ANA (Triagem) Imuno-ELISA

Transcrição

1 BIBLIOGRAFIA/ BIBLIOGRAPHY/ BIBLIOGRAFÍA 1. Tan, E.M.: Antinuclear antibodies: diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv Immunol.; 44: , Egner, W.: The use of laboratory tests in the diagnosis of SLE. J Clin Pathol; 53: , Kavanaugh, A., Tomar, R., Reveille, J. et al.: Guidelines for Clinical Use of the Antinuclear Antibody Test and Tests for Specific Autoantibodies to Nuclear Antigens. Arch Pathol Lab Med; 124: 71-81, Tozzoli, R., Bizzaro, N., Tonutti, E. et al.: Guidelines for the Laboratory Use of Autoantibody Tests in the Diagnosis and Monitoring of Autoimmune Rheumatic Diseases. Am J Clin Pathol; 117: , Greidinger, E.L., Hoffman, R.W.: Antinuclear Antibody Testing: Methods, Indications, and Interpretation. Lab Med, 34 (2): , Wiik, A.S., Gordon, T.P., Kavanaugh, A.F. et al.: Cutting Edge Diagnostics in Rheumatology: The Role of Patients, Clinicians, and Laboratory Scientists in Optimizing the Use of Autoimmune Serology. Arthr&Rheum; 51 (2): , Lyons, R., Narain, S., Nichols, C. et al.: Effective Use of Autoantibody Tests in the Diagnosis of Systemic Autoimmune Disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1050: , Kumar, Y., Bhatia, A. and Minz, R. W.: Antinuclear antibodies and their detection methods in diagnosis of connective tissue diseases: a journey revisited. Diag Pathol.; 4: 1-10, Copple, S.S., Sawitzke, A.D. et al.: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Screening Then Indirect Immunofluorescence Confirmation of Antinuclear Antibodies. Am J Clin Pathol; 135: , 11. MS Imuno-ELISA ANA (Triagem) Kit para a determinação qualitativa de anticorpos Antinucleares (ANA) e Anticitoplasmáticos no soro humano por enzimaimunoensaio (ELISA). Kit for the qualitative determination of Antinuclear antibodies (ANA) and anticytoplasmatic in human serum by enzyme immunoassay (ELISA). Kit para determinación cualitativa de anticuerpos antinucleares (ANA) y anticitoplasmacico en el suero humano por enzimoinmunoensayo (ELISA). R E F R E F 4096-E - 96 determinações / determinations / determinaciones E determinações / determinations / determinaciones Edição I: Rev. 11/12 EC R E P WAMA Diagnóstica Rua Aldo Germano Klein, CEAT CEP São Carlos - SP - Brasi Fone / Fax SAC Obelis S.A. Boulevard Général Wahis Brussels, BELGIUM Phone. +(32) Fax : +(32) SAC

2 01 18 PORTUGUÊS IMPORTÂNCIA CLÍNICA Os anticorpos antinucleares (ANA) são um grupo de anticorpos contra vários antígenos nucleares e alguns antígenos citoplasmáticos. Os testes sorológicos de ANA têm um papel importante no diagnóstico de diversas doenças autoimunes do tecido conjuntivo, especialmente no Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES), Esclerodermia, Doença Mista do Tecido Conjuntivo (DMTC) e Síndrome de Sjögren. Comumente, os ANA são detectados por imunofluorescência indireta em células HEp-2. Em virtude de certas limitações da IFI, havia a necessidade de um método não subjetivo de detecção de ANA. O imune ensaio enzimático (ELISA) oferece muitas vantagens em relação ao método de IFI na detecção de ANA, tais como a facilidade de utilização e a não necessidade de capacidades especiais para a execução e a leitura das reações de IFI. Como os ANA são indicadores sensíveis, mas não específicos, de uma doença do tecido conjuntivo, recomenda-se a realização de testes de anticorpos específicos em pacientes com ANA positivo suspeitos de terem doença autoimune do tecido conjuntivo. Também se sugere que resultados positivos de ANA em ELISA sejam confirmados por IFI com células HEp-2, pois poderão auxiliar na identificação de padrões de fluorescência sugestivos de vários anticorpos específicos para doença autoimune. O Imuno-ELISA ANA (Triagem) da WAMA é um teste imunoenzimático para a triagem da presença de anticorpos antinucleares (ANA) e citoplasmáticos no soro humano, como auxiliar ao diagnóstico das doenças autoimunes, tais como LES, Síndrome de Sjögren, DMTC e Esclerodermia. A especificidade dos resultados positivos pode ser identificada pela determinação individual de anticorpos específicos anti-sm, anti-rnp, anti-ro, anti-la, anti-scl-70, anti-dna e anti-histona. PRINCÍPIO DO MÉTODO As cavidades da placa de microtitulação são cobertas com antígenos purificados de células HEp-2, outros antígenos nucleares e antígenos citoplasmáticos (fase sólida). Quando anticorpos antinucleares ou anticitoplasmáticos estão presentes na amostra de soro, eles ligam-se às proteínas da fase sólida. O material não ligado é removido por lavagem. Um conjugado de anti-igg humana marcada com peroxidase se ligará aos anticorpos ligados a fase sólida. O conjugado não ligado é removido por lavagem. Um substrato (TMB) é adicionado, cuja presença de anticorpos é detectada pela mudança de cor na reação. Uma solução stop para bloqueio da reação enzimática é adicionada e a absorbância da reação é então medida a 450 nm. A concentração de anticorpos é proporcional à intensidade da cor da reação. Os resultados são expressos em unidades ELISA por mililitro (UE/mL) e informados como reagentes ou não reagentes. APRESENTAÇÃO DO KIT R E F 4096-E - 96 determinações 1. Microplaca com cavidades cobertas com antígenos antinuclares e anticitoplasmáticos purificados (12 tiras removíveis com 8 cavidades cada) 2. Solução de lavagem em pó (2 frascos) 3. Conjugado anti- IgG humana marcada com peroxidase (1 x 12 ml) 4. Substrato Cromógeno (TMB) (1 x 12 ml) 5. Diluente de Amostra (1 x 60 ml) 6. Solução Stop (1 x 12 ml) 7. Calibrador-ANA (1 x 1,5 ml) 8. Soro Controle Negativo (1 x 1,5 ml) 9. Soro Controle Positivo (1 x 1,5 ml) 10. Instruções para uso R E F E determinações 1. Microplaca com cavidades cobertas com antígenos antinuclares e anticitoplasmáticos purificados (24 tiras removíveis com 8 cavidades cada) 2. Solução de lavagem em pó (4 frascos) 3. Conjugado anti- IgG humana marcada com peroxidase (2 x 12 ml) 4. Substrato Cromógeno (TMB) (2 x 12 ml) 5. Diluente de Amostra (2 x 60 ml) 6. Solução Stop (2 x 12 ml) LIMITACIÓN DEL USO Ÿ Lo test Imuno-ELISA ANA (Triaje) de WAMA fue desarrollado para obtener la más alta sensibilidad y especificidad. Sin embargo, debido a la posibilidad de falso resultado reactivos y interferencias con otras enfermedades, resultados repetidamente reactivos siempre debe interpretarse con información clínica del paciente con los resultados de otras pruebas de laboratorio. Ÿ Ejemplos de reactivos que se convierten en no reactivo al repetir la prueba debe considerarse no reactivo. Ÿ Debido a la alta sensibilidad de la ELISA, los resultados falsos positivos pueden ocurrir debido a diversas razones, muchos de los cuales están relacionados, pero no se limitan a paso de lavado inadecuado. Ÿ La prevalencia de la enfermedad en la población evaluada afectará el valor predictivo de la prueba. PRECAUCIONES Y ADVERTENCIAS 1. Los reactivos deben conservarse entre 2 8 ºC. 2. La fecha de caducidad se refiere al último día del mes indicado en las etiquetas del frasco y de la caja del kit. 3. Evite la exposición de los reactivos a altas temperaturas y la luz solar directa. 