DE CICLOS Para uma reação ótima, menos de 10 moldesalvo de DNA podem ser amplificados em menos que 40 ciclos para uma quantidade de produto facilmente detectável em gel corado com brometo etídeo. A maioria das PCRs deveria então incluir apenas 25 a 35 ciclos. Com o aumento do número de ciclos, aumentam também as reações inespecíficas. No protocolo acima, cada ciclo tem duração de 1 a 3 minutos; entretanto, tempo extra é necessário para o aquecimento e resfriamento entre os passos. Portanto, ciclos de PCR estendese por 2 ou 3 horas 4 ESTRATÉGIAS GERAIS DE TRABALHO PARA EVITAR CONTAMINAÇÃO A amplificação apenas de molécula DNA de interesse pela PCR significa que quantidade mínima de contaminação ocorreu e esse contaminante não foi amplificado, o que resultaria em resultados falsopositivos. Como a PCR é muito sensível, contaminação com pequenas quantidades de material exógeno pode resultar na sua amplificação 9. A contaminação pode ser de origem laboratorial, por exemplo, seqüências previamente amplificadas, ou de origem externa, por exemplo, DNA do operador. Para minimizar o problema de contaminação, os seguintes cuidados são indicados: 1. Laboratório: local de trabalho separado para as fases antes, durante e após o PCR; proteção da sala do equipamento de PCR contra luz ultravioleta; uso de pipetas com pontas contendo filtro estéril e de uso exclusivo para PCR. 2. Manipulação da amostra: técnica estéril e luvas; ponteiras de pipetas e demais materiais estéreis; autoclavagem de todas as soluções e reagentes que podem ser autoclavadas sem perder suas propriedades (iniciadores, dntp e Taq não podem ser autoclavados); kit de reagentes somente para PCR, estocados em pequenas porções e individualizado; quando pipetando DNA evitar criar aerosol; incluir sempre um controle negativo, isto é, amostra sem DNA com todos os componentes da reação. 5 DETECÇÃO DOS PRODUTOS DE PCR Finalizada a PCR, o próximo passo é detectar a presença de produtos amplificados. Em geral, isso é realizado pela eletroforese em gel de agarose ou acrilamida, que pode ser seguida por Southernblotting e hibridização. 5.1 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE O produto de PCR tem um tamanho definido e, quando é necessário apenas checar esse tamanho, o método mais simples é carregar uma alíquota do produto em um gel de agarose, (tipicamente 1% w/v de agarose), contendo brometo de etídio e então submetê-lo a eletroforese. As bandas formadas no gel, correspondentes a diferentes tamanhos de fragmentos de DNA, serão visíveis sob um transiluminador de luz ultravioleta. O tamanho do produto é então estimado comparando as bandas do produto com marcadores de peso molecular apropriados. Os marcadores são misturados com fragmentos de DNA e carregados próximos aos produtos de PCR no gel de agarose. Eles podem ser obtidos de fragmentos de DNA igualmente espaçados com incrementos variando entre 10 pares de base e pares de base, ou eles podem ser produzidos pela digestão de um pedaço de DNA com uma ou mais enzimas de restrição. Os primers e outros produtos pequenos podem também aparecer como bandas difusas próximas à borda do gel. Outras bandas adicionais no gel podem ser resultado de reações inespecíficas ou presença de fitas únicas de DNA. A PCR APLICADA À ODONTOLOGIA A aplicação da técnica de PCR na pesquisa odontológica permite uma grande aproximação entre os profissionais envolvidos na clínica e na pesquisa científica, podendo, num futuro próximo ampliar, de um lado a qualidade do diagnóstico e tratamento, e de outro, as chances de investigação efetiva em doenças bucais através da expressão gênica de populações e indivíduos. Na odontologia, a PCR tem aplicação direta nas áreas de Patologia, Periodontia, Endodontia, Odontologia Social e forense. Desde sua introdução, a tecnologia da PCR tem sido reconhecida como uma ferramenta de diagnóstico rápida, sensível e específica e pode ser aplicada a qualquer situação que exija amplificação de DNA para que ele possa ser detectado, principalmente, quando a quantidade de DNA é limitada. 37 TÉCNICA E APLICAÇÃO DA REAÇÃO DA POLIMERASE.pmd 4

