AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DO PROCESSO CICATRICIAL DE LESÕES INDUZIDAS EM PELE DE RATOS TRATADOS POR 14 DIAS, COM

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1 UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO COORDENAÇÃO DE PÓS-GRADUAÇÃO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO LATO SENSU EM CLÍNICA CIRÚRGICA EM PEQUENOS ANIMAIS AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DO PROCESSO CICATRICIAL DE LESÕES INDUZIDAS EM PELE DE RATOS TRATADOS POR 14 DIAS, COM COBERTURA NATURAL PROVENIENTES DE PELE DE RANA CATESBEIANA Marcus Paulo Ferreira da Silva Campo Grande-MS, nov

2 MARCUS PAULO FERREIRA DA SILVA Aluno do Curso de Especialização Lato Sensu em Clínica Cirúrgica em Pequenos Animais AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DO PROCESSO CICATRICIAL DE LESÕES INDUZIDAS EM PELE DE RATOS TRATADOS POR 14 DIAS, COM COBERTURA NATURAL PROVENIENTES DE PELE DE RANA CATESBEIANA Trabalho monográfico de conclusão do curso de pósgraduação Lato Sensu em Clínica Cirúrgica em Pequenos Animais apresentado à UCB como requisito parcial para a obtenção de título de Especialista em Clínica Cirúrgica em Pequenos Animais, sob a orientação do Prof. Gilberto G. Facco. Campo Grande-MS, nov i

3 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DO PROCESSO CICATRICIAL DE LESÕES INDUZIDAS EM PELE DE RATOS TRATADOS POR 14 DIAS, COM COBERTURA NATURAL PROVENIENTES DE PELE DE RANA CATESBEIANA Elaborado por Marcus Paulo F. da Silva Aluno do Curso de Clinica Medica e Cirúrgica de Pequenos Animais. Foi analisado e aprovado com grau: Campo Grande, de de. Membro Membro Professor Gilberto G. Facco Campo Grande, nov ii

4 Dedico este trabalho aos meusfamiliares, principalmente minha noiva e minha mãe, que apesar das dificuldades, estiveram sempre ao meu lado na execução deste trabalho. iii

5 Agradecimentos Ao meu orientador, Prof. Gilberto G. Facco que forneceu orientações seguras, guiando meu caminho. À minha família que me incentivou a fazer este estudo. Aos meus professores e colegas, pela caminhada solidária. iv

6 RESUMO O presente trabalho tem como objetivo analisar por método histopatológico o processo de reparação tecidual em lesões induzidas em cobaias de laboratório, com pele de Rana catesbeiana tratado com raios-gama. Foram utilizados 15 ratos da linhagem Wistar, de sexo masculino, pesando aproximadamente 250 gramas, com procedência do biotério da Universidade para o Desenvolvimento do estado e da Região do Pantanal (UNIDERP). Como protocolo anestésico, foi utilizado uma associação de cloridrato de tiletamina 125,00 mg e cloridrato de zolazepan 125,00 mg, ambas substâncias contidas em um anestésico dissociativo Zoletil 50, administrado por via intraperitonial. Em seguida, realizado tricotomia da região a ser lesada, e logo após em região longitudinal, executava a incisão com largura de 1,0 cm e comprimento de 2,0 cm, se dividia os ratos por grupos de tratamento, sendo grupo controle, grupo pele tratado com raios-gama e pele não tratado. Após 14 dias foram realizadas biópsias das feridas incluindo-se a transição entre a pele normal e a área cruenta. Como resultado, verificou-se não haver diferenças significativas entre os grupos, conclui-se não haver benefícios no uso de pele de rã, como curativo biológico, sobre a cicatrização de feridas de pele produzidas em ratos. Palavras chaves: cicatrização, xenoenxerto, histopatologia, Rana catesbeiana. v

7 ABSTRACT The present work has as objective to analyze for histopathologic method the process of tecidual repairing in induced injuries in laboratory guineapigs, with treated skin of Rana catesbeiana with ray-gamma. 15 rats of the Wistar ancestry had been used, of masculine sex, weighing approximately 250 grams, with origin of the bioterio of the University for the Development of the state and the Region of Pantanal (UNIDERP). As protocol anaesthetic, an association of cloridrato of tiletamina 125,00 was used mg and 125,00 cloridrato of zolazepan mg, both substances contained in a dissociative anaesthetic Zoletil 50, managed for it saw intraperitoneal. After that, carried through trichotomy of the region to be injured, e soon after in longitudinal region, it executed the incision with width of 1,0 cm and length of 2,0 cm, if it divided the rats for groups of treatment, being group it has controlled, group skin dealt with ray-gamma and skin not treated. After 14 days had been carried through biopsys of the wounds including itself the transistion between the normal skin and the cruenta area. As result, it was verified not to have significant differences between the groups, it is concluded not to have benefits in the use of frog skin, as biological dressing, on the scars of produced wounds of skin in rats. Word-keys: scar, enxerto, histopatology, Rana catesbeiana. vi

8 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Anestesiando o Animal...21 Figura 2: Tricotomia do Dorso...21 Figura 3: Animal com Demarcação...22 Figura 4: Animal Lesionado Pós-cirúrgico...22 Figura 5: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com solução salina sete dias exibindo áreas de necrose e inflamação. Aumento de 5x. Coloração H&E...27 Figura 6: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com solução salina sete dias exibindo áreas de necrose e inflamação. Aumento de 10x. Coloração H&E Figura 7: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com solução salina 14 dias exibindo áreas de necrose, hemorragia e inflamação. Aumento de 5x. Coloração H&E...28 Figura 8: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com solução salina 14 dias exibindo áreas de necrose, hemorragia e inflamação. Aumento de 10x. Coloração H&E...28 vii

