Cultivo in vitro da oliveira e suas aplicações

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1 Cultivo in vitro da oliveira e suas aplicações Geraldo Magela de Almeida Cançado Francyane Tavares Braga Rafaeli Aparecida Vieira de Souza Claudinéia Ferreira Nunes Ana Paula Ribeiro Bárbara Dantas Fontes Soares 10 Arquivo: EPAMIG Sul de Minas - FECD - Laboratório de Biotecnologia Vegetal CAPÍTULO

2 Cultivo in vitro da oliveira e suas aplicações Geraldo Magela de Almeida Cançado Francyane Tavares Braga Rafaeli Aparecida Vieira de Souza Claudinéia Ferreira Nunes Ana Paula Ribeiro Bárbara Dantas Fontes Soares

3 INTRODUÇÃO A biotecnologia moderna em plantas possui inúmeras aplicações de grande potencial, sendo o cultivo e a propagação de tecidos vegetais em meios artificiais os de maiores impactos tanto para a pesquisa quanto para a atividade agrícola. Seu uso é de grande importância não só na geração de novos conhecimentos científicos, mas também na produção em larga escala de material propagativo com qualidade genética e fitossanitária asseguradas. A incorporação da transgenia em muitas das espécies de plantas cultivadas só foi possível graças ao desenvolvimento de protocolos eficientes de regeneração in vitro e, ainda hoje, é um método indispensável para novas variedades transgênicas. Espécies de plantas como a oliveira, de grande valor econômico, social e cultural, podem-se beneficiar consideravelmente com os avanços conquistados pela pesquisa biotecnológica, tanto pelo aumento da produção quanto pela melhoria da qualidade de seus produtos. As aplicações disponíveis já são inúmeras e aumentam continuamente com o desenvolvimento de novas tecnologias e processos. Em oliveira, seu uso vai desde a produção de mudas certificadas até a busca por novas variedades mais adaptadas aos estresses bióticos e abióticos, utilizando a introgressão direta de genes. Neste capítulo será abordada a experiência do Laboratório de Biotecnologia Vegetal da EPAMIG Sul de Minas, na Fazenda Experimental de Caldas (FECD), com o cultivo in vitro da oliveira, com o relato das principais aplicações da biotecnologia moderna já disponíveis para essa espécie. CONSIDERAÇÕES INICIAIS A oliveira (Olea europaea L.) é uma espécie perene amplamente cultivada e apreciada em todo o mundo e apresenta grande importância no mercado alimentício, pois seus produtos, o azeite e o fruto para mesa, são amplamente difundidos em centenas de países, inclusive no Brasil. Adicionalmente, resultados acumulativos de pesquisa na área da medicina ressaltam as propriedades benéficas da ingestão regular de azeite de oliva para a saúde humana, o que tem estimulado o aumento do seu consumo.

4 278 Cançado, G.M. de A. et al. Para muitas espécies de plantas cultivadas, dentre estas a oliveira, o grande impulso para o aumento da eficiência na agricultura, que se apresenta atualmente, deve-se à alta velocidade com que novos conhecimentos são disponibilizados pela biotecnologia moderna. Existem inúmeros conceitos que definem a biotecnologia, mas em um contexto mais amplo pode ser definida como o conjunto de técnicas que permitem a manipulação e o uso de microrganismos, plantas e animais com o objetivo de desenvolver processos e produtos de interesse para a sociedade. Atualmente, a biotecnologia moderna tem ampliado suas ramificações para os mais diversos setores do mercado e é possível encontrar produtos derivados dela nos alimentos, vestuário, fármacos e em inúmeros materiais utilizados pela indústria. Esses produtos já fazem parte do dia-a-dia do cidadão comum sem que, muitas vezes, tenha plena percepção de sua real magnitude. Em diversos países, o reconhecimento da importância dos processos biotecnológicos como ferramentas indispensáveis para obtenção de ganhos em qualidade e produtividade na agricultura já é consenso. Técnicas de elevado conteúdo tecnológico, advindas do conhecimento gerado na área biotecnológica, tais como a cultura de tecidos vegetais, a utilização de marcadores moleculares, a transformação genética de plantas, dentre outras, quando agregadas ao melhoramento convencional, têm possibilitado o desenvolvimento de novos genótipos, com características superiores, em períodos cada vez menores (SARTORETTO; SALDANHA; CORDER, 2008), e sua aplicação prática já é uma realidade. A cultura de tecidos vegetais ou cultivo in vitro pode ser considerada como o conjunto de procedimentos de grande sucesso na biotecnologia vegetal. Vem sendo aprimorado e aperfeiçoado há várias décadas e, nos dias de hoje, é adotado como processo rotineiro pela agricultura, permitindo a propagação de muitas espécies de forma mais eficiente e rápida. Dentre as muitas contribuições do cultivo in vitro, encontra-se a produção de mudas e de propágulos de qualidade genética e fitossanitária superior, o desenvolvimento mais rápido de novas cultivares, além da conservação de germoplasma valioso para os programas de melhoramento. O cultivo in vitro também é uma ferramenta imprescindível para o estudo fisiológico e bioquímico em muitas espécies de plantas, inclusive espécies selvagens, cujo potencial ainda permanece inexplorado. O cultivo in vitro em condições assépticas permite elevado grau de homogeneidade

5 Cultivo in vitro da oliveira e suas aplicações 279 para fatores ambientais difíceis de ser controlados em condições ex vitro e possibilita a clonagem dos genótipos, anulando as diferenças advindas da variação genética, o que é útil quando se deseja comparar efeitos de tratamentos em indivíduos sem a interferência do background genético. A transformação genética de plantas é outra grande conquista do avanço científico e tecnológico da área da biotecnologia. Os benefícios da aplicação dessa importante tecnologia só agora começam a ser percebidos e reconhecidos pela sociedade. Plantas transgênicas vêm sendo cada vez mais adotadas por países com aptidão agrícola. O Brasil, país de grande importância mundial para a produção de alimentos e de bioenergia, avança na aplicação dessa tecnologia de forma vertiginosa. Em pouco mais de cinco anos após sua liberação comercial, o País já ocupa a segunda posição como maior produtor mundial de transgênicos (JAMES, 2009). Até o momento, o cultivo in vitro tem sido uma das etapas essenciais para novas variedades transgênicas de plantas comercialmente cultivadas, o que demonstra a grande importância desse processo. O cultivo in vitro fundamenta-se na totipotencialidade celular, teoria proposta por Haberlandt em 1902, onde cada célula vegetal possui potencial genético para gerar um novo organismo, idêntico ao que lhe deu origem (GEORGE, 2008). A partir desse conceito, inúmeros trabalhos foram conduzidos com o intuito de regenerar plantas inteiras, utilizando meios nutritivos específicos. No entanto, o sucesso da técnica está associado ao desenvolvimento de protocolos eficientes que permitam inicialmente o perfeito desenvolvimento in vitro, e, posteriormente, ex vitro, durante as etapas de aclimatização. Por permitir o cultivo sob condições ambientais controladas e estéreis, o cultivo in vitro é muito utilizado para estudos que exigem elevado rigor científico, possibilitando a utilização de órgãos, tecidos ou mesmo células como explante inicial. Em oliveira, as aplicações da cultura de tecidos já são amplamente utilizadas pela pesquisa, muito embora seja uma espécie lenhosa que apresenta recalcitrância in vitro, o que torna a aplicação do cultivo in vitro com propósitos comerciais um desafio. Rotineiramente, a multiplicação em larga escala da oliveira ocorre por propagação vegetativa, em especial por estaquia e enxertia. Como a oliveira apresenta elevada taxa de fecundação cruzada, a prática de produção de mudas por semente é mais utilizada com a finalidade de melhoramento

