Cromatografia. Fundamentos, Instrumentação e Aplicações. Martha Adaime (UFSM)

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1 Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) Departamento de Química Programa de Pós Graduação em Química Grupo de Pesquisa em Análises Cromatográficas Cromatografia Fundamentos, Instrumentação e Aplicações Martha Adaime (UFSM)

2 Programa Fundamentos Gerais da Cromatografia - Fundamentos e Classificação Geral - Principais mecanismos de separação - Principais Parâmetros Cromatográficos: t R, n, Rs, α e relação entre eles Cromatografia Gasosa (GC) Fundamentos Teóricos; Instrumentação (Injetores, Colunas e Fases Estacionárias, Fase móvel, Detectores) Aplicações; Estado da Arte e Tendências. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) Fundamentos Teóricos; Modos de Separação: adsorção, partição, troca iônica, exclusão; Instrumentação (Bombas, Injetores, Colunas e Fases Estacionárias, Fase móvel, Principais Detectores); Aplicações; Estado da Arte e Tendências. Cromatografia Acoplada à Espectrometria de Massas GC-MS/MS LC-MS/MS 2

3 Por que usar CROMATOGRAFIA??? 3

4 HISTÓRICO M. TSWEET (1903): Separação de misturas de pigmentos vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e solventes variados. éter de petróleo mistura de pigmentos CaCO 3 pigmentos separados Cromatografia = kroma [cor] + graph [escrever] (grego) 4

5 Princípio Básico Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás). 5

6 Classificação da Cromatografia Cromatografia Planar Coluna FM Líquida FM Gasosa FM Líquida C.Papel C.Camada Delgada C. Gasosa CCC CLAE CCC-Cromatografia em Coluna Clássica. CLAE-Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. 6

7 1 Cromatógrafo a Gás Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna. 4 - Detector. 5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal. 6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador). 7

8 Cromatógrafo a Líquido 8

9 Fase Estacionária Sólida - é constituída por adsorventes sólidos (pó), tais como Sílica, Alumina, Carvão ativo, Zeólitos sintéticos, etc. A base para a separação, neste caso, é a Adsorção. Líquida - é constituída por uma película delgada (de líquidos orgânicos de alto ponto de ebulição) que impregnam o sólido (pó) inerte ou a parede interna da coluna capilar. A base para a separação, neste caso, é a Partição da amostra dentro ou fora da película líquida, devido a solubilidade seletiva dos compostos. 9

10 Fase Móvel Gasosa - Na Cromatografia Gasosa a Fase Móvel é o próprio Gás de Arraste cuja função é transportar os analitos através do Sistema (Injetor /Coluna /Detector). Os principais Gases de Arraste são o Hélio, Nitrogênio, Hidrogênio e o Argônio. Líquida Na Cromatografia Líquida emprega-se uma mistura de solventes, denominada Eluente, como Fase Móvel. Os principais são: metanol, acetonitrila e água. 10

11 Fluxo Fluxo Mecanismos da Cromatografia apolar apolar polar polar 11

12 Mecanismos da Cromatografia 12

13 Mecanismos da Cromatografia 13

14 TEORIA BÁSICA Constante de Distribuição, K C Ocorre um equilíbrio de distribuição do analito entre a FE e a FM. K C A S A M K C = Constante de Distribuição [A] S = concentração do analito na FE [A] M = concentração do analito na FM Afinidade pela FE MENOR RETENÇÃO!!! Volatilidade [A] S [A] M 14

15 TEORIA BÁSICA Quantificação da Eficiência Cada estágio de equilíbrio é chamado de PRATO TEÓRICO t R w b n Coluna mais eficiente 15

16 Número de pratos teóricos (n) n = 16 (t R / w b ) 2 n = segmento da coluna onde se atinge um equilíbrio entre fase móvel, estacionária e analito quanto > n > rendimento da coluna (picos mais finos) t R Injeção 16

17 Tempo de Retenção / Largura Pico t R = tempo de retenção t o = tempo de volume morto w b = largura da base t R Injeção Tempo 17

18 Seletividade ( ) = k 2 /k 1 = posição relativa de 2 picos Ideal: > 1 K 1 = 1.5 K 2 = 2.1 Tempo 18

19 Resolução (Rs) Rs = 2 (t R2 t R1 ) 2 / w b1 + w b2 Rs = separação real dos picos Rs = 0 (sem separação), Rs = 1 (separação parcial), Rs = 1.5 (separação na linha base) t Injeção W W Tempo 19