4. No congele el reactivo, ya que esto puede causar daños irreversibles. 5. Lo Imuno-ELISA ANA (Triaje) contiene material de origen humano, que se pusieron a prueba con resultados negativos para anticuerpos anti-hiv I e II, anti-h (excepto el Suero Control Positivo) y antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). Debido a que ninguna prueba puede ofrecer completa seguridad, a falta de éstos y otros agentes infecciosos, se recomienda para el tratamiento de todos los reactivos como materiales potencialmente infecciosos, y tener el mismo cuidado en la eliminación de estos materiales. 6. No utilizar reactivos o microplacas de lotes diferentes. 7. Dejar que los reactivos adquieran la temperatura ambiente ( 25 ºC) antes de iniciar los tests. 8. Los reactivos deben ser homogeneizados suavemente por inversión y cubiertos de forma inmediata después de su uso. 9. No dejar que los pocillos de la microplaca se sequen durante el ensayo. 10. Evitar pipetear repetidamente los reactivos en stock, pues esto puede causar contaminación. 11. Las muestras que serán testeadas y los sueros controles deben ser utilizados al mismo tiempo para mantener las mismas condiciones del test. 12. No utilice el reactivo después de la fecha de caducidad. 13. No reutilizar cualquier uno de los reactivos. 14. Desechar el material siguiendo regulaciones locales. 15. Utilice las Buenas Prácticas de Laboratorio (BPL) en el almacenamiento, la manipulación y eliminación de los materiales. TÉRMINO DE GARANTÍA WAMA Diagnóstica garantiza el cambio del kit de diagnóstico, siempre que estea dentro de la fecha de caducidad y que ha sido probado por su apoyo técnico que no hubo errores técnicos en la ejecución, la manipulación y el almacenamiento de este producto. WAMA and its distributors are not liable for failures on the performance of the kits under these conditions.

3 17 02 SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD DE LO TEST En un estudio de 292 muestras de suero obtenidas de un laboratorio de referencia, de los cuales 130 eran positivos y 162 negativos, se determinó la sensibilidad y especificidad de lo Imuno-ELISA ANA (Triaje) de WAMA en comparación con el Kit IMUNO-CON ANA-HEp2 de WAMA. Sensibilidad = Positivos Verdaderos / Positivos Verdaderos + Falsos Negativos) x 100 Especificidad = Verdaderos Negativos / (Verdaderos Negativos + Falsos Positivos ) x 100 Verdaderos Positivos RESULTADO 124 Falsos Verdaderos Falsos Sensibilidad Especificidade Positivos Negativos Negativos ,38 96,3 PRECISIÓN DEL TEST a. Precisión Intraensayo La precisión intraensayo se determiné mediante el ensayo 2 muestras de sueros, un reactivo y un noreactivo, en replicas. Muestras Positivas Alta Baja Número de Veces Promedia de las Absorbancias 27,23 7,67 Desviación Estándar 1,49 0,63 5,50% 8,31% b. Precisión Interensayo c. La precisión inter-ensayo se determinó analizando 2 muestras de suero, un reactivo y otro no reactiva, en replicas, siendo 10 réplicas para cada lote y por operadores diferentes. Muestras Positivas Positivo Negativo Número de Veces Promedia de las Absorbancias 27,05 7,74 Desviación Estándar 1,61 0,57 5,95% 7,45% RECUPERACIÓN Muestras con concentraciones conocidas de ANA se mezcla con diluciones apropiadas de otras muestras positivas con cantidades conocidas de ANA. Los niveles de ANA se determina a partir de las muestras y calculado el por ciento de recuperación calculado a partir de los valores obtenidos. Los resultados se muestran en la siguiente tabla: Muestras Concentración Conocida (UE/mL) Mezcla Concentración (UE/mL) % Recuperaion Mezcla/Conocidos Muestra 1 82,2 91,6 111,4 Muestra 2 93,4 93,5 100,1 Muestra 3 62,0 66,9 98,4 ESPECIFICIDAD ANALÍTICA No se demostró una injerencia significativa de las siguientes sustancias en las concentraciones indicadas: hemoglobina (hasta 2 g/l), bilirrubina (hasta 342 µmol/l) y el factor reumatoideo (hasta 100 UE/ml). Para determinar la reactividad cruzada de Imuno-ELISA ANA (Triaje) fueran analizadas 55 muestras de otra enfermedad autoinmune conocida comúnmente como negativo para ANA, así como el Pénfigo. Solamente 4 muestras fueron positivas, que se encuentra dentro del rango de positividad para las personas normales. 7. Calibrador-ANA (2 x 1, 5 ml) 8. Soro Controle Negativo (2 x 1,5 ml) 9. Soro Controle Positivo (2 x 1,5 ml) 10. Instruções para uso PREPARAÇÃO E ESTABILIDADE DOS REAGENTES Ÿ MICROPLACA (1): Retirar do envelope a quantidade de tiras que serão usadas e deixá-las atingir a temperatura ambiente (-25 ºC). As tiras que não forem utilizadas devem retornar ao envelope laminado, com dissecante, e mantidas entre 2-8ºC. Ÿ SOLUÇÃO DE LAVAGEM (2): Dissolver o conteúdo (pó) de 1 frasco em 1000 ml de água destilada ou deionizada. Durante cada ciclo de lavagem, cada cavidade deve ser completada com aproximadamente 350 µl. Manter entre 2-8ºC. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. Ÿ CONJUGADO ANTI-/IgG HUMANA MARCADA COM PEROXIDASE (3): pronto para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. Ÿ SUBSTRATO CROMÓGENO (TMB) (4): solução estabilizada de tetrametilbenzidina. Pronta para uso. Estável entre 2-8 ºC até a data de vencimento impressa na etiqueta do frasco. Não congelar. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. O TMB é não mutagênico e não carcinogênico. Ÿ DILUENTE DE AMOSTRA (5): pronto para uso. Estável entre 2-8ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Ÿ SOLUÇÃO STOP (6): pronta para uso. Contém ácido sulfúrico (H2SO4). Manusear com cuidado. É corrosivo. Em caso de contato com a pele lavar abundantemente em água corrente. Deixar atingir a temperatura ambiente (-25 ºC) antes de usar. Estável até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Ÿ CALIBRADOR-ANA (7): pronto para uso. Produzido de soro humano contendo ANA. A concentração em UE/mL e a data de vencimento estão impressas na etiqueta do frasco. Contém conservante. Estável entre 2-8ºC. O uso do Calibrador-ANA é para determinar resultados qualitativos e valores em unidades. O Calibrador- ANA deve ser sempre utilizado em cada ensaio realizado. Ÿ SORO CONTROLE NEGATIVO (8): pronto para uso. Soro humano negativo para ANA. Usar puro, ou seja, não diluído. Estável entre 2-8ºC até a data do vencimento impressa na etiqueta do frasco. Contém conservante. Ÿ SORO CONTROLE POSITIVO (9): pronto para uso. Soro humano positivo para ANA. Usar puro, ou seja, não diluído. A concentração em UE/mL e a data do vencimento estão impressas na etiqueta do frasco. Contém conservante. Estável entre 2-8ºC. Obs.: O kit mantém o mesmo desempenho após a primeira utilização, e é estável até a data de validade descrita no rótulo, desde que mantido na temperatura indicada (2-8ºC). AMOSTRAS Usar amostra de soro ou plasma livre de hemólise, lipemia e contaminação. A amostra pode ser conservada em geladeira entre 2-8 ºC por 48 horas. Para longo tempo, devem ser mantidas no freezer a - ºC. Amostras congeladas devem ser cuidadosamente homogeneizadas antes do teste. Evitar a formação de espuma. Repetidos congelamentos e descongelamentos podem causar falsos resultados. MATERIAL NECESSÁRIO, MAS NÃO FORNECIDO Ÿ Micropipeta de 5 µl e 1000 µl e ponteiras. Ÿ Água deionizada para diluição do tampão de lavagem. Ÿ Agitador de microplaca. Ÿ Incubador com temperatura de 37 ºC. Ÿ Leitor de microplaca com filtro de 450 nm. Ÿ Lavadora de microplaca. Ÿ Papel absorvente. Ÿ Recipiente para descarte de material. PROCEDIMENTO IMPORTANTE: Medidas de absorbância bicromática usando um filtro de referência com comprimento de onda de 630 nm é recomendado quando disponível. Nesta condição, o uso do blank deve ser desconsiderado, uma vez que ele somente deve ser usado quando utilizado um único filtro de 450 nm. 1. De acordo com o plano estabelecido de distribuição na placa, usar 1 cavidade para o calibrador-ana (7), 1 cavidade para o soro controle negativo (8) e 1 cavidade para o soro controle positivo (9). Usar 1 cavidade para o blank, a qual conterá somente 100 µl do diluente de amostra (5).

4 Preparar diluição das amostras a serem testadas a 1:101 (5 µl da amostra µl do diluente de amostra (5)). 3. Dispensar 100 µl do calibrador-ana (7), soro controle negativo (8), soro controle positivo (9) e amostras (1:101) nas cavidades da microplaca. Usar uma cavidade para o blank se a leitura for monocromática, dispensando nesta 100 µl do diluente de amostra (5). Usar ponteiras individuais para cada pipetagem, evitando com isso contaminação. 4. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa, ou por vibração mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 5. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 6. Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante, tendo o cuidado de evitar contaminação entre as cavidades. 7. Lavar a placa 4 vezes com a solução de lavagem (2) (ver Preparação e Estabilidade dos Reativos). Aspirar o conteúdo da microplaca, dispensar 350 µl de solução de lavagem (2) em cada cavidade, aguardar 30 segundos e esvaziar o conteúdo das cavidades. Repetir 3 vezes este procedimento (total de 4 ciclos). Recomenda-se o uso de uma lavadora de microplaca manual ou automática. ATENÇÃO: O correto procedimento de lavagem é fundamental para uma boa performance do ensaio. 8. Após a última lavagem, inverter a placa e batê-la sobre papel absorvente para remover todo o líquido residual. 9. Dispensar 100 µl do conjugado (3) em todas as cavidades, exceto no blank. 10. Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 11. Repetir as etapas 6 a Dispensar 100 µl do substrato cromógeno (TMB) (4) em cada cavidade da microplaca, exceto no blank. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 13. Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos, protegendo da luz. 14. Bloquear a reação dispensando 100 µl da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca, exceto no blank. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos. 15. Ler a absorbância (D.O.) em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm, contra o blank, dentro de 60 minutos. NOTA: recomenda-se usar um duplo comprimento de onda utilizando um filtro de referência de 630 nm quando disponível. IMPORTANTE: O procedimento de lavagem é crítico para o desempenho do teste. Lavagens insuficientes resultarão leituras pouco precisas ou absorbâncias falsamente elevadas. A realização dos testes em duplicata, embora não obrigatória, é recomendada. O tempo levado para pipetagem das amostras e controles não deve exceder 30 minutos. RESUMO DO PROCEDIMENTO 1. Pipetar 100 µl do calibrador-ana (7), controle negativo (8), controle positivo (9), amostras (1:101) e blank (leitura monocromática) nas respectivas cavidades. 2. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a T.A. por 30 minutos. 3. Descartar o conteúdo da microplaca dentro de um recipiente contendo solução desinfetante e lavar 4 vezes com solução de lavagem (2). 4. Descartar completamente o conteúdo da última lavagem, removendo todo o líquido residual. 5. Pipetar 100 µl do conjugado (3) em cada cavidade da placa, exceto blank. 6. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a T.A. por 30 minutos. 7. Repetir as etapas 3 e Pipetar 100μl do substrato cromógeno (4) em cada cavidade da placa, exceto no blank. Haverá mudança na cor da reação onde houver peroxidase. 9. Homogeneizar por 30 segundos e Incubar a T.A. por 30 minutos. Protegendo da luz 10. Pipetar 100 µl da solução stop (6) em cada cavidade da microplaca. 11. Homogeneizar por 30 segundos. 12. Ler a D.O. em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm contra o blank, ou um duplo comprimento de onda (450/630 nm), dentro de 30 minutos. A B C D E F G H EJEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUICIÓN EN LA MICROPLACA 1 Blank Controle neg. Controle pos. Calibrador A1 A2 A3 A4 2 A5 A6 A7 A8 A9 A CÁLCULOS DE LOS RESULTADOS Determinar para cada test y sueros controles la densidad óptica (D.O.), cuyo valor final se obtiene restando de la lectura de la D.O. el valor del blank. Si dupla longitud de onda dual se utiliza, lo "blanco" se omite, y por lo tanto las lecturas de D.Os. se utilizan sin sustracción. Si más de una placa que se utiliza debe ser considerado por separado para el cálculo y la interpretación de los resultados. Determinar la concentración de las muestras a través de la siguiente ecuación: D.O. de la Muestra x UE/mL de lo Calibrador = UE/mL de la Muestra D.O. de lo Calibrador Advertencia: Se recomienda que los resultados cualitativos se reportan como "REACTIVO" o "NO REACTIVO". Las muestras con resultados superiores a 25 UE/mL se consideran Reactiva. VALIDACIÓN DEL TEST: El test es válido si: La D.O. del "blank", que contiene solamiente lo diluyente de muestra, debe ser inferior a 0,3 a 450 nm. Lo valor de la D.O. de lo Calibrador debe ser igual o superior a 1.0, de lo contrario, la prueba debe repetirse. La concentración de lo controle negativos debe ser inferior a UE/mL. La D.O. de lo calibrador debe ser mayor que el D.O. del control negativo y menor que el D.O. del control positivo. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS REACTIVO : concentración de la muestra > 25 UE/ml. NO REACTIVO : concentración de la muestra < UE/ml. BORDERLINE : concentración de la muestra entre - 25 UE/ml IMPORTANTE: 1. Los valores anteriores son sólo un guía para interpretación de los resultados. Es recomendable que cada laboratorio establecer su propio rango de referencia. 2. Los valores superiores a 25 EU/mL deben ser testadas para determinar la especificidad (anti-sm, anti-rnp, anti-ro, anti-la, anti-scl- 70, anti-adn, y anti-histona) y los niveles de anticuerpos. VALORES ESPERADOS Los valores esperados en una población normal es no reactivo (< UE/mL). Sin embargo, algunos individuos asintomáticos, aparentemente sano, puede probar reactivo para ANA. Muestras Clinicas probadas con el Imuno-ELISA ANA (Triaje), cuyos resultados muestran la incidencia de estos anticuerpos en varios grupos de estudio, como se muestra en la siguiente tabla: Grupos de Pacientes* Incidencia LES Esclerodermia EMTC 100 Síndrome de Sjögren Poli/Dermatomiositis Artritis Juvenil -50 Raynaud -60 Artritis Reumatoide Enfermedad de la tiroides Fibromialgia Individuos normales ~ 10 * Referencia Bibliográfica 3

5 15 04 solamente 100μl de diluyente de muestra (5). 2. Preparar dilución de muestras a ser testeadas a 1:101 (5 µl de muestra µl de la muestra diluyente (5)). 3. Dispensar 100 µl de lo calibrador ANA (7), suero control negativo (8), suero control positivo (9) y muestras (1:101 ) en los pocillos de la placa de microtitulación. Usar 1 pocillo para el blank, si la lectura es monocromático, dispensando 100μl de diluyente de muestra (5). Usar puntas de pipeta individuales para cada pipeteo, evitando la contaminación.. 4. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 5. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 6. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante, teniendo cuidado de evitar la contaminación entre pocillos. 7. Lavar la placa 4 vezes con la solución de lavado (2) (ver Preparación y Estabilidad de los Reactivos). Aspirar el contenido de la microplaca, dispensar 350μl de solución de lavado (2) en cada pocillo, esperar 30 segundos y vaciar el contenido de los pocillos. Repetir 3 veces este procedimiento (total de 4 ciclos). Se recomienda el uso de una lavadora de microplacas, automática o manual. ADVERTENCIA: Es fundamental, para un buen desempeño del ensayo, que los procedimientos de lavado sean adecuados. 8. Después del último lavado, invertir la placa y golpearla sobre papel absorbente para eliminar cualquier residuo líquido. 9. Dispensar 100μl del conjugado (3) en todos los pocillos, excepto el blank. 10. Cubrir la placa con papel adhesivo e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 11. Repetir los pasos 6 al Dispensar 100μl del sustrato cromógeno (TMB) (4) en cada pocillo de la microplaca, excepto el blank. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 13. Incubar a 37 C durante 30 minutos, protegerlo de la luz. 14. Bloquear la reacción dispensando 100μl de la solución Stop (7) en cada pocillo de la microplaca, inclusive el blank. Homogeneizar suavemente, tamborileando con los dedos sobre los bordes de la placa o por vibración mecánica (agitador de placa) por 30 segundos. 15. Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank del sustrato, en un plazo de 60 minutos. NOTA: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. IMPORTANTE: El procedimiento de lavado es fundamental para el desempeño del test. Un mal lavado dará lugar a lecturas inexactas o absorbancias falsamente elevadas. Se recomienda la realización de los tests por duplicado, aunque no sea obligatorio. El pipeteo de las muestras y los controles no debe exceder 30 minutos. RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO 1. Dispensar 100μl del calibrador ANA (7) control negativo (8), control positivo (9), muestras (1:101), y blank (lectura monocromatica) en sus respectivos pocillos. 2. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 3. Descartar el contenido de la placa en un recipiente con solución desinfectante y enjuague 4 vezes con solución de lavado (2). 4. Descartar completamente el contenido del último lavado, eliminando todo el residuo líquido. 5. Dispensar 100μl del conjugado (3) en cada pocillo de la placa, excepto el blank. 6. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. 7. Repetir los passos 3 y Dispensar 100μl del sustrato cromógeno (4) en cada pocillo de la microplaca, excepto el blank. Cambio de color aparecerá donde está presente la enzima peroxidasa. 9. Homogeneizar por 30 segundos e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos. Protegido de la luz 10. Dispensar 100 µl de la Solución Stop (6) en cada uno de los pocillos de la microplaca. 11. Homogeneizar por 30 segundos. 12. Leer la absorbancia (D.O.) en un lector de microplacas con un filtro de 450 nm, contra el blank del sustrato, o en una doble onda (450/630 nm), en un plazo de 30 minutos. A B C D E F G H EXEMPLO DE ESQUEMA DE DISTRIBUIÇÃO NA MICROPLACA 1 Blank Controle Neg. Controle pos. Calibrador A1 A2 A3 A4 2 A5 A6 A7 A8 A9 A CÁLCULOS DOS RESULTADOS Determinar para cada teste e soros controles a densidade óptica (D.O.), cujo valor final é obtido subtraindo da leitura da D.O. do blank. Se duplo comprimento de onda é usado o blank é omitido e, portanto, as leituras das D.Os. são usadas sem subtração. Se mais do que uma microplaca é utilizada elas deveriam ser consideradas separadamente para cálculos e interpretação dos resultados. Determinar a concentração das amostras através da seguinte equação: D.O da Amostra x UE/mL do Calibrador = UE/mL da Amostra D.O do Calibrador Atenção: Recomenda-se que os resultados qualitativos sejam informados como REAGENTES ou NÃO REAGENTES. As amostras com resultados superiores a 25 UE/mL são consideradas Reagentes. VALIDAÇÃO DO TESTE: O teste é válido se: A D.O. do blank, que contém somente o diluente de amostra, deve ser menor do que 0,3 a 450 nm. O valor da D.O. do Calibrador deve ser igual ou superior a 1,0, caso contrário o teste deve ser repetido. A concentração do controle negativo deve ser inferior a UE/mL. A D.O. do Calibrador deve ser superior à D.O. do controle negativo e inferior à D.O. do controle positivo. