Diagnóstico Genético Pré-Implantacional PGD-FISH

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1 Diagnóstico Genético Pré-Implantacional PGD-FISH Manual Pré-caso O requerimento do kit de pocedimento deverá ser solicitado no dia da coleta de oócitos da paciente. Estocar as soluções 1 e 2 em temperatura ambiente e a solução 3 a 4 C. Se por alguma razão o ciclo de FIV tiver que ser cancelado os mesmos são estáveis se estocados corretamente. Para fazer o requerimento entre em contato pelo telefone 0xx / Este kit inclui: 1- Solução 1 (HCl 1N) e Solução 2 (Tween-20). Estes tubos serão enviados a temperatura ambiente. PS: Solução 1 é tóxica e corrosiva. Tenha cuidado ao manuseá-la. 2- Solução 3 (Solução hipotônica). Este tubo será enviado a temperatura ambiente, mas deverá ser estocado a 4 C imediatamente após a chegada. 3- Lâmina para biópsia. Serão enviadas lâminas para fixação dos blastômeros. Tomar cuidado para não manusear as lâminas sem luvas deixá-las estocadas dentro do recipiente em que serão enviadas e em lugar seco. 4- Termo de consentimento. O termo original deverá ser assinado para que o diagnóstico possa ser realizado. O diagnóstico NÃO SERÁ REALIZADO caso o termo não esteja assinado, SEM EXCEÇÕES. 5- Folha de Dados da Biópsia e Fixação. É necessário relatar todas as intercorrências durante o processo da biópsia embrionária e também as características do ciclo (nº de embriões biopsiados, nº de blastômeros encontrados) na folha de dados da biópsia, assim como quaiquer intercorrências ocorridas durante a fixação dos núcleos. 6- Checklist do embriologista, descrito abaixo. 1 de 7

2 Checklist do Embriologista Antes da biópsia: 1. Anote todos os dados dos pacientes envolvidos e do ciclo em questão na Folha de Dados e tire uma cópia para que esta fique em sua clínica. 2. Faça a solução de fixação descrita no protocolo de procedimento recomendado para biópsia. 3. Guarde o recipiente em que as lâminas foram enviadas e reutilize-o para o reenvio da lâmina para a Genesis Genetics Brasil (GGB). Encontre uma pequena caixa de isopor onde a mesma possa ser inserida, tomando cuidado para esta fique estável e não se mova durante o transporte. 4. Leia os protocolos e o termo de aceitação e rejeição das lâminas. Ligue se tiver dúvidas. Alguns cuidados deverão ser tomados durante a fixação: 1) Verificar se no blastômero biópsiado há núcleo. 2) Verificar se a numeração enviada na lâmina corresponde à numeração do embrião em sua clínica. 3) Verificar se não há citoplasma no núcleo. Caso haja a presença de citoplasma sobre o núcleo, faça uma nova biópsia. 4) Marcar todas as intercorrências no relatório de biópsia. Se o embrião não estiver no estágio correto de desenvolvimento ao terceiro dia, rediscuta a conduta da biópsia com o médico responsável. Estes embriões raramente produzem bons resultados moleculares, provavelmente porque nucleases e lisosimas estão sendo liberadas pelo embrião e o DNA esta sendo degradado. Nossa preocupação é que esta condição leve a resultados falsos de FISH. 2 de 7

3 Após a biópsia e antes do envio: 1. O que deve ser enviado a GGB juntamente com a amostra: a. Termo de Consentimento ORIGINAL em um envelope dentro da caixa. O diagnóstico NÃO SERÁ REALIZADO caso o termo não esteja assinado, SEM EXCEÇÕES. Uma CÓPIA do Termo de Consentimento para PGD deve ser deixada em sua clínica. b. Folha de dados da biópsia e deixe uma cópia na sua clínica. c. Ficha de solicitação do exame 2. Tudo deverá ser correta e completamente preenchido 3. Siga as direções de armazenamento e envio da amostra. Certifique-se de que todos os documentos necessários estão no envelope. 4. Informe-nos por telefone quando a amostra for enviada. Como enviar a amostra - transporte: Para o transporte da amostra, procedemos da seguinte maneira: 1) Assim que confirmada a data da biópsia (até, no máximo, um dia antes), o embriologista responsável deverá ligar para GGB e informar a data da mesma e o painel de sondas que será utilizado. 2) A lâmina deve ser colocada em um bórel (mesmo recipiente em que foi encaminhada a lâmina para biópsia) e, presa no interior de uma caixa de isopor com fita adesiva, nos espaços vazios completar com papel absorvente (esses utilizados para enxugar as mãos). Feito isso, lacrar a caixa com fita adesiva. 3) O meio de transporte deverá ser discutido e decido conjuntamente com a GGB. Para isto, entre em contato com os profissionais da GGB ( ou ) 3 de 7

