UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO-SENSU EM CIÊNCIAS DA SAÚDE ALEXANDRA SILVA LEAL

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1 1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO-SENSU EM CIÊNCIAS DA SAÚDE ALEXANDRA SILVA LEAL HAPLÓTIPOS DA β S -GLOBINA E SUA CORRELAÇÃO CLÍNICA- HEMATOLÓGICA EM PORTADORES DE ANEMIA FALCIFORME ATENDIDOS NO SERVIÇO DE HEMATOLOGIA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO/HEMOCENTRO REGIONAL DE UBERABA. UBERABA-MG 2014

2 2 ALEXANDRA SILVA LEAL HAPLÓTIPOS DA β S -GLOBINA E SUA CORRELAÇÃO CLÍNICA- HEMATOLÓGICA EM PORTADORES DE ANEMIA FALCIFORME ATENDIDOS NO SERVIÇO DE HEMATOLOGIA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO/HEMOCENTRO REGIONAL DE UBERABA. Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação Strictosensu em Ciências da Saúde, área de concentração Patologia Humana, da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre. Orientador: Dr. Paulo Roberto Juliano Martins Co-Orientadora: Dra. Marly Aparecida Spadotto Balarin Co- Orientadora: Dr. Marly Aparecida Spadotto Balarin UBERABA-MG 2014 II

3 3 Dedicatória Ao filho primogênito João Lucas e ao caçula Rafael, que enchem meu coração de Amor, Alegria e Paz. Vocês são as maiores riquezas da minha vida, peço desculpas, pelos momentos de ausência, pelas vezes, que lhes privei da minha companhia para que esse trabalho fosse terminado. Meus amores, vocês são a melhor parte de mim! Ao meu esposo Evani Júnior, meu companheiro, meu amigo, obrigada por acolher esse sonho como se fosse seu. Seu amor e sua dedicação à nossa Família foram primordiais para a conclusão desse trabalho. Á minha querida Mãe Dalva, que sempre abriu mão dos seus projetos, em favor dos meus. Você é meu porto seguro, obrigada por poder contar com a sua ajuda e pelo seu amor incondicional a mim e aos meus filhos. Minha eterna gratidão... Ao meu querido Pai Wilson, que tanto me incentiva, sempre me estimula a ir mais longe e que nunca deixou que eu desistisse dos meus objetivos. Obrigada por tudo. Ao meu irmão Wilson Júnior e minha cunhada Luciana que sempre são tão presentes em minha vida, obrigada pelo carinho, amizade e pelas palavras de encorajamento nos momentos que precisei. E à minha filha do coração, minha afilhada Valentina, que me contagia com sua alegria e seu afeto, madrinha a ama muito. À minha madrinha Águeda Maria, que sempre me considerou como filha, obrigada por todas as ajudas, por apoiar todos os meus sonhos. E a ele, meu segundo Pai, meu padrinho Mário Lúcio, que infelizmente não está mais aqui comigo, obrigada por tudo, serei eternamente grata ao senhor. Seu abraço fez muita falta no dia da defesa dessa dissertação, mas sei que está bem, nos braços de Deus e que continuará a cuidar de mim. III

4 4 Agradecimentos Agradeço a Deus, que com sua providência Divina, nunca me abandonou, renovando minha Fé, mesmo nos momentos mais difíceis. Agradeço a Nossa Senhora Aparecida, por sua intercessão milagrosa, meu refúgio. Ao meu orientador, Dr. Paulo, que sempre abriu as portas da Instituição para mim, desde a orientação do meu projeto de conclusão de curso na graduação. Sempre disposto a ajudar, com extrema competência e profissionalismo, meu muito obrigado! À minha co-orientadora Dra. Marly Aparecida Spadotto Balarin, obrigada pelos ensinamentos, por conduzir com maestria a parte prática desse trabalho, por me acolher com tanto carinho e pela compreensão nas minhas ausências. Aos meus sogros Evani e Teresinha, dispostos a me ajudar, todas as vezes que precisei. À minha cunhada e amiga Ana Cristina, obrigada pelo incentivo e por todas as orações. À Família Genética, minha segunda casa, todos vocês são muito especiais para mim. À professora Dra. Alessandra Trovó, obrigada pela ajuda no laboratório e pela correção do artigo. Ao professor Dr. Gilberto de Araújo Pereira, obrigada por contribuir tanto para esse trabalho, desde a criação do nosso banco de dados até as análises estatísticas. Ao professor Dr. Hélio Moraes de Souza, pela disposição e atenção em me auxiliar todas as vezes que precisei. Às minhas amigas Gláucia Domingos, Aline Menezes e Renata Volpe, obrigada pelo carinho de vocês, pelas ajudas e por me manter encorajada quando tudo parecia dar errado. À amiga Fernanda Bernadelli por todas as ajudas, obrigada de coração. Às amigas Cristina Pissetti e Elaine Pessoa, obrigada pelo ombro amigo, por estarem sempre dispostas a me ouvir, e me incentivarem a continuar. Aos funcionários do Hemocentro Regional de Uberaba, pela gentileza e colaboração. IV

5 5 Epígrafe O único Sucesso que vale a pena é aquele que lhe dá o direito de ao final do dia, deitar a cabeça no travesseiro e dormir feliz, sabendo que você foi o Ser Humano que você poderia ter sido Padre Fábio de Mello V

6 6 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS 1 INTRODUÇÃO 1.1 ESTRUTURA DA MOLÉCULA DE HEMOGLOBINA Genes das Cadeias Globínicas HEMOGLOBINOPATIAS Hemoglobina S Fluxo Gênico da Hemoglobina S da África para as Américas DOENÇA FALCIFORME Fisiopatologia Manifestações Clínicas e Laboratoriais Eventos Clínicos mais relevantes na Doença Falciforme Crise Vaso-oclusiva ou Crises de Dor Sequestro Esplênico Agudo Úlcera de Perna Cálculo Biliar Síndrome Torácica Aguda Acidente Vascular Cerebral Insuficiência Cardíaca Transfusão Sanguínea e Esquema de Hipertransfusão Internação Hospitalar HAPLÓTIPOS DO GENE Β S : DEFINIÇÃO E ORIGENS Relação entre os haplótipos β s e a diversidade fenotípica da anemia falciforme Os haplótipos β s no Brasil Os haplótipos βs no Mundo Haplótipos Atípicos β s HEMOGLOBINA FETAL HIDROXIURÉIA VI

7 7 2 OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS JUSTIFICATICA MATERIAL E MÉTODO DELINEAMENTOS E CASUÍSTICA CONSIDERAÇÕES ÉTICAS MÉTODOS Estudo Retrospectivo Estudo Molecular Obtenção da Amostra Extração de DNA PCR_RFLP ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS ANEXOS APÊNDICES VII

8 8 LISTA DE FIGURAS E QUADROS Figura 01 Molécula de Hemoglobina 13 Figura 02 Tipos de Hemoglobinas 14 Figura 03 Representação esquemática da organização do complexo de 14 genes das globinas alfa e beta Figura 04 Fisiopatologia da Hb S 16 Figura 05 Fenômeno da Vaso-oclusão 21 Quadro 01 Características laboratoriais da Hb S 22 Figura 06 Principais haplótipos do cluster gênico da β-globina 28 Figura 07 Rota do tráfico de escravos da África para o Brasil 31 Figura 08 Figura 09 Representação dos níveis de significância estatística da Hemoglobina Fetal entre os diferentes genótipos. Representação dos níveis médios de Hemoglobina Fetal nos diferentes genótipos VIII

9 9 LISTA DE TABELAS Tabela Distr 01 Distribuição dos Haplótipos da Globina β no Brasil 33 Tabela 02 Tamanho dos fragmentos de DNA amplificados, após clivagem pelas endonucleases de restrição 40 Tabela 03 Sequência dos oligonucleotídeos 40 Tabela 04 Tabela 05 Tabela 06 Composição das PCRs utilizadas para amplificação das regiões polimórficas do cluster da globina β Condições das PCRs utilizadas para amplificação das regiões polimórficas do cluster da globina β Composição das digestão enzimáticas utilizadas para análise dos polimorfismos de tamanho de restrição Tabela 07 Padrão dos polimorfismos para cada haplótipo 42 Tabela 08 Caracterização dos Pacientes que participaram do estudo 44 Tabela 09 Distribuição da Ocorrência dos Genótipos 45 Tabela 10 Tabela 11 Distribuição da ocorrência dos haplótipos quanto ao número de cromossomos Perfil Demográfico-Epidemiológico em relação aos Genótipos da β S Globina Tabela 12 Características Hematológicas em associação ao Genótipo 47 Tabela 13 Tabela 14 Ocorrência das Manifestações Clínicas em relação ao tipo de Genótipo Ocorrência das manifestações clínicas nos 27 pacientes que faziam uso de Hidroxiuréia IX

