Clinical Applications for Vitamin D Assays: What Is Known and What Is Wished for

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1 Clinical Applications for Vitamin D Assays: What Is Known and What Is Wished for Moderator: Michael Kleerekoper 1,*, Experts: Rosemary L. Schleicher 2, John Eisman 3.4.5, Roger Bouillon 6, Ravinder J. Singh 7 and Michael F. Holick 8 Aplicações Clínicas para Testes da Vitamina D: O que é Conhecido e o que se Deseja Michael Kleerekoper 1,*, Moderador Rosemary L. Schleicher 2, John Eisman 3.4.5, Roger Bouillon 6, Ravinder J. Singh 7 and Michael F. Holick 8, Experts 1 Wayne State University, St. John River District Hospital, East China, MI; 2 Nutritional Biomarkers Laboratory, Division of Laboratory Sciences, National Center for Environmental Health, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA; 3 University of New South Wales, Sydney, Australia; 4 St. Vincent's Hospital, Sydney, Australia; 5 Osteoporosis and Bone Biology Research Program, Garvan Institute of Medical Research, Sydney, Australia; 6 Experimental Medicine and Endocrinology Section, K.U.Leuven, Leuven, Belgium; 7 Endocrine Laboratory, Clinical Biochemistry and Immunology, Department of Laboratory Medicine and Pathology, Mayo Clinic, Rochester, MN; 8 General Clinical Research Center, Boston University School of Medicine, Boston, MA. * Envie correspondência para esse autor para : Wayne State University, St. John River District Hospital, 4014 S. River Rd., Bldg. 2B, East China, MI Fax ; Vitamina D é um tópico quente, com o número de citações na PubMed excedendo 2400 em 2009, um aumento de 3 vezes em 1 ano. Nos Estados Unidos, o número de testes pedidos de 25-hidroxivitamina D (25-OHD)9 está aumentando exponencialmente. Nem todo o material publicado tem validade, entretanto. Um painel de peritos foi convidado para abordar uma série de questões pertinentes aos métodos laboratoriais e aplicações clínicas dos testes disponíveis para 25-OHD e 1,25-dihidroxivitamina D (1,25- OHD). Qual nós devemos medir: 25-OHD3, 25-OHD2, ambas, ou 1,25-OHD? Rosemary L. Schleicher: Nosso interesse está em fornecer dados da 25-OHD para o Levantamento Nacional do Exame de Nutrição e Saúde (NHANES). Estimativas separadas para 25-OHD2 e 25- OHD3 juntamente com recentes dados de ingestão de alimentos e suplementos, dados de questionários sobre atividade física, comportamento de proteção contra o sol e tipo de pele, e informação demográfica relacionada com raça/etnia, estação, latitude, e idade fornecem informação valiosa sobre as fontes de vitamina D para aqueles na população americana civil não institucionalizada. Além disso, nós estaremos separando e quantificando o epímero C3 da 25-OHD3, que pode não ser tão biologicamente ativo quanto a 25-OHD3. John Eisman: 25-OHD2 e 25-OHD3 devem ser medidas na maioria das situações clínicas, embora em muitos países suplementos de vitaminas e fortificação alimentar estão se movendo da vitamina D2 para D3. Eu não estou