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS REAGENTE : concentração da amostra > 25 UE/mL. NÃO REAGENTE : concentração da amostra < UE/mL. BORDERLINE : concentração da amostra entre 25 UE/mL IMPORTANTE: 1. Os valores acima servem apenas como orientação para a interpretação dos resultados. É recomendável que cada laboratório determine seus próprios valores de referência normais. 2. Valores superiores a 25 UE/mL deveriam ser testados para determinar a especificidade (anti-sm, anti-rnp, anti-ro, anti-la, anti-scl-70, anti-dna e anti-histona) e os níveis de anticorpos. VALORES ESPERADOS Os valores esperados numa população normal são não reagentes (< UE/mL). No entanto, alguns indivíduos assintomáticos, aparentemente saudáveis, podem apresentar testes reagentes para ANA. Foram testadas amostras clínicas com o Imuno-ELISA ANA (Triagem), cujos resultados demonstram a incidência desses anticorpos nos vários grupos estudados, conforme é mostrado no quadro abaixo: Grupos de Pacientes* Incidência LES Esclerodermia DMTC 100 Síndrome de Sjögren Poli/Dermatomiosite Artrite Juvenil -50 Raynaud -60 Artrite Reumatóide Doença da Tireóide Fibromialgia Indivíduos Normais ~ 10 * Referência bibliográfica 3

6 05 14 SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DO TESTE SENSIBILIDADE ANALÍTICA Em um estudo realizado com 292 amostras de soro obtidas de um Laboratório de referência, das quais 130 eram positivas e 162 negativas foram determinadas a sensibilidade e especificidade do kit Imuno-ANA (Triagem) da WAMA em comparação com o Kit IMUNO-CON ANA-HEp2 da WAMA. Sensibilidade = Verdadeiros Positivos / (Verdadeiros Positivos + Falsos Negativos) x 100 Especificidade = Verdadeiros Negativos / (Verdadeiros Negativos + Falsos Positivos) x 100 Verdadeiros Positivos RESULTADO 124 Falsos Verdadeiros Falsos Sensibilidade Especificidade Positivos Negativos Negativos ,38 96,3 PRECISÃO DO TESTE a. Precisão Intra-Ensaio A precisão intra-ensaio foi determinada ensaiando 2 amostras de soros, uma reagente e outra não reagente, em replicatas. Amostras Positivas Alta Baixa Número de Vezes Média das Absorbâncias 27,23 7,67 Desvio Padrão 1,49 0,63 5,50% 8,31% b. Precisão Inter-Ensaio c. A precisão inter-ensaio foi determinada ensaiando 2 amostras de soros, uma reagente e outra não reagente, em replicatas, sendo 10 replicas para cada lote estudado e por operadores diferentes. Amostras Positivas Alta Baixa Número de Vezes Média das Absorbâncias 27,05 7,74 Desvio Padrão 1,61 0,57 5,95% 7,45% RECUPERAÇÃO Amostras com concentrações conhecidas de ANA foram misturadas com diluições apropriadas de outras amostras positivas com quantidades conhecidas de ANA. Foi então determinado os níveis de ANA das amostras misturadas e calculado a porcentagem de recuperação a partir dos valores obtidos. Os resultados são mostrados na tabela a seguir: Amostras Concentração Conhecida (UE/mL) Concentração da Mistura (UE/mL) % Recuperação Mistura/Conhecida Amostra 1 82,2 91,6 111,4 Amostra 2 93,4 93,5 100,1 Amostra 3 62,0 66,9 98,4 ESPECIFICADADE ANALÍTICA Não foi demonstrada interferência significativa para as seguintes substâncias nas concentrações indicadas: Hemoglobina (até 2g/L), Bilirrubina (até 342 µmol/l) e Fator Reumatóide (até 100 UE/mL). Para se determinar a reatividade cruzada do Imuno-ELISA ANA (Triagem) foram testadas 55 amostras de outras doenças autoimunes normalmente conhecidas como negativas para ANA, tal como o Pênfigo. Somente 4 amostras foram positivas, estando dentro da faixa de positividade para indivíduos normais. 6. Solución Stop (2 x 12 ml) 7. Calibrador ANA (2 x 1,5 ml) 8. Suero control negativo (2 x 1,5 ml) 9. Suero control positivo (2 x 1,5 ml) 10. Instrucciones de uso PREPARACIÓN Y ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS Ÿ MICRO PLACA (1): Retirar de la sobre la cantidad de tiras que se utilizarán, y dejar que alcancen a temperatura ambiente ( - 25 C). Las tiras que no se utilicen deben regresar al sobre laminado, con desecante, y se mantendrá a 2-8 C. Ÿ SOLUCIÓN DE LAVADO (2): Disolver el contenido (en polvo) de 1 botella en 1000 ml de agua destilada o desionizada. Durante cada ciclo de lavado, cada pocillo debe completarse con, aproximadamente 350 μl. Conservar entre 2 y 8 C. Dejar que alcance la temperatura ambiente ( - 25 C) antes de usar. Ÿ CONJUGADO ANTI-IgG HUMANA MARCADO CON PEROXIDASA (3): listo para usar. Estable entre 2-8 C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente ( - 25 C) antes de usar. Ÿ SUSTRATO CROMÓGENO (TMB) (4): Solución estabilizada con tetrametilbencidina. Listo para usar. Estable a 2-8 C hasta que fecha de vencimiento impresa en el envase. No congelar. Dejar que alcance la temperatura ambiente ( - 25 C) antes de usar. Lo TMB no es mutagénico ni carcinogénico. Ÿ DILUYENTE DE MUESTRA (5): listo para usar. Estable entre 2-8 C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. Ÿ SOLUCIÓN STOP (6): Listo para usar. Contiene ácido sulfúrico (H2SO4). Manejar con cuidado. Corrosivo. En caso de contacto con la piel, lavar abundantemente en agua corriente. Dejar que alcance la temperatura ambiente ( - 25 C) antes de usar. Estable C hasta la fecha de vencimiento impresa en el frasco. Ÿ CALIBRADOR ANA (7): Listo para usar. Producido de sueros humanos que contiene ANA. La concentración en UE/mL y de la fecha de vencimiento se imprimen en la etiqueta de cada botella. Contiene conservante. Estable entre 2 y 8 C. Lo uso de Calibrador ANA es para determinar resultados cualitativos y los valores en unidades. El Calibrador ANA deben utilizarse siempre en cada prueba realizada. Ÿ SUERO DE CONTROL NEGATIVO (8): listo para usar. Suero humano negativo para ANA. Usar puro, en otras palabras, no diluido. Estable entre 2-8 C hasta la fecha de vencimiento impresa en el envase. Contiene conservante. Ÿ SUERO DE CONTROL POSITIVO (9): Listo para usar. Suero humano positivo para ANA. Usar puro, en otras palabras, no diluido. La concentración en UE/mL y de la fecha de vencimiento se imprimen en la etiqueta de cada botella. Contiene conservante. Estable entre 2-8 C. Nota: El kit mantiene el mismo rendimiento después de la primera utilización, y es estable hasta la fecha de vencimiento descripta en la etiqueta, siempre que se mantenga a la temperatura indicada (2-8ºC). ESPECÍMENES Usar muestras de suero o plasma libres de hemólisis, lipemia y contaminación. Las muestras se pueden conservar en refrigerador, entre 2-8 ºC, por 48 horas. Para un período mayor, deben guardarse en freezer a - ºC. Las muestras congeladas deberán homogeneizarse antes del test. Evite la formación de espuma. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, ya que esto puede producir resultados falsos. MATERIAL NECESARIO, NO SUMINISTRADO Ÿ Micropipeta de 5μl y 100μl y puntas de pipeta. Ÿ Agua destilada o desionizada, para dilución de tampón de lavado. Ÿ Agitador de microplaca. Ÿ Incubadora con una temperatura de 37 º C Ÿ Lector de micro placa con filtro de 450 nm. Ÿ Lavador de microplaca. Ÿ Papel absorbente. Ÿ Recipiente para descarte de material. PROCEDIMIENTO IMPORTANTE: Mediciones de absorbancia bicromático utilizando un filtro de referencia con longitud de onda de 630 nm filtro se recomienda cuando disponible. En esta condición, el uso de "blanco" debe ser descartado, ya que solo se utilizan cuando se utiliza un solo filtro de 450 nm. 1. De acuerdo con el plan establecido de distribución en la placa, usar 1 pocillo para el Calibrador ANA (7), 1 pocillo para lo suero control negativo (8) y 1 pocillo para el suero control positivo (9). Usar 1 pocillo para el blank, el cual contendrá

7 13 06 R E F ESPAÑOL IMPORTANCIA CLÍNICA Los anticuerpos antinucleares (ANA) son un grupo de anticuerpos contra varios antígenos nucleares y algunos antígenos citoplasmaticos. Las pruebas serológicas para ANA tienen un papel importante en el diagnóstico de varias enfermedades autoinmunes del tejido conectivo, especialmente en el Lupus Eritematoso Sistémico (LES), Esclerodermia, enfermedad mixta del tejido conectivo (EMTC) y síndrome de Sjögren. Normalmente, la ANA se detectan por inmunofluorescencia indirecta en células HEp-2. Debido a ciertas limitaciones de la IFI, existe una necesidad de un no-subjetivo para la detección de ANA. El enzyme-linked immuno ensayo (ELISA) ofrece muchas ventajas en comparación con el método de IFI en la detección de ANA, tales como la facilidad de uso y no necesidad de habilidades especiales para realizar y leer el reacciones de IFI. Porque ANA son indicadores sensibles, pero no específica, de una enfermedad del tejido conectivo, se recomienda llevar a cabo pruebas de anticuerpos específicos en pacientes con ANA positivo sospechos de tener enfermedad autoinmune del tejido conectivo. También sugerimos que los resultados positivos de ANA en ELISA sean confirmados a través del IFI con células HEp-2, ya que puede ayudar en la identificación de las normas de fluorescencia, lo que sugiere de varios anticuerpos específicos para la enfermedad autoinmune. Lo Imuno-ELISA ANA (Triaje) de WAMA es una prueba inmunoenzimática para la triaje de la presencia de anticuerpos antinucleares (ANA) y citoplasmaticos en el suero humano, como auxiliar en el diagnóstico de enfermedades autoinmunes, como el LES, Síndrome de Sjögren, EMTC y Esclerodermia. La especificidad de los resultados positivos pueden ser identificadas por determinación individual de anticuerpos específicos anti-sm, anti- RNP, anti-ro, anti-la, anti-scl-70, anti-dna y anti-histonas. PRINCIPIO DEL MÉTODO Los pocillos de la placa de micrititulación se recubren con antígeno purificado de celulas HEp-2, otros antigenos nucleares y antigenos citoplasmaticos (fase sólida). Cuando anticuerpos antinucleares o anticitoplasmatico están presentes en la muestra de suero, se ligan a las proteínas de la fase sólida. El material no ligado se elimina mediante lavado. Un conjugando de anti-igg humana de marcado con peroxidasa se liga a los anticuerpos ligados a la fase solida. El material no ligado se elimina mediante lavado. Un sustrato (TMB) es adicionado, el cual detecta la presencia de anticuerpos a través del cambio de color en la reacción. Una solución stop para bloquear la reacción enzimática es adicionada y se mide la absorbancia de la reacción a 450 nm). La concentración de anticuerpos es directamente proporcional a la intensidad de la reacción. Los resultados se expresan en unidades ELISA por mililitro (UE/mL) y se reportan como reactivo o no reactivo. LIMITAÇÕES DE USO Ÿ O teste Imuno-ELISA ANA (Triagem) da WAMA foi desenvolvido para se obter a mais alta sensibilidade e especificidade. Entretanto, devido à possibilidade de falsos resultados reagentes e interferência com outras doenças, resultados repetidamente reagentes devem ser sempre interpretados com as informações clínicas do paciente e com os resultados de outros testes laboratoriais. Ÿ Amostras reagentes que se tornam não reagentes quando retestadas devem ser consideradas não reagentes. Ÿ Devido à alta sensibilidade dos testes ELISA, falsos resultados reagentes podem ocorrer devido a várias razões, muitas das quais estão relacionadas, mas não limitadas, à inadequada etapa de lavagem. Ÿ A prevalência da doença na população avaliada afetará o valor preditivo do teste. PRECAUÇÕES E ADVERTÊNCIAS 1. Os reagentes devem ser conservados entre 2 8 ºC. 2. A data de validade corresponde ao último dia do mês assinalado nos rótulos dos frascos e da caixa do kit. 3. Deve ser evitado expor os reagentes a temperaturas elevadas, bem como diretamente ao sol. 4. Não congelar nenhum reagente, pois isto causará deterioração irreversível. 5. O Imuno-ELISA ANA (triagem) contém materiais de origem humana, os quais foram testados, com resultados negativos para anticorpos anti-hiv I e II, anti-h e antígeno de superfície da Hepatite B (HBsAg). Porém, como nenhum método diagnóstico oferece completa segurança da ausência destes e de outros agentes infecciosos, recomenda-se tratar os reagentes como material potencialmente infeccioso, bem como ter o mesmo cuidado no descarte destes materiais. 6. Não utilizar reagentes ou microplacas de lotes diferentes. 7. Deixar os reagentes adquirir a temperatura ambiente ( 25 ºC) antes de iniciar os testes. 8. Os reagentes devem ser homogeneizados levemente por inversão e tampados imediatamente após o uso. 9. Não deixar os cavidades da microplaca secar durante o ensaio. 10. Evitar repetidas pipetagens dos reagentes estoques, pois isso pode causar contaminação. 11. As amostras a serem testadas e os soros controles devem ser utilizados ao mesmo tempo para manter as mesmas condições do teste. 12. Não usar reagentes após a data de validade. 13. Não reutilizar qualquer um dos reagentes. 14. Descartar o material conforme regulamentações locais. 