9 Figura 9: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com membrana tratada sete dias exibindo áreas de necrose e inflamação. Aumento de 5x. Coloração HE...29 Figura 10: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com membrana tratada sete dias exibindo áreas de necrose, hemorragia e inflamação. Aumento de 10x. Coloração H&E...29 Figura 11: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com membrana tratada 14 dias exibindo áreas de crostas, necrose e inflamação. Aumento de 5x. Coloração H&E...30 Figura 12: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com membrana tratada 14 dias exibindo áreas de crostas, necrose e inflamação. Aumento de 10x. Coloração H&E...30 Figura 13: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com membrana não tratada sete dias exibindo áreas de crostas, necrose e inflamação. Aumento de 5x. Coloração H&E...31 Figura 14: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com membrana não tratada sete dias exibindo áreas de crostas, hemorragia, necrose e inflamação. Aumento de 10x. Coloração H&E...31 Figura 15: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com membrana não tratada 14 dias exibindo áreas de crostas, necrose e inflamação. Aumento de 5x. Coloração H&E...32 Figura 16: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com membrana não tratada 14 dias exibindo áreas de crostas, necrose e inflamação. Aumento de 10x. Coloração H&E...32 viii

10 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Percentual de fatores do processo cicatricial, no tratamento de 14 dias.... Tabela 2 Percentual de fatores do processo inflamatório, no tratamento de 14 dias.... ix

11 SUMÁRIO RESUMO...v ABSTRACT...vi LISTA DE FIGURAS...vii LISTA DE TABELAS...ix 1. INTRODUÇÃO Conceitos de Feridas Animais Acometidos por Feridas ou Úlceras Histórico da Cicatrização Custo da Cicatrização Processo Cicatricial Fatores que Influenciam a Cicatrização Localização Idade Nutrição Atraso na Cicatrização MATERIAIS E MÉTODOS...18 x

12 2.1.Grupos Experimentais Técnica Cirúrgica Tratamento com Cobertura de Pele de Rã Coleta de Material para Exame Histopatológico Realização de Lâminas para Análise Histopatológica Análise Histopatológica RESULTADOS E DISCUSSÕES Animais que Receberam Pele de Rã Não Tratada Animais que Receberam Pele de Rã Tratada com Raios-gama CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...34 xi

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14 1. INTRODUÇÃO Nos humanos, a pele é um dos maiores órgãos do corpo em termos de superfície e peso. Além disso, forma o revestimento externo do corpo que é a vital relevância de prevenir sua invasão por microorganismo, constituindo, desta forma uma barreira importantíssima da imunidade inata. Porém, agentes estranhos, muitos dos quais são patógenos, são passíveis a entrar no organismo animal quando ocorre uma lesão corpórea atingindo a epiderme, que dependendo da extensão, pode permanecer por longo período aberta, facilitando a penetração (BRASILEIRO FILHO et al., 2002). Por esse motivo, tem-se pesquisado materiais biológicos para serem utilizados como curativo oclusivo. Para tanto, procuram-se materiais com propriedades antibacteriana e analgésica, que acelerem a formação de tecido de granulação e epitelização, propiciem barreira à invasão bacteriana e possuam a capacidade de reter a umidade, características estas benéficas para uma adequada cicatrização (PREVEL et al., 1995; SAL et al.,1995). Os tecidos de origem biológica, obtidos a partir de animais da mesma espécie ou de espécie diferentes, comportam-se, do ponto de vista imunológico, respectivamente, como materiais alogênicos e xenogênicos, podendo induzir rejeição, constituindo assim fator que restringe a eficácia e o tempo de uso como curativo ou enxerto (FALCÃO, 2002). 1

15 Nosso organismo é freqüentemente lesado por agentes agressores. Traumatismos mais ou menos graves, desencadeados de diferentes maneiras, destroem zonas do corpo, que a partir desse momento necessitam de reparação. A pele, sendo a região mais periférica e superficial, é a mais freqüentemente lesada. Como envoltório de estruturas internamente situadas, apresenta uma resistência maior que os órgãos envolvidos (BRASILEIRO FILHO et al., 2002). 1.1.Conceitos de Feridas Qualquer lesão que leva a solução de continuidade de pele pode ser chamada de ferida. Existem quatro tipos de feridas: traumática, sendo mecânica: química ou física; intencional por cirurgia; por isquemia, por exemplo, uma ulcera de decúbito (DEALEY, 2001). Dealey (2001), diz que no ferimento traumático e no intencional, há ruptura dos vasos sanguineos, resultando em sangramento seguido de formação de coágulos. Já nas feridas causadas por isquemia e pressão, o fornecimento de sangue é interrompido pela oclusão local da microcirculação, assim seguindo a necrose do tecido, resultando em formação da ulcera, possivelmente com escaras ou crostas necróticas. 2

16 1.2. Animais Acometidos por Feridas ou Ulceras São aqueles vítimas dos mais diversos tipos de acidentes, pacientes de póscirúrgicos, pacientes vítimas de patologias arteriais e venosas, ou seja, exposição à solução de continuidade da pele (BIRCHARD, 1998) Histórico da Cicatrização Desde a antiguidade o homem utiliza plantas em ferimentos superficiais com o objetivo de alterar o processo de reparação tecidual. Em nosso meio, muitas plantas são utilizadas para auxiliar a cicatrização e, na maioria das vezes, sem nenhum conhecimento dos princípios ativos e sem estudo adequado do mecanismo de ação e toxidade das mesmas (BRITO et al., 1999). A manipulação das lesões, objetivando melhores efeitos cicatriciais, desafiou os cirurgiões cujos estilos se modificaram ao longo dos séculos (GRABB, 1992) Custo da Cicatrização As pessoas vítimas de feridas e úlceras crônicas sofrem muito com a enfermidade, pois, alem de perder a mobilidade física que pode levar em conseqüência, à perda do vinculo empregatício, ela também sofre ao conviver com a lesão cotidiana. Assim, a ferida torna-se integrante e importante da sua vida, comprometendo, inclusive, a 3