2 ciente das necessidades clínicas necessárias para se conhecer a 25-OHD2 e a 25-OHD3 separadamente, ou o epímero C3. Existem poucas situações clínicas onde conhecer as concentrações de 1,25-OHD seja clinicamente crítico ou demasiadamente útil. Roger Bouillon: Nós precisamos conhecer a concentração combinada de 25- OHD3 e 25-OHD2 porque ambos os produtos podem ser convertidos no hormônio ativo 1,25-OHD. Em países onde suplementação de vitamina D2 não está disponível, a medição da 25-OHD3 sozinha seria suficiente, desde que haja muito pouca vitamina D2 no alimento natural não suplementado, e esse é o caso da maioria dos países europeus. Em países onde vitamina D2 é prontamente usada, ou como aditivo alimentar ou como suplemento dietético, a concentração de 25-OHD2 deve ser incluída na medição. Não existem razões clínicas sólidas para se medir 25-OHD2 e 25-OHD3 separadamente. O teste desejado seria aquele que reconhecesse igualmente 25-OHD2 e 25-OHD3 para fornecer 25-OHD total. Alternativamente, existe um método que permite a medição, de ambos os componentes, que então podem ser somados. Medições separadas podem responder perguntas específicas de pesquisa. Insuficiência rena progressiva é a principal razão para baixas concentrações de 1,25-OHD, contudo sua utilidade clínica nessa doença ainda não está estabelecida. Medição do soro 1,25-OHD pode ser útil para avaliar a origem de concentrações anormais de cálcio, especialmente hipercalcemia. Essa medição é essencial para diagnosticar hipercalcemia devido à produção excessiva de 1,25-OHD extra renal, tais como em sarcoidose ou hipercalcemia guiada por inflamação. Soro 1,25-OHD é ligeiramente elevado na hipercalcemia devido ao excesso de hormônio paratireóide (PTH), ao passo que ele é reduzido na maioria das outras causas não relacionadas com PTH de hipercalcemia. Ravinder J. Singh: Realmente depende do diagnóstico diferencial. Para deficiência nutricional, definitivamente ambas as formas, vitamina D2 e D3, devem ser medidas. O fígado converte vitamina D2 e D3 rapidamente em 25-OHD2 e 25- OHD3, que são convertidas em 1,25-OHD2 e 1,25-OHD3, respectivamente, num ciclo de retroalimentação negativa baseada no PTH e no cálcio. Visto que 25-OHD3 e 25-OHD2 circulam em concentrações de ng/ml (nmol/l), é mais fácil desenvolver métodos para medi-las do que os metabolitos 1,25- OHD2 e 1,25-OHD3 (pg/ml, pmol/l). A maioria dos estudos mediu apenas 25-OHD3 e 25-OHD2 e demonstrou associações com elas. 1,25-OHD2 e 1,25-OHD3 são medidos em pacientes com insuficiência renal e pacientes com sarcoidose e outras doenças granulomatosas. Michael F. Holick: Para determinar o status da vitamina D de uma pessoa, é importante conhecer a concentração total de sangue de 25-OHD, que inclui 25-OHD2 e 25- OHD3. Nos Estados Unidos, a única forma de prescrição farmacêutica de vitamina D é vitamina D2, e portanto medir 25-OHD2 pode ser de grande valor em indivíduos tratados para deficiência de vitamina D. Se a 25-OHD2 do paciente não aumentar, isso pode ser devido a não conformidade ou a uma silenciosa síndrome de má absorção intestinal, tal como doença celíaca. O teste para 1,25-OHD não deve ser usado para determinar o status da vitramina D de uma pessoa, já que pacientes com deficiência de vitamina D e hiperparatireoidismo secundário frequentemente possuem concentrações normais ou elevadas de 1,25-OHD. Entretanto, esse teste é de grande valor para avaliar o diagnóstico diferencial para uma variedade de distúrbios