15. Utilizar a Boas Práticas de Laboratórios (BPLs) na conservação, manuseio e descarte dos materiais. TERMO DE GARANTIA A WAMA Diagnóstica garante a troca deste conjunto diagnóstico, desde que o mesmo esteja dentro do prazo de validade e que seja comprovado por sua assessoria técnica que não houve falhas na execução, manuseio e conservação deste produto. A WAMA e seus distribuidores não se responsabilizarão por falhas no desempenho do kit sob essas condições. PRESENTACIÓN DEL KIT R E F 4096-E - 96 determinaciones 1. Microplacas con pocillos recubiertos con antígenos antinucleares y anticitoplasmaticos purificados (12 tiras extraíbles con 8 pocillos cada uno) 2. Solución de lavado: en polvo (2 botellas) 3. Conjugado anti-igg humana marcada con peroxidasa (1 x 12 ml) 4. Sustrato Cromógeno (TMB) (1 x 12 ml) 5. Diluyente de Muestra (1 x 60 ml) 6. Solución Stop (1 x 12 ml) 7. Calibrador ANA (1 x 1,5 ml) 8. Suero control negativo (1 x 1,5 ml) 9. Suero control positivo (1 x 1,5 ml) 10. Instrucciones de uso R E F E determinaciones 1. Microplacas con pocillos recubiertos con antígenos antinucleares y anticitoplasmaticos purificados (24 tiras extraíbles con 8 pocillos cada uno) 2. Solución de lavado: en polvo (4 botellas) 3. Conjugado anti-igg humana marcada con peroxidasa (2 x 12 ml) 4. Sustrato Cromógeno (TMB) (2 x 12 ml) 5. Diluyente de Muestra (2 x 60 ml)

8 07 12 ENGLISH SUMMARY The antinuclear antibodies (ANA) are a group of antibodies against several nuclear antigens and some cytoplasmic antigens. The serologic tests for ANA has an important role in the diagnosis of several autoimmune diseases of the connective tissue, especially in Systemic Lupus Erythematosus (SLE), scleroderma, mixed connective tissue disease (MCTD) and Sjögren's syndrome. Commonly, the ANA are detected by indirect immunofluorescence on HEp-2 cells. Due to certain limitations of IFI, there was a need for a non-subjective method for the detection of ANA. The Enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) offers many advantages compared to the IFI method in the ANA detection, such as the ease of use and no need for special skill to perform and read the IFI reactions. Because ANA are sensitive indicators, but not specific, a disease of the connective tissue, it is recommended to perform the specific antibodies tests in patients with positive ANA suspect of having autoimmune disease of the connective tissue. We also suggest that positive results of ANA in ELISA be confirmed through IFI with HEp-2 cells, because it can assist in the identification of fluorescence standards, which suggests the several specific antibodies for the autoimmune disease. The Imuno-ELISA ANA (Screening) from WAMA is an immunoenzymatic test for screening for the presence of antinuclear antibodies (ANA) and cytoplasmic in human serum, as auxiliary in the diagnosis of autoimmune diseases, such as SLE, Sjögren syndrome, mixed connective tissue disease (MCTD) and scleroderma. The specificity of positive results can be identified by individual determination of specific antibodies anti-sm, anti-rnp, anti-ro, anti-la, anti-scl-70, anti-dna and anti-histone. PRINCIPLE OF THE METHOD The microtiter wells of the plate are covered with antigens purified from HEp-2 cells, other nuclear antigens and cytiplasmatic antigens (solid phase). When anti-nuclear or anti-cytoplasmatic antibodies are present in the serum sample, they bind to proteins from the solid phase. Material not bound is removed by washing. An anti-human IgG conjugated to peroxidase will bind to the antibodies linked to the solid phase. Unbound conjugate is removed by washing. A substrate (TMB) is added, which detects the presence of antibodies through the change of color in the reaction. A stop solution to block the enzymatic reaction is added and the reaction absorbance is measured at 450 nm. The concentration of antibodies is directly proportional to the intensity of the reaction color. The results are expressed as ELISA units per milliliter (EU/mL) and reported as reactive or non-reactive. the results of other laboratory tests. Reactive samples that become non-reactive when retested must be considered not reactive. Due to the high sensitivity of ELISA tests, false reactive results may occur due to various reasons, many of which are related, but not limited to, improper washing step. The prevalence of the disease in the evaluated population will affect the predictive value of the test. PRECAUTIONS AND WARNINGS 1. The reagents should be kept between 2-8 ºC. 2. The expiry date refers to the last day of the month indicated on the labels of the vial and of the kit box. 3. Avoid exposing the reagents to high temperatures and direct sunlight. 4. Do not freeze the reagent, as this may cause irreversible damage. 5. The Imuno-ELISA ANA (screening) contains materials of human origin, which have been tested, with negative results for anti-hiv I and II antibodies, anti-h and Hepatitis B surface antigen virus (HBsAg). However, as no diagnostic method offers complete safety, in the absence of these and other infectious agents, it is recommended to treat all the reagents as potentially infectious materials, as well as having the same care when disposing these materials. 6. Do not use reagents or microplates fof different batches. 7. Allow the reagents to reach the room temperature ( -25ºC) before starting the test. 8. The reagents should be homogenized gently by inversion and capped immediately after use. 9. Do not let the wells of microtiter plates dry during the test. 10. Avoid repeated pipetting the reagents,because this could cause contamination. 11. The samples to be tested and the serum controls should be used at the same time to maintain the same test conditions. 12. Do not use the reagent after the expiration date. 13. Do not it reuse any one of the reagents. 14. Discard the material following local regulations. 15. Use the Good Laboratory Practices (GLPs) in storage, handling and disposal of materials. WARRANTY WAMA Diagnóstica guarantees the exchange of the diagnostic kit, provided it is within the expiration date and is proven by its technical support that there were no technical mistakes in the execution, handling and storage of this product. WAMA and its distributors are not liable for failures on the performance of the kits under these conditions. KIT PRESENTATION R E F 4096-E - 96 determinations 1. Microplate with wells coated with purified anti-nuclear and anti-cytoplasmatic antigen (12 removable strips with 8 wells each) 2. Washing solution - powder (2 bottles) 3. Anti-human IgG conjugate marked with peroxidase (1 x 12 ml) 4. Chromogen Substrate (TMB) (1 x 12 ml) 5. Sample Diluent (1 x 60 ml) 6. Stop Solution (1 x 12 ml) 7. ANA Calibrator (1 x 1.5 ml) 8. Negative Serum Control (1 x 1.5 ml) 9. Positive Serum Control (1 x 1.5 ml) 10. Instructions for use R E F E determinations 1. Microplate with wells coated with purified anti-nuclear and anti-cytoplasmatic antigen (24 removable strips with 8 wells each) 2. Washing solution - powder (4 bottles) 3. Anti-human IgG conjugate marked with peroxidase (2 x 12 ml) 4. Chromogen Substrate (TMB) (2 x 12 ml) 5. Sample Diluent (2 x 60 ml) 6. Stop Solution (2 x 12 ml)