17 qualidade de vida. Também se deve considerar que, ao receber a alta hospitalar, a internação já pode Ter se prolongado em decorrência da ferida. Tudo isto, causa perdas econômicas ao individuo, que pode perder a capacidade produtiva em temporária ou definitiva, e à sociedade que cobre os gastos com o sistema de saúde, que paga o auxilio doença, alem de perder com a diminuição de bens produzidos e dos impostos que podem deixar de serem pagos (DEALEY, 2001) Processo Cicatricial Cada vez que ocorre lesão tecidual no organismo, não importando qual o agente causal, a perda é reparada por um conjunto de fenômenos que leva, invariavelmente, a tentativa de reparação, o processo cicatricial. A cicatrização é um evento biológico complexo, envolvendo inflamação, quimiotaxia, proliferação celular, diferenciação e remodelação (MELLEGA, 1992). Se a ferida constitui a solução de continuidade, a cicatriz corresponde à tentativa biológica a que o organismo recorre para restaurar sua integridade, quer do ponto de vista funcional, quer do estético ( KOOPMANN, 1993). A finalidade da cicatrização é, em primeiro lugar, a remoção das partes necrosadas, sendo reabsorvidas pelas células fagocíticas; em segundo lugar uma crescente proliferação de um tecido germinativo vascularizado penetra pelas fendas da ferida e limpa-as em uma ação conjunta com o tecido de granulação que acompanha tal crescimento proliferativo. Quando termina a reabsorção dos tecidos necrosados, o tecido 4

18 de granulação jovem regressa para tecido cicatricial, ao mesmo tempo em que começa a epitelização a partir dos bordos (GONÇALVES & PARIZOTO, 1998). Segundo Cotran et al., (2000), os eventos de cicatrização ocorre na ordem descrita a seguir: A 24 horas neutrófilos na direção do coagulo de fibrina; atividade mitótica de células basais espessamento da epiderme; B 48 horas migração de componentes de células epiteliais ao longo das margens coradas da derme; deposição de componentes da membrana basal á medida que se deslocam; estas se fundem abaixo da superfície da crosta, produzindo camada epitelial fina e continua; C 72 horas substituição de neutrófilos macrófagos; Invasão por tecido de granulação; surgimento de colágeno, sem pontes; proliferação de células endoteliais espessa epiderme; 5

19 D 96 horas substituição de neutrófilos macrófagos; invasão por tecido de granulação; surgimento de colágeno; proliferação de células endoteliais espessa epiderme; E horas espaço preenchido por tecido de granulação; neovascularização atinge um pico; colágeno mais abundante começa a constituir pontes; epiderme com espessura normal diferenciação de células de superfície arquitetura epidérmica madura com queratinização superficial; F 2 a semana acúmulo de colágeno e proliferação de fibroblastos; desaparecimento quase total de derme, infiltrado leucocitário e aumento da permeabilidade; inicio do empalidecimento da cicatriz, devido ao acumulo do colágeno na cicatriz e involução dos canais vasculares; G final do 1º mês cicatriz é um tecido celular isento de infiltrado inflamatório, recoberto por epiderme integra; 6

20 força de estiramento aumenta, mas apenas em meses chegara em nível máximo. A cicatrização é composta pelas fases: coagulativa; inflamatória; fibroplasia ou proliferativa; maturativa ou remodelação. A fase coagulativa tem inicio imediato ao surgimento da ferida, é dependente de atividade plaquetária e da cascata de coagulação. Ocorre uma complexa liberação de produtos como substancias vasoativas, proteínas adesivas, fatores de crescimento e protease. A formação de coagulo serve não apenas para coaptar as bordas das feridas, mas também para cruzar a fibronectina, oferecendo uma matriz provisória em que os fibroblastos, células endoteliais e queratinócitos possam ingressar na ferida, (MANDEBAUM; DI SANTIS; MANDELBAUM, 2003). A fase inflamatória depende, alem de inúmeros mediadores químicos das células inflamatórias, como os leucócitos polimorfonucleares (PMN), macrófagos e linfócitos, (MANDELBAUM; DI SANTIS; MANDELBAUM, 2003). Os PMN chegam no momento da injuria tissular e ficam por período que variam de 3 a 5 dias sendo eles os responsáveis pela fagocitose das bactérias no inicio da reação inflamatória. O macrófago é a célula inflamatória mais importante dessa fase, que por sua vez permanece do terceiro ao decimo dia, realizando a fagocitose das bactérias, corpos estranhos e direcionando o desenvolvimento de tecido de granulação (MANDELBAUM; DI SANTIS; MANDELBAUM, 2003). Além das células inflamatórias e dos mediadores químicos, a fase inflamatória conta com o importante papel da fibronectina sintetizada por uma variedade de células como fibroblastos, queratinócitos e células endoteliais, tendo por função realizar 7

21 a aderência da fibrina ao colágeno, funcionando assim como um aderente para consolidar o coagulo de fibrina, as células e os componentes da matriz, (MANDELBAUM; DI SANTIS; MANDELBAUM, 2003). Dois grupos de células são importantes na fase inflamatória; uma delas são os neutrófilos que infiltram o local em grande numero nas primeiras horas após a lesão predominam no primeiro e segundo dia e desaparecem apos 72 horas. Suas funções primárias são: a fagocitose (desbridamento inicial), liberam seus grânulos para a rede de fibrina, provocando hidrolise enzimática da matriz extracelular, digerem os tecidos desvitalizados e as bactérias, de modo a promover limpeza da área lesada e possibilitar o inicio da fase seguinte. Assim quando os leucócitos fagocitam bactérias ou substancias estranhas formam piócitos (COTRAN et al., 2000). Porém, se os leucócitos conseguirem em 6 horas limpar a ferida, não produzirão os piócitos, que são prejudiciais ao processo de cicatrização. Os neutrófilos não parecem indispensáveis para a cicatrização, uma vez que sua depleção, não a afeta (KOOPMANN, 1993). As outras células são os monócitos que por sua vez são as segundas células a aparecer no local da lesão; marginalizam-se nos capilares e vênulas, migram através do endotélio e uma vez no local amadurem e transformam-se em macrófagos. Estes são fundamentais para o processo de cicatrização e sua depleção diminui a resposta reparadora (KOOPMANN, 1993). Estas células predominam entre o terceiro e o quinto dia após a lesão. Tem papel primordial na transição entre a fase inflamatória e a segunda fase. Auxiliam os neutrófilos na fagocitose de bactéria e restos celulares, também produzem e liberam fatores (monocinas) que controlam a formação do tecido de granulação; influenciam na angiogênese; estimulam a proliferação de células mesenquimais e proliferação de fibroblastos; produzem proteales que digerem a fibrina e o colágeno 8