3 inatos e adquiridos de cálcio, vitamina D e metabolismo ósseo. É especialmente valioso em pacientes com doença renal crônica, hiperparatireoidismo primário, sarcoidose, osteomalácia oncogênica, raquitismo resistente à vitamina D, raquitismo por deficiência de pseudo vitamina D, e raquitismo hipofosfatêmico. Existe um teste preferido para a medição dos metabolitos da vitamina D? Rosemary L. Schleicher: Nós definitivamente preferimos testes baseados na química nos quais os diferentes metabolitos da vitamina D são separados. Para quantificação, nós preferimos espectrometria de massa conjunta (MS/MS) usando padrões internacionais estáveis marcados por isótopos para corrigir resultados de recuperação. Em teoria, diluição do isótopo fornece a melhor combinação de materiais para a correção de resultados. Entretanto, outros têm mostrado que detecção ultravioleta (UV) fornece resultados que são comparáveis àqueles da espectrometria de massa. Para o NHANES, a disponibilidade do soro é limitada porque muitos testes clínicos são realizados no sangue de cada participante. Espectrometria de massa é mais sensível do que detecção UV, e desse modo ela se adapta melhor às nossas necessidades. Ravinder J. Singh: Historicamente, vários testes foram usados, incluindo RIA, testes protéicos de ligação de vitamina D, HPLC-UV, e métodos de cromatografia líquida/ms/ms (LC-MS/MS). Cada método possui vantagens e desvantagens, e é impraticável para cada laboratório realizar o método de referência. É importante, contudo, que os testes sejam padronizados e harmonizados. Levou 50 anos para se atingir a padronização para as medições do colesterol, mas até que isso seja atingido para o teste da vitamina D, o valor de vários estudos publicados que usaram testes atuais é limitado. Infelizmente, nenhum limite de erro clínico foi definido para o teste da vitamina D para se tomar decisões de desempenho clínico ou analítico. Michael F. Holick: Meu teste de escolha para medir 25-OHD é LC-MS/MS, que quantitativamente mede as concentrações circulantes tanto de 25-OHD2 quanto de 25-OHD3, que então dá a concentração total de 25-OHD. Muitos dos testes de quimiluminescência usam anticorpos para medir 25-OHD em soro não extraído. Isso é problemático já que esses anticorpos reconhecem outros metabolitos da vitamina D, tais como 24,25-OHD, e portanto o teste não apenas fornece a concentração total de 25-OHD mas também inclui outros metabolitos da 25-OHD. Além disso, a partir de minha experiência clínica eu descobri que esses testes nem sempre reconhecem 25-OHD2 e 25-OHD3. Desse modo, pacientes sendo tratados com vitamina D2 para deficiência de vitamina D podem ser informados por seus médicos que eles não estão respondendo à terapia já que seu 25-OHD do total do plasma não aumentou, quando de fato ele aumentou. O CDC e o NIH estão usando agora o teste de LC-MS/MS como o teste preferido para testes clínicos. Quão estáveis são a 25-OHD e o 1,25-OHD durante o transporte? Rosemary L. Schleicher: Os metabolitos 25- hidroxilados que nós medimos são muito estáveis no soro. Quando o soro foi mantido descongelado em temperaturas de até 37 C por mais de uma semana, as concentrações de 25- OHD2, 25-OHD3, ou epi-25-ohd3 não mudaram. Em nosso laboratório, dados de congelamento/degelo mostram excelente estabilidade desses 3 analitos por pelo menos 5 ciclos. John Eisman: Os metabolitos 25-OHD são muito estáveis, assim como 1,25-OHD no soro. Entretanto, eles não são tão estáveis uma vez que foram extraídos. Roger Bouillon: De acordo com dados publicados confirmados por dados pessoais não publicados, metabolitos da vitamina D são muito estáveis à 20 C e após ciclos de congelamento/degelo. Eles também são estáveis por 24 hs ou o equivalente em temperatura ambiente.

