Polymerase Chain Reaction Reação de polimerização em cadeia ou Polimerização em cadeia do DNA

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1 Polymerase Chain Reaction Reação de polimerização em cadeia ou Polimerização em cadeia do DNA PCR - consiste em fazer cópias de DNA in vitro, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA.

2 PCR foi idealizada como um método para isolar rapidamente sequências específicas a partir de uma mistura complexa de seqüências genômicas ou de cdnas. PCR alcançou objetivos bem mais amplos que os propostos inicialmente. PCR é comparada em importância à definição da estrutura do DNA.

3 PCR foi apresentada pela primeira em um encontro científico Publicação: Mullis and Faloona, 1987 Saiki at al : Thomas D. Brock descobriu a DNA polimerase termoestável de Thermus aquaticus. 1988: Esta DNA polimerase foi usada por Saiki para fazer PCR.

4 PCR requer 7 componentes essenciais: - DNA polimerase termoestável - Um par de oligonucleotídeos para iniciar a síntese de DNA - Deoxinucleotídeos trifosfato (dntps) - Cátion divalente: toda DNA pol. requer cátion divalente, usualmente Mg 2+ - Tampão para manter o ph - Cátions monovalentes, usualmente K + (KCl) - Template de DNA

5 Virtualmente, qualquer seqüência alvo de DNA pode ser amplificada por PCR. A localização da seqüência alvo é feita pelos iniciadores (primers). Oligonucleotídeos com 17 mers são usualmente seletivos o suficiente para localizar um sítio único em um genoma de alta complexidade, tal como o genoma humano. Pareamento: pontes de hidrogênio Watson e Crick: A C T G

6 A TÉCNICA DE PCR

7 PCR

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9 A TÉCNICA DE PCR

10 PCR é um processo iterativo, consistindo de três elementos: - Desnaturação da template por aquecimento - Pareamento dos iniciadores à seqüência alvo fita única - Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase termoestável

11 Separação das fitas é denominada FUSÃO da molécula de DNA - MELTING MELTING POINT de primers para PCR: TEMPERATURA NA QUAL 50% DAS TEMPLATES ALVO ESTÃO PAREADAS COM OS PRIMERS

12 Cada uma das novas fitas de DNA extendidas a partir dos primers serve como template para síntese de uma nova fita. Os primers presentes na reação fazem o pareamento com as novas fitas, na região de complementariedade antiparalela entre primer - template. Isso garante a aumento exponencial do número de novas fitas. Todas as fitas de DNA sintetizadas durante a PCR têm a sequência de um dos primers na extremidade 5 e a seqüência complementar ao outro primer na extremidade 3 forward reverse primers complemento dos primers

13 Amplificação específica Amplificação inespecífica Quando os produtos de PCR são usados como template eles já têm match perfeito com os primers É feito um segmento complementar ao primer 5 3 5

14 Produtos específicos Produtos inespecíficos Tanto produtos específicos como inespecíficos têm sítios para pareamento perfeito dos primers e continuarão a ser amplificados nos diversos ciclos da PCR

15 N o = número inicial de cópias de DNA-dupla fita (template) N f = número final de cópias da seqüência alvo (dupla fita) Y = eficiência da extensão do primer por ciclo n = número de ciclos

16 Cinética da PCR: - Fase de screening - ciclos iniciais Os primers (ou iniciadores) procuram a template de DNA. - Fase intermediária: Acúmulo exponencial do fragmento de DNA. - Fase de amplificação linear: A amplificação já é sub-ótima. - Fase de platô: a quantidade de produto é estável.

17 Cinética da reação 1 g de DNA genômico tem 3 x 10 5 cópias do genoma de mamíferos

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19 O crescimento linear (plot semi-log) do número de cópias ocorre até um determinado número de ciclos. A saturação ocorre quando a concentração de produto amplificado atinge ~ 10-8 M ou ~ moléculas por 100 l. As causas do platô são várias: - Perda da atividade da enzima - Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas com a síntese de DNA - Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si, em detrimento do pareamento com os primers. Nesse ponto, a possibilidade de amplificação de produtos inespecíficos é maior. - Gasto dos reagentes, especialmente inativação da DNA polimerase - Acúmulo de pirofosfato (PiPi) - Competição com outros produtos que vinham sendo amplificados com eficiência menor mas que também foram se acumulando etc

20 Eficiência da amplificação A eficiência média de amplificação é 0,85. Pequenas alterações para menos podem fazer com que o produto não seja detectado. Redução de 1% na eficiência, redução de 15% no produto final após 25 ciclos.