10 10 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS PCR RFLP CAR BEN CAM ATP SEN ARB Hb HbF Hb S DF AF α β γ ε δ δ HU Tal. ICAM VCAM CD DNA Reação em cadeia da Polimerase Polimorfismo de Tamanho de Fragmento de Restrição República Centro Africana Benin Camarões Atípico Senegal Árabe Indiano Hemoglobina Hemoglobina Fetal Hemoglobina S Doença Falciforme Anemia Falciforme Alfa Beta Gama Épsilon Zeta Delta Hidroxiuréia Talassemia Molécula de Adesão Intracelular Molécula de Adesão Intracelular Vascular Cluster de Diferenciação Àcido dexorribonucléico X

11 11 RESUMO Introdução: A Anemia Falciforme é uma doença genética crônica, com expressão clínica e Hematológica extremamente variável, indo de uma forma grave a uma condição praticamente assintomática. Diante da prevalência, da diversidade clínica relacionada aos haplótipos e ao fato de não existir relatados da frequência desses na região do Triângulo Mineiro, Estado de Minas Gerais, se justifica a realização desse estudo. Objetivo: Determinar a frequência dos haplótipos dos pacientes com Anemia Falciforme atendidos no Hemocentro Regional de Uberaba e/ou Serviço de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, e sua correlação com o perfil clínicohematológico. Métodos: Foi realizado um estudo descritivo e retrospectivo com a leitura dos prontuários e um estudo transversal de corte para a análise molecular para a determinação dos haplótipos do gene da globina β S de 61 pacientes com Anemia Falciforme (SS), sendo realizada pela técnica de PCR-RFLP, utilizando-se as endonucleases de restrição Xmn I, Hind III, Hinc II e Hinf I para análise de seis sítios polimórficos do cluster beta. Resultados: Os genótipos encontrados foram: CAR/CAR (50,8%), CAR/BEN (13,1%), CAR/CAM (1,6%), CAR/ATP (13,1%), BEN/BEN (13,1%), BEN/ATP (4,9%) e ATP/ATP (3,3%). Dos cromossomos analisados, (64,8%) foram do tipo CAR, (22,1%) BEN, (12,3%) ATP e (0,8%) CAM. Os níveis de hemoglobina fetal foi significante inferior no CAR/CAR em relação ao ATP/ATP, BEN/ATP e CAR/BEN. Não observou associação entre os diferentes genótipos e as manifestações clínicas. Conclusão: Apesar da não associação entre os genótipos e o perfil clínico foi observada maior frequência de ocorrências clínicas nos pacientes portadores de pelo menos um cromossomo do tipo CAR. Observou-se ainda, associação significativa dos menores níveis médios de HbF no genótipo CAR/CAR quando comparado a outros três genótipos. Palavras-chave: Anemia Falciforme; Haplótipos; Hemoglobina Fetal; XI

12 12 ABSTRACT Introduction: Sickle Cell Anemia is a chronic genetic disease with highly variable clinical expression and Hematologic, going from a severe form an almost asymptomatic condition. Given the prevalence of clinical and haplotype diversity related to the fact that there is often reported of these in the Triângulo Mineiro, Minas Gerais region justifies this study. Objective: To determine the frequency of the haplotypes of patients with sickle cell disease treated at Uberaba Regional Blood Center and / or Service of Hematology, Federal University of Triangulo Mineiro, and their correlation with clinical and hematological profile. Methods: A retrospective descriptive study of reading the charts and a cross-sectional study for molecular analysis to determine the βs globin haplotypes of 61 patients with sickle cell disease (SS) gene was performed, and is performed by PCR -RFLP using the restriction endonucleases Xmn I, Hind III, Hinf I and Hinc II for analysis of six polymorphic sites in the cluster beta. Results: The genotypes were: CAR / CAR (50.8%), CAR / BEN (13.1%), CAR / CAM (1.6%), CAR / ATP (13.1%), BEN / BEN (13.1%), BEN / ATP (4.9%) and ATP / ATP (3.3%). Of chromosomes analyzed (64.8%) were type CAR (22.1%), BEN (12.3%) and ATP (0.8%) CAM. Levels of fetal hemoglobin was significantly lower in the CAR / CAR relative to ATP / ATP, BEN / ATP and CAR / BEN. No association was observed between the different genotypes and clinical manifestations. Conclusion: Although no association between genotypes and clinical profiles higher frequency of clinical events in patients with at least one chromosome type CAR was observed. It was also observed, significant association of lower average levels of HbF in genotype CAR / CAR compared to other genotypes. Keywords: Sickle Cell Anemia; haplotypes; Fetal hemoglobin; XII

13 13 1 INTRODUÇÃO 1.1 ESTRUTURA E SÍNTESE DA HEMOGLOBINA A hemoglobina é uma molécula de estrutura quaternária composta por quatro cadeias polipeptídicas de globinas e quatro grupamentos heme. Encontra-se armazenada no interior da hemácia, tendo como função principal o transporte de oxigênio dos pulmões para os tecidos. O grupamento prostético heme, é constituído por um anel tetrapirrólico protoporfirina IX com um átomo de ferro incorporado ao centro (Figura 01). Na hemoglobina A, o grupo heme se associa a uma cadeia polipeptídica alfa, contendo 141 resíduos de aminoácidos e uma cadeia beta que possui 146 aminoácidos (Bunn; Forget, 1986; Marengo-Rowe, 2006). Figura Molécula da Hemoglobina Fonte: Adaptado de BEIGUELMAN, 2006 As hemoglobinas humanas são formadas por cadeias globínicas: α (alfa), β (beta), γ(gama), δ (delta), ε (épsilon) e δ (zeta), em diferentes estágios do desenvolvimento, sendo as cadeias α e δ codificadas por genes localizados no cromossomo 16 e as demais, codificadas por genes no cromossomo 11 (Figura 02). Além dos genes estruturais ativos, há também a presença de pseudogenes (ψδ psi zeta, ψα1 psi alfa 1 e ψα2 psi alfa 2, θ- teta 1), que possuem seqüências idênticas a um gene de globina, mas contém mutações que inibem a sua expressão tornando-os silenciosos (inativos). A função do gene θ1 ainda é desconhecida (Jarman; Higgs, 1988). A regulação da expressão dos genes alfa globina, situado na região 16 p13.3, é controlada por elementos localizados no próprio gene, em regiões adjacentes a ele, e

14 14 por uma seqüência denominada HS-40 localizada a 40 Kb do gene zeta. Esse sítio tem como característica a presença de elementos hipersensíveis à digestão com DNAse e age como um elemento enhancer eritróide específico ao interagir com fatores de transcrição de genes intimamente ligados (Schechter, 2008). Ao contrário, a expressão do gene beta-globina, localizado na região 11 p15.5, é regulada pela sua proximidade a um grupo que contêm pelo menos cinco segmentos de DNA denominados Locus Control Region (LCR). Esse LCR também é hipersensível à clivagem pela nuclease DNAse I e parece contribuir significativamente para a expressão seqüencial 5-3 dos genes globina durante o desenvolvimento, além de contribuir com a concentração alta de hemoglobina no eritrócito normal (Schechter, 2008). Na região 3 do gene beta (Figura 03), encontra-se representado o segmento HS1, que faz parte do locus regulatório, porém não altera a transcrição do gene (Bender et al, 2006). Figura 02 - Tipos de Hemoglobinas Fonte: adaptado de SCHECHTER, Figura 03 - Representação esquemática da organização do complexo de genes das globinas alfa e beta. Fonte: adaptado de SCHECHTER, 2008.

15 Genes Das Cadeias Globínicas Todos os genes envolvidos com a síntese de cadeias globínicas têm estrutura similar, são formados por três regiões codificantes (exons I, II e III) e duas seqüências de intervenção (introns ou IVS I e II) e flanqueados por seqüências 5 e 3 não codificantes (regiões não traduzidas ou UTR s) (Figura 3) (Clark, Thein, 2004). A regulação da expressão dos genes das globinas é um mecanismo complexo que envolve a interação de proteínas trans-atuantes (fatores de transcrição) com seqüências regulatórias cis-atuantes (promotores, reforçadores, silenciadores e elementos de regiões controladoras do lócus - LCRs) (Grosveld; Dillon; Higgs, 1993) No cluster beta, há cinco sítios hipersensíveis que receberam a denominação de HS-1 a HS-5. Individualmente, HS-2, HS-3 e HS-4 são capazes de reforçar (enhancing) a expressão dos genes das cadeias globínicas, enquanto que o HS-1 é muito menos ativo e pode ser dispensável. O HS-3 é provavelmente o sítio mais importante na abertura da estrutura da cromatina para permitir o acesso dos fatores de transcrição. (Weatherall, et al., 2001). Esses principais elementos regulatórios promovem a expressão dos genes e coordenam as mudanças de atividade dos mesmos durante o desenvolvimento através de ligações com vários fatores de transcrição ubíquos ou eritróide-específicos (Schechter, 2008). 1.2 HEMOGLOBINOPATIAS Os distúrbios das hemoglobinas humanas, ou hemoglobinopatias, são um grupo heterogêneo de doenças geneticamente determinadas, de ampla distribuição e que apresentam morbidade significativa em todo o mundo (Weatherall e Clegg, 1999). Clinicamente, as hemoglobinopatias mais importantes são aquelas que envolvem anomalias dos genes α e β. A gravidade da doença dependerá da herança, definida pelos progenitores do indivíduo, existindo formas homozigóticas e heterozigóticas. Alterações envolvendo as cadeias γ, ε e δ são letais já nas fases iniciais da vida (Bunn e Forget, 1986) Hemoglobina S A hemoglobina S (α 2 β S 2) resulta de uma mutação no gene da cadeia globínica β, localizado no cromossomo 11, que leva à substituição da base nitrogenada adenina (A) pela