22 desvitalizado e remove os neutrófilos, dando lugar a proliferação celular (KOOPMANN, 1993). Na fase de fibroplasia ou proliferativa, ocorre à reparação do tecido conectivo e do epitélio. Na reparação do tecido conectivo ocorre a formação do chamado tecido de granulação e sua principal característica é a presença do fibroblasto por volta do segundo ou terceiro dia após o trauma. Produzem matriz extracelular, colágeno e glicasaminoglicanos, participando na remodelação do tecido normal e no processo de reparação e também estão relacionados com o mecanismo de reabsorção do colágeno. Os fibroblastos, após ingressarem na ferida, podem assumir três fenótipos: migratório, produtor de colágeno e contrátil (miofibroblasto). O crescimento do fibroblasto é estimulado por baixa oxigenação e altos níveis de lacto. Eles movem-se na ferida ao longo da matriz extracelular. Um dos primeiros eventos da cicatrização é a produção de fibronectinas, que são glicoproteinas. São também essenciais para a cicatrização, aparecem precocemente no local da lesão, aderem simultaneamente à fibrina, colágeno, glicosaminoglicanos e outra molécula de fibronectina, formando uma matriz que serve para adesão e migração celulares, sendo essencial para o deposito de colágeno. Facilitam o crescimento de fibroblastos; são opsoninas para microorganismos e restos teciduais e são quimiotáticas para células inflamatórias, endoteliais, epidérmicas e fibroblastos. A fibroplasia ocorre de forma alternada sendo fundamental. Assim, o fibrinogênio presente no exsudato inflamatório converte-se em fibrina, que forma uma rede que em cujas malhas depositam-se os fibroblastos; porém a fibrina, quando em excesso, impede a migração dos fibroblastos. Como a fibroplasia é sempre acompanhada de proliferação vascular, nesta situação, as células endoteliais produzem um fator ativante do plasminogênio que reduz a 9

23 quantidade de fibrina, permitindo assim, a deposição de fibroblastos, que se multiplicam e passam a secretar os componentes protéicos do tecido cicatricial (KOOPMANN, 1993). Assim, já mencionado concomitantemente a fibroplasia há a intensa proliferação vascular, graças à modulação dos macrófagos que se interam com tromboxanos e prostaglandinas, produzindo o fator angiogênico (KOOPMANN, 1993). A neoformação vascular é necessária para oxigenação e nutrição da ferida. A natureza do estimulo para a angiogênese seria a hipóxia e a diminuição do ph no centro da lesão. Ocorre a formação de novos vasos, aumento do fluxo sanguíneo e da oxigenação tecidual, cessando a produção do fator angiogênico pelos macrófagos. Desta maneira, formam-se brotos endoteliais cujas células se multiplicam em grande velocidade, constituindo cordões sólidos que se intermeia com os fibroblastos e seus produtos. Seqüencialmente, os cordões endoteliais canalizam-se, permitindo o fluxo sanguíneo. Forma-se, desta maneira, um substrato tecidual, cujo aspeto macroscópico peculiar, granuloso e avermelhado é chamado de tecido de granulação (KOOPMANN,1993). No tecido de granulação diferencia-se uma célula que possui características ultra-estruturais dos fibroblastos e da célula muscular lisa, denominada miofibroblasto. Ela confere capacidade contrátil ao tecido de granulação, reduzindo a área cruenta da ferida nos processos de cicatrização por segunda intenção, facilitando a epitelização. São fibroblastos que contém em seu interior microfilamentos de actina e miosina. Estão envolvidos na contração da ferida, na adesão celular e podem participar na reabsorção da matriz extracelular. A associação dos fibroblastos e seus produtos com os miofibroblastos garantem aumento da força tensil da cicatrização. A atividade mitótica do fibroblasto no tecido de granulação começa a declinar a partir do oitavo dia e praticamente desaparece por volta do decimo quinto dia. Uma vez cessada a hiperplasia, os fibroblastos passam a 10

24 secretar as proteínas presentes no tecido de granulação, ou seja, os componentes das substancias e o colágeno (KOOPMANN, 1993). A substancia fundamental ou matriz é um material viscoso, amorfo, semelhante a um gel, elaborado pelos fibroblastos, que fica entre as fibras do tecido conectivo (GRABB, 1992). Há um conjunto de hipóteses para explicar a função dos glicosaminoglicanos. Dentre elas, destacam-se aquelas que envolvem essas substancias com a produção, orientação e comprimento da fibra colagena, interação celular e como componente importante da matriz (KOOPMANN, 1993). Verifica-se acumulo de substancias fundamental durante os cinco primeiros dias da cicatrização em animais com metabolismo normal. A presença do colágeno começa a ser notado após o sexto dia, quando os níveis elevados da substancia fundamental começam a declinar com rapidez. A epitelização se faz pelo aumento da divisão e da migração das células da camada basal da epiderme por sobre a área de reparação do tecido conectivo subjacente. Nas feridas de espessura parcial a epitelização é o principal fenômeno da cicatrização. A altura da pele, onde a fase de maturação foi mais bem estudada, a reconstrução da continuidade associa-se a epitelização. Assim, 10 a 15 horas após a lesão, as células epiteliais da margem da ferida, dos folículos pilosos e de outros anexos migram sobre o tecido subjacente, com movimentos amebóides, formando camadas estratificadas, de modo em que de quatro a cinco dias, em condições ideais de assepsia, identificamos um extrato granuloso e uma membrana basal na interface dermo-epidermica. Esse evento não requer proliferação celular previa e para isto as células desfazem as suas conexões com as vizinhas e adquirem pseudópodes (KOOPMANN, 1993). 11