4 Ravinder J. Singh: A concentração de 25-OHD3 em seu estado natural ligada à proteína de ligação da vitamina D é muito estável em temperatura ambiente, mesmo para sangue total não processado. Tanto para as amostras processadas quanto para as não processadas, atrasos de várias horas antes da análise tiveram efeitos desprezíveis sobre as concentrações. Mesmo as amostras esquecidas ou aquelas recebidas em estado descongelado parecem estar adequadas para análise. As reduções nas concentrações notadas após 3 dias sob condições usuais de laboratório em temperatura ambiente foram menores do que a imprecisão analítica interteste. Não parece haver necessidade de que o soro seja congelado para transporte, e o sangue total pode até mesmo ser a amostra de escolha para transporte para até 3 dias. Condições de armazenagem de soro à 4 C por pelo menos 7 dias e até 4 ciclos de congelamento/degelo são admissíveis. Concentrações de 25-OHD3 parecem ser estáveis em temperatura ambiente e sob as condições pré-analíticas comuns experimentadas nos laboratórios médicos. Quais são as indicações clínicas para medição da 25-OHD em distúrbios do metabolismo mineral e ósseo, ou outras situações? John Eisman: Nossa experiência, apoiada por outros estudos internacionais e usando testes apropriados, é que concentrações de 25-OHD são muito baixas em muitas pessoas com osteoporose e em muitas pessoas por outro lado saudáveis. Michael F. Holick: Nós desenvolvemos testes de LC-MS/MS e HPLC para vitamina D que têm sido valiosos em avaliar o papel da irradiação UV em elevar as concentrações sanguíneas de vitamina D. Eles também têm sido de valor para determinar o grau de má absorção da vitamina D em pacientes com doença inflamatória intestinal, fibrose cística, e colite ulcerada, e após cirurgia gástrica de bypass. Todos os peritos: Em outras situações, não há necessidade de medição específica da própria vitamina D para propósitos clínicos fora de um cenário de pesquisa que aborde uma questão sobre a origem ou metabolismo da própria vitamina D, ou estudos populacionais. Os muitos estudos epidemiológicos que ligam deficiência de vitamina D com condições/doenças específicas ou para prever resultados adversos de saúde são intrigantes contudo até agora de pouca relevância clínica. Quais intervalos de referência devem ser usados para relatar resultados de 25-OHD, e eles devem ser estratificados por sexo, etnia, idade, e estação? Rosemary L. Schleicher: Para levantamentos populacionais, nós estamos interessados em diferenças demográficas. Nossos dados do NHANES mostram que existem diferenças entre os sexos (2% de diferença entre homens e mulheres), na raça/etnia (67% de diferença entre brancos não Hispânicos e negros não Hispânicos), na idade (33% de diferença entre crianças e idosos) e na estação/latitude (8% de diferença entre inverno no sul e verão no norte). John Eisman: Medir os valores numa população e presumir que isso é o que deve ser é tão racional quanto aceitar obesidade, hipertensão, diabetes, dano renal, e osteoporose significativos como sendo normais. Na ausência de qualquer dado sobre o que seja uma concentração apropriada de latitude/etnia/sexo ou idade, eu creio que nós temos que usar apenas os dados sazonais. Uma pessoa com uma 25-OHD limítrofe no fim do inverno pode estar bem durante o verão e desse modo provavelmente bem durante todo o ano. Uma pessoa cuja 25- OHD esteja limítrofe no fim do verão quase certamente estará baixa no inverno e desse modo merece cuidado e consideração para substituição e investigação para excluir outras causas, tais como doença celíaca. Roger Bouillon: 25-OHD deve ser mais alta do que 10 μg/l (25 nmol/l), porque tais concentrações persistentemente baixas podem resultar em depósito mineral prejudicado (raquitismo/osteomalácia). Em adultos, 25-OHD deve ser mais alta do que 20 μg/l (50 nmol/l) para evitar mecanismos compensatórios na secreção do PTH ou absorção de cálcio, e desse modo

