Enzimas. 1.Maiores velocidades de reacção

Transcrição

1 Enzimas

2 Enzimas Diferenças em relação aos catalisadores químicos: 1.Maiores velocidades de reacção P Com enzima reacção A P Sem enzima tempo

3 2. Condições de reacção mais suaves 3. Maior especificidade 3. Capacidade de regulação

4 História Anos: 1700 estudos sobre a digestão da carne por secreções do estômago Conversão do amido em açucar pela saliva e extractos de plantas (amilase)

5 1850 Pasteur a fermentação do açucar em álcool pelas leveduras era catalisada por fermentos, inseparáveis das células vivas vitalismo.

6 1893 Ostwald - enzima = catalisador Fischer: -teoria chave-fechadura 1897 Eduard Buchner as moléculas do extracto de levedura responsáveis pela conversão de açucar a etanol, continuavam a funcionar quando removidas das células. É uma molécula!?

7 1877 Kühne: in zyme enzima

8 Sumner: - urease cristal É uma proteína!

9 1905 Harden e Young: coenzima isolado(nad + ) 1909 Sorensen: escala de ph 1913 Michaelis e Menten: teoria cinética 1925 Briggs e Haldane: teoria cinética modificada

10 1931 Lineweaver e Burk determinação das constantes cinéticas Hirs, Moore e Stein ribonuclease (estrutura primária) 1962 Phillips lisozima (estrutura terciária) 1970 Chang e Cohen clonagem do gene do β-lactamase de Staphylococcus aureus em E. Coli 1982 produção de mutante de tirosil-rna sintetase por mutagénese dirigida

11 Mas todos os enzimas são realmente proteínas? Cech 1968 ribozimas - RNA com actividade catalítica Wade 1997 abzimas - anticorpo monoclonal com actividade catalítica.

12 Aplicações industriais de enzimas DISTRIBUIÇÃO DO MERCADO 29% 15% 10% 14% 32% p.lácteos deterg. texteis amido outros (2x) (2x) Godfrey,T., West, S.(eds)Industrial Enzimology, Macmillan, London(1990)

13 Indústria Função dos enzimas alimentos quebra do xarope de amido em xarope de glucose (osidases); isomerização de glucose em frutose, mais doce logo menor quantidade (isomerase); hidrólise da sacarose em glucose e frutose (hidrolases); fabrico de adoçantes artificiais; alimentos bébé sumos de frutos detergentes biológicos carne medicamentos início da digestão da comida (proteases e lipases) impedir turvação (pectinase) anti-nódoas (proteases para as proteinas e lipases para as gorduras); amaciadores (celulases quebram os borbotos ) tornar mais tenra cancro, produção de drogas sintéticas (penicilina)

14 Enzimas em medicina enfarte miocárdio (diagnóstico) terapêutica

15 Desenvolvimentos da última década Sobre-expressão Mutagénese dirigida Mais estruturas Mais sequências + Modificar e estudar propriedades Novos métodos de cálculo automático + desenho molecular Desenho de novos biocatalisadores enzimas artificiais

16 Enzimas artificiais maior estabilidade térmica Ex: subtilisina com 8 aa substituidos vida média a 100 o passa de 30s para 170min

17 A maioria dos enzimas são proteínas! MM

18 Classificação internacional de enzimas Nº Classe Tipo de reacção 1 Oxidoreductases Transferência de electrões 2 Transferases Reacções de transferência de grupos 3 Hidrolases Reacções de hidrólise (transferência de grupos para a água) 4 Liases Adição de grupos a ligações duplas ou formação de ligações duplas por remoção de grupos 5 Isomerases Transferência de grupos dentro da molécula para dar origem a formas isoméricas 6 Ligases Formação de ligações C-C, C-S, C-O e C-N, por reacções de condensação acopladas à hidrólise de ATP