21 Parâmetros mais importantes para a otimização de PCR: - Temperatura de annealing dos primers - Regime de ciclos - Composição do tampão Componentes do tampão para PCR (10 X): - Tris.HCl mm (ph 8.3 a 25 o C) - KCl mm - gelatina 1 g/ L ou - Albumina bovina - 0,1% Tween-20 ou - 0,1% Laureth 12 ou - 0,1% NP-40 - MgCl 2-15 mm estas substâncias aumentam a estabilidade da enzima

22 10 a 50 mm de Tris HCl - ph entre 8,3 e 8,8 (a 20 o C) - Usualmente 10 mm Tris-HCl/pH 8,3 O ph do tampão Tris varia muito com a temperatura (6,8 a 8.3 durante a PCR). O ph mais baixo é atingido em temperaturas mais elevadas.

23 MgCl 2 : testar de 0,5 a 5 mm em steps de 0,5 ou 1 mm (para multiplex, até 10 mm) - Se a concentração de Mg 2+ é muito baixa, temos pouco ou nenhum produto - Se a concentração de Mg 2+ é muito elevada, a PCR tem baixa especificidade. Observa-se muitas bandas ou smear. A concentração de Mg 2+ deve superar em 1,2 mm a concentração total de dntps, porque esta é a concentração de Mg 2+ livre necessária para atividade ótima da enzima.

24 dntps: Usar dnpts preparados para PCR, pois são fornecidos com ph adequado (8.1) e sem pirofosfato. Acúmulo de PiPi pode inibir a reação de polimerização. Usar entre 20 e 200 M, procurando a concentração que forneça o máximo de produto com o máximo de especificidade. Menor concentração de dntps: maior especificidade, com pouco produto final. Maior concentração de dntps: há aumento da quantidade de produto com perda de especificidade.

25 Primers: A concentração ótima de primer é entre 0,1 e 0,5 M Ambos os membros do par devem ser usados na mesma concentração. Excesso de primers induz aparecimento de produtos inespecíficos e formação de dímeros de primers.

26 Concentração de reactantes e produtos antes e após 30 ciclos de PCR

27 DNA polimerases utilizadas em PCR

28 DNA polimerases: Todas sintetizam uma fita nova de DNA extendendo um primer, através da incorporação de nucleotídeos do meio, na direção 5 3, tendo como orientação para a incorporação dos nucleotídeos a informação contida na fita molde (template). Todas são DNA-pol na direção 5 3 As DNA polimerases usualmente têm também atividade exonucleásica: na direção 3 -> 5 : uma atividade corretiva - proof reading na direção 5 -> 3 : atividade de reparo do DNA (remoção de um segmento de DNA que está na frente da enzima)

29 DNA polimerases termoestáveis: DNA polimerase de Thermus aquaticus (Taq - polimerase) - a primeira a ser descoberta e a mais utilizada. Esta DNA polimerase termófila não tem atividade de exonuclease 3-5, ou seja, não tem atividade corretiva, mas tem atividade exonucleásica 5 3 A taxa de incorporação de bases erradas durante a PCR pode variar entre 10-3 a 10-6, dependendo especialmente das concentrações de Mg 2+ e dntps A incorporação de base errada (mismatch) reduz a estabilidade da interação da enzima com o DNA. Baixa temperatura de extensão e elevada concentração de dntps favorecem a extensão de primers com pareamento imperfeito e a extensão após mismatch.