25 A migração é influenciada pelo tipo de matriz, tensão de oxigênio e presença ou não de infecção. A proliferação celular das margens da lesão inicia-se após a migração e é máxima horas após a lesão. O estagio final da reepitelização é a maturação das células epidérmicas. Em torno do décimo dia, há um extrato córneo que, comumente, é mais espesso que o da pele sã circunjacente. Nas feridas extensas, com perda parcial da espessura da pele (ex.: queimaduras de segundo grau, escorpiões, dermoabrasão) ocorrem algumas particularidades no processo de reparação. A proliferação das células epiteliais se faz a partir da epiderme marginal da ferida, assim como dos elementos epiteliais dos anexos cutâneos remanescentes, principalmente dos folículos pilosos e das glândulas sebáceas. A reparação da derme se faz pela elaboração do tecido de granulação, que será tanto mais intensa quanto maior a profundidade da lesão. Nas feridas extensas, com perda da epiderme e de toda a espessura da derme, o tecido de granulação formado deverá ser revestido por epitélio proliferado apenas das bordas da ferida. Devido à extensão da perda cutânea, o processo de cicatrização é demorado e sofre importantes alterações. Com o passar do tempo, a disposição dos fibroblastos se altera, podendo levar à isquemia das camadas superficiais do tecido de granulação, com necrose e exsudação, o que propicia a infecção. Esta prejudica a velocidade de proliferação das células epiteliais das bordas estabelecendo-se um circulo vicioso que leva a formação de uma úlcera crônica (KOOPMANN, 1993). Por último na fase de maturação ou remodelação ocorre dois eventos bem nítidos: o primeiro corresponde à deposição, agrupamento e remodelação do colágeno, enquanto o segundo segue-se á regressão endotelial. Identifica-se, assim, um substrato histológico que caracteriza o tecido conectivo com fibrócitos, fibrilas colágenas e pequena quantidade de vasos sanguíneos. A remodelação da matriz e do colágeno inicia-se na 12

26 formação do tecido de granulação e continua progressivamente, por meses após Ter ocorrido a reepitelização. Há uma progressiva digestão do colágeno pela colagenase e outras proteases, produzidas localmente por macrófagos, neutrófilos e células epidérmicas e que atuam preferencialmente sobre as fibras de colágeno defeituosas (COTRAN et al., 2002). Nas cicatrizes cutâneas, a regressão endotelial pode ser confirmada pela observação da coloração local que, gradualmente, passa do rosado para o esbranquiçado em decorrência da redução da vasculatura do tecido conectivo (GRABB, 1992). Nesta fase, ocorre uma diminuição progressiva dos vasos de neoformação, bem como dos elementos celulares, inclusive fibroblastos. O epitélio mono-estratificado transforma-se em pluri-estratificado. A diminuição de todos os elementos do tecido conectivo ocorre de maneira progressiva até a formação da cicatriz definitiva, constituída apenas por fibrilas colágenas. Conforme o colágeno é depositado, a fibronectina gradualmente desaparece, o colágeno tipo III é substituído pelo tipo I, mais resistente e o acido hialurônico é substituído por outros proteoglicanos que possuem efeito permissivo na agregação das fibras de colágeno. Água é reabsorvida e a cicatriz se torna menos espessa (GRABB, 1992). Um fenômeno que por muitos anos foi controvertido é o da contração da cicatriz, que se inicia uma semana apos a lesão. No presente momento, admite-se que os miofibroblastos sejam as células contrateis e que o colágeno seria o responsável por mantêlos em posição nos tecidos recem-contraidos. A contração é caracterizada pelo movimento centrípeto das bordas, ocorrendo no Maximo quinze dias apos a lesão, contribuindo para o fechamento efetivo desta (COTRAN et al., 2000). 13

27 O processo de remodelação é lento e a força tênsil que depende basicamente do colágeno leva tempo para se desenvolver. Duas semanas apos a lesão, a cicatriz é frágil, tendo 5% da força normal, ocorrendo um aumento progressivo até um ano apos a lesão, mas terá sempre, no máximo 80% da força tênsil normal (KOOPMANN, 1993) Fatores que Influenciam a Cicatrização Localização A localização de uma ferida deve ser observada como parte da avaliação, pois ela pode indicar problemas potenciais com o risco de contaminação da ferida, na região sacral, por exemplo, problemas de mobilidade, causados por feridas nos pés (DEALEY, 2001). É sabido que as úlceras localizadas em regiões proximais, devido ao aporte sanguíneo mais eficiente, tendem a cicatrizar com maior facilidade; ao contrario daquelas em regiões distais, especialmente os membros inferiores (DEALEY, 2001). Feridas localizadas em sítios de alta mobilidade como articulações merecem cuidados especiais, uma vez que a tensão da pele e tecidos nestas regiões, pode retardar o processo cicatricial (HESS, 2002). 14

28 1.6.2.Idade Os jovens apresentam um metabolismo maior que os adultos e ainda um maior turgor da pele, portanto, a maioria das suturas ficam sob tensão, havendo uma maior propensão a cicatrizes hipertróficas. Deve se lembrar que cicatrizes não crescem com o individuo, resultando em restrição funcional ou de crescimento. Pacientes mais velhos não tem mais o turgor da pele dos jovens e, portanto as suturas apresentarão menos tensão promovendo melhores cicatrizes. Adolescentes, muitas vezes tem pele acneíca e oleosa, desse modo podem apresentar problemas de cicatrização. Mesmo adultos com pele oleosa tendem a pior cicatrização (MELLEGA, 1992). Já Dealey (2001), diz que os idosos têm o ritmo metabólico celular desacelerado com o passar dos anos juntamente com a elevação de risco de desnutrição Nutrição Durante os primeiros dias apos a lesão ou pós-operatório, soluções de glicose ou cristalóides são suficientes, assim que o paciente aceitar a alimentação oral ou nasogástrica, o metabolismo aumenta sensivelmente (HESS, 2002) 15

