Comunicado 186 Técnico

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1 Comunicado 186 Técnico ISSN Dezembro, 2008 Brasília, DF Identificação de ESTs Tecido-specíficas no Banco de Dados do Genoma funcional de Coffea spp. Santos, D. B. M.; Barros, L. M. G.; De Almeida, J. D.; Andrade A. C.; Carneiro, M.; da Silva, F. R. O Brasil é o maior produtor e exportador mundial de café, entretanto a cafeicultura apresenta uma série de problemas que podem limitar a produção nacional cuja solução requer o desenvolvimento de cultivares mais adaptados a estresses bióticos e abióticos. A transgenia é uma ferramenta bastante útil na aceleração da obtenção de cultivares elite de cafeeiro, no entanto a expressão indiscriminada do transgene em todos os tecidos e durante todas as fases do desenvolvimento da planta além de gerar desgaste metabólico desnecessário para as plantas levanta preocupações com Biossegurança. Além disso, os promotores em uso na Embrapa são de propriedade de transnacionais, onerando a pesquisa e causando dependência tecnológica. Essas questões podem ser resolvidas mediante a utilização de promotores tecido-específicos ou induzíveis. O objetivo desse trabalho foi identificar, no banco UniGene do Projeto Brasileiro do Genoma Café, ESTs abundantes e inéditas preferencialmente expressas em raiz, folha, flor ou fruto. Northern Eletrônico das bibliotecas do Projeto Brasileiro Genoma Café apontaram 103 UniGenes preferencialmente expressos, sendo 18 de folhas, 40 de frutos, 14 de raiz e 31 de botões florais. Experimentos de expressão gênica estão sendo realizados para avaliar a tecidoespecificidade dos UniGenes selecionados. As seqüências validadas serão utilizadas para o isolamento do seu próprio promotor. Introdução O Brasil é o maior produtor e exportador mundial de café, respondendo por cerca de um quarto da produção mundial. Contudo, a cafeicultura apresenta uma série de problemas que podem limitar a produção nacional cuja solução requer o desenvolvimento de cultivares mais adaptados a estresses bióticos e abióticos. A obtenção de novos cultivares por métodos clássicos de melhoramento é dificultada por aspectos intrínsecos como: a perenidade, a baixa variabilidade no gênero Coffea e a diferença de ploidia entre as espécies (OGITA et al., 2002). Nesse caso, a transgenia que é uma técnica que permite incorporar características Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF

2 desejáveis em uma espécie através da inserção de genes de interesse, apresentase como ferramenta bastante útil na aceleração da obtenção de cultivares elite de cafeeiro. Existem críticas e discussões em torno da expressão indiscriminada do transgene em todos os tecidos e durante todas as fases do desenvolvimento da planta. Essa questão pode ser resolvida mediante a utilização de promotores tecidoespecíficos e induzíveis que promovem expressão do transgene somente em seu tecido-alvo ou sob algum stress. Nesse caso, a expressão do transgene passa a ocorrer somente onde e quando é necessária, limitando as precauções com biossegurança, reduzindo custos de testes de segurança biológica e ambiental e o gasto energético do vegetal. Além disso, os promotores em uso na Embrapa são de propriedade de transnacionais, onerando a pesquisa e causando dependência tecnológica. O projeto Brasileiro Genoma Café (VIEIRA et al., 2006) foi elaborado e executado na tentativa de auxiliar os pesquisadores na obtenção de variedades mais adequadas ao cenário atual como, por exemplo, tolerantes a estresses bióticos e abióticos ou que produzam grãos de melhor qualidade. Nesse projeto foram seqüenciados clones de ESTs (Expressed Sequenced Tags) escolhidos aleatoriamente de 49 bibliotecas de cdna de C. arabica, C. canephora e C. racemosa, representando estágios específicos de desenvolvimento de tecidos e tecidos submetidos a estresse biótico e abiótico. Após a remoção de contaminações e seqüências de baixa qualidade, as ESTs restantes foram agrupadas em clusters (UniGenes), dos quais são formados por uma única seqüência (SALES et al., 2005). Cerca de 27% dos UniGenes não apresentam similaridade significativa (blastx com e- value melhor que 10-4 ) com seqüências protéicas já descritas. Os contrastes entre as bibliotecas dos diferentes órgãos apontaram 103 UniGenes com expressão preferencial em raiz, folha, flor ou fruto, sendo 16% das seqüências inéditas. De posse de um determinado UniGene, é possível identificar e isolar seu promotor. Assim, promotores tecido-específicos inéditos poderão ser isolados, caracterizados e potencialmente utilizados para agregação de valor nas mais diversas culturas e no caso específico do café visando resistência a patógenos, tolerância à seca, uniformidade de maturação e qualidade dos frutos. Objetivo Identificar no banco UniGene do cafeeiro, ESTs abundantes e inéditas preferencialmente expressas em raiz, folha, flor ou fruto, que no futuro serão utilizadas na prospecção de seus respectivos promotores. Material e Métodos Foram realizados Testes Exatos de Fisher, in silico (SALES e SILVA, 2005), contrastando bibliotecas de ESTs de um único tecido contra bibliotecas dos demais tecidos. Primeiramente, foram agrupadas as bibliotecas a serem contrastadas para então serem selecionados para o Teste Exato de Fisher. O primeiro grupo de ESTs de um único tecido a ser criado foi de raiz no qual foram escolhidos todas as bibliotecas de raiz excetos as bibliotecas de tecidos indiferenciados. O mesmo foi feito para as bibliotecas de folha, flor e fruto. Cada um desses grupos foi contrastado com um grupo formado por todas as bibliotecas dos demais tecidos. Além do Teste Exato de Fisher, o mesmo programa