19 Cada enzima tem um nome sistemático, um nº de classificação e um nome trivial Ex: O enzima que catalisa a reacção ATP + D-glucose ADP + D-glucose6-P Nome sistemático : ATP glucose fosfotransferase Nº de classificação: E.C E.C. Enzyme Commission 2- classe das transferases 7- subclasse fosfotransferase 1- fosfotransferase com um grupo hidroxilo como aceitador 1- D-glucose como aceitadora do grupo fosforilo Nome trivial : hexoquinase

20 Há enzimas que precisam de outras moléculas ou iões para a sua actividade Cofactores iões ou pequenas moléculas orgânicas (coenzimas) necessários à actividade enzimática. Os coenzimas podem estar transientemente ou permanentemente grupo prostético -ligados aos enzimas. Enzima + cofactor holoenzima Enzima sem cofactor apoenzima

21 Cofactores - iões inorgânicos Cu 2+ Ião Fe 2+ Fe 2+ K + Mg 2+ Mn 2+ Mo Ni 2+ Se Zn 2+ Citocromo oxidase Enzima Peroxidase, catalase, citocromo oxidase Piruvato cinase Hexocinase, 6-P-glucose fosfatase, piruvato cinase Arginase,ribonucleotido redutase Dinitrogenase Urease Glutationo peroxidase Anidrase carbónico, alcool desidrogenase, carboxipeptidases A e B

22 Coenzimas: moléculas orgânicas complexas ou organometálicas que transferem átomos específicos ou grupos funcionais coenzima Grupo transferido Precursor na dieta do mamífero Biocitina CO 2 biotina Coenzima A Grupos acilo Ácido pantoténico Coenzima B 12 H, grupos alquilo Vit B 12 FAD Electrões Riboflavina (Vit B 2 ) Lipoato Electrões, grupos acilo Não necess. na dieta NAD + Ião hidreto (:H - ) Ácido nicotínico Fosfato de piridoxal Grupos amina Piridoxina (Vit B 6 ) Tetrahidrofolato Grupos de 1C Folato Pirofosfato de tiamina Aldeídos Tiamina (Vit B 1 )

23 Os enzimas são altamente específicos: Estereoespecificidade reconhecem substratos quirais Especificidade geométrica são selectivos em relação aos grupos químicos dos substratos. Os enzimas variam no grau de especificidade geométrica

24 Regulação da actividade enzimática Controlo da quantidade de enzima Controlo da actividade enzimática

25 Funções termodinâmicas úteis para compreender o funcionamento dos enzimas Variação de energia livre de Gibbs entre os produtos e os reagentes Energia necessária para iniciar a conversão de reagentes em produtos

26 A variação da energia livre padrão de uma reacção está relacionada com a constante de equilíbrio Relação entre K eq e G o S P K eq = [P]/[S] G o = -RT lnk eq

27 Como é que os enzimas funcionam? Os enzimas fornecem um ambiente em que a reacção ocorre mais rapidamente. A reacção tem lugar no local activo do enzima. A molécula que se liga ao local activo é chamada substrato. Forma-se um complexo enzima-substrato

28 Os enzimas afectam as velocidades de reacção e não o equilibrio E + S ES EP E + P

29 Os catalisadores aumentam a velocidade das reacções baixando a energia de activação A reacção chega mais depressa ao equilíbrio

30 A velocidade de reacção é determinada pela concentração do(s) reagente(s) e pela constante de velocidade, k. v = k[s] A constante de velocidade de uma reacção está relacionada com a energia de activação: k = kt/h. e - G*/RT k constante de Boltzman h constante de Planck Uma energia de activação mais baixa significa uma maior velocidade de reacção para um reacção ser acelerada por um factor de 10, a energia de activação tem que baixar cerca de 5,7 kj/mole

31 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Catalisador E activ (Jmol -1 ) Pt coloidal Catalase 8 400

32 Como é que os enzimas conseguem aumentar tanto as velocidades das reacções? Interacções covalentes entre enzimas e substratos baixam a energia de activação fornecendo uma via reaccional alternativa com energia mais baixa. Formação de um complexo específico enzima substrato em que são formadas muitas interacções fracas. A energia libertada aquando da formação destas ligações contribui para a especificidade e para a catálise. As ligações fracas são optimizadas no estado de transição. Os locais activos são complementares do estado de transição e não do substrato.