6 280 Cançado, G.M. de A. et al. genético dessa espécie. Pela segregação provocada pela recombinação genética, que pode alterar as características agronômicas da cultivar, não é indicada a produção de mudas comerciais utilizando sementes. Além disso, por causa do efeito de juvenilidade fisiológica, a propagação por semente retarda a produção de flores e frutos, o que em oliveira pode significar de dois a cinco anos de atraso para a colheita da primeira safra de frutos. O enraizamento de estacas e a enxertia, embora sejam as práticas mais adotadas para produção de mudas dessa espécie, apresentam como desvantagem a reduzida eficiência, sendo influenciadas pelas variações sazonais do clima, pela constituição genética das variedades e por questões nutricionais e sanitárias do material vegetativo utilizado. Diante dessas limitações, a propagação clonal in vitro da oliveira tornase uma opção atraente, capaz de superar as limitações que são encontradas nos processos de enraizamento de estacas e de enxertia, além de permitir a multiplicação clonal em larga escala. Adicionalmente, a micropropagação pode ser um modelo interessante aplicado a estudos bioquímicos, fisiológicos e no aperfeiçoamento dos processos de melhoramento genético da oliveira (RUGINI; CARICATO, 1995). APLICAÇÕES DAS TÉCNICAS DE CULTURA DE TECIDOS EM OLIVEIRA A biotecnologia associada à cultura de tecidos engloba várias técnicas como a micropropagação, cultura de embriões, embriogênese somática, resgate de embriões raros e transformação genética. Essas técnicas e processos são amplamente empregados na pesquisa com plantas e podem ser utilizados para a obtenção e multiplicação de materiais elite de oliveira. Micropropagação em oliveira Para a multiplicação dos propágulos entra em cena a micropropagação. Esta prática é a aplicação mais rotineira da cultura de tecidos e, depois dos transgênicos, é aquela de maior impacto prático na agricultura. Basicamente, a micropropagação é encarada como a opção mais adequada para espécies de plantas, cuja dificuldade de propagação por métodos convencionais é considerada limitante para a sua multiplicação em larga escala. No entanto, diante da popularização dessa técnica associada à redução de seu custo, tem sido estimulada sua aplicação, mesmo em culturas agronômicas, cuja

7 Cultivo in vitro da oliveira e suas aplicações 281 propagação é considerada fácil. Algumas das vantagens da micropropagação, quando comparada aos métodos convencionais de propagação são: a) possibilidade de produção contínua de material vegetal ao longo do ano, já que as condições ambientais aplicadas a esse processo são artificialmente controladas; b) menor necessidade por espaço, visto que as mudas são produzidas em laboratório e aclimatizadas em casas de vegetação; c) possibilidade de multiplicação exponencial de clones a partir de um único explante, dispensando a necessidade de muitas plantasmatrizes no campo para fornecimento de material propagativo, o que não ocorre em outros métodos de propagação. No entanto, a grande vantagem da micropropagação, quando comparada a outros métodos, está alicerçada no seu princípio de funcionamento. Para o sucesso do estabelecimento in vitro, assim como da multiplicação em escala exponencial, é fundamental que a fonte de explantes seja saudável e vigorosa. Portanto, as mudas geradas pelo processo de micropropagação, invariavelmente, têm sua origem em plantas-matrizes de elevada qualidade sanitária e genética. Essas plantas-matrizes são frequentemente cultivadas em ambientes protegidos para evitar contaminação por doenças e ataques de pragas. Esse detalhe, por si só, já garante uma qualidade excepcional para as mudas produzidas por meio da micropropagação. Consequentemente, para a oliveira, uma espécie lenhosa, cuja propagação vegetativa por métodos convencionais é ineficiente e limitada pela influência sazonal do clima e pela necessidade de grandes quantidades de material vegetativo para formação das estacas, a micropropagação pode assumir uma posição de destaque na multiplicação dessa espécie. No Brasil, o cultivo comercial da oliveira só está começando, mas já se percebe que a disponibilidade de mudas de qualidade é um limitante para sua expansão no território nacional. Os processos tradicionais de enraizamento de estacas em leitos aquecidos e em ambiente protegido com atmosfera controlada possibilitam taxas de enraizamento de estacas que variam de 5% a 30%, dependendo da cultivar de oliveira utilizada, o que pode ser considerado medíocre em função dos elevados investimentos necessários para a formação e manutenção de áreas cultivadas com plantas-matrizes e para a instalação e manutenção da infraestrutura necessária para a produção das mudas.

8 282 Cançado, G.M. de A. et al. Embora o custo elevado seja um fator a ser considerado para a micropropagação da oliveira em laboratório, pela experiência acumulada em outras culturas, tais como eucalipto, morangueiro, bananeira, batateira, floricultura, etc., observa-se que, após o sistema de micropropagação ter sido estabelecido como processo de rotina, os custos envolvidos com a montagem da infraestrutura são amortizados rapidamente e os custos de manutenção caem à medida que a escala de produção se eleva. No entanto, para a oliveira, cujo cultivo comercial no Brasil começou a menos de uma década, é necessário um crescente incentivo e aporte de recursos para o desenvolvimento de pesquisa agrícola direcionada para essa espécie. Diante da pouca informação disponível no território nacional, é necessária a geração de conhecimento em várias áreas importantes para a evolução da olivicultura, desde a produção de mudas, poda e manejo das plantas no campo, nutrição mineral e adubação, controle de doenças e pragas, pós-colheita e processamento dos frutos até logicamente, o melhoramento genético, visando à geração de cultivares especificamente adaptadas para as diferentes condições ambientais encontradas no Brasil. A micropropagação, como metodologia moderna e de aplicação prática, assume papel importante nesse processo de geração de conhecimento, mas, para tanto, alguns gargalos precisam ser solucionados, já que muitas variedades comerciais de oliveira não respondem adequadamente ao processo de cultivo in vitro. O Laboratório de Biotecnologia Vegetal da EPAMIG Sul de Minas, localizado em Caldas, Minas Gerais, vem testando processos e diferentes condições para a propagação em larga escala da oliveira in vitro. Semelhantemente ao que se observa no processo convencional de enraizamento de estacas em leito aquecido, a taxa de sucesso de enraizamento in vitro está intrinsecamente associada à variedade utilizada, indicando uma forte resposta genótipo-específica. Essa observação, embora interessante, já era esperada pela grande influência da constituição genética na eficiência dos processos metabólicos e na capacidade de resposta ao ambiente. Embora a oliveira não seja uma espécie caducifólia ou que apresente período de dormência característico, observa-se uma significativa redução do seu crescimento na estação do inverno, principalmente em regiões onde o inverno é rigoroso. A equipe do Laboratório de Biotecnologia Vegetal