16 16 timina (T) no códon 6 (GAG GTG), acarretando a inserção do aminoácido valina ao invés do ácido glutâmico na sexta posição da globina β (β S ) (Nagel ;Steinberg, 2001). Esta mutação pontual influencia na forma desoxigenada da Hb S (Figura 05), e fazendo com que hemoglobina (α 2 β S 2) sofra polimerização em baixa concentração de oxigênio, e quando a concentração de desoxiemoglobina S torna-se suficientemente alta, suas propriedades diferem fortemente das propriedades da desoxiemoglobina A, levando a formação de polímeros insolúveis que causam alteração da forma normal do eritrócito (Ashley-Koch et al., 2000). Segundo os mesmos autores, tal processo repercute em graves danos à membrana da célula. O índice e a extensão da polimerização da Hb S no interior da hemácia estão relacionados a três fatores: a concentração de hemoglobina intracelular, o percentual de hemoglobina fetal e o grau de oxigenação na célula. As hemácias falcizadas podem se agregar no interior dos vasos capilares e ocasionar obstrução do fluxo sangüíneo que, conseqüentemente, podem levar a crises dolorosas, priapismo, embolismo pulmonar e osteonecrose, além de danos em vários órgãos como retina, baço, fígado e rins (Figura 04). Figura 04 Fisiopatologia da HbS Fonte : adaptado de jpg acesso em

17 Fluxo Gênico da Hemoglobina S da África para as Américas A Hb.S foi introduzida no continente Americano por meio do tráfico de escravos pelo Oceano Atlântico. Cerca de de africanos subsaarianos foram forçados a emigrar para as Américas como escravos (Curtin, 1969). Infelizmente, essa é uma pequena fração do total de africanos mortos em guerras interétnicas, tornando-se um atrativo para a captura de prisioneiros além de um número desconhecido que morreu durante o transporte por terra até os portos de saída e um número incontável que morreram nas ilhas dominadas pelos europeus Espalhadas pela costa africana. Se isso não bastasse, o total de mortos durante as viagens por meio do Oceano Atlântico até chegarem ao continente americano foi extraordinário. Muitos capturados se lançaram ao mar quando viam a sua terra desaparecendo no horizonte. Nunca se conhecerá com exatidão a magnitude do genocídio africano (Nagel, 1984). Durante os séculos XVII e XVIII mais de escravos desembarcaram no Caribe. Destes, cerca de foram levados para outras colônias de domínio inglês. É surpreendente a concordância entre as porcentagens calculadas para os haplótipos na população atual e os registros de escravos importados no período colonial. Em decorrência do estado da Carolina do Sul ter recebido escravos da Baia de Biafra, a distribuição haplotípica deve partir das médias preditas para todos os escravos trazidos pelos ingleses no século XVIII. Uma alta porcentagem de indivíduos da Senegâmbia (e seus haplótipos correspondentes) e uma porcentagem menor de indivíduos da África Centro Ocidental (haplótipo BEN) deve ser esperada. As freqüências dos haplótipos ligados à Hb.S podem variar nos EUA de acordo com a porcentagem de indivíduos que descendem de escravos da Carolina do Sul ou Virginia (Nagel, 2004). 1.3 DOENÇA FALCIFORME As doenças falciformes são condições que possuem como característica em comum a herança da hemoglobina mutante S, que é o resultado da substituição da base nitrogenada adenina pela timina no sexto códon do gene da ß-globina, codificando o aminoácido valina na posição do ácido glutâmico Tal modificação provoca grandes alterações na solubilidade e estabilidade da hemoglobina, levando à sua polimerização quando desoxigenada e distorção da membrana eritrocitária com o aspecto de foice à microscopia (Marotta et al, 1977). O ácido glutâmico é um aminoácido que tem sua cadeia lateral carregada

18 18 negativamente, com ponto isoelétrico de 2,77. A valina tem o ponto isoelétrico de 5,97, sendo assim classificada como um aminoácido neutro. Essa troca de aminoácidos envolvendo a saída de um aminoácido com carga negativa e a entrada de outro neutro resulta na perda de cargas negativas da Hb S em relação à Hb A, fato que modifica uma série de propriedades físico-químicas da hemoglobina, levando a todas as alterações presentes na doença, inclusive a mobilidade eletroforética mais lenta da Hb S, facilitando o diagnóstico (Naoum, 2000). A Anemia Falciforme e a Sß 0 -talassemia são as formas mais graves de DF, enquanto a Hemoglobinopatia SC e a Sß+ talassemia são condições, que apesar de significativa morbidade, têm manifestações clínicas mais brandas (Powars et al,1990). Os genótipos da doença falciforme mais comuns em nosso meio são: Hb SS, Hb SC, Hb Sβ+-tal, Hb Sβ0-tal e Hb SDPunjab (Januario, 2002). Os indivíduos portadores do traço falciforme (heterozigotos AS) apresentam em um cromossomo o alelo β normal e no outro o alelo mutante βs, produzindo, fundamentalmente, uma mistura de Hb A e Hb S (Hb AS). Esses indivíduos são assintomáticos, não sendo classificado como doença (Ashley-Koch et al., 2000). Quando o alelo β-talassêmico coexistente causa a completa inativação do gene β, a doença falciforme resultante é conhecida como Sβ 0 -Talassemia (Sβ0-Tal) e a gravidade clínica tente a ser semelhante à da anemia falciforme (Hb SS). Entretanto, quando o alelo β- talassêmico coexistente causa a diminuição da transcrição do gene β, a doença falciforme resultante é conhecida como Sβ+-Talassemia (Sβ+Tal), caracterizada por um amplo espectro de gravidade clínica que depende do nível de comprometimento da produção de cadeias beta (Serjeant et al., 1979). A doença das células falciformes é uma das alterações hematológicas hereditárias mais freqüentes no homem, e que a anemia falciforme é a anomalia genética mais importante no Brasil, sobretudo nas regiões que receberam grandes contingentes de escravos africanos. A hemoglobina S se distribui heterogeneamente no Brasil, sendo mais freqüente onde a população de antepassados africanos é maior (Alvares Filho et al, 1995). Estudos genéticos e arqueológicos indicam que o alelo βs mutante é evolutivamente recente, com estimativas de que a mutação ocorreu pela primeira vez entre a anos atrás (Flint et al., 1993).. Sabe-se que o alelo βs confere uma vantagem seletiva aos portadores do traço falciforme, os protegendo contra a malária. Esta pressão seletiva levou à persistência do alelo βs em regiões endêmicas para a malária (Aidoo et al., 2002) e o aumento rápido da sua frequência ao longo de várias gerações (Hanchard et al., 2007). Esta proteção faz do agrupamento de genes da β-globina uma área apropriada para se estudarem as

19 19 assinaturas genéticas da seleção natural e a origem e dispersão de populações humanas (Crawford et al., 2002) Fisiopatologia A compreensão da patogenia da DF vem mudando com o tempo. O dano isquêmico causado por obstrução mecânica devido a presença de hemácias rígidas e distorcidas, tem sido considerado, o principal componente responsável pela hemólise e pelas lesões agudas e crônicas observadas na doença. No decorrer dos anos diferentes pesquisadores têm notado que pacientes com DF apresentam, a despeito de compartilharem o mesmo defeito genético, grande disparidade de manifestações clínicas e no prognóstico (Powars, 2005). A membrana eritrocitária é o ponto de intersecção entre os eventos intra e extracelulares e apresenta diversas alterações (Kuypers, 2007). O polímero de Hb S é uma fibra que se alinha com outras para formar um feixe, alterando o eritrócito para uma forma clássica de foice. O restabelecimento das condições físico-químicas adequadas devolve a solubilidade da hemoglobina. Células irreversivelmente falcizadas são células densas que não retornam à forma normal mesmo quando reoxigenadas, devido o dano irreversível sofrido pela membrana (Stuart; Nigel, 2004). Essas células permanentemente falcizadas são destruídas prematuramente, o que caracteriza a DF como uma anemia hemolítica, levando a um aumento de bilirrubina indireta e de reticulócitos em crises hemolíticas. Podem ocorrer crises aplásticas, por exaustão da medula óssea, durante as quais há um agravamento da anemia, diminuindo a quantidade de reticulócitos no sangue periférico (Ângulo, 2003). A forma falcizada é originalmente a causa da obstrução da microcirculação, resultando em crise vaso-oclusiva. A vaso-oclusão de pequenos e algumas vezes de grandes vasos é a principal marca da DF, contribuindo muito para sua morbidade e mortalidade (Rosse et al., 2000). A vaso-oclusão e a isquemia tecidual na DF envolvem não somente a polimerização da Hb S, mas também interações entre os eritrócitos, endotélio, plaquetas, leucócitos e fatores do plasma. A polimerização da Hb S é o fator mais importante no ciclo da falcização, no entanto um aumento nos níveis de Hb Fetal (HbF) diminui a polimerização intracelular da Hb S (Vichinski, 2002). Além de serem responsáveis pela mudança da forma dos eritrócitos, os polímeros de hemoglobina S têm um impacto direto sobre a membrana plasmática dos mesmos, promovendo uma exposição extracelular de glicolipídeos que normalmente são encontrados