3 submete os Unigenes ao programa Blast para identificar se há ou não genes homólogos previamente descritos. UniGenes constitutivos também foram selecionados para servir de controle positivo aos experimentos. Resultados e Discussão O banco de dados do Genoma Funcional de Coffea spp disponível no site: T/ apresenta uma ferramenta a qual permite o contraste de bibliotecas de diferentes órgãos contra todas as bibliotecas do banco (Northern Eletrônico) utilizando o Teste Exato de Fish (figura 1A). Os dados gerados apresentam também o resultado do Blast de cada UniGene indicando quais são homólogos à seqüências já conhecidas e quais são inéditos (Figura 1B). Para tal, as bibliotecas de um mesmo tecido foram agrupadas e realizado um ensaio no qual esse grupo foi contrastado com outro contendo as bibliotecas de todos os demais tecidos, exceto bibliotecas de tecidos indiferenciados. Os ensaios resultaram na indicação de UniGenes que apresentam expressão preferencial ou exclusiva em cada um dos tecidos. Os contrastes entre as bibliotecas dos diferentes órgãos apontaram 103 UniGenes preferencialmente expressos, sendo 18 de folhas, 40 de frutos, 14 de raiz e 31 de botões florais (Tabela 1). A comparação destas seqüências com seqüências protéicas já descritas, utilizando-se Blastx, mostrou que 84% dos clusters apresentam similaridade a seqüências conhecidas e 16% são inéditos. Todos os UniGenes selecionados foram escolhidos levando em consideração o fato de serem formados apenas por bibliotecas do tecido em questão, de suas seqüências serem inéditas e de apresentarem uma boa expressão relativa em relação ao total de reads das bibliotecas que o compunham. O Unigene constitutivo escolhido foi aquele formado pelo maior número possível de bibliotecas de todos os tecidos. A próxima etapa será validar os UniGenes selecionados mediante ensaios de Northen blot e RT-qPCR. Uma vez validada a tecidoespecificidade do Unigene, o passo subseqüentemente será isolar seu promotor. Conclusão No Banco de Dados do Genoma Funcional de Coffea spp foram detectados 18 genes preferencialmente expressos em folha, 40 em frutos, 14 em raiz e 31 em botões florais. Desses, 84% apresentam similaridade a seqüências conhecidas e 16% são inéditos. Referências OGITA, S.; UEFUJI, H.; CHOI, Y-E.; HATANAKA, T.; OGAWA, M.; YAMAGUCHI, Y.; KOIZUMI, N.; SANO, H. Genetic Modification of coffee plants. Journal of Plant Biotechnology, v. 4, n.3, p , SALES, R. M. O.B.; ANDRADE, A. C.; SILVA, F. R. da. Determinação do unigene do projeto genoma café. In: SIMPÓSIO DE PESQUISA DOS CAFÉS DO BRASIL, 4., 2005, Londrina. Anais... Londrina: IAPAR; Brasília, DF: Embrapa Café, CD ROM. SALES, R. M. O. B.; SILVA, F. R. Desenvolvimento de ferramenta web para análise de dados de projetos genoma do tipo EST. In: ENCONTRO DO TALENTO ESTUDANTIL DA EMBRAPA RECURSOS GENÉTICOS E BIOTECNOLOGIA, 10., 2005, Brasília, DF. Anais: resumos dos trabalhos. Brasília, DF: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, p. 61.