29 Atraso na cicatrização Muitos pacientes não exibem problemas na cicatrização, entretanto a maioria dos problemas se da pela infecção das feridas. Algumas doenças congênitas podem alterar a cicatrização (HESS, 2002). A reparação inicia-se durante as fases iniciais da inflamação e, em geral, só é concluída após a neutralização da influência agressora. Durante a reparação, o tecido agredido é substituído pela regeneração das células parenquimatosas nativas ou pelo preenchimento do defeito por tecido fibroblástico (COTRAN et al., 2000). Contudo, várias substâncias são ativadas durante o processo inflamatório participando na reparação do ferimento. Durante este processo, várias células, até mesmo leucócitos, são destruídos. Os macrófagos presentes no local fagocitam os debris e os produtos da reação inflamatória, o tecido pode ser restituído ao seu estado normal, ou um tecido cicatrizante pode ser formado (BENJAMIN et al., 2002). A cicatrização é o processo pelo qual o tecido necrosado é substituído por tecido conectivo cicatricial. Inicialmente, na área lesada são liberados mediadores químicos que se difundem para o tecido não lesado, nele iniciando as alterações vasculares e a exsudação celular necessárias à reabsorção dos restos celulares. Por ação contrátil do miofibroblastos, a cicatriz conectiva tende a se contrair e a reduzir o volume da área comprometida (COTRAN et al., 2000). Entretanto é importante salientar que a capacidade de reparar lesões inflamatórias depende do tipo de inflamação e de componentes genéticos do indivíduo. A quantidade de fatores de crescimento produzidos varia com o tipo de inflamação, enquanto que fatores genéticos comandam a maior ou menor produção de matriz extracelular ou a 16

30 maior ou a menor capacidade para degradar o tecido conectivo neo-formado (BRASILEIRO FILHO et al., 2002). Dentre os tecidos biológicos destaca-se nesse projeto a pele de anfíbio que, que segundo estudos tem contribuído para a proliferação, migração e diferenciação do colágeno nas células epiteliais. O uso do extrato de colágeno da pele do sapo facilita a formação de uma reconstituição semi-sólida e que apesar da diversidade de espécie de anfíbios, esta pesquisa restringiu se para a espécie denominada Rana Catesbeiana, no qual, já foi utilizada como enxertos em pacientes queimados em alguns experimentos. Usualmente, o curativo de pele de rã é feito com pele fresca adicionada com antibióticos e que precisa ser mantido à baixa temperatura até o momento do uso. Com a nova técnica de desidratação, a pele de rã não recebeu antibióticos e pode ser estocada sem congelamento. A desidratação garante a durabilidade da pele, que pode ser utilizada a qualquer momento (RODRIGUES, 1998). O presente trabalho teve por objetivo avaliar histopatologicamente o processo cicatricial promovido pelo uso de xenoenxerto, proveniente da pele de anfíbio da espécie Rana catesbeiana, tratados com raios-gama e não tratado, por 14 (quatorze) dias após a aplicação em lesões de pele de ratos Wistar. Os dados a serem apresentados compõem resultados finais de uma ampla pesquisa. 17

31 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1. Grupos Experimentais No presente estudo foram usados 15 (quinze) ratos Wistar, da espécie Rattus norvegicus, albinus, machos, adultos, pesando aproximadamente 250g cada, clinicamente sadios, procedentes do Biotério da Universidade para o desenvolvimento do Estado e região do Pantanal (UNIDERP). Os animais foram mantidos em ciclo claro/escuro, em gaiolas apropriadas, individuais de plástico, com tampa superior metálica, com umidade e temperatura natural do ambiente, recebendo água potável e ração própria para a espécie ad libitum. Os ratos permaneceram alojados em gaiolas individuais. Os quinze indivíduos foram agrupados quanto ao tratamento que receberam após incisão cirúrgica, sendo dividido em três grupos compostos por cinco animais: Grupo controle sem tratamento (solução salina); Grupo que recebeu pele de rã não tratada com raios-gama; Grupo que recebeu pele de rã tratada com raio-gama. 18

32 2.2. Técnica Cirúrgica Para realização da incisão cirúrgica nos animais experimentais, os mesmos, foram pesados, com auxílio de uma balança analítica, para determinação da dose anestésica para administração individual. Foi usado um anestésico dissociativo comercial¹, por injeção intraperitoneal, na dosagem de 0,1 ml/kg. Uma vez aplicada anestesia foi feita a tricotomia dorsal no lado direito, na região toraco-lombar, com posterior anti-sepsia com álcool 70%, para então ser realizada uma incisão de 2,0cm x 1,0 cm de diâmetro com retirada de fragmento de pele, para posterior tratamento com cobertura Tratamento com Cobertura de Pele de Rã Após procedimento cirúrgico os animais receberam uma cobertura natural produzida a partir da pele do anfíbio Rana catesbeiana² tratada com raios-gama e sem tratamento, no tamanho exato da incisão, cobrindo toda área lesada. A pele sem tratamento, ao contrário da pele tratada com raios-gama, por haver sido manipulada antes do experimento e por ter sido mantida em recipiente que permitia uma contaminação ambiental, foi mantida por 15 minutos em capela de fluxo laminar sob ação de raios ultravioleta antes da aplicação. ¹ Zoletil 50 - composto de 125 mg de cloridrato de tiletamina e 125 mg de cloridrato de zolazepam em excipiente q.s.p. 660 mg liofilizado, para ser diluído em 5 ml de água esterilizada apirogênica Virbac Saúde Animal partida 005/04, fabricação Out/04, validade Out/06. ² Material produzido no laboratório da Organização Não Governamental (ONG) OISCA DO BRASIL Jacareí/SP e gentilmente cedida pela Química Dra. Maria de Lourdes M. Velly. 19