4 4) Os seguintes documentos deverão ser enviados junto com a amostra preenchidos completa e corretamente, e assinados (quando necessário): a. Ficha de solicitação de exame; b. Folha de dados da biópsia e fixação; c. Termo de consetimento do paciente. 5) O resultado do exame será enviado para indicado na ficha de solicitação na manhã do dia 5 do desenvolvimento embrionário. RESULTADOS: 1. Para Clínicas de São Paulo (capital): A biópsia é realizada na manhã do dia 3 de desenvolvimento embrionário. É importante lembrar que o resultado para o PGD FISH de 5 cromossomos sairá na manhã do dia seguinte a biópsia caso a lâmina com a fixação seja entregue até às 15 horas do dia da biópsia. Para os PGDs FISH de 7, 9 e 11 cromossomos é necessário que a lâmina seja entregue até às 9 horas do dia da bióspia para que o resultado saia na manhã do dia seguinte. Invariavelmente, caso a lâmina chegue após os horários estabelecidos, os resultados sairão com 24 horas de atraso, ou seja, no dia 5 do desenvolvimento do embrião. 2. Para clínicas fora de São Paulo: O Resultado sairá no dia 5 do desenvolvimento embrionário devido ao transporte. 4 de 7

5 Procedimento recomendado para biópsia 1. Para evitar que haja citoplasma sobre o núcleo proceda da seguinte maneira: a. No máximo 1 hora antes da realização da biópsia, faça uma solução de difusão 0,01N HCl (100µl solução ml H 2 O ultra-pura) com 1% da solução 2 (10ml HCl 0,01N + 100µl solução 2). Esta solução deve ser feita tomando cuidado para que os recipientes estejam sempre bem fechados, por causa da evaporação. É necessário agitar bem o frasco em que ela for colocada. 2. Os blastômeros deverão ser fixados na lâmina da seguinte maneira: 1 O procedimento de fixaçao consiste em: 1- Transferir o blastômero biopsiado para uma gota com a Solução 3 (Hipotônica), onde deve permanecer de 1 a 2 minutos. 2- Marcar no lado oposto da lâmina, utilizando lápis de diamante ou tungstênio, com um pequeno círculo, o local onde este blastômero será colocado, indicando qual o número de referência dele ( ex: 1, 2, 3...). PS: sempre faça o círculo com caneta de diamante ou tungstênio o número correspondente ao blastômero ANTES de iniciar a fixação, para que o núcleo não se perca na lâmina. 3- Colocar uma gota (3-4µl) de solução de difusão (0,01N HCl/ 1% Tween-20) sobre o círculo feito na lâmina. Em seguida, transferir o blastômero da solução hipotônica, com o mínimo de líquido possível, para a gota na lâmina. 5 de 7

6 4- A transferência dos blastômeros para a solução de difusão deve ser realizada com análise simultânea em microscópio de fase. Se não possuir microscópio de fase, sugerimos a aquisição de um, pois será muito importante nessa etapa. 5- Verificar se houve rompimento do citoplasma e extrusão do núcleo. Caso a solução esteja a ponto de secar e o núcleo ainda não tenha sido observado, adicionar mais 2µl da solução de difusão (0,01N HCl/ 1% Tween-20). 6- Quando o núcleo estiver fixado, passe para o próximo blastômero e repita o procedimento. 7- Caso o núcleo não seja visualizado, considere rebiopsiar o embrião. 8- As lâminas devem permanecer em temperatura ambiente por 1 hora até que a amostra esteja completamente seca. 9- As lâminas completamente secas devem ser acondicionadas dentro de um portalâminas, para que as mesmas não corram risco de serem danificadas. 10- Lembre-se de identificar a lâmina (a lápis grafite) com o nome e sobrenome da paciente e data da biópsia. É NECESSÁRIO QUE O NOME DA PACIENTE NA LÂMINA SEJA O MESMO NOME DE IDENTIFICAÇÃO NOS DOCUMENTOS ENTREGUES. 11- Lembre-se de anotar todas as intercorrências do processo de fixação na Folha de Dados da Fixação. 6 de 7

7 Folha de Dados de Biópsia e Fixação Nome da paciente: Nome do marido: Data da biópsia: N do blastômero número de células no momento da biópsia qualidade do embrião * Ex: 1 8 células *Referência da qualidade embrionária seguida: N do blastômero núcleo visto no momento da retirada do blastômero? S/N Núcleo foi visto na fixação? S/N observações Ex:1 N S biopsiada segunda célula EX:2 S S biópsia fácil Outras observações: 7 de 7