20 20 no interior das células, como a fosfatidilserina. Essa alteração aliada a uma expressão anormal de moléculas de adesão (CD47, BCAM/Lutheran), provavelmente explicam um aumento da aderência dos eritrócitos falcizados ao endotélio vascular. Algumas dessas moléculas (CD36 e VLA-4) são expressas somente pelos reticulócitos que, por estarem presentes em número elevado nos pacientes com a doença, desempenham papel importante no fenômeno vasooclusivo. Dessa forma, os eritrócitos falciformes bloqueiam o fluxo sangüíneo por meio dos capilares devido tanto à redução de sua deformabilidade quanto ao aumento de sua adesão ao endotélio, o que compromete o aporte de oxigênio aos órgãos e tecidos (Ashley-Koch, 2000). O próprio endotélio também está anormal na doença falciforme. As proteínas endoteliais envolvidas na adesão celular (VCAM-1, ICAM-1, E-selectina, P-selectina, laminina, trombospondina, fibronectina e integrina αvβ3) têm sua expressão aumentada como resultado de uma elevação da concentração de citocinas inflamatórias no plasma. Elas interagem com moléculas de adesão presentes nos eritrócitos falciformes e leucócitos, contribuindo para a vasoclusão (Frenette; Atweh, 2007). Os leucócitos, por serem células grandes (12 a 15μm) e que não se deformam com facilidade, possuem um grande potencial para promover a obstrução vascular. Além disso, a ativação do endotélio vascular promove o recrutamento, ativação e adesão dos leucócitos, culminando com interações adesivas entre eritrócitos circulantes e leucócitos aderentes. Esses eritrócitos podem, então, ficar presos, e isso propiciar a desoxigenação e falcização dos mesmos, com conseqüente vaso-oclusão (Frenette; Atweh, 2007) (Figura 05)). Figura 05: Fenômeno da vaso-oclusão Fonte: Frenette; Atweh, 2007

21 21 A adesão dos leucócitos ao endotélio vascular é mediada pela interação de moléculas de adesão leucocitárias (L-selectina, αmβ2 integrina e αlβ2 integrina) com moléculas de adesão endotelial, envolvidas também na inflamação vascular. Os neutrófilos nos pacientes com doença falciforme têm capacidade aumentada de aderir-se à fibronectina e à monocamada de células endoteliais em relação aos neutrófilos de indivíduos sadios (Frenette; Atweh, 2007). As plaquetas também têm participação na fisiopatologia da doença falciforme. Nos pacientes acometidos pela doença, elas circulam no sangue em um estado anormalmente ativado. Concentrações elevadas de micropartículas plaquetárias têm sido relatadas nesses pacientes e as plaquetas têm apresentado aumento da superfície de expressão de P-selectina e GPIIb/IIIa e maiores concentrações de marcadores de ativação plaquetária como fator plaquetário 4 e β tromboglobulina. (Johnson; Telen, 2008). A hemólise intravascular crônica promove uma redução da biodisponibilidade do óxido nítrico (NO) através do consumo aumentado do mesmo pela desoxihemoglobina, o que resulta em vasoconstricção, aumento da ativação plaquetária e expressão de moléculas de adesão em leucócitos e células endoteliais (Flora Filho; Zilberstein, 2000). A Doença Falciforme deve ser considerada uma doença inflamatória crônica, onde a gravidade das manifestações clinica seriam determinadas por um estado pró-inflamatório amplificado, contribuindo para os episódios vasos-oclusivos, desempenhando assim, um importante papel na fisiopatologia da doença (Chies; Nardi, 2001) Manifestações Clínicas e Laboratoriais É extremamente variável, a severidade das manifestações clínicas e hematológicas, podendo ir de uma doença grave a uma condição quase assintomática detectada apenas acidentalmente. Suas características hematológicas, bem como gravidade clínica, são influenciadas por variações nos níveis de hemoglobina fetal, presença simultânea de α- talassemia, deficiência na glicose-6-fosfato desidrogenase e os haplótipos ligados ao grupamento do gene da β-globina (Moreno et al., 2002). Sintomas clínicos mais leves têm sido descritos em pacientes que apresentam α- talassemia e altos níveis de hemoglobina fetal (Hb F), ligados à presença de haplótipos específicos (Gonçalves et al., 2003).

22 22 A morbidade na DF surge de eventos vaso-oclusivos ou danos teciduais resultantes da obstrução do fluxo sangüíneo. A oclusão, principalmente em pequenos vasos, determina a grande maioria dos sinais e sintomas presentes no quadro clínico dos pacientes com DF, tais como: crises álgicas, crises hemolíticas, úlceras de membros inferiores, síndrome torácica aguda, seqüestro esplênico, priapismo, necrose asséptica de fêmur, retinopatia, insuficiência renal crônica, auto-esplenectomia, AVC, entre outros (Ashley-Koch et al., 2000). As manifestações clínicas em pacientes árabes são geralmente mais leves que as manifestações clínicas em africanos, em parte devido à freqüente co-herança de elevados níveis de Hb F, que inibe a polimerização da Hb S (Inati et al., 2003). As características laboratoriais da Doença Falciforme estão resumidas no Quadro 01. Quadro 01- Características Laboratoriais da Doença Falciforme Fonte: Naoum, Crianças com anemia falciforme são particularmente mais suscetíveis a complicações sérias tais como acidente vascular cerebral (AVC), síndrome torácica aguda, anemia aplástica severa, crises des esplênico, infecção e falência múltipla dos órgãos (Jenkins, 2002). Asplenia

23 23 funcional em pacientes jovens, autoesplectomia em adultos e defeito na opsonização, são os maiores fatores reconhecidos de predisposição a infecções bacterianas em pacientes com doença falciforme (Raghupathy et al., 2000) Eventos Clínicos mais relevantes na Doença Falciforme Crise Vaso-oclusiva ou Crises de Dor As crises vaso-oclusivas ou crises de dor são caracterizadas por episódios de oclusão microvascular em um ou vários locais, causando dor e inaptidão, acompanhada por uma inflamação local (Stuart;Nagel, 2004). Os episódios são recorrentes, com duração de horas ou dias, podendo chegar a semanas, embora mais comumente tenham de cinco a sete dias de duração (Serjeant, 1992). A oclusão microvascular origina-se, predominantemente, em áreas localizadas da medula óssea, levando à necrose. Os mediadores inflamatórios ativam fibras nervosas aferentes nociceptivas, evocando a resposta de dor. As áreas afetadas são ossos longos, costelas, esterno, coluna vertebral e pelve, muitas vezes com envolvimento de vários locais simultaneamente. A maioria dos episódios de crise de dor pode ser tratados em casa, com uma combinação de agentes antiinflamatórios, hidratação oral e analgésicos opióides e nãoopióides (Stuart e Nagel, 2004) Sequestro Esplênico Agudo O sequestro esplênico agudo (SEA), classicamente definido como aumento súbito do volume esplênico, associado à queda de pelo menos 2 g/dl na concentração de hemoglobina e reticulocitose (Stuart;Nagel, 2004; Rezende et al., 2009), é resultado do aprisionamento de sangue no baço, em consequência da falcização das hemácias e obstrução do fluxo vascular. O espectro de gravidade é amplo, com casos raros de aumento agudo do baço acompanhado por colapso circulatório e morte por anemia e choque hipovolêmico (Stuart;Nagel, 2004). As crises de SEA não têm etiologia definida. O tratamento imediato inclui a correção da hipovolêmica com transfusão. Como a taxa de reincidência é alta (cerca de 50%), o acompanhamento clínico é crucial. Para crianças com mais de 2-3 anos, a esplenectomia é recomendada logo após o episódio agudo (Stuart;Nagel, 2004).