5 equilíbrio ósseo. Valores são afetados pela estação e exposição ao sol, pigmento de pele, e etnia. Ravinder J. Singh: Está claro que valores de cutoff clínicos e críticos serão diferentes para pacientes em diferentes latitudes, raças e doenças. Por exemplo, prevenção de raquitismo em neonatos e perda óssea em adultos terão valores de cutoff muito diferentes. Para doenças tais como diabetes e doença cardiovascular, será muito difícil determinar valores de cutoff, já que essas doenças são distúrbios complexos e sendo multifatoriais terão amplos valores de intervalos de referência nessas populações. Michael F. Holick: Eu não acredito que uma concentração de plasma de 25-OHD deva ser baseada no sexo, etnia, idade, ou estação. Eu acredito que todas as crianças e adultos devam manter uma concentração de plasma de 25- OHD de pelo menos 30 μg/l (75 nmol/l) e até 100 μg/l (250 nmol/l) seja seguro. A única exceção é em pacientes com produção extrarenal de 1,25-OHD, incluindo pacientes com distúrbios crônicos de granuloma e alguns linfomas. Quão importantes são os filtros solares e chapéus de sol na regulação da síntese da vitamina D? Rosemary L. Schleicher: Filtros solares e vestuário efetivamente previnem síntese cutânea da vitamina D. No NHANES, o soro total 25-OHD estava significativamente mais alto naqueles que frequentemente ou algumas vezes praticaram comportamentos de proteção contra o sol, comparados com aqueles que não praticaram. John Eisman: Em um estudo da Victoria, Austrália, uso do filtro solar num teste clínico randomizado não estava associado com significativas diferenças nas concentrações de 25-OHD. Isso pode estar relacionado com o cumprimento e adoção de outras práticas de proteção contra o sol na Austrália. Roger Bouillon: Ambas as proteções diminuirão a produção de vitamina D por radiação UVB e concentração de 25-OHD. Ravinder J. Singh: Depende se a fonte de vitamina D for a suplementação ou a exposição ao sol. Michael F. Holick: Se o filtro solar for usado adequadamente, ele reduzirá acentuadamente a síntese de vitamina D na pele. Por exemplo, um filtro solar com um SPF de 30 por definição deve absorver aproximadamente 98% da radiação incidente de UVB e desse modo reduzirá a capacidade da pele de produzir vitamina D em aproximadamente 98%. Eu sempre encorajo o uso de filtro solar no rosto e o uso de um chapéu de sol para proteger a face dos efeitos prejudiciais da excessiva exposição à luz solar. Já que o rosto é a área do corpo mais exposta ao sol, ele é mais propenso à dano solar e elevado risco de câncer de pele não melanoma. Também, ele representa apenas cerca de 9% da superfície do corpo e desse modo fornece muito pouca vitamina D. Por todas essas razões, quando alguém é exposto à luz solar, algum tipo de proteção solar da face é encorajada. Quão válidos são os dados epidemiológicos que relacionam a vitamina D com doenças fora do esqueleto? John Eisman: Existem dados interessantes, mas não é possível separar o status da saúde do estilo de vida e desse modo estabelecer relações causais. Roger Bouillon: Tomando como base a secional cruzada e apenas até um certo ponto dados epidemiológicos prospectivos, baixo status da vitamina D é geralmente um indicador de mau status de saúde ou resultado. Grande parte dos dados epidemiológicos fornece informação conflitante. A maioria dos estudos controlados randomizados não relata efeitos benéficos líquidos nos tecidos extra- esqueléticos. Michael F. Holick: Tem havido muita discussão e debate sobre estudos de associação e estudos de observação que têm sugerido que viver em latitudes mais altas e estando com um risco mais alto de deficiência de vitamina D aumenta o risco de doenças autoimunes, doença cardiovascular, diabetes do tipo II, doenças infeccio-

6 sas, pré-eclâmpsia, cesariana e cânceres mortais. Tomados como um todo, os dados são muito fidedignos e claramente merecedores de investigação adicional. Existem agora vários testes controlados randomizados demonstrando que elevada ingestão de vitamina D reduz o risco de ataques de asma, rigidez vascular do músculo liso, influenza, infecção e melhora a sensibilidade à insulina, achados que ajudam a apoiar muitas das reivindicações feitas por estudos de associação e de observação. Quais são os mecanismos que controlam a produção de 1,25-OHD fora do rim? John Eisman: Existe boa evidência de produção extra-renal de 1,25-OHD na pele e nos tecidos hematopoiéticos