4 VIEIRA, L. G. E. et al. Brazilian coffee genome project: an EST-based genomic resource. Brazilian Journal of Plant Physiology, v. 18, n. 1, p , Figura 1 Resultado do Northern eletrônico proporcionados pelo Teste Exato de Fisher o qual apresenta a expressão relativa de uma seqüência em relação ao total de Reads da Biblioteca (A) e o resultado do Blast (B).

5 Tabela 1 - Relação das bibliotecas que participam dos grupos contrastados, as comparações realizadas e seus respectivos resultados. Nome dos Grupos Bibliotecas Raiz RT4 Raiz FB3 FB4 Raiz X Raiz Folha Folha BP1 BP2 CA1 CB1 CD1 CL1 CL2 CM1 CS1 EA1 EC1 FB3 FB 4 FP2 LM3 LP1 PA1 RT7 RT8 SH2 SI3 Folha X Folha Flor FB4 Flor BP1 BP2 CA1 CB1 CD1 CL1 CL2 CM1 CS1 EA1 EC1 FP2 LM3 LP1 PA1 RT7 RT8 SH2 SI3 Flor X Flor Fruto Fruto BP1 BP2 CA1 CB1 CD1 CL1 CL2 CM1 CS1 EA1 EC1 FB3 FB4 FP2 LM3 LP1 PA1 RT7 RT8 SH2 SI3 Fruto X Fruto Clusters Total Clus ters Selecionados Clusters Inéditos : Folhas com tratamento de ac. Araquidonico; BP1: Bion positive- plantulas inteiras + células; BP2: Sem Nome; CA1: Calo; CB1: Células em suspensão com Bion e brassinosteroides; CD1: Sem Nome; CL1: Sem Nome; CL2: Calo com e sem bion curta; CM1: Sem Nome; CS1: Células em suspensão com sais; EA1: Calos embriogênicos (C. arabica); EC1: Calos embriogenicos (C. canephora); : Botão floral estágios 1 e 2 longa; : Botão floral 1 e 2 curta; FB3: Sem Nome; FB4: Botão floral estágios 3 e 4 curta; FP2: Sem Nome; : Botão floral no 6, Chumbinho no 1, frutos estágios 1 e 2 curta; : Fruto de Racemosa; FV1: Fruto verde - estagio 1,2 e 3 (C. racemosa) curta; : Fruto verde estágio 1,2 e 3 (C.racemosa)- longa; : Linhagem embriogênica (folha C. arabica) com indução de 2,4 D; : Linhagem não embriogênica (folha C. arabica) sem indução de 2,4 D; LM3: Sem Nome; LP1: Plântulas com tratamento de ac. Araquidonico; : Folhas de ponteiro ortotropicas sem bion longa; : Folhas de ponteiro ortotropicas sem bion curta; : Folhas plagiotropicas de plantas adultas sem bion longa; : Folhas plagiotropicas de plantas adultas sem bion curta; PA1: Linhagem embriogênica

6 (calos primários C. arabica); : Linhagem não embriogênica (folha C. arabica) com indução de 2,4 D; PL1: Sem Nome; : Folhas com ferrugem e bicho mineiro; : Raiz sem bion longa; : Raiz sem bion curta; RT7: Sem Nome; RT8: Raiz e células em suspensão na presença de alumínio curta; : Ramos infectados com Xylella; SH2: Estresse hídrico no campo (Pool de tecidos); : Folhas de C. canephora tolerante (seca) - regime de estresse hídrico; SI3: Sementes Germinando (Inteira). Comunicado Técnico, 186 Ministério da Agricultura, Pecuária Abastecimento e Exemplares desta edição podem ser adquiridos na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Serviço de Atendimento ao Cidadão Parque Estação Biológica, Av. W/5 Norte (Final) Brasília, DF CEP Caixa Postal PABX: (61) Fax: (61) e.mail:sac@cenargen.embrapa.br 1ª edição 1ª impressão (2008): Comitê de Publicações Presidente: Miguel Borges Secretária-Executiva: Maria da Graça Simões Pires Negrão Membros:Diva Maria de Alencar Dusi Luiz Adriano Maia Cordeiro José Roberto de Alencar Moreira Regina Maria Dechechi G. Carneiro Samuel Rezende Paiva Suplentes:João Batista Tavares da Silva Margot Alves Nunes Dode Supervisor editorial: Maria da Graça Simões Pires Negrão Normalização Bibliográfica: Rosamares Rocha Galvão Editoração eletrônica: Maria da Graça Simões Pires Negrão