5 São especialmente importantes os testes diagnósticos para análise microbiológica, através da identificação de patógenos relacionados às doenças periodontais, pulpares, periapicais e à cárie. Bactérias encontradas clinicamente em pequena quantidade e que dificilmente seriam detectadas por um cultivo bacteriano, podem ser detectadas com alta sensibilidade através desta técnica 13. No caso de diagnóstico de doenças virais, se o material genético do vírus for RNA, este é extraído, transcrito em cdna e amplificado pela PCR 10,15. A PCR pode ser empregada para se estudar alterações genéticas correlacionadas com determinadas patologias. Nestes casos, o DNA do paciente é extraído do sangue ou das células do paciente e, por exemplos, polimorfismos genéticos podem ser investigados. Um diagnóstico individualizado da susceptibilidade a doenças específicas, como, por exemplo, da periodontite e câncer, pode vir a ser uma das aplicações clínicas desta técnica. Recentemente, estudos têm sugerido que uma significante parte da predisposição ou resistência individual a periodontite pode estar relacionada a fatores genéticos. Polimorfismos no gene da Interleucina-1, além de outros genes, foram associados com a severidade da periodontite crônica 3,8. A PCR pode também ser empregada para análise de material histológico, por exemplo, para se detectar alterações genéticas associadas a neoplasias. Em oncologia, a PCR tem sido empregada para elucidar mecanismos fundamentais da transformação maligna, tipagem de tecido e estudo da expressão gênica 1. Ainda, a expressão gênica de proteínas tem pode ser estudada através da PCR. Após extração do RNA de biópsias de tecidos periodontais, de origem endodôntica, ou tumorais, este RNA é transcrito em cdna e, em seguida, amplificado por PCR. Um dos grandes desafios da pesquisa básica é tornar as técnicas e conhecimentos adquiridos aplicáveis à melhoria do tratamento de pacientes. A PCR tem potencial para se transformar em uma ferramenta adicional para o diagnóstico de várias doenças, permitindo o estabelecimento de um diagnóstico e prognóstico mais precisos e tratamento individualizado. CONCLUSÃO A PCR é uma técnica relativamente simples, exigindo cuidados de otimização da reação para cada situação. A aplicabilidade clínica da técnica é bastante extensa em Odontologia, entretanto, um custo adicional é incorporado. AGRADECIMENTOS À aluna de mestrado Fernanda Almeida e à técnica Dra. Maria das Graças Silva Valenzuela por lerem criticamente o trabalho. ABSTRACT The Polymerase Chain Reaction (PCR) has changed the science. The PCR technique is now so important that is difficult to think of molecular biology without it. The technique is based on the amplification of specific sequences of nucleic acids, and has received widespread application in many diverse fields such as forensic science, histopathology, microbiologic etc. The aim of this paper is to explain the essentials of the basic PCR technique and optimization of the procedure, approaches to sample preparation, and show its application. UNITERMS: Polymerase chain reaction REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1 - Ahmed FE. Molecular techniques for studying gene expression in carcinogenesis. J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev 2002; 20(2): Baumforth KR, Nelson PN, Digby JE, O Neil JD, Murray PG. Demystified... the polymerase chain reaction. Mol Pathol 1999; 52(1): Engebretson SP, Lamster IB, Herrera-Abreu M, Celenti RS, Timms JM, Chaudhary AG, di Giovine FS, Kornman KS.The influence of interleukin gene polymorphism on expression of interleukin-1beta and tumor necrosis factoralpha in periodontal tissue and gingival crevicular fluid. J Periodontol 1999; 70(6): Innis MA, Gelfand DH. Optimisation of PCRs. In: Innis MA ed. PCR protocols a guide to methods and application. New York. Academic Press; 1990, Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 1988; 85(24): Kawasaki ES. Amplification of RNA. In: Innis MA, Gelfand DH. Optimisation of PCRs. In: Innis MA Ed. PCR protocols a guide to methods and application. New York. Academic Press; Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R, Molineux I, Khorana HG. Studies on polynucleotides. XCVI: repair replications of short synthetic DNA s as catalyzed by DNA polymerases. J Mol Biol 1971; 56(2): TÉCNICA E APLICAÇÃO DA REAÇÃO DA POLIMERASE.pmd 5

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