9 Cultivo in vitro da oliveira e suas aplicações 283 da EPAMIG Sul de Minas tem observado que as variedades de oliveira respondem melhor ao processo de multiplicação in vitro em estações do ano, quando as condições atmosféricas são mais favoráveis ao crescimento vegetativo das plantas-matrizes cultivadas em ambiente aberto, ou seja, épocas do ano quando ocorre maior precipitação pluviométrica, dias longos e temperaturas médias mais elevadas. Portanto, para obter sucesso na micropropagação escalonada ao longo de todo o ano, é importante a manutenção das plantas-matrizes em ambientes protegidos, não apenas para evitar contaminações por patógenos e ataques de pragas, como também para simular condições ambientais mais favoráveis ao crescimento vegetativo. Na década de 1970, quando o cultivo in vitro de plantas ganhou grande impulso, foram estabelecidas as principais fases para o desenvolvimento da micropropagação sucintamente ilustradas no esquema da Figura 1 e descritas a seguir: a) fase 1: seleção de explantes, que podem ser ápices caulinares e gemas (regiões meristemáticas), segmentos nodais, segmentos radiculares, segmentos foliares, cotilédones, entre outros. A desinfestação do tecido vegetal inicia-se logo após a coleta e, geralmente, é realizada com álcool a 70% (utilizado para reduzir a hidrofobicidade causada pelas ceras), hipoclorito de sódio que é o agente desinfestante propriamente dito, e lavagens em água destilada e autoclavada para eliminar resíduos do hipoclorito, os quais podem inibir o desenvolvimento do explante. Esse processo deve ser preferencialmente realizado em ambiente estéril para evitar contaminações posteriores. Os meios de cultura artificiais também devem ser esterilizados, o que geralmente é feito por autoclavagem em elevada temperatura e pressão. A coleta do propágulo ideal para a finalidade de micropropagação deve ser inicialmente testada, para evitar taxas elevadas de contaminação e de oxidação. No Laboratório de Biotecnologia Vegetal da EPAMIG Sul de Minas, foi observado para várias cultivares de oliveira que a melhor fonte de explante foi obtida em plantas cultivadas em ambiente protegido (casa de vegetação e sala de crescimento), enquanto plantas cultivadas em ambiente externo foram as piores fontes de explantes;

10 284 Cançado, G.M. de A. et al. b) fase 2: multiplicação dos propágulos já estabelecidos mediante sucessivas subculturas em meio, cuja constituição foi otimizada para propiciar o crescimento e a multiplicação de novas brotações. Geralmente, nessa fase é importante o balanço de reguladores de crescimento adicionados ao meio, assim como o fornecimento adequado de nutrientes orgânicos e inorgânicos para favorecer o rápido crescimento dos propágulos. As condições ambientais onde são mantidos os frascos de cultura também devem ser adequadas para as necessidades dessa fase, fornecendo luminosidade na quantidade e qualidade necessária, além de manutenção de temperatura e umidade relativa (UR) favoráveis para o crescimento rápido; c) fase 3: transferência das brotações geradas durante a fase de multiplicação para um novo meio de cultura, que favoreça e estimule o enraizamento das brotações. Frequentemente, nessa etapa, são necessários vários testes para avaliar a concentração de várias fontes de auxina, assim como seu balanço com outras classes de reguladores de crescimento, tais como citocininas e giberelinas. A auxina é um regulador de crescimento imprescindível para o estímulo da rizogênese. Algumas auxinas sintéticas de uso mais comum nessa fase são ácido indolbutírico (AIB), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), ácido indolacético (AIA) e ácido naftalenoacético (ANA); d) fase 4: aclimatização dos propágulos enraizados no ambiente externo. Esta fase é crucial para o sucesso da micropropagação e tem sido considerada como um dos grandes desafios a serem superados pela micropropagação comercial. Após o enraizamento in vitro, os propágulos são transferidos para substratos adequados a seu desenvolvimento. Durante a transição do ambiente in vitro para o ambiente ex vitro, dois processos bioquímicos de extrema importância devem ocorrer. O primeiro é a mudança do metabolismo basicamente heterotrófico, suportado pela disponibilidade de fontes de carbono facilmente assimiláveis no meio artificial, para o metabolismo autotrófico, no qual o propágulo

11 Cultivo in vitro da oliveira e suas aplicações 285 deve ser capaz de sintetizar suas próprias fontes de energia para dar suporte a seu crescimento e acumulação de reservas. O outro processo fundamental para o sucesso dessa fase é a síntese da cutina na superfície das folhas e a funcionalidade estomática. Em consequência da UR saturada encontrada no interior dos frascos de cultura in vitro, o tecido foliar dos propágulos reduz drasticamente a produção dessa cera que protege a superfície da folha e seu mecanismo de abertura e fechamento estomático é ineficiente, o que facilita a perda excessiva de água pela transpiração na condição ex vitro. Para o sucesso da aclimatização, é essencial estimular a síntese da cutina e a regulação do fechamento estomático antes de expor completamente os propágulos ao ambiente de baixa UR e com excesso de luz. Geralmente, isso é feito gradativamente, quando os propágulos ainda são mantidos in vitro, por meio da troca da tampa do frasco de cultura por filme plástico poroso, o que permite equilibrar gradativamente a umidade interna com a umidade externa. Outro artifício é manter os propágulos recém-transferidos para o substrato sob ambiente sombreado e com frequente nebulização com água para reduzir a evapotranspiração. As fases descritas e seus riscos também se aplicam para a oliveira. A equipe de pesquisadores do Laboratório de Biotecnologia Vegetal da EPAMIG Sul de Minas vem testando condições adequadas para otimizar a micropropagação da oliveira. Entre os principais problemas já identificados, estão a oxidação por compostos fenólicos exsudados pela própria oliveira, a elevada taxa de contaminação por microrganismos endosimbiontes e a recalcitrância intrínseca da oliveira para o enraizamento in vitro. Medidas como a adição de ácido ascórbico, um poderoso agente antioxidante, durante todas as etapas de esterilização dos explantes de oliveira, assim como a adição de ácido ascórbico e carvão ativado na composição do meio, têm sido de grande eficácia na redução ou mesmo eliminação da oxidação fenólica nos tecidos de oliveira inoculados. Outro composto que tem-se mostrado efetivo para esse propósito é o polivinilpirrolidona (PVP), que, adicionado ao meio, tem inibido a oxidação dos explantes.