33 2.4. Coleta de Material para Exame Histopatológico Ao final do décimo quarto dia de experimento, os animais dos três grupos foram sacrificados com uma super dosagem de éter etílico em campânula fechada, para que fossem retiradas amostras da lesão com pele, nos bordos da cicatrização, e então fixadas em solução de formol a 10% tamponado Realização de Lâminas para Análise Histopatológica Após processamento histológico, foram realizados cortes histológicos das amostras de pele de cada animal, com a espessura de 5µm, as lâminas foram posteriormente coradas pela técnica de hematoxicilina-eosina (HE), para estudo através de microscopia óptica (LUNA, 1995) Análise histopatológica As características histológicas do processo de reparação tecidual nas feridas dos Grupos Controle e Testes foram avaliadas, qualitativamente transformados em valores de percentuais de Macrófagos (PM), Percentuais de Fibroplasia (PF), Percentual de Reepitelização (PRE), Percentual de Angiogênese e Percentual de Glândulas Anexas (PGA), adotando-se o seguinte critério: ( - ) = 0; ( + ) = 25%; ( ++ ) = 50%; ( +++ ) = 75%; 20

34 e ( ++++) = 100%. Realizou-se estudo comparativo no período de 14 dias, entre os Grupos Controle e Teste. TABELA 1 PERCENTUAL DE FATORES DO PROCESSO CICATRICIAL, NO TRATAMENTO DE 14 DIAS. Alterações morfológicas Grupo controle Grupo pele tratada Grupo pele não tratada Polimorfonucleares Angiogênese Necrose Hiperemia Percentuais de Polimorfonucleares (PM), Percentuais de Angiogênese (PA), Percentual de Necrose (PN), Percentual de Hiperemia (PI), adotando-se o seguinte critério: ( - ) = 0; ( + ) = 25%; ( ++ ) = 50%; ( +++ ) = 75%; e ( ++++) = 100% TABELA 2 PERCENTUAL DE FATORES DO PROCESSO INFLAMATÓRIO, NO TRATAMENTO DE 14 DIAS. Alterações morfológicas grupo controle grupo pele tratada grupo pele não tratada Mononucleares Angiogênese Fibroplasia Necrose Percentuais de Mononucleares (PM), Percentuais de Angiogênese (PA), Percentual de Fibroplasia (PF), Percentual de Necrose (PN), adotando-se o seguinte critério: ( - ) = 0; ( + ) = 25%; ( ++ ) = 50%; ( +++ ) = 75%; e ( ++++) = 100% 21

35 Figura 1: Anestesiando o animal Figura 2: Tricotomia do dorso 22

36 Figura 3: Animal com demarcação Figura 4: Animal lesionado pós-cirúrgico. 23

37 3. RESULTADOS E DISCUSSÕES 3.1 Animais que Receberam Pele de Rã Não Tratada Todo o membro dos grupos que receberam pele não tratada apresentaram suas lesões, pela avaliação clinica e visual, com as mesmas características: área de lesão pequena, ausência de vermelhidão e de aumento de volume, com presença de pequenas quantidades das crostas na superfície, sugerindo discreta resposta inflamatória local. Como a rejeição a transplante é um processo tardio, especialmente em animais não sensibilizados, caso destes animais experimentais que nunca haviam tido contato de qualquer espécie com a pele de rã usada neste estudo, o período de sete dias pode não ter sido suficiente para a instalação e ou manifestação desse processo Animais que Receberam Pele de Rã Tratada com Raios-gama Os animais do grupo tratado com raios gama também apresentaram suas lesões com características de forma uniforme: hiperemia, tumefação e presença de grande quantidade de crosta na superfície. Tais resultados, bastante diferentes dos que foram encontrados no grupo anterior, sugere a presença de um processo inflamatório agudo, que 24

38 pode estar associado ao inicio de uma reação de hipersensibilidade de rejeição a transplante. Na literatura consultada, foram encontrados apenas três estudos experimentais sobre emprego de pele de anfíbios, com curativo biológico oclusivo, em lesões cutâneas. Em um deles, a pele de Rana tigrina foi testada em feridas cutâneas produzidas cirurgicamente em ratos Wistar (SAY et al.,1995). O outro, a pele de Rana catesbeiana foi utilizada em lesões cutâneas induzidas por queimadura em ratos dessa mesma linhagem (RODRIGUES et al.,1998). Os achados histopatológicos do período de 48 horas dos Grupos Controle, pele tratada com raios-gama e não tratado apresentaram alterações morfológicas idênticas, com um intenso infiltrado inflamatório polimorfonuclear, representado predominantemente por neutrófilos, o qual tem a função de fagocitar o tecido necrosado, extensas áreas de necrose, hiperemia vascular e angiogênese em desenvolvimento. Já os achados histopatológicos do período de sete dias dos Grupos Controle, pele tratada com raios-gama e pele não tratada, apresentaram moderado processo inflamatório, representado por células mononucleares (macrófagos), fibroblastos ativados com núcleo volumoso, o que indica intensa atividade na produção de tecido conectivo, neoformação vascular para suprir os novos tecidos depositados e ainda escassas áreas de tecido necrosado. Em estudo semelhante Falcão et al. (1998) utilizando pele de Rana Catesbeiana preservadas em solução de NaCl e glicerol sob temperatura de -4ºC, como curativo biológico oclusivo em lesões cutâneas induzidas cirurgicamente em 15 cães, observou que não houve diferença estatística significativa entre os grupos controle e tratado, com um processo de rejeição agudo, exibindo um infiltrado inflamatório 25