20 Eficiência de Sistemas Cromatográficos TEMPO A migração um analito pela coluna provoca inevitavelmente o alargamento da sua banda. Efeitos do alargamento excessivo de picos: Separação deficiente de analitos com retenções próximas Picos mais largos e menos intensos = menor detectabilidade EFICIÊNCIA: Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito. 20

21 INTRODUÇÃO A CROMATOGRAFIA GASOSA Martha Adaime Depto de Química-CCNE UFSM

22 CROMATOGRAFIA GASOSA Aplicabilidade Quais misturas podem ser separadas por CG? (para uma substância qualquer poder ser arrastada por um fluxo de um gás ela deve ser dissolver - pelo menos parcialmente - nesse gás) Misturas cujos constituintes sejam VOLÁTEIS (= evaporáveis ) DE FORMA GERAL: CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300 o C e que termicamente estáveis. 22

23 1 O Cromatógrafo a Gás Reservatório de Gás e Controles de Vazão / Pressão. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 - Coluna Cromatográfica e Forno da Coluna. 4 - Detector. 5 - Eletrônica de Tratamento (Amplificação) de Sinal. 6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador). 23

24 INSTRUMENTAÇÃO Gás de Arraste Fase Móvel em CG: NÃO interage com a amostra - apenas a carrega através da coluna. Assim é usualmente referida como GÁS DE ARRASTE Requisitos: INERTE Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento. PURO Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária. Impurezas típicas em gases e seus efeitos: H 2 O, O 2 oxida / hidroliza algumas FE incompatíveis com DCE hidrocarbonetos ruído no sinal de DIC 24

25 HETP (mm) Curvas de Van Deemter para diferentes Gases de Arraste N 2 C 17 at 175 C k = 4.95 Vidro W.C.O.T. OV m x 0.25 mm 0.6 He 0.4 H Velocidade linear média (cm/seg) u 25

26 CUSTO FASE MÓVEL ou Gás de Arraste Requisitos: CUSTO Gases de altíssima pureza podem ser muito caros. A PUREZA B C A = 99,995 % (4.5) B = 99,999 % (5.0) C = 99,9999 % (6.0) COMPATÍVEL COM DETECTOR Cada detector demanda um gás de arraste específico para melhor funcionamento. 26

27 LINHA DE GÁS Componentes necessários à linha de gás: controladores de vazão / pressão de gás dispositivos para purificação de gás ( traps ) Cilindro de Gás 2 - Regulador de Pressão Primário 3 - Traps para eliminar impurezas do gás 4 - Regulador de Pressão Secundário 5 - Regulador de Vazão (Controlador Diferencial de Fluxo) 6 - Medidor de Vazão (Rotâmetro) 5 27

28 Dispositivos de Injeção de Amostra Os dispositivos para injeção (INJETORES ou VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica t = 0 Injeção instantânea: t = x t = 0 Injeção lenta: t = x 28

29 Injeção Split (com Divisão) Considerando a geometria dos injetores split-splitless, a razão de divisão normalmente é ajustada variando-se a vazão total de entrada de gás de arraste: CONTROLE DE VAZÃO TOTAL Deve ser regulado até o SR desejado CONTROLE DE PRESSÃO Altera pressão vazão na coluna (NÃO DEVE SER MODIFICADA VISANDO REGULAGEM DE SR!!!!!) 29

30 Injetor on-column Convencional Septo (silicone) 2 - Alimentação de gás de arraste) 3 - Bloco metálico aquecido 4 - Ponta da coluna cromatográfica 30

31 Injeção on-column de líquidos Ponta da agulha da microseringa é introduzida no início da coluna. 2 - Amostra injetada e vaporizada instantâneamente no início da coluna. 3 - Plug de vapor de amostra forçado pelo gás de arraste a fluir pela coluna. 31

32 Parâmetros de Injeção TEMPERATURA DO INJETOR Deve ser suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposição Regra Geral: T inj = 50 o C acima da temperatura de ebulição do componente menos volátil VOLUME INJETADO Depende do tipo de coluna e do estado físico da amostra COLUNA empacotada = 3,2 mm ( 1 / 4 ) capilar = 0,25 mm Amostras Líquidas 0,2 L L 0,01 L... 3 L Amostras Gasosas 0,1 ml ml 0,001 ml... 0,1 ml Sólidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a solução 32

33 Microsseringas para Injeção LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1, 5 e 10 L Microseringa de 10 L: êmbolo agulha (inox 316) corpo (pirex) Microseringa de 1 L (seção ampliada): corpo agulha guia êmbolo (fio de aço soldado ao guia) 33

34 Colunas: Definições Básicas EMPACOTADA = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m CAPILAR = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m 34