12 286 Cançado, G.M. de A. et al. Isolamento de explante inicial Planta-matriz Inoculação de segmentos nodais in vitro Multiplicação in vitro Aclimatização dos clones Figura 1 - Esquema do processo de micropropagação da oliveira in vitro, com a produção de clones genéticos em escala exponencial a partir de explante isolado e de uma única planta-matriz Outro grande problema observado para o estabelecimento de explantes de oliveira in vitro, como citado anteriormente, é a elevada taxa de contaminação endógena por bactérias endosimbiontes, principalmente em explantes oriundos de plantas adultas cultivadas no campo. No Laboratório de Biotecnologia Vegetal da EPAMIG Sul de Minas, foram observadas taxas de contaminação superiores a 90% em explantes provenientes de plantas do banco de germoplasma mantido em campo aberto. Embora essa classe de bactérias não se manifeste prejudicialmente em plantas cultivadas no campo, quando os explantes provenientes de plantas infectadas são submetidos ao estresse provocado pelo processo de cultivo in vitro, observase a rápida proliferação dessas bactérias, o que provoca a morte do explante. O controle dessas bactérias é facilmente obtido pela adição de doses corretas de antibióticos de grande espectro de ação em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, como a ampicilina, rifampicina e cefotaxima (BARRUETO CID; ZIMMERMANN, 2006). No entanto, a solução com esses antibióticos

13 Cultivo in vitro da oliveira e suas aplicações 287 deve ser esterilizada por filtração e adicionada ao meio de cultura após a sua autoclavagem, evitando assim a termodegradação desses antibióticos. Além de manter as plantas-matrizes de oliveira em ambiente de casa de vegetação sem contato com o ambiente externo, outra medida em caráter experimental adotada pelos pesquisadores do Laboratório de Biotecnologia Vegetal da EPAMIG Sul de Minas, com o intuito de reduzir as taxas de contaminação tanto por bactérias como por fungos, tem sido a aplicação intercalada e contínua do fungicida sistêmico Amistar (Azoxystrobin) e do fungicida de contato Orthocide (Captan) associado com o antibiótico Agrimicina (estreptomicina) nas plantas-matrizes mantidas em casa de vegetação. As abordagens aplicadas para tratamento de plantas e explantes podem variar bastante entre laboratórios, sendo necessário testar a eficiência de cada procedimento para as condições de cada ambiente e para a fonte do explante utilizado. Peixe et al. (2007), para promover a desinfestação de segmentos nodais da cultivar de oliveira Galega, desenvolveram um protocolo que consiste na lavagem dos explantes em água corrente durante 3 h, seguida por imersão com agitação suave em solução do fungicida Benomyl 1% (v/v), durante 50 min, seguida por três lavagens em água bidestilada autoclavada, concluindo com a imersão dos explantes em solução de cloreto de mercúrio 0,2% (v/v) e tween 20 durante 10 min sob agitação suave. Segundo relato desses autores, esse procedimento foi o mais eficiente para o estabelecimento de culturas in vitro dessa variedade de oliveira. A fase 2 da micropropagação de oliveira diz respeito à multiplicação in vitro, processo cujo objetivo é aumentar exponencialmente o material propagativo. Porém, não basta conseguir altas taxas de multiplicação. É importante obter uma taxa média satisfatória que seja capaz de manter a homogeneidade e a qualidade dos novos propágulos. Nessa fase, atenção especial deve ser destinada à variação somaclonal, evitando ao máximo sua ocorrência. As causas da variação somaclonal podem ser genéticas ou epigenéticas e são induzidas principalmente pelo estresse provocado durante os subcultivos sucessivos dos explantes in vitro. As variações ocorrem diretamente no DNA pelas quebras de braços cromossômicos, migrações desbalanceadas de cromossomos durante a mitose, alterações na sequência de nucleotídeos da fita de DNA (mutações), sendo esses transmitidos hereditariamente. Outras alterações, conhecidas como epigenéticas, são

14 288 Cançado, G.M. de A. et al. provocadas pela metilação da molécula do DNA, que acarreta perda de função dos genes (silenciamento), na maioria das vezes com papel importante no metabolismo celular. Embora o padrão de metilação do DNA não seja herdável, em plantas este pode ser transmitido assexuadamente por multiplicação vegetativa. Diversos meios de cultura estão sendo testados para a multiplicação de oliveira. Inicialmente, é muito comum a escolha de uma composição de meio que ofereça uma boa resposta e, posteriormente, efetue seu aperfeiçoamento, inserindo pequenas modificações controladas na sua composição. A composição do meio de cultura, no que se refere ao tipo e ao balanço de reguladores de crescimento, talvez seja uma das etapas mais difíceis de ser ajustadas para cada uma das fases da micropropagação. A eficiência dos reguladores de crescimento artificiais depende e é influenciada pelo conteúdo endógeno dessas substâncias no tecido do explante. Como os conteúdos variam em função de características sazonais do ano, tipo de tecido ou órgão utilizado, posição na planta onde foi coletada e do estado nutricional da planta-matriz, é difícil definir uma concentração e uma proporção padrão para os reguladores adicionados no meio de cultura. As citocininas, classe de reguladores responsáveis pela quebra de dominância apical e pela indução da proliferação de células em gemas axilares (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998) são consideradas indispensáveis durante a etapa de multiplicação dos explantes. Já as auxinas, reguladores envolvidos com o enraizamento, são indispensáveis para estimular a rizogênese na maioria das espécies de plantas. Para muitas espécies, com destaque para a oliveira, sua adição no meio é indispensável, porém, para outras espécies, como a videira, sua adição externa é dispensável, dependendo do genótipo, pois o próprio tecido encarrega-se da síntese em quantidades suficientes para disparar o processo (CANÇADO et al., 2009b). Roussos e Pontikis (2002), ao estudarem a multiplicação da variedade de oliveira Koroneiki, avaliaram o efeito de diferentes citocininas dimetilalil-amino-purina (2iP); 6 - benzilaminopurina (BAP); thidiazuron (TDZ) e Zeatina em concentrações variáveis (0,5; 1,0; 2,0 e 4,0 mg/l) no meio Driver Kuniyuki for Walnut medium (DKW) descrito por Roussos et al. (1999). Esses autores observaram que as melhores respostas foram obtidas para a zeatina, principalmente quando utilizada na concentração de 2 mg/l. Já Peixe et al. (2007), ao trabalharem com ápices caulinares da