24 24 Todas as mães devem ser educadas para fazer a palpação do baço de seus filhos, bem como reconhecer os sintomas deste evento potencialmente ameaçador à vida. Tais medidas têm reduzido o número de mortes (Cançado e Jesus, 2007) Úlcera de Perna A úlcera de perna inicia-se com poucas alterações locais, passando a escurecimento da pele, necrose e infecção por bactérias (Staphylococcus aureus, Pseudomonas e Streptococcus). Geralmente acompanhada de dor, dificulta a limpeza local para remoção mecânica das crostas. Acomete os pacientes com anemia falciforme, mas ocorre raramente em pacientes com a interação Sβ-talassemia e em crianças menores de 10 anos. Fatores genéticos, ambientais, sociais e econômicos predispõem à sua formação. A realização de culturas microbiológicas para o controle da infecção e o emprego de antibióticos são medidas necessárias para a remissão das úlceras (Fabron Jr.,1997) Cálculo Biliar A elevada excreção constante de bilirrubina devido às alterações hepáticas secundarias à hemólise crônica e múltiplas transfusões resulta em formação freqüente de cálculos biliares. A colelitíase é mais freqüente em indivíduos homozigotos para anemia falciforme (58%) se comparados a indivíduos com hemoglobinopatia SC ou Sß talassemia (17%) e a prevalência aumenta com a idade. Coledocolitíase (presença de cálculos biliares no ducto colédoco) tem sido descrita em 18% dos pacientes submetidos à colecistectomia (Bond, 1987). Colecistectomia deve ser realizada em pacientes com sintomas decorrentes de colelitíase para prevenir sintomas recorrentes e evitar dúvidas no diagnóstico diferencial entre outras complicações hepáticas e cólicas biliar ou colecistite. O procedimento deve ser realizado após a ocorrência de uma crise de cólica biliar, mas não no episódio agudo de dor. O adiamento da cirurgia por tempo prolongado pode favorecer a inflamação crônica da vesícula biliar e dificultar o procedimento cirúrgico. A indicação de colecistectomia profilática, na presença de colelitíase e ausência de sintomas clínicos, ainda é controversa. O procedimento cirúrgico está associado ao risco de síndrome torácica aguda (10%) e crises álgicas (5%). A freqüência de complicações é semelhante entre o preparo pré-operatório realizado com transfusão simples para elevação da hemoglobina para 10 g/dl ou transfusão de troca para redução da HbS para menos de 30 % (Haberkern, 1997).

25 Síndrome Torácica Aguda A síndrome torácica aguda (STA) é uma causa frequente de hospitalizações e a principal causa de morte em jovens adultos com doença falciforme (Platt et al., 1994). Trata-se de complicação comum, caracterizada por dor peitoral pleurítica, febre, estertores na ausculta pulmonar e infiltrado pulmonar na radiografia de tórax (Castro et al., 1994). Episódios repetidos de STA podem predispor à doença pulmonar crônica, incluindo a hipertensão pulmonar (Vichinsky et al., 2000). Os fatores de risco incluem o genótipo homozigoto (Hb SS), baixas concentrações de hemoglobina fetal (Hb F_ e níveis basais altos de hemoglobina e leucócitos (Castro et al., 1994). O tratamento da STA consiste na identificação da causa, quando possível, e o uso de antibióticos, mesmo nos casos em que a causa infecciosa não tenha sido identificada. Eritrocitaférese em casos graves e transfusão simples nos casos moderados podem salvar vidas. O tratamento com antibiótico macrolídeo é uma importante ferramenta. Em casos de necrose óssea (além da embolia gordurosa pulmonar), a gordura pode atravessar a microvasculatura pulmonar, ganhando acesso à circulação sistêmica, com disseminação de embolias a vários locais, incluindo o sistema nervoso central. Esta síndrome de falência de múltiplos órgãos é muitas vezes letal e exige eritrocitaférese imediata (Stuart;Nagel, 2004) Acidente Vascular Cerebral O acidente vascular cerebral (AVC) é uma das complicações mais graves da anemia alciforme, acometendo 11% dos pacientes até 18 anos de idade (Quinn et al., 2004). Os dois principais mecanismos responsáveis pelo AVC em indivíduos com doença falciforme são: 1) arteriopatia oclusiva em que existe proliferação da camada íntima e aumento dos fibroblastos e das células musculares lisas na parede das artérias, e como consequência, estreitamento segmentar progressivo da porção distal da artéria carótida interna e ramos proximais das principais artérias intracranianas (polígono de Willis); 2) agregação das células falciformes e, consequentemente, oclusão do lúmen de pequenos vasos (Hillery ;Panepinto, 2004). O AVC isquêmico é mais comum nas crianças; nos adultos predomina a hemorragia intracraniana. Também ocorrem ataques isquêmicos transitórios, definidos como eventos isquêmicos cujos sintomas se resolvem em menos de 24 horas de evolução sem sequelas motoras. O primeiro AVC ocorre mais comumente na primeira fase da infância (1,02 por 100

26 26 pacientes/anos em crianças de 2 a 5 anos). Há diminuição da incidência em pacientes de 6 a 9 anos (0,79 por 100 pacientes/ano) (Ohene-Frempong et al., 1998). O risco de recorrência é grande, principalmente nos primeiros anos após o primeiro evento. Quando o tratamento não é realizado após o primeiro AVC isquêmico, o risco de recorrência observado em estudos de coorte variou entre 46% e 67% ( Balkaran et al., 1992). Os fatores de risco para a ocorrência de AVC em indivíduos com doença falciforme são o genótipo homozigoto (Hb SS), histórico de ataque isquêmico transitório, nível basal baixo de Hb basal, contagem alta de leucócitos, aumento da pressão arterial sistólica e histórico de síndrome torácica aguda (Ohene-Frempong et al., 1998). Na fase aguda do AVC isquêmico é necessária a transfusão sanguínea imediata para reduzir a Hb S para níveis menores que 30%, com um acompanhamento transfusional para manter a concentração de Hb S em menos de 30%. Essa terapia, com acompanhamento de três anos, reduziu a taxa de reincidência de 50% para cerca de 10% (Stuart; Nagel, 2004). A terapia transfusional traz riscos para os pacientes como reações transfusionais, infecções, aloimunização e sobrecarga de ferro. Como a retirada do tratamento de transfusão pode acarretar na recorrência de AVC, a terapia com hidroxiureia (HU) foi sugerida para prevenir a recorrência, sendo o uso iniciado antes do fim do período de transfusões (Ware et al., 1999). È recomendada a realização anual do DTC para crianças de dois a 16 anos com o genótipo homozigoto (Hb SS) (Stuart;Nagel, 2004) Insuficiência Cardíaca Na Doença Falciforme (DF), o débito cardíaco está elevado devido a um aumento do volume sistólico. O volume sangüíneo está aumentado devido ao aumento do volume plasmático e a diminuição da resistência. O aumento do débito cardíaco leva ao aumento das câmaras cardíacas e hipertrofia do septo. Essas alterações, entretanto, são mais pronunciadas nas DF do que nas outras anemias. Estudos hemodinâmicos em adultos e crianças com DF confirmam a existência de um aumento importante do débito cardíaco mesmo com valores mais elevados de hemoglobina (entre 9 e 10 g/dl) (Gualandro et al, 2007) Transfusão Sanguinea e Esquema de Hipertransfusão A terapêutica transfusional com concentrado de hemácias é uma prática comum no tratamento e prevenção de complicações na anemia falciforme. Cerca de 50% dos pacientes

27 27 portadores de anemia falciforme recebem transfusões de concentrado de hemácias em algum estágio da vida, e de 5% a 10% destes entram no programa de transfusão crônica (esquema hipertransfusional). O principal objetivo da transfusão é melhorar a capacidade de transporte de oxigênio e o fluxo de sangue na microcirculação pela diminuição na porcentagem de hemoglobina S (HbS) e pelo aumento no nível de hematócrito, que não deverá exceder 30%, o que previne eventos vaso-oclusivos clinicamente significantes (Pinto et al, 2011) Internações Hospitalares Um dos aspectos clínicos da DF é a ocorrência de eventos agudos, que levam à necessidade de internações hospitalares. O evento agudo mais freqüente é a crise vasooclusiva, definida como um evento doloroso, que necessita de assistência médica, na ausência de outra causa que explique os sintomas. As internações concentraram-se em faixas etárias jovens, o que revela o grande impacto social da doença e alerta quanto à importância de se otimizar a atenção aos pacientes portadores da DF (Loureiro; Rozenfeld, 2005). 1.4 HAPLÓTIPOS DO GENE Β S : DEFINIÇÃO E ORIGENS Estudos moleculares pioneiros de Kan e Dozy (1978) demostraram que a mutação que originou o gene da hemoglobina S não foi um evento único, mas ocorreu em diversos locais e em diferentes épocas, dentro e fora do continente africano, estabelecendo o conceito de origem multicêntrica para essa doença. Estudos subseqüentes definiram os três principais haplótipos para a anemia falciforme: CAR (República Centro-Africana), Benin e Senegal, originados em regiões distintas do continente africano, e outro haplótipo, também de origem independente, foi descrito em populações provenientes da península Arábica e da Índia. A variabilidade genética em torno da mutação permitiu uma melhor compreensão da heterogeneidade clínica da doença, além de ter importância para o estudo antropológico (Zago, 1993). É do conhecimento geral que indivíduos são geneticamente diferentes, e que algumas das diferenças entre as pessoas representam alterações genéticas patológicas. O locus b está localizado no cromossomo 11, em uma região que tem sofrido uma série de transformações através do tempo. Usando uma série de enzimas de restrição, que identifica alterações específicas do DNA, é possível verificar a constituição das regiões adjacentes ao locus b. Uma determinada ordem de marcadores herdada em bloco, observada em um cromossomo