35 INSTRUMENTAÇÃO Colunas: Definições Básicas Empacotadas analíticas: - Aço inoxidável; mm (d.i.) m Capilares: Coluna empacotada e capilar. - Sílica fundida; - Poliimida; - 0,32 mm (d.i.) m 35

36 TEORIA BÁSICA Quantificação da Eficiência ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO TEÓRICO (H) Tamanho de cada estágio de equilíbrio (L = comprimento da coluna) Capilares, L = 30 m Empacotadas, L = 2 m Valores típicos de H e N: d C d f H N % % Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais eficientes 36

37 Temperatura da Coluna PRESSÃO DE VAPOR (p 0 ). p 0 = f Estrutura química do analito Temperatura da coluna Temperatura da coluna Pressão de vapor Velocidade de migração ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE 37

38 Temperatura da Coluna TEMPERATURA DA COLUNA 38

39 Programação Linear de Temperatura Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE: T COL BAIXA: T COL ALTA: 39

40 TEMPERATURA Programação Linear de Temperatura A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação: Parâmetros de uma programação de temperatura: T FIM T INI R t INI TEMPO t FIM 40

41 Programação Linear de Temperatura Possíveis problemas associados à PLT: VARIAÇÕES DE VAZÃO DO GÁS DE ARRASTE A viscosidade de um gás aumenta com a temperatura. viscosidade vazão DERIVA ( DRIFT ) NA LINHA DE BASE Devido ao aumento de volatilização de FE líquida 41

42 42

43 FASES ESTACIONÁRIAS LÍQUIDOS Depositados sobre a superfície de: só-lidos porosos inertes (colunas empacotadas) ou de tubos finos de materiais inertes (colunas capilares) SUPORTE Sólido inerte poroso FE líquida Tubo capilar de material inerte Para minimizar a perda de FE líquida por volatilização, normalmente ela é: Entrecruzada Quimicamente ligadas 43

44 FASES ESTACIONÁRIAS SELETIVA Deve interagir diferencialmente com os componentes da amostra. FE Seletiva: separação adequada dos constituintes da amostra FE pouco Seletiva: má resolução mesmo com coluna de boa eficiência A FE deve ter características tanto quanto possível próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático...) 44

45 FASES ESTACIONÁRIAS Substituintes Nomes Comerciais Observações - - SE-30 OV-1 OV-101 SP-2100 mais apolares da série pouco seletivas carborano? - Dexsil 300GC similar a PDMS estável até > 400 o C fenil 5 % - SE-52 SE-54 OV-3 OV-5 OV-73 pouco polar cianopropil 7% fenil 7% OV-1701 SPB-7 CP-Sil 19CB moderadamente polar fenil 50 % - OV-17 SP-2250 HP-50+ SPB-50 moderadamente polar retém aromáticos trifluoropropil 50% - OV-210 QF-1 moderadamente polar retém compostos carbonílicos cianopropil 50% fenil 50% OV-225 SP-2300 CP-Sil 43CB polar retem doadores de elétrons cianopropil 100% - SP-2340 SP-2330 Silar-9 CP altamente polar Diferenças entre FE de composição similar provenientes de fornecedores diferentes: pureza, viscosidade. 45

46 FASES ESTACIONÁRIAS Famílias de FE Líquidas Separação de pesticidas - FE = 100 % PDMS 1 - TCNB 2 - Dichloram 3 - Lindano 4 - PCNB 5 - Pentacloroanilina 6 - Ronilano 7 - Antor 8 - pp -DDE 9 - Rovral 10 - Cypermetrin 11 - Decametrin Coluna: CP-Sil 5 (25 m x 0,32 mm x 0,12 m) T COL :195 o C (6,5 min) / 195 a 275 o C (10 o C min -1 ) 17 min Gás de Arraste: 35 cm min -1 Detector: FID Amostra: 2 L de solução dos pesticidas on-column 46

47 FASES ESTACIONÁRIAS Famílias de FE Líquidas Separação de piridinas - FE = 100 % CNpropilsilicone 1 - piridina 2-2-metilpiridina 3-2,6-dimetilpiridina 4-2-etilpiridina 5-3-metilpiridina 6-4-metilpiridina 3 min Coluna: CP-Sil 43CB (10 m x 0,10 mm x 0,2 m) T COL : 110 o C (isotérmico) Gás de Arraste: N 2 at 16 cm min -1 Detector: FID Amostra: 0,1 L de solução 1-2% das piridinas em 3-metilpiridina 47