9 11 08 SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF THE TEST In a study conducted with 292 samples of serum obtained from a reference laboratory, of which 130 were positive and 162 negative, the sensitivity and specificity were determined for the Imuno-ANA (Screening) from WAMA in comparison to the Kit IMUNO-CON ANA-HEp2 from WAMA. Sensitivity = True Positive / (True Positive + False Negative) x 100 Specificity = True Negative / (True Negative + False Positive ) x 100 True Positives RESULTS 124 False True Falses Sensitivity Especificity Positives Negatives Negatives ,38 96,3 PRECISION OF THE TEST: a. Intra-Assay Precision The intra-assay precision was determined by assaying 2 samples of sera, one reactive and one non-reactive, in replicates. Positive Samples High Low Number of times Average of Absorbances 27,23 7,67 Deviation Standard 1,49 0,63 5,50% 8,31% b. Inter-Assay Precision c. The inter-assay precision was determined by assaying 2 serum samples, one reactive and another not reactive, in replications, being 10 replicas for each lot and by different operators. Positive Samples High Low RECOVERY Samples with known concentrations of ANA were mixed with appropriate dilutions of other positive samples of known ANA amounts. The levels of ANA were determined from the mixed samples and the percent recovery calculated from the values obtained. The results are shown in the table below: Amostras Number of times Known Concentration (EU/mL) Average of Absorbances 27,05 7,74 Mixture Concentration (EU/mL) Deviation Standard 1,61 0,57 % Recovery Mixture/Known Sample 1 82,2 91,6 111,4 Sample 2 93,4 93,5 100,1 Sample 3 62,0 66,9 98,4 5,95% 7,45% ANALYTICAL SPECIFICITY It was not demonstrated significant interference for the following substances at the indicated concentrations: Hemoglobin (up to 2g/L), bilirubin (up to 342 µmol/l) and rheumatoid factor (up to 100 EU/mL). To determine the cross-reactivity of Imuno-ELISA ANA (Screening) were 55 samples from other autoimmune disease commonly known as negative for ANA, as well as Pemphigus. Only 4 samples were positive, as it is within the range of positivity for normal individuals. LIMITATIONS OF USE The test Imuno- ELISA ANA (Screening) from WAMA was developed to obtain the highest sensitivity and specificity. However, due to the possibility of false results reagents and interference with other diseases, results repeatedly reactive should always be interpreted with clinical information from the patient and with 7. ANA Calibrator (2 x 1.5 ml) 8. Negative Serum Control (2 x 1.5 ml) 9. Positive Serum Control (2 x 1.5 ml) 10. Instructions for use REAGENT PREPARATION AND STABILITY Ÿ MICROPLATE (1): Remove from the envelope the strips that will be used, and allow it to reach room temperature ( 25 C). The strips that will not be used must be returned to the sealing envelope, with desiccant, and kept at 2 8 C. Ÿ WASH SOLUTION (2): Dissolve the contents (powder) of 1 bottle in 1000 ml of distilled or deionized water. During each wash cycle, each well must be washed filled with approximately 350µl. Keep at 2-8ºC. Allow it to reach room temperature ( 25 C) before using it. Ÿ ANTI-HUMAN IgG\ CONJUGATE TAGGED WITH PEROXIDASE (3): ready to use. Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature ( 25 C) before using it. Ÿ CHROMOGEN SUBSTRATE (TMB) (4): solution stabilized with Tetramethyl Benzidine. Ready to use. Stable at 2 8 C until expiration date printed on the bottle. Do not freeze. Allow it to reach room temperature ( 25 C) before using it. The TMB is not mutagenic and not carcinogenic. Ÿ SAMPLE DILUENT (5): ready for use. Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. Ÿ STOP SOLUTION (6): ready to use. Contains sulfuric acid (H2SO4). Handle with care. Corrosive. On skin contact, immediately flush with large amounts of water. Allow it to reach room temperature ( 25 C) before using it. Stable at until expiration date printed on the bottle. Ÿ ANA CALIBRATOR (7): ready to use. Made from human sera containing ANA. The concentration in EU/mL and the expiration date are printed on the label of the bottle. Contains preservative. Stable at 2-8 C. The use of ANA Calibrator is to determine qualitative results and values in units. The ANA Calibrator must always be used in each test performed. Ÿ NEGATIVE SERUM CONTROL (8): ready for use. Negative human serum to ANA. Use it as is (do not dilute it). Stable at 2 8 C up to the expiration date printed on the bottle. Contains preservative. Ÿ POSITIVE SERUM CONTROL (9): ready to use. Positive human serum to ANA. Use it as is (do not dilute it). The concentration in EU/mL and the expiration date are printed on the label of the bottle. Contains preservative. Stable at 2-8 C. Note.: The kit has the same performance after first use, and is stable until the expiration date described on the label if it is kept in the indicated temperature (2-8 C). SPECIMENS Use serum or plasma specimens not hemolysed, lipemic or contaminated. The sample can be stored covered in refrigerator at 2-8 C for 48 hours. For long-term storage, serum or plasma must be kept in the freezer at ºC. Frozen specimens must be carefully homogenized before testing. Avoid making foam. Avoid repeated freeze and thawing as this may lead to false results. MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED Ÿ Micropipette of 5 µl and 1000 µl and tips. Ÿ Deionized water for dilution of the wash buffer Ÿ Microplate shaker. Ÿ Incubator at 37 C. Ÿ Microplate reader with 450nm filter. Ÿ Microplate washer. Ÿ Absorbent paper. Ÿ Container for material disposal PROCEDURE IMPORTANT: Bichromatic absorbance measurements using reference filter with wavelength of 630 nm is recommended when available. In this condition, the use of "blank" should be disregarded, since it should be used only when using a 450 nm single filter. 1. In accordance with the plan established plan for the plate distribution, use 1 well for the ANA Calibrator (7), 1 well for tne negative serum control (8), and 1 well for the serum positive control (9). Use 1 well for the "blank", which will contain only 100 µl of the sample diluent (5). 2. Prepare dilution of samples to be tested at 1:101 (5 µl of sample µl of the sample diluent (5)).