28 28 particular é denominada haplótipo. Haplótipos específicos são encontrados no cromossomo portador do alelo β S (Figura 06) (Bortolini; Salzano, 2002). Os haplótipos são definidos como padrões de vários polimorfismos no DNA ao longo de uma região de um cromossomo, são utilizados para inúmeras finalidades, por exemplo, como marcadores para migração de populações em estudos antropológicos e para detectar distâncias genéticas entre os principais grupos étnicos em estudos sobre a origem das raças humanas. Haplótipos específicos são encontrados nos cromossomos portadores do alelo βs (Nagel;Ranney, 1990) Figura 06 - Principais haplótipos do cluster gênico da β-globina. Fonte: Adaptado (Galiza-Neto; Pitombeira, 2003) Os haplótipos β S representam potencialmente diferentes origens étnicas e geográficas: o haplótipo Benin (BEN), originado na costa oeste Africana, alcança o norte da África (Argélia e Tunísia), oeste da Arábia e sul da Europa (Portugal, Sicília e Grécia). O haplótipo Bantu foi originalmente identificado na República da África Central (por essa razão, é algumas vezes conhecido como haplótipo CAR) e após, em várias populações de dialeto Bantu, em regiões geográficas separadas do sul da África. O haplótipo Senegal (SEN) originado no oeste da África Atlântica, o Camarões (CAM) ao longo da costa oeste da África e o haplótipo Árabe-indiano (ARB) ocorre no sub-continente Indiano e a leste da península Árabe, sendo também chamado haplótipo Indo-Árabe (Zago et al., 1999; Inati et al., 2003).

29 29 Pagnier e colaboradores (1984) definiram 11 sítios de restrição no agrupamento de genes da β-globina de indivíduos com anemia falciforme de regiões africanas separadas (Benin, República Central Africana, Senegal e Argélia) e observaram que em todos os pacientes de Benin e da Argélia os cromossomos portadores do alelo β S possuíam o mesmo haplótipo. Na República Central Africana e no Senegal a grande maioria dos cromossomos βs foi associada com um haplótipo específico para cada região. Dos 124 cromossomos analisados naquele estudo, 110 haplótipos eram geograficamente específicos e 120 poderiam ser classificados em três grupos: Benin, Senegal e CAR (populações de dialeto Bantu). Como os três haplótipos diferem entre si em pelo menos três sítios a 5 e a 3 de um ponto quente (hot spot) de recombinação no agrupamento de genes da β-globina, os autores sugeriram que o alelo βs provavelmente surgiu pelo menos três vezes em haplótipos pré-existentes. O haplótipo Cam, que difere dos outros três haplótipos africanos em regiões 5 e 3 da mutação βs, é encontrado no grupo étnico Eton. Este haplótipo está associado ao gene AγT e é idêntico ao haplótipo II, encontrado algumas vezes associado à β- talassemia no Mediterrâneo. A quarta mutação βs na África (haplótipo Cam) provavelmente expandiu-se também pela presença da malária (Nagel e Ranney, 1990). Um desequilíbrio de ligação entre o alelo βs e o haplótipo Árabe-Indiano foi descrito, independentemente em pacientes com anemia falciforme na parte oriental da Arábia Saudita. Esse haplótipo também é encontrado na Índia, representando mais de 90% dos haplótipos neste país (Nagel; Ranney, 1990). Labie e colaboradores (1989), estudando três tribos isoladas do subcontinente indiano, separadas por mais de Km e que não possuem nenhum tipo de comunicação atual e nem por um longo tempo atrás, encontraram o mesmo haplótipo (Árabe-Indiano) ligado ao alelo βs. Provavelmente este alelo βs teve origem unicêntrica; as tribos isoladas teriam uma origem comum. Existe uma hipótese de que a localização geográfica deste ancestral comum poderia ter sido da civilização Harappa, residente numa área endêmica para malária, fator indispensável para seleção e dispersão do alelo βs (Nagel e Ranney, 1990). A maioria dos cromossomos portadores do alelo βs possui o padrão genético de um dos cinco haplótipos clássicos, porém em todo grande grupo de pacientes com doença falciforme existe uma minoria de cromossomos (5 a 10%) associados à haplótipos menos comuns, geralmente referidos como haplótipos atípicos (Atp).

30 Relação entre os haplótipos β s e a diversidade fenotípica da anemia falciforme Os haplótipos têm sido úteis marcadores para estudos antropológicos e para a definição o fluxo do alelo bs em populações humanas. Em cada uma das quatro regiões da África e uma da Ásia onde o alelo bs é altamente prevalente, o alelo anormal está associado com um haplótipo diferente do agrupamento do gene b. Isso significaria que a mutação falciforme ocorreu pelo menos cinco vezes durante a evolução humana (Magaña et al., 2002). Essa interpretação tem sido proposta, em contradição a uma explicação alternativa de que a mutação da Hb S ocorreu uma vez na África e provavelmente uma vez na Índia. Após sua extensão inicial na África, o alelo anormal fixou-se em diferentes haplótipos pela conversão gênica sofrida pela seleção local da malária. Isto explicaria a predominância de haplótipos distintos em diferentes regiões. Exceto para a Índia e Arábia, a presença do alelo falciforme fora da África é conseqüência da migração voluntária ou forçada (Zago et al., 1999). Diversos mecanismos genéticos, incluindo as recombinações, substituições pontuais e conversões de genes, estão envolvidos na geração destes haplótipos atípicos (Zago et al., 2000). É importante destacar que as referências que se fazem relacionando a gravidade clínica com os haplótipos da HbS devem ser interpretadas com ressalvas, pois pelo menos dois fatores hereditários apresentam-se como interferentes: aumento da concentração de HbF e a interação com talassemia alfa (Naoum, 2000). Os haplótipos ligados ao grupo de genes da globina β são definidos como a associação não randômica da combinação de vários sítios de clivagem para endonucleases de restrição localizados ao longo do grupamento de genes β. Esses haplótipos estão presentes em um número limitado de combinações na população e não estão relacionados a doenças (Steinberg, 2001). Os haplótipos do gene β s têm papel importante na regulação variável da síntese da Hemoglobina Fetal (HbF) na relação final entre as concentrações de hemoglobina S (HbS) e HbF no adulto e na taxa de redução da HbF durante a infância. A concentração de HbF está aumentada nos haplótipos Senegal e Asiático (árabe) e decresce nos haplótipos Bantu e Benin, devido a uma taxa de translação no sentido 5 3 e à substituição da HbF por HbS mais lenta nos primeiros do que nos dois últimos haplótipos (Zago, 1993) Os haplótipos β s no Brasil

31 31 Durante o período transatlântico de tráfico de escravos ( ), aproximadamente 4,9 milhões africanos vieram para o Brasil e foram distribuídas em quase todas as regiões do país (Estimates Database, 2010). Cerca de indivíduos foram trazidos entre 1701 a 1810 e 1817 a 1843, dos quais 73% eram da África equatorial (regiões de dialeto Bantu), leste e sul do continente (Angola, Congo e Moçambique), 26% eram do centro-oeste africano (golfo de Benin e baía de Biafra) e um pequeno grupo do ocidente atlântico africano (Senegâmbia, Guiné-Bissau e Cabo Verde). As diferenças regionais foram marcantes em relação à quantidade e a origem dos escravos que foram recebidos por cada região do país (Curtin, 1969; Estimates Database, 2010). Esses dados são concordantes com o perfil da frequência dos haplótipos βs encontrados no Brasil, sendo a grande maioria composta pelos haplótipos CAR e Ben, e uma minoria pelos haplótipos Senegal, Camarões e Árabe-Indiano, com diferenças regionais marcantes demonstrando a heterogeneidade do comércio de escravos Africanos trazidos para o país durante o período colonial (Figura 07). Figura 07 Rota do tráfico de escravos da África para o Brasil. Fonte: acesso em 28/03/2012 Segundo Ramalho e seus colaboradores (2008), o Estado de São Paulo (Sudeste do Brasil) é um local onde o estudo genético-epidemiológico da Hemoglobina S é de grande