48 FASES ESTACIONÁRIAS Famílias de FE Líquidas Separação de fenóis - FE = fenilmetilsilicones 50% Ph 50% Me 5% Ph 95% Me 48

49 FASES ESTACIONÁRIAS FE Quirais Separação de isômeros óticos: PRODUTOS BIOLÓGICOS Distinção entre produtos de origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias oticamente puras; sintético = muitas vezes são misturas racêmicas). FÁRMACOS Em muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos têm atividade farmacológica. Propriedades físico-químicas de isômeros óticos são MUITO SIMILARES FE convencionais não interagem diferencialmente com isômeros óticos Separação de misturas de isômeros óticos só é possível com FE oticamente ativas = FE Quirais 49

50 ANÁLISE QUALITATIVA Conceitos Gerais Aplicações Qualitativas de CG Identificação individual das espécies contidas na amostra Determinação da identidade da amostra propriamente dita Fontes de Informações Qualitativas RETENÇÃO identificação Uso de dados de retenção de um analito para sua DETECÇÃO Detectores que fornecem informações estruturais sobre as substâncias eluídas 50

51 t R = f ANÁLISE QUALITATIVA Tempos de Retenção Interações analito / FE Pressão de vapor do analito Condições operacionais (T COL, F C...) Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de um analito é uma constante AMOSTRA PADRÃO 51

52 MASSA ANÁLISE QUALITATIVA Tempos de Retenção Identificação por t R é muito pouco confiável: Dependência com F C e T COL Variações nestas condições afetam sensivelmente os t R VARIAÇÃO DE 1% DT COL = 0,1% NO t R DF C = 1% Sobrecarga na coluna Aumento excessivo na massa de material eluido deforma o pico cromatográfico e altera o seu t R 52

53 ANÁLISE QUALITATIVA Tempos de Retenção Comparação de t R usando dopagem ( spiking ) da amostra com o analito suspeito: aumento da confiabilidade de identificação. 53

54 DETECTORES Definições Gerais Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade eluida de um analito ~ 60 detectores já usados em CG ~ 15 equipam cromatógrafos comerciais 4 respondem pela maior parte das aplicações DCT TCD Detector por Condutividade Térmica DCE ECD Detector por Captura de Elétrons DIC FID Detector por Ionização em Chama EM MS Detector Espectrométrico de Massas 54

55 INSTRUMENTAÇÃO Detectores Mais Importantes: DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU TCD) Variação da condutividade térmica do gás de arraste. DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID) Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de H 2 + ar. DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD) Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por eluatos altamente eletrofílicos. REGISTRO DE SINAL ANALÓGICO Registradores XY DIGITAL Integradores Computadores 55

56 DETECTORES Detector por Condutividade Térmica PRINCÍPIO Variação na condutividade térmica do gás quando da eluição de um analito. i Cela de Detecção do DCT: 1 Bloco metálico (aço) Entrada de gás de arraste 3 Saída de gás de arraste Filamento metálico (liga W-Re) aquecido 5 Alimentação de corrente elétrica para aquecimento do filamento 56

57 DCT: Aplicações Separação de Gases e Hidrocarbonetos: Coluna: CP Sil 5CB (50 m x 0,32 mm x 5 µm) Gás de Arraste: He, 3 ml min -1 T COL : 40 C 1 N 2 2 CH 4 3 CO 2 4 n-c 2 5 NH 3 6 n-c 3 7 i-c 4 8 n-c 4 Detector: DCT 57

58 Detector por Ionização em Chama O efluente da coluna é misturado com H 2 e O 2 e queimado. Como numa chama de H 2 + O 2 não existem íons, ela não conduz corrente elétrica. Quando um composto orgânico elui, ele também é queimado. Como na sua queima são formados íons, a chama passa a conduzir corrente elétrica 58

59 Detector por Captura de Eletrons Um fluxo contínuo de eletrons lentos é estabelecido entre um anôdo (fonte radioativa b -emissora) e um catodo. Na passagem de uma substância eletrofílica alguns eletrons são absorvidos, resultando uma supressão de corrente elétrica. 59

60 Características Operacionais do DCE SENSIBILIDADE :QMD = 0,01 pg a 1 pg (organoclorados), 10 fg Lindano (C 6 H 6 ) -ECD HP-6890 ~250 fg cada analito PESTICIDAS 1 tetracloro-m-xileno 2 - BHC 3 Lindano 4 Heptachlor 5 Endosulfan 6 Dieldrin 7 Endrin 8 DDD 9 DDT 10 Metoxychlor 10 decaclorobifenila 60