30 DNA polimerases podem adicionar uma base a mais na extremidade 3 OH, independetemente da template. A probabilidade de adição é maior quanto maior a concentração de Mg 2+ e de enzima e se as últimas bases imporadas previamente forem A ou T. A base a adicionada é quase sempre A. 5 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx3 3 yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy5 5 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx3 3 Ayyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy 5 5 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxa3 3 yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy5 1º ciclo 5 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxa3 3 Ayyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy 5 5 xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxa3 3 A yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy 5 2º ciclo

31 DNA polimerases termorresistentes com atividade corretiva: Uemori et al. 1997: DNA polimerase de Pyrococcus furiosus (Pfu) - com duas subunidades codificadas por genes dispostos em seqüência num único operon. Tem forte atividade exonucleásica 3 5 (proof reading). Tli DNA polimerase: derivada do Thermoccocus litoralis. (Promega) Vent DNA polimerase: é a forma recombinante da Tli (New England Biolabs) Ambas têm atividade exonucleásica 3 5 e são mais termoestáveis que a Taq (meia vida de 6,7 h a 95 o C). Sintetizam fragmentos de até 13 kpb. DeepVent DNA polimerase: extraída do Pyroccocus GB-D. (New England) Pwo polimerase (Boehringer Mannheim)

32 Ao usar DNA-polimerase com atividade proof-reading (exonuclease 3 5 ), deve-se usar uma maior concentração de dntps (no mínimo 200 mm de cada), para evitar que a enzima destrua os primers ou mesmo os produtos de PCR em forma de fita única. Estas polimerases degradam DNA fita única. Enzimas com atividade corretiva não adicionam uma base a mais na extremidade 3 (-A), como ocorre com a Taq polimerase usual e outras enzimas sem atividade corretiva.

33 Avaliar o produto final da PCR Eletroforese: Tipo de tampão Voltagem Coloração

34 - Evitar produtos inespecíficos na PCR - Otimizar a reação

35 Hot Start PCR (Faloona et al. 1990) A reação de amplificação é iniciada em temperatura elevada Vantagem: se não há amplificação de produtos inespecíficos, há aumento da especificidade e do rendimento da reação de amplificação. A polimerase é ativa em faixa ampla de temperatura. A atividade da enzima varia em 2 duas ordens de grandeza entre 20 e 85 o C. Elimina primer-dimers

36 Como fazer hot start PCR? - Anticorpo anti-dna polimerase (Life, Clontech, Sigma ) - High-affinity oligonucleotide ligands (aptamers)" - permanecem ligados à polimerase a baixas temperaturas, inativando-a. - Taq-polimerase modificada quimicamente: O modificador é permanentemente liberado em temperatura elevada. A liberação é gradual, diferentemente dos dois métodos anteriores (AmpliTaq Gold - PE Applied Biosystems)

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38 Alguns aditivos podem aumentar a especificidade e o rendimento da PCR DMSO (1-10%) (10% DMSO inibe a atividade da enzima em cerca de 50%) PEG-6000 (5-15%) Glycerol (5-20%) Detergentes não iônicos Formamida (1,25-10%) Albumina sérica bovina ( g/ml) Betaína Tetrametilamônio (TMAC)

39 Quantidade de enzima: Se não se observa produto de PCR ou se observa muito pouco produto, o problema pode ser a quantidade de enzima. Quando se usa enzima com atividade corretiva, deve-se usar uma quantidade maior, porque a processividade destas enzimas é menor. Se possível, reduza a temperatura e o tempo de desnaturação. Caso não consiga amplificação com uma dada enzima, teste outras enzimas.

40 A concentração de primers : A proporção primer-template deve ser entre 10 7 a 10 8, no início da PCR. Se a quantidade inicial de moléculas alvo é menor que 100, inciar a PCR com 1 pmol. Após os 5 ciclos iniciais, aumentar a concentração dos primers. Booster PCR

41 Temperatura de annealing dos primers: O pareamento específico depende criticamente da temperatura, além de ser influenciado pela concentração de cátions, de primers, tempo na temperatura de annealing e outros fatores, como presença de aditivos. A temperatura de annealing deve ser a mais alta possível que permita o pareamento. Pode-se fazer também touch down PCR : Exemplo: variar a temperatura de annealing entre 65 o C e 55 o C, reduzindo a temperatura em 1 o C a cada 2 ciclos, durante 20 ciclos. Fazer mais 10 ciclos a 55 o C. Usar ter,ocicladores com gradiente

42 Magnésio: Concentração de Mg 2+ afeta: - annealing dos primers - temperatura de desnaturação da template e dos produtos amplificados - especifidade da reação - formação de dímeros de primers - atividade e fidelidade da enzima Usualmente se começa com 1,5 mm Pode-se utilizar de 0,5 mm a 5 mm de Mg 2+ na reação.