32 32 importância, devido os seguintes fatores: participação relevante do elemento afro-descedente na composição étnica da população; presença de imigrantes italianos, portugueses, espanhóis, árabes, entre outros, que também colaboraram para a introdução do gene da hemoglobina S no Estado, aonde chegaram, em grande quantidade, a partir da segunda metade do século XIX, e recebimento de grande contingente de imigrantes do Nordeste do Brasil, entre os quais, a composição haplotípica em relação ao gene da HbS (Bantu/Benin), difere da observada originalmente na população paulista. O Brasil, um país com grande extensão continental, cuja população tem origem étnica heterogênea e desigualmente repartida, tem uma interessante distribuição de hemoglobinopatias, resultado do influxo de muitos grupos imigrantes diferentes e do comércio escravo dos séculos XVIII e XIX (Figueiredo et al, 1996). Até o fim da 2ª Guerra Mundial o Brasil recebeu quase cinco milhões de imigrantes europeus, que se fixaram principalmente no Sul e Sudeste. Todos estes grupos raciais foram gradualmente se miscigenando, embora as diferenças regionais sejam ainda notórias. Essa característica da população brasileira tem conseqüências importantes para as doenças hereditárias que estão associadas com etnia: suas freqüências são diferentes em várias regiões do país, refletindo uma variedade de origens étnicas com variável grau de miscigenação (Zago et al, 1999). Vários outros estudos foram realizados no Brasil para determinar a freqüência variação, alguns deles foram resumidos na Tabela Os haplótipos β s no Mundo A doença vista nas Américas do Norte e Sul, no Caribe e no Reino Unido é predominantemente de origem africana e a maior parte dos afetados é do haplótipo Benin, embora o CAR seja mais freqüente no Brasil (Zago et al,1992). Além disso, o alelo causador da Anemia Faciforme (AF) também está espalhado em volta do Mediterrâneo, ocorrendo na Sicília, sudeste da Itália, norte da Grécia e costa sul da Turquia, embora todos esses sejam do haplótipo Bantu (Serjeant, 2001). O haplótipo Camarões foi identificado em Guadalupe, Venezuela e Suriname, com uma baixa freqüência (3%). Neste ponto há uma diferença nas freqüências relativas dos haplótipos CAR e Benin, ao comparar a América Central, Venezuela e Suriname com o Brasil. Enquanto no grupo anterior de nações, o haplótipo Benin é o mais freqüente, o contrário é verificado no Brasil, onde o CAR é o mais prevalente. O haplótipo Senegal mostra uma distribuição um pouco irregular na América Latina, com alta prevalência em Cuba, Guadalupe, Venezuela e Nordeste do Brasil (Salzano; Bortolini, 2002).

33 33

34 Haplótipos Atípicos β s Outros haplótipos menos comuns recebem o nome de haplótipos atípicos (ATP) e são gerados, provavelmente, por uma variedade de mecanismos genéticos, que incluem: mutações pontuais nos sítios polimórficos de restrição, simples ou duplas trocas entre dois haplótipos β S típicos ou mais freqüentemente entre um haplótipo β S típico e um haplótipo β A diferente e presente numa população e conversões gênicas (Zago et al., 2000). Segundo o mesmo autor, os haplótipos do cluster da β globina têm aproximadamente 2000 anos, por isso, não surpreende que eles possam ter sofrido mudanças nas seqüências próximas a eles. A maioria dos cromossomos β S tem um dos cinco haplótipos mais comuns designados como Benin, Bantu, Senegal, Camarões e Arábico-Índico. Entretanto, 5 a 10% dos pacientes com anemia falciforme apresentam cromossomos incomuns, geralmente chamados de haplótipos atípicos. 1.5 HEMOGLOBINA FETAL A HbF tem sido o modulador genético mais estudado na anemia falciforme e é considerada o mais potente modificador da doença, diminuindo a polimerização da β S quando em estado desoxigenado (Steinberg, 2005). Geralmente, a Hb F mantém-se com níveis de 1% após o sexto mês do nascimento, podendo permanecer aumentada na Persistência Hereditária da Hemoglobina Fetal, essa condição genética é clinicamente benigna e se carcteriza pela síntes contínua de Hb F na vida adulta (Wood; Clegg; Weatherall, 1979). Já a condição adquirida se deve ao uso de determinadas drogas, como a Hidroxiuréia, que é um agente estimular de sua síntese (Charache, et al, 1992). A HbF em indivíduos com Af está relacionada com a variabilidade das manifestações clínicas e hematológicas da doença. Sua elevação se associa com redução dos eventos vasooclusivos, de sequestro esplênico e de mortalidade precoce, além da redução do número de Transfusões e hospitalizações (Mousinho-Ribeiro et al, 2008). 1.6 HIDROXIURÉIA A inibição da falcização tem incluído agentes anti-falcizantes como a Hidroxiuréia (HU). Essa é um agente potencialmente menos tóxico que aumenta os níveis de Hb F. Ambos

35 35 os aspectos clínico e laboratorial da anemia falciforme são influenciados pela concentração de Hb F. Pacientes com níveis mais altos de Hb F apresentam menos episódios de dor e maior sobrevida (Klings, 2006; Machado, 2007). A HU tem outros efeitos que podem beneficiar os pacientes com DF, como por exemplo, diminuir a adesão de células falcizadas ao endotélio vascular e diminuir o nível de expressão da molécula VCAM-1 solúvel (Saleh et al., 1999). Devido à sua atividade mielossupressora, a HU reduz a contagem de leucócitos circulantes e provavelmente o número de leucócitos aderentes à parede de vênulas de pequeno porte (Frenette e Atweh, 2007). Além disso, a HU pode causar efeito citoredutivo em neutrófilos, aumento do teor de água nas hemácias, aumento da deformabilidade e capacidade de navegação microvascular de hemácias falciformes e alterar a capacidade de adesão das hemácias ao endotélio (Aliyu et al., 2006).

36 36 2. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Determinar a frequência dos haplótipos dos pacientes com Anemia Falciforme atendidos no Hemocentro Regional de Uberaba e/ou Serviço de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro; 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS analisados; Estabelecer uma associação entre os haplótipos e alguns parâmetros hematológicos Estabelecer uma associação entre os haplótipos e as complicações clínicas apresentadas pelos pacientes;

37 37 3. JUSTIFICATIVA A anemia falciforme, uma doença hereditária, causada por uma única mutação no gene da β-globina, produz uma diversidade de expressões fenotípicas nos pacientes acometidos (Serjeant, 1992). Essa variação fenotípica, se deve a fatores genéticos que podem influenciar no processo da polimerização da Hemoglobina S (HbS), no processo de falcização e na hemólise, tais como a co-herança com a α-talassemia, a taxa de HbF, o tipo de haplótipos da globina β S, entre outros. Os fatores ambientais e as condições socioeconômicas do paciente também podem interferir (Zago e Pinto, 2007). Como os haplótipos da globina β S podem atuar como instrumentos para o prognóstico dos pacientes e contribuírem para os estudos antropológicos da origem dos africanos em nosso país, e, considerando a não existência de um estudo sobre a freqüência desses na nossa região, se justifica a realização desse trabalho.

38 38 4. MATERIAL E MÉTODO 4.1 DELINEAMENTOS E CASUÍSTICA Foi realizado um estudo descritivo e retrospectivo com a leitura dos prontuários um estudo transversal com a análise molecular para a determinação dos haplótipos do gene da globina β S. Nesse estudo, foi analisado amostras de sangue de 61 pacientes com diagnóstico de Anemia Falciforme. 4.2 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS Todos os pacientes, após a leitura e a explicação, assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecimento. O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM), conforme protocolo 1949/2011. E também, pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação Hemominas sob o registro número 324/ MÉTODOS Estudo Retrospectivo Os parâmetros hematológicos avaliados no trabalho foram colhidos a partir de registros nos prontuários. Para os dados hematológicos (hemácias, hemoglobina, hematócrito, plaquetas e hemoglobina fetal), visando uma maior credibilidade, foram anotados todos os resultados desses dados no período de 2008 a 2012, porém os valores quando o paciente se encontrava em crise dolorosa, foram excluídos.. Os pacientes foram caracterizados segundo idade, gênero, procedência, uso de Hidroxiuréia, diagnóstico pelo Teste do Pezinho, além do registro da ocorrência das principais manifestações clínicas e dados hematológicos, de 2008 a Algumas dessas manifestações, por serem consideradas de grande importância para o prognóstico do paciente, foram observadas por todo o período de vida do mesmo, de acordo com o prontuário médico. As médias dos dados hematológicos foram obtidas por meio do registro de todos os exames registrados no prontuário de 2008 a 2012, visando uma maior credibilidade dos dados. A análise molecular foi realizada no Laboratório de Genética e Biologia Molecular da UFTM Estudo Molecular