39 constituído por células mononucleares, com destruição das camadas de Malpighi e subjacentes foram observadas na área de contato com a área de lesão da ferida induzida. Assim, Falcão et al., (1998) concluiu que a pele não é efetiva no tratamento de feridas caninas, pois, a rejeição foi sugerida como um fator causal. Estes achados coincidem com os citado por Rahal et al., (2001) na utilização de uma pomada orgânica natural no tratamento de feridas limpas induzidas em ratos, que após sete dias de tratamento com a pomada mostrou intenso infiltrado inflamatório (neutrófilos, macrófagos, basófilos) associado à intensa hemorragia e presença de fibrina, havendo, também, a presença de fibroblastos e diminuição do número de neutrófilos, em relação ao grupo controle negativo. A ocorrência de destruição da pele de rã de caráter precoce evidenciada nos animais, poderia significar fenômeno da interação imunológica entre os tecidos, constituindo, assim, fenômeno sugestivo de rejeição. A interação xenogênica, o reconhecimento de uma espécie por outra, através de anticorpos naturais, guarda uma relação diretamente proporcional à distância filogenética existentes entre as mesmas, permitindo assim a identificação de espécie discordantes em maior ou menor grau. Recentemente vários autores têm admitido a necessidade da presença de células apresentadoras de antígenos do receptor para o reconhecimento efetivo de xenoantígenas (LE MALUFF et al.,1997; TIZARD., 1998). Assim, o fenômeno de rejeição xenogênica poderia ser classificado como agudo, do tipo celular ou humoral (FALCÃO et al.,2002). 26

40 Figura 5: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com solução salina sete dias exibindo áreas de necrose e inflamação. Aumento de 5x. Coloração H&E. Figura 6: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com solução salina sete dias exibindo áreas de necrose e inflamação. Aumento de 10x. Coloração H&E. 27

41 Figura 7: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com solução salina 14 dias exibindo áreas de necrose, hemorragia e inflamação. Aumento de 5x. Coloração H&E. Figura 8: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com solução salina 14 dias exibindo áreas de necrose, hemorragia e inflamação. Aumento de 10x. Coloração H&E. 28

42 Figura 9: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com membrana tratada sete dias exibindo áreas de necrose e inflamação. Aumento de 5x. Coloração HE. Figura 10: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com membrana tratada sete dias exibindo áreas de necrose, hemorragia e inflamação. Aumento de 10x. Coloração H&E. 29

43 Figura 11: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com membrana tratada 14 dias exibindo áreas de crostas, necrose e inflamação. Aumento de 5x. Coloração H&E. Figura 12: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com membrana tratada 14 dias exibindo áreas de crostas, necrose e inflamação. Aumento de 10x. Coloração H&E. 30

44 Figura 13: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com membrana não tratada sete dias exibindo áreas de crostas, necrose e inflamação. Aumento de 5x. Coloração H&E. Figura 14: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com membrana não tratada sete dias exibindo áreas de crostas, hemorragia, necrose e inflamação. Aumento de 10x. Coloração H&E. 31

45 Figura 15: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com membrana não tratada 14 dias exibindo áreas de crostas, necrose e inflamação. Aumento de 5x. Coloração H&E. Figura 16: Aspecto microscópico de animal de grupo tratado com membrana não tratada 14 dias exibindo áreas de crostas, necrose e inflamação. Aumento de 10x. Coloração H&E. 32

46 4. CONCLUSÃO Conclui-se assim, não haver benefícios no uso de pele de rã tratada com acelerador de elétrons e não tratada, comparado ao grupo controle, como curativo biológico, sobre o processo cicatricial de feridas de pele produzidas em ratos, devido a um processo de rejeição em fase aguda. 33

47 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BENJAMINI, E.; COICO, R.; SUNSHINE, G. Imunologia. 4ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara- Koogan, p.14, BIRCHARD, S.J.; SHERDING, R.G. Manual Saunders: Clinica de Pequenos Animais. São Paulo: Roca, Pag BRASILEIRO FILHO et al., Patologia Geral. 6ª ed., Rio de Janeiro. Guanabara- Koogan, p , BRITTO, N.M.B. ; et al Revista Paraense de Medicina. V.13, jan-abril, COTRAN, R.S.; et al. Patologia Estrutural e Funcional. 6ª ed. Rio de Janeiro. Guanabara-Koogan, p. 45, DEALEY, C. Cuidando de feridas: um guia para as enfermeiras. 2 ed. São Paulo: editora Atheneu, FALCÃO, S.C.; LOPES, S. L.; COELHO, A.R.B.; ALMEIDA, E.L. Pele de Rana catesbeiana como curativo biológico oclusivo no tratamento de feridas cutâneas produzidas em cães. Alterações macroscópicas e microscópicas resultantes da interação desses tecidos. Estudo preliminar. Acta Cir. Bras., v. 17, n. 3, Disponível em: <http//: Acesso em: 20 abr GONÇALVEZ, G.; PARIZOTO, N. Fisiopatologia da Recuperação Cutânea: Atuação da Fisioterapia. Ver. Brás. Fisiot. V.3, N.1, p. 5-13, abr-set

48 GRABB, S. Plastic surgery: Saunders HESS. C. T. Tratamento de Feridas e Ulceras. 4 ed., KOOPMANN, Jr. C. Wound Healing: a Review of Factors Affecting Wound Repair. Otolaryngology. Lippincot, LUNA, L. G. Histopalogic methods and color atlas of special stains and tissue artifacts. Downers Grove: Johnson, 1995, p.767. MANDELBAUM, S. H.; DI SANTIS, E. P. ; MANDELBAUM, M. H. S. Cicatrização: conceitos atuais e recursos auxiliares-parte I. Na. Bras. Dermatol., Rio de Janeiro, V.78, N.4, p MELLEGA, J. Cirurgia Plástica Reparadora e Estética. 2 ed., Rio de Janeiro: Medsi Editora, PREVEL, D.C.; EPPLEY, LB.; SUMMERLIN, D. J.; SIDNER, R.; JACKSON, J. R.; MCCARTY, M.; BADYLAK, S.F. Small intestinal submucosa: utilization as a wound dressing in full-thickness rodent wounds. Ann. Plast. Surg., v.35, p , RODRIGUES, J.M.; MEDEIROS, AC. Tratamento de queimaduras do dorso de ratos com pele de rã como curativo biológico. In: 9º Congresso de Iniciação Científica UFRN. Imprensa Universitária, p.49, SAI, K.P.; REDDY, PN.; BABU, M. Investigations on wound healing by using amphibian skin. Indian j. Exp. Biol., v.33, p ,