15 Cultivo in vitro da oliveira e suas aplicações 289 cultivar Galega em meio olive medium (OM) suplementado com 50 ml/l de água-de-coco, testaram os efeitos de BAP e zeatina nas concentrações de (2,22; 2,28 e 2,32 µm). Esses autores observaram que o acréscimo de 2,28 µm de zeatina ao meio promoveu o maior número de brotações por explante. Resultados semelhantes foram observados por Binet et al. (2007) com a cultivar Aglandau, Tanche e Laragne, onde ápices caulinares foram inoculados em diferentes meios OM e Woody plant medium (WPM) suplementados com 4 mg/l de zeatina. Embora esses resultados possam ser os mais adequados para as cultivares descritas, não necessariamente indicam que a zeatina possa ser a melhor fonte de citocinina para outras variedades de oliveira. Dessa forma, para cada condição e genótipo, testes específicos devem ser conduzidos com o intuito de otimizar a micropropagação. Além disso, embora a zeatina apresente os melhores resultados para a fase de multiplicação nos trabalhos descritos, seu uso rotineiro em processos comerciais de micropropagação é inviável por causa do elevado custo dessa citocinina. A rizogênese é considerada uma fase crítica na regeneração de plantas in vitro, pois tem influência direta na fase seguinte que é a de aclimatização dos propágulos no ambiente externo (ROCHA et al., 2008). Propágulos com sistema radicular débil têm poucas chances de equilibrar seu balanço evapotranspiratório sem sofrer as severas consequências do dessecamento. Em oliveira, por ser uma espécie lenhosa, as emissões de raízes adventícias in vitro é lenta e heterogênea. A priori, observa-se no ambiente in vitro comportamento bastante semelhante ao enraizamento de estacas no processo convencional de produção de mudas. Além disso, o enraizamento responde de forma genótipo-específica, observando-se taxas variáveis entre as diferentes variedades de oliveira. Há uma relação entre os níveis endógenos de auxinas e citocininas, responsáveis por disparar o processo de rizogênese (GEORGE, 2008). Além disso, outras variáveis podem afetar o processo de formação de raízes adventícias em oliveira, tais como o excesso de osmolaridade do meio que ocasiona estresse hídrico, o acúmulo de compostos fenólicos na base do segmento nodal que reduz a proliferação e a diferenciação das células, a baixa disponibilidade de substâncias de reserva no tecido, o estado nutricional aquém do adequado, a contaminação por patógenos, a juvenilidade do material utilizado e a espessura e a lignificação da parede celular. Todos esses

16 290 Cançado, G.M. de A. et al. fatores, atuando isoladamente ou em sinergia, podem inibir completamente o processo de rizogênese. No entanto, há pouca literatura disponível apontando as melhores condições para promover o enraizamento da oliveira in vitro. Roussos e Pontikis (2002), ao estudarem o genótipo Koroneiki, cultivado no meio WPM com 20 g/l de sacarose e suplementado com AIB e ANA nas concentrações de 2 e 4 mg/l, 4 e 8 mg/l, 8 e 16 mg/l, respectivamente, observaram, após seis semanas de cultivo, 80% de enraizamento nos explantes mantidos no meio, contendo a menor concentração de AIB (2 mg/l). Porém, verificaram maior número de raízes por explante com as doses mais elevadas de ANA. Peixe et al. (2007), ao utilizarem propágulos da variedade Galega após 60 dias de cultivo in vitro, fizeram dois tratamentos utilizando auxinas: alguns explantes foram inoculados em meio OM suplementado com 4,9 µm de AIB e outros foram imersos em solução estéril com 14,7 µm de AIB, durante 10 s, antes de serem inoculados em meio OM sem adição de reguladores de crescimento, técnica conhecida como pulsing. Esses autores observaram maiores porcentagens de enraizamento in vitro (87%) nos brotos submetidos ao tratamento com pulsing. Uma possível explicação para isso seria o fato de os explantes não serem expostos continuamente à auxina, já que o excesso de exposição a esse regulador de crescimento pode inibir a rizogênese e induzir a calogênese. A escassez de informações referente ao enraizamento in vitro de oliveira dificulta o estabelecimento de um protocolo de micropropagação padrão para essa espécie, motivo pelo qual a pesquisa na área deve ser estimulada, principalmente porque as respostas morfogenéticas são específicas para cada genótipo. Na última fase da micropropagação da oliveira ocorre a aclimatização ex vitro dos propágulos que conseguiram desenvolver a parte aérea e o sistema radicular de forma equilibrada. Essa fase é determinante para a qualidade final das mudas produzidas. A transferência dos propágulos das condições controladas de temperatura, UR, intensidade luminosa e fotoperíodo, para o ambiente aberto, sujeito a variações de grande amplitude nas condições atmosféricas e de luminosidade, provoca intenso estresse nesses propágulos. Durante essa fase, o déficit hídrico torna-se a maior ameaça e as taxas de mortalidade podem facilmente atingir 100%, caso cuidados especiais não sejam tomados.

17 Cultivo in vitro da oliveira e suas aplicações 291 Embora um propágulo cultivado in vitro possa aparentar uma condição perfeita e saudável, este apresenta deficiências anatômicas ocasionadas pelo próprio processo de cultivo in vitro. Essas deficiências dificultam o controle da transpiração pela planta, ocasionando rápida perda de água pelo tecido foliar. Os estômatos, estruturas responsáveis pela troca gasosa, não se encontram funcionalmente adaptados para responderem rapidamente aos sinais de estresses. Adicionalmente, a camada de cera epiculticular que forma a barreira protetora de cutina na superfície das folhas da oliveira, ainda não é suficientemente espessa para evitar a perda excessiva de água por evaporação. Além disso, o sistema vascular, principalmente nas conexões que ligam a raiz à parte aérea, ainda se encontra em estado primordial de desenvolvimento, o que limita a absorção e translocação de água na quantidade suficiente para compensar o fluxo transpiratório. Esse conjunto de alterações morfoanatômicas, observado em propágulos de oliveira oriundos do cultivo in vitro, reduz as chances de sobrevivência em ambiente externo. Dessa forma, alguns procedimentos durante a aclimatização devem ser rigorosamente implementados, dentre os mais importantes estão a manutenção da umidade do ar próxima da saturação no interior da casa de vegetação (Fig. 2). Além disso, o sombreamento, principalmente nas horas mais quentes do dia, ajuda a reduzir os efeitos maléficos da alta temperatura. A escolha correta do substrato também é fundamental. Após a remoção dos propágulos do meio de cultura, onde a disponibilidade de água não é limitante, as raízes rapidamente sofrem os efeitos do estresse hídrico. É importante a escolha de um substrato que consiga reter elevada umidade sem, no entanto ficar encharcado. A adição de adubos, principalmente na forma salina, é extremamente deletéria para os propágulos, pois o aumento do potencial osmótico impede que os propágulos absorvam água do substrato. É importante considerar a higiene de ferramentas, recipientes, substrato e água utilizados, pois no início da fase de aclimatização os proprágulos são bastante suscetíveis ao ataque de patógenos, incluindo fungos saprófitas e oportunistas. O controle com defensivos deve ser realizado com cautela, para evitar problemas de fitotoxidez. À medida que o tempo passa, a condição ambiental, na qual os propágulos estão expostos deve ser gradativamente alterada. Com isso, as novas mudas são forçadas a adaptar seu metabolismo e sua anatomia para condições mais próximas ao ambiente externo. O uso de casas de