33 Formação de um complexo enzima-substrato. As interacções fracas entre o enzima e o substrato são optimizadas no estado de transição

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35 Para baixar a energia de activação o sistema deve adquirir uma quantidade de energia equivalente à que diminui. Muita desta energia ( G B )vem da formação de ligações fracas entre o enzima e o substrato no estado de transição.

36 glucocinase PDB ID 2YHX

37 A catálise pode ser descrita formalmente em termos de estabilização do estado de transição através de ligação forte (tight binding) do reagente ao catalisador Jencks 1975 Ligação do reagente (substrato) ao centro activo do enzima(quimotripsina)

38 Aumentos de velocidade produzidos por enzimas: Ciclofilina Anidrase carbónico P-triose isomerase Carboxipeptidase A Fosfoglucomutase Succinil - coa transferase Urease Monofosfato de oritidina descarboxilase

39 O tamanho dos enzimas reflecte a necessidade de a superestrutura ter os grupos reactivos posicionados de modo correcto e de manter o local activo formado.

40 Os enzimas podem ser inibidos por moléculas específicas Inibição irreversível - os inibidores ligam-se covalentemente (ou não)ou destroiem um grupo funcional essencial para a actividade do enzima. A penicilina modifica por meio de ligações covalentes o enzima transpeptidase, impedindo a síntese das paredes bacterianas. A aspirina inibe o enzima que catalisa o 1º passo da síntese das prostaglandinas, compostos envolvidos nos processos de produção de dor.

41 Inactivadores-suicidas Compostos pouco reactivos que se ligam ao enzima no local activo, sofrem os primeiros passos da reacção normal mas não se transformam em produto. Convertem-se num composto muito reactivo que se combina irreversivelmente com o enzima. Design de fármacos Especificidade menos efeitos secundários

42 Inibição reversível Rápida dissociação do complexo enzima-inibidor. Inibição competitiva um inibidor competitivo compete com o substrato para o local activo do enzima. O inibidor é semelhante ao substrato. Substrato Inibidor competitivo Enzima Enzima

43 Ex. malonato (inibidor) e succinato (substrato da succinato desidrogenase) - OOCCH 2 COO - malonato - OOCCH 2 CH 2 COO - succinato

44 Metotrexato anticancerígeno Inibidor competitivo do dihidrofolato reductase Tratamento para a ingestão de metanol (solvente existente nos anticongelantes). Metanol formaldeído (provoca cegueira) desidrogenase alcoólica do fígado Etanol é inibidor competitivo do metanol e também é substrato para o enzima dando origem a acetaldeído.

45 Outros tipos de inibição reversível: Inibição incompetitiva o inibidor liga-se a um local diferente do local activo. Liga-se ao complexo ES Inibidor incompetitivo Substrato Inibição mista o inibidor também se liga a um local diferente do local activo. Liga-se a E ou a ES Enzima

46 Enzimas regulatórios Aumentam ou diminuem a sua actividade catalítica em resposta a sinais. Os enzimas alostéreos funcionam através de ligações reversíveis de compostos regulatórios. Outros enzimas são regulados por ligações covalentes reversíveis.

47 Regulação alostérea Forma activa Forma inactiva Substrato ligado ao local activo Inibidor ligado ao local alostéreo

48 Alguns enzimas são regulados por modificações covalentes reversíveis Modificação covalente (resíduos alvo) Fosforilação ( Tyr, Ser, Thr, His) Inactivo Activo

49 A actividade enzimática depende do ph Pepsina estômago G-6-P - hepatócitos Perfil da actividade enzimática vs ph de dois enzimas

50 Como estudar o mecanismo de acção dos enzimas? Cinética enzimática Estudos estruturais Química de proteínas Mutagénese dirigida