43 Template: A quantidade de template a ser adicionada depende do tipo de material que estamos utilizando. DNA genômico: 50 a 250 ng 1 g de DNA genômico tem 3 X 10 5 moléculas de um gene único. O mesmo número de moléculas está presente em: - 10 ng de DNA genômico de levedura - 1 ng de DNA genômico de E. coli pg de plasmídeo - 2 pg de bacteriofago l

44 Parâmetros dos ciclos: Temperatura e Tempo de desnaturação: A desnaturação da template ocorre entre 90 o C e 98 o C Primeira desnaturação: 2 a 5 min a 92 o C a 95 o C Desnaturação nos demais ciclos: 94 o C por 15/30 segundos Falta de desnaturação da template é uma causa comum de falha na PCR. Tempo de desnaturação muito longo reduz a meia vida da enzima e pode causar depurinação do DNA.

45 Temperatura e tempo de extensão: Temperatura de extensão: usualmente 72 o C Nessa temperatura, há incorporação de 35 a 100 nucleotídeos por segundo, dependendo da enzima, do tampão, do ph, da concentração de sal, da natureza do DNA - template. Tempo de extensão: depende do tamanho do amplicon; 1 minuto é suficiente para um amplicon de 2 kb Processividade da Taq polimerase: - 0,25 nt/s a 22 o C - 1,5 nt/s a 37 o C - 24 nt/s a 55 o C - > 60 nt/s a 70 o C nt/s a o C

46 Nested PCR pode ser uma alternativa para melhorar a especificidade e a sensibilidade da PCR

47 Problemas comuns e algumas sugestões para solução: 1 Nenhuma ou pouquíssima amplificação Desnaturação incompleta da template Ferva o DNA antes de misturar os reagentes Fortes estruturas secundárias na template Adicione 7-deaza-dGTP (3:1 ao dgtp) Adicione DMSO até 10% e/ou glicerol até 12% e/ou formamida até 10% Use Taq com deleção N-terminal Sua template alvo não está presente na amostra Faça um controle positivo Desnaturação incompleta dos produtos de PCR Aumente o tempo de desnaturação para 1 minuto Não pareamento dos primers Abaixe a temperatura de annealing Seqüência dos primers pode estar incorreta Verifique a seqüência dos primers Magnésio insuficiente Teste concentrações a 1 a 10 mm em passos de 0,5 mm

48 Sugestões de solução para smears : Reduza a quantidade de DNA Aumente a temperatura de annealing em passos de 2 o C (amplificador com gradiente) Reduza a concentração de enzima em passos de 0,25 U Reduza a concentração de Mg 2+ - em passos de 0,1 mm Aumente o tempo de desnaturação em passos de 5 s Aumente a temperatura de desnaturação em passos de 1 o C Reduza o número de ciclos em 5 a 10 ciclos Faça hot start Faça touch down Reduza o tempo de extensão Reveja o desenho dos primers

49 PCR a partir de RNA

50 RT-PCR RT PCR (Powell e col. Cell 1987, 50: ) DNA- Polimerase não usa RNA como template Primeiro é necessário fazer a transcrição reversa do RNA em cdna RT: Reverse Transcriptase Após a transcrição reversa, prossegue-se normalmente com o PCR

51 RT-PCR eficiente: RNA da mais alta qualidade, íntegro, sem sinais de degradação. RNA livre de DNA Livre de inibidores Livre de nucleases

52 Tipicamente, uma célula de mamífero tem ~10 pg de RNA por célula. 1 mg de RNA total representa ~ células. Abundância No. de cópias No. de mensagens diferentes por célula Abundância de cada mensagem baixa ~ 10 ~ < 0,004% intermediária ~ 200 ~ 500 < 0,1% alta ~ ~ 10 3%