18 292 Cançado, G.M. de A. et al. vegetação com controle de temperatura e umidade do ar, de preferência com acionamento automático (por termostato e/ou umidostato), é um fator preponderante para obter elevada taxa de sobrevivência durante a aclimatização (Fig. 2). Preferencialmente, o substrato utilizado deve ser quimicamente inerte e ter boa capacidade de retenção de umidade, mas com boa porosidade e drenagem, para evitar o encharcamento (SOUZA JÚNIOR; BARBOZA; SOUZA, 2001). Os mais utilizados são a vermiculita expandida, a casca de arroz carbonizada, a perlita e substratos agrícolas comerciais, do tipo Plantmax, que podem ser misturados em diferentes proporções. A esterilização prévia do substrato pode ser uma boa medida para A B C Figura 2 - Infraestrutura envolvida na micropropagação de oliveira NOTA: A - Casa de vegetação com controle automático de temperatura, umidade relativa (UR) e luminosidade; B - Interior da casa de vegetação com destaque para bancadas, sombrite ajustável e isolamento com policarbonato; C - Viveiro com tela antiafídeo para manutenção de plantas-matrizes e mudas sem risco de transmissão de doenças por insetos; D - Plantas-matrizes de oliveira mantidas sob ambiente protegido. EPAMIG Sul de Minas - Fazenda Experimental de Caldas - Laboratório de Biotecnologia Vegetal, D

19 Cultivo in vitro da oliveira e suas aplicações 293 evitar contaminações. Peixe et al. (2007) obtiveram 95% de sobrevivência em plântulas de oliveira, ao utilizarem, como substratos, uma combinação de vermiculita com perlita esterilizadas, cultivando as plântulas em casa de vegetação com controle de temperatura e umidade do ar por nebulização automática com água. Cultivo in vitro de embriões na propagação da oliveira Dentre as técnicas já citadas, a cultura de embriões in vitro tem seu uso principalmente no resgate de embriões zigóticos incapazes de se desenvolverem no interior da semente, assim como na produção de plântulas destinadas a trabalhos de regeneração por vias organogênicas e embriogênicas. Por meio da cultura de embriões é possível reduzir o tempo para obtenção de um novo indivíduo, além de permitir boa uniformidade e alto porcentual de germinação de embriões de espécies como a oliveira. Associada ao cultivo in vitro, a germinação de embriões permite o estabelecimento de culturas axênicas (isentas de microrganismos), sendo modelos úteis para a pesquisa científica. Porém, alguns fatores devem ser levados em consideração, quando se deseja cultivar embriões dessa espécie in vitro, tais como: a) desinfestação da semente; b) dificuldade envolvida com a excisão do embrião; c) escolha adequada do meio de cultura, principalmente no que diz respeito às concentrações de carboidratos, sais inorgânicos, suplementos orgânicos e reguladores de crescimento; d) condições de incubação, dentre outros. No Laboratório de Biotecnologia Vegetal da EPAMIG Sul de Minas, são realizadas pesquisas com o objetivo de desenvolver e estabelecer protocolos eficientes para o cultivo in vitro de embriões zigóticos de oliveira (Fig. 3). Esse tipo de abordagem é de grande utilidade para o processo de melhoramento, estudos fisiológicos, bioquímicos e morfológicos, geração e conservação de germoplasma, entre outros. Além disso, no Laboratório de Biotecnologia Vegetal da EPAMIG Sul de Minas são utilizados marcadores moleculares de DNA para mensurar a magnitude da segregação genética em plântulas oriundas de embriões gerados por fecundação.

20 294 Cançado, G.M. de A. et al. A B Figura 3 - Cultivo in vitro de embriões de oliveira NOTA: A e C - Detalhe de embriões de oliveira isolados de sementes fisiologicamente maduras; B - Plântula de oliveira in vitro originada da germinação e do desenvolvimento de embrião isolado. EPAMIG Sul de Minas - Fazenda Experimental de Caldas - Laboratório de Biotecnologia Vegetal, Inúmeros trabalhos utilizam, como agente desinfestante de sementes e embriões envolvidos pelo albúmen, o álcool a 70% e o hipoclorito de sódio por um período predeterminado (ALCHÉ et al., 2004; GARCÍA et al., 2002; OLIVEIRA, 2001; ACEBEDO et al., 1997). A esterilização é feita em ambiente estéril (câmara de fluxo laminar) e os embriões são transferidos para frascos contendo meio de cultura sólido e incubados em câmaras de crescimento com temperatura, umidade, fotoperíodo e intensidade luminosa controlados. C

21 Cultivo in vitro da oliveira e suas aplicações 295 Dentre os fatores relacionados com a planta doadora e seus frutos, os mais importantes para o cultivo de embriões são os relacionados com a maturidade fisiológica do fruto na planta, e, portanto, do embrião, a sanidade sanitária e o estado nutricional da planta, e, consequentemente, de seus frutos e sementes, além do potencial genético intrínseco da variedade utilizada. Dentre os fatores que influenciam na eficiência do procedimento, os mais importantes são as modificações e adequações realizadas na composição dos meios de cultura e os ajustes nas condições ambientais durante a incubação dos embriões. A variação nesses fatores pode resultar em maior ou menor porcentagem de germinação, além de influenciar no desenvolvimento posterior das plântulas geradas. Souza et al. (2010b) avaliaram a resposta de embriões isolados de frutos provenientes de 19 genótipos de oliveira. Os embriões foram cultivados em meio de cultura MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) em câmara de crescimento na presença e ausência de luz. Esses autores observaram maiores porcentagens de germinação em embriões expostos à luz, com média de 75% para os genótipos avaliados. Em um outro experimento, Souza et al. (2010a) avaliaram os efeitos da suplementação do meio de cultura com diferentes doses de água-de-coco e observaram que a resposta a essa mistura complexa ocorre em função do genótipo específico. Para a maioria dos genótipos testados, a porcentagem de germinação respondeu de forma positiva ao aumento da dose de água-de-coco no meio, chegando a 100% para alguns dos tratamentos. No entanto, poucos genótipos não demonstraram nenhuma resposta à adição da água-de-coco em relação ao controle que não continha essa substância natural. Embora os frutos utilizados nesse experimento tenham sido coletados no mesmo estádio de maturidade fisiológica e a viabilidade dos embriões tenha sido previamente confirmada com coloração por tetrazólio, os resultados apontam que as diferenças observadas na germinação entre as diferentes variedades pode ter sido influenciada pela constituição genética, que, por sua vez, tem papel preponderante no controle da germinação. García et al. (2002) testaram diferentes fontes e concentrações de carboidratos na germinação in vitro de embriões da variedade de oliveira Manzanilla. Esses autores avaliaram o efeito de diferentes concentrações de sacarose e manitol (0; 10; 15; 20 e 25 g/l) e observaram que independente da concentração de sacarose utilizada, houve 100% de germinação dos embriões, porém, o desenvolvimento posterior das plântulas foi superior,