51 Efeito da concentração de substrato na velocidade inicial de uma reacção enzimática

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53 O modelo de Michaelis - Menten A relação entre a concentração de substrato e a velocidade de reacção pode ser expressa quantitativamente Equação de Michaelis-Menten Vmax velocidade máxima; K M constante de Michaelis

54 Dependência da velocidade inicial da concentração de substrato

55 Quando [S] <<< K M, então v 0 = V max [S] /K M A velocidade é directamente proporcional a [S] Quando [S] >>> K M, então v 0 = V max A velocidade é independente de [S] Quando v 0 = V max /2, então K M = [S] K M é a conc. de substrato para a qual v 0 = V max /2

56 Transformações da equação de Michaelis- Menten a equação de Lineweaver-Burk (duplo recíproco)

57 Gráfico de Lineweaver-Burk

58 Os parâmetros cinéticos são usados para comparar actividades enzimáticas A equação de Michaelis descreve o comportamento cinético dos enzimas em que v 0 tem uma dependência hiperbólica de [S]. Estes enzimas seguem uma cinética de Michaelis-Menten. Excepções enzimas regulatórios. Parâmetros cinéticos: K M V max

59 Significado dos parâmetros cinéticos K M e V max K M Concentração de substrato para a qual a velocidade é igual a metade da V max. [S] necessária para ocorrer uma catálise significativa.

60 Consequência fisiológica do K M Fígado etanol acetaldeído desidrogenase alcoólica acetaldeído acetato desidrogenase do acetaldeído Desidrogenase do acetaldeído: Enzima mitocondrial baixo K M Enzima citosólico elevado K M Em pessoas susceptíveis ao etanol o enzima mitocondrial é menos activo.

61 O K M é muitas usado como indicador da afinidade do enzima para o substrato. O K M está relacionado com as constantes de velocidade: Se k 2 <<< k -1 Elevado K M substrato baixa afinidade do enzima para o Baixo K M elevada afinidade

62 V max V max = k cat [E t ] Representa o nº de moléculas de substrato convertidas em produto por uma molécula de enzima, numa unidade de tempo, quando o enzima está completamente saturado com o substrato. k cat Nº de turnover

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64 Exemplo: Foi descoberto um enzima que catalisa a reacção Triste Contente Uma equipa de investigadores altamente motivados resolve estudar o enzima que chamaram contentase e verificaram que o k cat para este enzima era 600 s -1. Quando [E t ] = 20 nm e [Triste] = 40 µm, a velocidade da reacção V 0 é 9,6 µm s -1. Calcular o K M para o substrato Triste. R: 10 µm

65 Inibição competitiva A competição pode ser desviada para favorecer o substrato simplesmente adicionando mais substrato. Quando [S] >>> [I] a probabilidade do inibidor se ligar é minimizada e a reacção tem a V max normal. No entanto [S] para o qual V 0 =1/2 V max (K M ) aumenta. V max mantem o valor. K M - aumenta

66 Representação de Lineweaver-Burk para inibidores competitivos

67 Os investigadores a trabalhar na enzima contentase descobriram que o composto STRESS era um potente inibidor competitivo do enzima contentase. A adição de STRESS aumenta o valor de K M para o dobro. O que deverá ser feito para a reacção manter a sua velocidade máxima normal?

68 Os outros tipos de inibição reversível com diferentes variações dos parâmetros cinéticos (inibição anticompetitiva e mista) são observados em geral em reacções enzimáticas com mais que dois substratos.

69 Enzimas regulatórios Aumentam ou diminuem a sua actividade catalítica em resposta a sinais. Os enzimas alostéreos funcionam através de ligações reversíveis de compostos regulatórios. Outros enzimas são regulados por ligações covalentes reversíveis. Os enzimas alostéreos não obedecem à cinética de Michaelis-Menten

70 . Regulação da actividade enzimática Em muitas vias os passos de regulação são catalisados por enzimas alostéreos. Ex. Inibição por feed-back

71 Os enzimas alostéreos apresentam uma cinética sigmoidal que reflecte interacções cooperativas entre as subunidades da proteína