39 Obtenção da Amostra Foi coletado de cada participante 10 ml de sangue periférico, por venopunção, em tubos de coleta a vácuo estéril contendo EDTA Extração do DNA A extração do DNA foi realizada pelo método Fenol-Clorofórmio segundo Sambrook (1989). O sangue de cada participante foi colocado em um tubo cônico de 50 ml e adicionado uma solução de lise celular (TE 20:5- Tris HCl 1M, EDTA 0,5M ph=8,0 e H 2 O miliq) até completar 30 ml. As amostras foram submetidas a uma agitação em vórtex para que as hemácias fossem lisadas mais facilmente. Em seguida, foi centrifugado a 3500 rpm durante 15 minutos a 10 C. O sobrenadante foi desprezado e o procedimento repetido três vezes até a obtenção de um pellet de leucócitos livre de hemácias. Esse sedimento foi transferido para um microtubo Bio free de 2 ml (SARSTEDT), livre de enzimas, como DNAses e RNAses, que poderiam comprometer o DNA a ser extraído. Foi adicionado, um ml de tampão TE 20:5 e as amostras armazenadas a -20ºC para posterior extração de DNA genômico. O pellet armazenado foi transferido para um tubo de 15mL, adicionado 200 L de Tris EDTA (TE), 25 L de SDS (dodecil sulfato de sódio) 10% e 10 L da solução de proteinase K (20 g/ml). As amostras foram incubadas overnight em banho Maria à 37 C até a dissolução completa do pellet. No dia seguinte, as amostras foram agitadas em vórtex até o deslocamento do sedimento. Foram adicionados 40 L de acetato de sódio 0,2M e 1mL de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1) e a mistura foi homogeneizada em um agitador orbital por 20 minutos. Em seguida, centrifugação a 3000 rpm por 20 minutos a 4 C. O DNA solubilizado estava no sobrenadante (fase aquosa) e foi retirado com o auxílio de uma pipeta, com o cuidado para que a camada branca (camada proteica) não fosse recolhida junto. Acrescentou-se um ml de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1) e o tubo foi novamente levado ao agitador orbital por 15 minutos e centrifugado a 3500 rpm por 15 minutos a 4 C. A fase superior foi novamente recolhida com cuidado e acrescentou-se 1 ml de etanol 100%. O tubo foi então invertido lentamente e o DNA precipitado recolhido e transferido para um microtubo de dois ml contendo etanol 70%. As amostras foram centrifugadas a rpm por dois minutos a temperatura ambiente. O sobrenadante foi desprezado e o microtubo ficou secando overnight. Em seguida, o DNA foi ressuspendido em 200 L de água pura. Para verificar se o DNA extraído tinha qualidade adequada foi realizada uma eletroforese em gel de agarose 1%. Em seguida, as amostras foram estocadas em freezer a -20ºC.

40 PCR-RFLP A determinação dos haplótipos foi realizada por meio da técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase) e RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism ou Polimorfismo de Tamanho de Fragmento de Restrição) em seis sítios polimórficos, seguindo a metodologia de Sutton et al (1989) de acordo com a tabela 2: A tabela 3 ilustra a sequência dos oligonucleotídeos (primers) utilizados: Tabela 3 Sequência dos oligonucleotídeos 4 e 5: As condições para cada PCR de cada região a ser amplificada está descritas nas tabelas

41 41 Os produtos de PCR foram submetidos à digestão e os componentes utilizados nas digestões estão representados na tabela 6, o mix resultante foi colocado em banho-maria a 37ºC por 2 horas.

42 42 A identificação dos fragmentos de DNA amplificados e a análise dos fragmentos após a clivagem pelas endonucleases de restrição foi realizada por meio da técnica de eletroforese em gel de agarose 2,0% em tampão TBE 1X sob diferença de potencial de 90V por aproximadamente 75 minutos. Em cada gel de eletroforese foi aplicado 2 μl do padrão de tamanho molecular 100 pb DNA Ladder (Biolabs) corados pelo GelRed e posterior aplicação no gel de agarose. As imagens foram feitas pelo sistema de captura de imagens (L- PIX ) O genótipo de cada participante foi determinado pelo tamanho do fragmentos digeridos e de acordo com o perfil de restrição para as regiões polimórficas do cluster da globina β, os haplótipos β S foram definidos e tomando esses haplótipos como padrão (Tabela 7), qualquer outra combinação diferente da presença e/ou ausência desses sítios o haplótipo foi classificado como atípico. Tabela 7 Padrão de polimorfismos para cada haplótipo 4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA Para a Análise Estatística, os dados foram submetidos a uma análise descritiva a partir de frequências absoluta e percentual para as variáveis categóricas e por medidas descritivas de

43 43 centralidade e dispersão para as variáveis numéricas. Para a análise dos parâmetros hematológicos foi considerado o período de 2008 a 2012, utilizando a análise de variância- ANOVA. O teste qui-quadrado foi utilizado para avaliar as associações dos haplótipos com as manifestações clínicas categorizadas. O nível de significância estatística considerado para todos os testes foi igual a 95% (p*<0,05). A normalidade dos dados foi verificada a partir do teste de Kolmogorov-Smirnov e a homogeneidade das variâncias a partir do teste de Bartlett.

44 44 5. RESULTADOS Em relação ao perfil epidemiológico, a idade dos 61 pacientes que participaram do estudo variou de 03 a 63 anos, com idade média de 24,33 e desvio padrão de 15,22 anos, sendo que 41 eram do sexo feminino (67,3%) e 19 do masculino (31,7%). A idade do paciente no diagnóstico variou de um mês até 52 anos, sendo em 24 (39,3%), esse foi realizado até os seis meses, em 13 (21,3%) dos sete meses aos dois anos, em 11 (18%) entre os três e 10 anos, quatro pacientes (6,5%) entre 11 e 18 anos e em apenas um (1,6%), o diagnóstico foi realizado após os 50 anos de idade. Em oito pacientes (13%) não foi possível identificar a data do diagnóstico. Para 19 pacientes (31,1%), o diagnóstico inicial foi realizado por meio do Teste do Pezinho. Quanto à procedência dos pacientes que participaram do estudo, 26 (42,6%) nasceu em Uberaba e 21 (34,4%) na mesorregião do Triângulo Mineiro e Alto Paranaíba.

45 45 Os genótipos da β S globina encontrados nos 61 pacientes com Anemia Falciforme estudados foram: 31 CAR/CAR (50,8%), oito CAR/Benin (13,1%), um CAR/Camarões (1,6%), oito CAR/Atípico (13,1%), oito Benin/Benin (13,1%), três Benin/Atípico (4,9%) e dois Atípico/Atípico (3,3%). Em relação aos cromossomos: (64,8%) foram do tipo CAR, (22,1%) Benin, (12,3%) Atípicos e (0,8%) Camarões (Tabelas 9 e 10). Ressaltando ainda, que nove desses 61 pacientes (14,7%) são oriundos de outras regiões do estudo, sendo cinco de São Paulo (dois CAR/CAR; dois CAR/BEN e um ATP/ATP), dois de Goiás (CAR/CAR; CAR/ATP), um de Rondônia (BEN/BEN) e um da Bahia (BEN/ATP). A distribuição dos sete genótipos determinados em nosso estudo, em relação ao sexo, faixa etária e uso da medicação Hidroxiuréia estão representados na tabela 11, aonde vale

46 46 ressaltar que a maioria dos pacientes possui menos de 30 anos de idade e que 48,2% dos pacientes com o genótipo CAR/CAR usam ou já usaram a Hidroxiuréia. Na comparação múltipla dos níveis médios de hemácias, hemoglobina, hematócrito, plaquetas e hemoglobina fetal entre os sete grupos de genótipos obtidos, apenas, os níveis médios de HbF apresentou diferença estatisticamente significante. Quando comparamos o nível de hemoglobina fetal entre os diferentes genótipos, observamos que o CAR/CAR foi o de menor valor e está estatisticamente significante quando comparado ATP/ATP (p* = 0,03); BEN/ATP (p* = 0,0006) e CAR/BEN (p* = 0,0001). Ressaltamos ainda que, o genótipo BEN/ATP possui a maior concentração dos níveis médios de HbF entre os outros genótipos, sendo estatisticamente significante, quando comparados com BEN/BEN (p* = 0,007), CAR/ATP (p* = 0,004) e CAR/CAR (p* = 0,0006) (Tabela 12, Figuras 8 e 9).

47 47 FIGURA 8 REPRESENTAÇÃO DOS NÍVEIS DE SIGNIFICÂNCIA ESTATÍSTICA DA HEMOGLOBINA FETAL ENTRE OS DIFERENTES GENÓTIPOS. FIGURA 9 REPRESENTAÇÃO DOS NÍVEIS MÉDIOS DE HEMOGLOBINA FETAL NOS DIFERENTES GENÓTIPOS.