22 296 Cançado, G.M. de A. et al. quando utilizado 15 g/l de sacarose. Esse resultado indica que num primeiro momento, os embriões são capazes de iniciar o processo de germinação com pouca influência da composição do meio externo, mas nas etapas posteriores, que necessitam de fonte de carbono e energia disponíveis para a síntese e crescimento de novos tecidos e órgãos, o papel do meio de cultura torna-se imprescindível. No entanto, concentrações elevadas de açúcares no meio, podem elevar o potencial osmótico e reduzir a germinação dos embriões. Esses mesmos autores observaram que o manitol na concentração de 30 g/l foi eficiente para promover o crescimento das plântulas de Manzanilla in vitro, indicando uma contribuição positiva desse composto orgânico. Esse conjunto de informações indica que os embriões de oliveira não são exigentes quanto à composição do meio de cultura, podendo tanto ser germinados em meio MS básico, como suplementados com água-de-coco, porém necessitam de luz para melhor germinação, podendo ser classificados como fotoblásticos positivo. No entanto, na medida que a plântula originada a partir do embrião muda seu metabolismo autotrófico para o metabolismo heterotrófico, mais importante e fundamental se torna o papel do meio de cultura para a manutenção do desenvolvimento. Embriogênese somática em oliveira A propagação da oliveira pode ser realizada por sementes, enxertia e enraizamento de estacas lenhosas e semilenhosas. Porém, essas técnicas apresentam inconvenientes como a baixa capacidade de regeneração de plantas e elevada heterogeneidade no potencial de enraizamento, por causa de fatores genéticos e de ambiente. Isso obriga o viveirista a utilizar uma elevada quantidade de propágulos para geração de poucas mudas. Já a utilização de semente, é contra-indicada, pela perda de identidade genética e pelo longo período de juvenilidade. Uma opção que vem sendo considerada por pesquisadores é a utilização de tecidos e órgãos provenientes de genótipos elite de oliveira, para obtenção em larga escala de clones, preservando, assim, as características agronômicas desejáveis e gerando grandes quantidades de mudas. Dentre as técnicas biotecnológicas aplicáveis para a propagação clonal da oliveira, destaca-se a embriogênese somática. Essa abordagem consiste basicamente na indução da organização de células somáticas em estruturas bipolares sem conexão vascular com o tecido de origem, geralmente uma massa de calos sem diferenciação.

23 Cultivo in vitro da oliveira e suas aplicações 297 A embriogênese somática ocorre ordenadamente em fases, esquematizado na Figura 4, sem que ocorra a fusão de gametas, mas produzindo embriões a partir do tecido somático (WILLIAMS; MAHESWARAN, 1986). Conceitualmente, a indução e a expressão são as duas principais fases da embriogênese somática. As células somáticas, quando induzidas por estímulos ambientais ou químicos, podem adquirir o que se caracteriza de competência morfogenética. Posteriormente, após mudanças estruturais pelas condições de cultivo, balanço dos reguladores de crescimento, potencial osmótico, dentre outros aspectos intrínsecos do cultivo in vitro, os tecidos ou células induzidas adquirem competência para se diferenciarem em embriões somáticos durante a fase conhecida como de expressão. Em oliveira, o uso da técnica da embriogênese somática é considerada de grande relevância, pois já é objeto de estudo em muitos grupos de pesquisa, tais como Rugini (1988), Orinos e Mitrakos (1991) e Rugini e Caricato (1995), sendo utilizada como ferramenta auxiliar em estudos desenvolvidos em outras áreas, tais como a fisiologia e a genética vegetal. Doadora de explantes Segmento foliar ou meristema apical Diferenciação do tecido em calos Regeneração de nova planta Desenvolvimento dos calos Multiplicação de plântulas in vitro produzidas a partir de embriões somáticos Desenvolvimento dos embriões somáticos Figura 4 - Esquema do processo de embriogênese somática in vitro da oliveira, utilizando como fonte inicial de tecido segmentos foliares

24 298 Cançado, G.M. de A. et al. Quanto ao uso da embriogênese somática para a regeneração in vitro da oliveira, Shibli et al. (2001) obtiveram resultados satisfatórios, após cuidadosamente estudarem a influência de vários fatores na formação dos embriões somáticos, tais como a fonte de explantes, a presença de agentes osmóticos na composição do meio e combinações e o balanço de reguladores de crescimento. Já Lopes et al. (2009) verificaram a integridade genética em duas espécies do gênero Olea, utilizando marcadores moleculares ao longo das etapas da embriogênese somática. Esses autores não detectaram a ocorrência de variação somaclonal, indicando que o processo pode ser seguro no que se refere à estabilidade genética. Já Pérez-Barranco et al. (2009) utilizaram calos embriogênicos de oliveira como material base para trabalhos de transformação genética nessa espécie. A equipe de pesquisadores do Laboratório de Biotecnologia Vegetal da EPAMIG Sul de Minas tem obtido resultados promissores com o estabelecimento in vitro de genótipos de oliveira, associando técnicas de cultivo de tecidos com biologia molecular para monitorar possíveis variações genéticas introduzidas durante a embriogênese somática. São utilizados marcadores moleculares do tipo simple sequence repeat (SSR), inter simple sequence repeat (ISSR) e random amplified polymorphic DNA (RAPD), para monitorar o perfil de polimorfismo no DNA dos genótipos de oliveira testados. Os resultados obtidos até o momento indicam que os propágulos de oliveira (segmentos nodais, embriões zigóticos, cotilédones, etc.) utilizados como fonte de explante, apresentam elevada competência para a proliferação de brotos (Fig. 5). Alternativamente, propágulos de oliveira já estabelecidos e subcultivados in vitro, oriundos de segmentos nodais (Fig. 6), podem ser utilizados como excelente fonte de tecido para a embriogênese somática e posterior multiplicação clonal. A Figura 5 ilustra plântulas de oliveira cultivadas in vitro com intensa calogênese e embriogênese somática, indicando uma elevada competência do tecido da oliveira para a formação de estruturas vegetativas. Além disso, essa abordagem tem grande valor para estudos fisiológicos, genéticos e bioquímicos em acessos de oliveira provenientes de Bancos de Germoplasma. Dessa forma, estudos com o objetivo de identificar genótipos de oliveira mais responsivos para a regeneração e multiplicação in vitro assumem importância estratégica para a produção de material propagativo em quantidade e qualidade suficientes.