53 TRANSCRIPATASE REVERSA é uma DNA polimerase que utiliza RNA como template Precisa de primer, como toda DNA polimerase A polimerização é sempre na direção 5 3 Trancriptases reversas de origem viral não têm atividade exonucleásica 3 5 ( proof reading ) ou 5 3

54 Transcriptases Reversas mais comumente usadas: AMV-RT (de virus de aves) M-MLV-RT (de virus de mamífero mouse) Transcriptases reversas mesófilas (funcionam bem a o C)

55 Primers Transcrição Reversa

56 É altamente recomendável que o RNA a ser utilizado para RT-PCR seja previamente tratado com DNase RNase-free. Pequenas quantidades de DNA genômico podem permitir a amplificação do produto procurado, dando-nos a falsa impressão de que o amplicon é proveniente de cdna sintetizado a partir de RNA pela transcripase reversa. Faça sempre um controle negativo, em que a reação de amplificação é feita sem a adição de transcriptase reversa.

57 Cuidado com pseudo-genes completamente processados: cerca de 50% dos genes têm um pseudogene correspondente processado

58 Exemplo de amplificação simultânea de fragmento de DNA genômico e de fragmento de cdna

59 A Transcrição Reversa é o passo menos reprodutível na RT-PCR O sucesso da transcrição reversa depende de vários fatores: Integridade do RNA é o fator fundamental Ausência de contaminantes no RNA tais como LiCl, SDS, EDTA e outros As condições da reação - concentração e tipo de tampão, ph, Mg 2+ ou Mn 2+, dntps etc - devem ser otimizados Estruturas secundárias estáveis no RNA dificultam a progressão da enzima; regiões ricas em GC são difíceis de serem reversamente transcritas.

60 mrna cdna AAAAAAAAAAAAAA TTTTTTT AAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTT primers oligo-dt Estruturas secundárias abortam a transcrição reversa AAAA O RNA se degrada a 94 o C, em presença de íons divalentes AAAAAAAAAAAAAA TTTTTT TTTT AAAA TTTT Sendo esta a seqüência alvo para PCR, o primer sense sintetisado para a PCR será o primer para a sintese da 2 a. fita de cdna, que será sintetizada pela Taq DNA polimerase

61 A eficiência da PCR após a transcrição reversa pode melhorar muito com a adição de RNase H ou por desnaturação do cdna a 97 o C por 5 minutos, imediatamente antes da PCR. fragmentos de RNA estáveis em regiões ricas em G e C TTTT 5 1 a. fita de cdna Híbrido DNA/RNA tem T m mais elevado que DNA/DNA

62 AMV-RT (de virus de aves) M-MLV-RT (de virus de mamífero mouse) Transcriptases reversas mesófilas (funcionam bem a o C) Não funcionam bem com RNAs com estruturas secundárias estáveis. Thermo-Script RT É uma enzima que permite realizar transcrição reversa em temperatura elevada (60 o C) Essa enzima é proveniente da AMV-RT, que foi modificada para eliminar a atividade de RNase H e para ter termoestabilidade.

63 rtth polimerase: Isolada da eubatéria termofílica Thermus thermophilus DNA polimerase termófila que tem atividade de transcripatse reversa em temp. elevada (60-70 o C). Como funciona em temperatura mais elevada, as estruturas secundárias do RNA podem ser desfeitas nessa temperatura. Primer usado para RT deve ser específico, com Tm elevado. rtth tem atividade exonucleásica 5 3 e atividade de RNase H, mas não cliva híbrido RNA-DNA endonucleoliticamente, como AMV e M-MLV.

64 rtth a mesma enzima é usada para RT e PCR Atividade de RT favorecida pela presença de Mn 2+ Primeiros experimentos com rtth: Mn 2+ para RT EGTA para quelar Mn 2+ Adição de Mg 2+ para PCR Atualmente RT e PCR são realizadas com Mn 2+ Inconvenientes do Mn 2+ : degrada RNA em temperatura elevada e aumenta erros de incorporação de bases na PCR.