61 DCE: Aplicações Contaminantes em ar atmosférico - detecção paralela DIC + DCE DIC DCE 1, 2, 3 - Hidrocarbonetos aromáticos 4, 5, 6 - Hidrocarbonetos clorados 61

62 SINAL (S) DETECTORES Parâmetros Básicos de Desempenho QUANTIDADE MÍNIMA DETECTÁVEL Massa de um analito que gera um pico com altura igual a três vezes o nível de ruído S N = 3 RUÍDO (N) RUÍDO Qualquer componente do sinal gerado pelo detector que não se origina da amostra Fontes de Ruído Contaminantes nos gases Impurezas acumuladas no detector Aterramento elétrico deficiente 62

63 DETECTORES Parâmetros Básicos de Desempenho LIMITE DE DETEÇÃO Quantidade de analito que gera um pico com S/N = 3 e w b = 1 unidade de tempo Mesmo detector, nível de ruído e massa de analito MAS diferentes larguras de base: QMD = f w b Detector (sinal gerado, ruído) Largura do pico cromatográfico Definindo limite de detecção como: LD é independente da eficiência do sistema cromatográfico! [QMD] = massa (ng, pg...) [LD] = massa / tempo (ng.s -1, pg.s -1...) 63

64 DETECTORES Classificação Detector Tipo Gases Seletividade Faixa Detecção Faixa Dinâmica Ionizaçao de Chama (FID) Fluxo de Massa Hidrogenio e ar Maioria dos compostos organicos. 100 pg 10 7 Condutividade Térmica TCD Concentração Referencia Universal 1 ng 10 7 Captura de Eletrons ECD Nitrogeniofosforo (NPD) Fotometrico de Chama (FPD) Concentraçao Make-up Haletos, nitratos, nitrilas, peroxidos, anidridos, organometalicos. Fluxo de Massa Hidrogenio e ar Nitrogenio, fosforos Fluxo de Massa Hidrogenio e ar possivelmente oxigenio Sulforados, fosforados, tin, boro, arsenico, germânio, selenio, cromo 50 fg pg pg 10 3 Fotoionizaçao (PID) Concentração Make-up Alifaticos, aromaticos, cetonas, esteres, aldeidos, aminas, heterociclicos, organosulforados, alguns organometalicos 2 pg 10 7 Condutividade Eletrolitica (HECD) Fluxo de Massa Hidrogenio, oxygenio Haletos, nitrogenados, nitrosaminas, sulforados 64

65 ANÁLISE QUALITATIVA Métodos de Detecção Qualitativos Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica de Massas (CG-EM) Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica por Emissão Atômica (CG-EA) Cromatografia Gasosa com Deteção Espectrométrica por Absorção no Infra-Vermelho (CG-EIV) Identificação muito confiável quando combinados a técnicas de identificação baseadas em retenção 65

66 ABUNDÂNCIA ANÁLISE QUALITATIVA Espectrometria de Massas 1 Moléculas da amostra são bombardeadas por elétrons (electron impact = EI) ou íons (chemical ionization = CI): ABCDE + e - ABCDE e - 2 O íon formado se fragmenta: ABCDE.+ AB. + CDE + ABCDE.+ AB + + CDE. ABCDE.+ A + + BCDE. 3 Os fragmentos iônicos formados são separados magneticamente de acordo com suas massas moleculares e contados: MASSA / CARGA 66

67 ANÁLISE QUALITATIVA Espectrômetro de Massas Câmara de Ionização Eletrons gerados por um filamento aquecido bombardeam a amostra. Os fragmentos ionizados (carga +1) são repelidos pelo eletrodo positivo e conduzidos ao separador magnético. 2 Saída de Vácuo Todo o interior do EM deve estar sob alto vácuo (natm). 4 3 Separador Magnético A ação do campo magnético deixa apenas íons com determinada razão Massa / Carga atravessar esta área do equipamento. 4 Detector Uma válvula fotomultiplicadora ou um fotodiodo gera um sinal elétrico proporcional ao número de íons que incide sobre o elemento. 67

68 ANÁLISE QUALITATIVA Espectro de Massas m / Z - CO m/z = 80 m/z = (CO + H) m/z = 79 m/z = 90 68

69 ANÁLISE QUALITATIVA CG-EM: TIC x SIM Aroma de polpa industrializada de cajá após extração por SPME TIC Aparecem os picos correspondentes a todas substâncias eluídas SIM (m/z = 149) Cromatograma construido a partir dos mesmos dados acima, mas apenas usando fragementos com massa = 149 (ftalatos: plastificante) 69

70 DETECTORES CG Sensibilidade e Faixa de resposta 70

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