25 Cultivo in vitro da oliveira e suas aplicações 299 A B C Figura 5 - Estabelecimento in vitro de genótipos de oliveira NOTA: A - Segmentos nodais de oliveira cultivados in vitro; B - Desenvolvimento de novas brotações em segmentos nodais; C - Formação de calos com competência regenerativa na base das plântulas de oliveira estabelecidas in vitro; D - Detalhe do início da formação de estruturas embrionárias a partir da massa de calo de oliveira. EPAMIG Sul de Minas - Fazenda Experimental de Caldas - Laboratório de Biotecnologia Vegetal, As aplicações da embriogênese somática são vantajosas, especialmente no que diz respeito ao seu grande potencial para geração de propágulos de elevada qualidade, em grande número e com baixo custo, o que possibilita a multiplicação rápida de variedades, além de ser uma excelente alternativa para conservação e manutenção de germoplasmas. A expectativa é que a embriogênse somática assuma em curto espaço status de técnica de fácil adoção e aplicação rotineira para a propagação da oliveira. Apesar das vantagens envolvidas com a embriogênese somática, esta apresenta algumas limitações, tais como a fusão de embriões ou o D

26 300 Cançado, G.M. de A. et al. Figura 6 - Processo de preparação dos explantes (segmentos nodais) de oliveira em capela de fluxo laminar antes da inoculação in vitro NOTA: EPAMIG Sul de Minas - Fazenda Experimental de Caldas - Laboratório de Biotecnologia Vegetal 2010.

27 Cultivo in vitro da oliveira e suas aplicações 301 aparecimento de anomalias morfológicas que se originam durante as divisões celulares, formação de quimeras genéticas, além da variação somaclonal. Contudo, a frequência com que essas anomalias ocorrem pode ser monitorada e controlada facilmente em laboratórios que possuem expertise na área de biologia molecular aplicada à avaliação genética. Transformação genética da oliveira O melhoramento genético clássico de plantas foi durante muito tempo a única alternativa para o desenvolvimento de variedades com características agronômicas de interesse, tais como maior produtividade, melhor valor nutricional, resistência a doenças e pragas e tolerância a estresses abióticos. No entanto, os métodos de melhoramento clássico apresentam como limitações a redução da variabilidade genética das populações melhoradas, a dificuldade para a seleção de características poligênicas, a incompatibilidade sexual entre progenitores e a interferência de efeitos ambientais de difícil controle e mensuração. Além disso, os programas de melhoramento demandam tempo e necessitam de grandes áreas para ser executados, o que encarece o processo de geração de novas variedades, principalmente de espécies perenes como a oliveira. O desenvolvimento de métodos de transformação genética gerou possibilidades inimagináveis de avanços no melhoramento vegetal, pois oferece a oportunidade de introduzir genes de interesse provenientes de outros vegetais, animais e até mesmo de microrganismos, diretamente dentro do genoma de cultivares elite (PERANI et al., 1986). Essa possibilidade permite ao melhorista de plantas eliminar as barreiras interespecíficas que impedem a troca de material genético entre espécies distintas, intransponíveis para os métodos convencionais de melhoramento genético. Além disso, a transgenia elimina o efeito indesejável provocado pelo arraste genético, fenômeno em que genes de interesse permanecem ligados a genes indesejáveis, provenientes de genótipos selvagens e rústicos. Dessa forma, a transgenia evita a necessidade de retrocruzamentos com o genótipo recorrente para eliminar os genes indesejáveis. Consequentemente, com a transformação genética de genótipos de interesse, é possível reduzir significativamente o tempo necessário para a obtenção de uma nova variedade.

28 302 Cançado, G.M. de A. et al. Conceitualmente, a transformação genética é a introgressão controlada e estável de genes selecionados, diretamente no genoma de um organismoalvo por via não sexual (TORRES et al., 2000). Podem ser definidas como plantas transgênicas aquelas que apresentam um ou vários genes não pertencentes ao conjunto de genes do genoma original, obtidos por técnicas de engenharia genética (GANDER; MARCELLINO, 1997; TORRES et al., 2000). Plantas transgênicas podem ser utilizadas como modelos para estudos sobre o metabolismo, bioquímica, morfologia, resposta a doenças e pragas, regulação e expressão de genes, entre tantas outras possibilidades (Fig. 7). No entanto, é na agricultura que suas aplicações têm promovido uma grande revolução. A adoção de plantas transgênicas em lavouras comerciais cresce a cada safra e para muitas culturas, como soja, algodão e milho, seu uso já tem superado o plantio das variedades similares não transgênicas. No Brasil, país onde o cultivo comercial de transgênicos vem sendo liberado gradativamente pela Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio), as oportunidades associadas à adoção dessa tecnologia são inúmeras. O cultivo in vitro de tecidos vegetais é considerado um requisito essencial para a transformação genética da maioria das espécies de plantas, uma vez que, nessa condição, é possível regenerar plantas completas a partir de uma única célula geneticamente alterada pela introgressão estável do gene exógeno (PASQUALI; ZANETTINI, 2007; SARTORETTO; SALDANHA; CORDER, 2008). No entanto, a inexistência de técnicas eficientes para a transformação genética em oliveira tem sido uma limitação para adoção mais ampla dessa tecnologia nessa espécie, principalmente diante da natureza recalcitrante da oliveira para a regeneração in vitro. A cultivar Picual, considerada como a mais popular para produção de azeitonas na Espanha, tem sido um dos principais alvos para estudos na área de transformação genética. Um avanço na abordagem de seu melhoramento genético, por meio dos métodos biotecnológicos, foi recentemente relatado por Pérez-Barranco et al. (2007). Esses autores desenvolveram um sistema mais eficiente para regeneração de material juvenil, via embriogênese somática, utilizando segmentos radiculares de embriões zigóticos maduros como explantes. Esse é o primeiro passo em direção a um protocolo eficiente para geração de transgênicos na cultivar Picual.

29 Cultivo in vitro da oliveira e suas aplicações 303 A Figura 7 - Algumas das aplicações da biotecnologia no melhoramento genético e estudo fisiológico da oliveira NOTA: A - Seleção de genótipos de oliveira tolerantes ao alumínio tóxico em solução nutritiva; B - Caracterização genética de genótipos de oliveira por marcadores moleculares de DNA. EPAMIG Sul de Minas - Fazenda Experimental de Caldas - Laboratório de Biotecnologia Vegetal, B