65 Nova geração de RT termófilas: T. Z05 DNA polimerase: DNA polimerase com atividade de RT isolada de Thermus Z05. Também dependente de Mn 2+, porém mais estável que rtth rtth mutada para aumentar a eficiência de RT na presença de Mg 2+ GeneAmp AccuRT RNA PCR Enzyme (Roche)

66 Montagem de um laboratório para PCR

67 DNA genômico purificado Células Lise e purificação DNA RNA viral mrna e rrna Possibilidade de contaminação PCR cdna Hibridização, dot, slot, e microplaca Sequenciamento de DNA PCR em tempo real Eletroforese

68 Laboratório para PCR Todas as salas devem ter: pipetadores, geladeira, freezer -20 o C, bancada de trabalho. 1 - Sala para preparo de reagentes Equipamentos: microcentrífuga, vórtex, dh2o, máquina de gelo, balança, phmetro. 2 Sala para preparo de amostras Equipamentos: microcentrífuga, vórtex, fluxo laminar (p/ proteger a pessoa que trabalha) 3 Sala de 1ª. PCR: termocicladores 4 Sala de 2ª. PCR: termocicladores 5 Sala de pós-pcr: cubas de eletroforese, fontes de voltagem, micro-ondas, transiluminador, sistema de documentação de imagem de gel.

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70 Pipetadores devem ser dedicados para as áreas específicas; e os pipetadores para pipetar DNA nas misturas de PCR devem ser com dispensadores positivos (que não provocam aerossol) ou com ponteiras com filtro, nunca reutilizadas. Uma partícula de aerosol usualmente tem cópias do DNA amplificado. Exposição da área de preparo, do material, e mesmo de alguns reagentes, a luz ultravioleta (UV) danifica o DNA que eventualmente esteja contaminando o local, tornando-o não amplificável. É mais fácil danificar DNAs longos e ricos em pirimidinas. 400 mw/cm 2 - reduz contaminação com moléculas de DNA. Redução em 1000 vezes, com exposição por 4 h.

71 Não reutilize os plásticos (tubos, ponteiras) Todo o material deve ser estéril. Autoclave as partes autoclaváveis do pipetador. Todas as soluções devem ser autoclavadas. Não podem ser autoclavados: oligonucleotídeos, DNA, RNA, enzima DNA polimerase, dntps. As ponteiras devem ter filtro protetor, o que evita contaminação por formação de aerossol Avental específico para ser utilizado apenas na área para PCR, sendo que o que foi usado na área de pós-pcr não pode ser usado nas demais áreas. A área pós-pcr deve estar distante das áreas de preparo de amostra e de pipetagem dos reagentes.

72 Use luvas descartáveis e troque-as com freqüência e sempre quando entrar na área 1 ou 2. Tire as luvas e avental antes de sair da sala. Limpe a bancada de trabalho ao começar e ao terminar. Adicione o DNA por último na reação, para evitar transferência de amostras de DNA de um tubo para outro. Faça sempre um controle negativo, sem template. Prepare o tubo controle negativo por último, para que este seja representativo da manipulação que ocorreu nos demais tubos. Para evitar contaminação na fase de eletroforese, lave bem a cubas de eletroforese, bandejas e pentes com HCl 1 M.

73 Controles: Controle negativo: sem DNA Controle positivo: DNA sabidamente com a seqüência alvo Controle interno: primers para outra seqüência alvo

74 PCR: evitando contaminação por carryover Lembre-se: 100 ml de uma reação de PCR usual, diluídos na água de uma piscina olímpica, resulta em 400 moléculas por 100 ml da água da piscina!! Uso de Uracil-DNA-glicosilase (UNG) e deoxiuridina trifosfato (dutp)

75

76 O produto de PCR com dutp pode ser utilizado para praticamente todas as aplicações de um produto de PCR usual com dttp. DNA polimerase com atividade corretiva não incorpora dutp! Tome o cuidado de desnaturar completamente a UNG, para que não haja destruição de seu produto de PCR. Uma alternativa ao uso de dutp é sintetizar os primers com dutp. Ao final da PCR, uracil-dna glicosilase destrói os primers nas extremidades dos fragmentos amplificados, inutilizando-os para amplificação posterior

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