entre outros. É provavelmente nesses locais que 1,25-OHD exerce algum papel regulador parácrino. Muitas moléculas reguladoras têm sido invocadas como sendo importantes na regulação do 1,25-OHD extra-renal. Entretanto, está claro que existe uma perda de feedback negativo do 1,25-OHD e nenhuma evidência de regulação por PTH naqueles locais. Roger Bouillon: Síntese extra-renal é regulada por fatores diferentes daqueles no rim, que estão melhores documentados no monócito e no sistema imune e, em menor grau, nos queratinócitos. Michael F. Holick: Agora está bem documentado que macrófagos ativados possuem a capacidade de produzir 1,25-OHD, que desempenha um importante papel para ajudar a célula a destruir agentes infecciosos, tais como tuberculose, aumentando a produção de catelicidina. Nós, assim como muitos outros investigadores, temos demonstrado que queratinócitos humanos, células do cólon, células da próstata e outros expressam a enzima que é capaz de produzir 1,25-OHD. Mais pesquisa é necessária para entender quão importante a produção local de 1,25-OHD é para regular o crescimento celular e uma ampla variedade de outras atividades gênicas. Existe um papel para se determinar polimorfismos no receptor da vitamina D (VDR)? John Eisman: Essa ainda é uma área em desenvolvimento no sentido que polimorfismos no VDR, entre aqueles em muitos genes, eventualmente desempenharão um papel na farmacogenética com relação às escolhas de terapia. Entretanto, nós ainda não estamos lá. Polimorfismos do VDR têm sido relatados possuir um efeito nos fenótipos ósseos em muitos estudos e aparecem nas listas de genes possivelmente associados nos grandes estudos de associação genômica. Roger Bouillon: O impacto do polimorfismo do VDR não é grande e certamente não é uniforme em diferentes populações, contudo efeitos menores não podem ser excluídos e são até mesmo prováveis portanto nenhum valor clínico atualmente. Ravinder J. Singh: Já que grandes números de pacientes estão sendo tratados com doses mais altas de vitamina D, será ótimo ter o conhecimento não apenas dos polimorfismos do VDR mas também dos genes envolvidos na farmacogenômica. Michael F. Holick: A literatura sobre polimorfismo do VDR possui uma história diversificada. Originalmente, se pensava que a causa principal da osteoporose era devido à um polimorfismo do VDR. Entretanto, isso acabou não sendo verdade. Parece haver alguma associação com outros polimorfismos do VDR e elevado risco de doenças crônicas, incluindo câncer de próstata. Mais pesquisa é necessária para se definir melhor a relação causa/efeito do polimorfismo do VDR nas doenças crônicas. Existe evidência crescente de que o polimorfismo para a proteína de ligação da vitamina D pode desempenhar um papel muito importante para determinar o status da vitamina D de uma pessoa. Isso precisa de investigação adicional. Numa área de poucos recursos no tratamento da saúde e devido aos estudos populacionais e clínicos existentes, você apóia a medição da vitamina D na prática geral em indivíduos com nenhum sinal ou suspeita clínica de doença óssea?

7 John Eisman: Insuficiência de vitamina D é comum em pessoas por outro lado saudáveis ao redor do mundo, mesmo perto do equador, e é provavelmente mais comum naqueles indivíduos com pele escura, naqueles com pouca exposição da pele (frequentemente culturalmente determinado), e naqueles que possuem limitada exposição à luz solar, por exemplo, relacionado com compromissos de trabalho. Em tais indivíduos, uma medição da 25-OHD, particularmente no fim do inverno, fornece clareza sobre sua precisa situação e se ou não eles podem se beneficiar da substituição de longo prazo da vitamina D. Isso é crítico naqueles com qualquer sugestão ou evidência de má absorção ou doença óssea. Precisa haver mais consideração cuidadosa sobre o que pode ser considerado como concentrações ótimas de 25-OHD. Eu acredito que o recente relatório do Instituto de Medicina (IOM) tenha balançado o pêndulo para longe demais do outro extremo de defender valores muito altos. Em minha opinião, nenhuma é apoiada por evidência muito boa. Para evitar a situação de bom no verão mas baixo demais no inverno, pareceria que ter como objetivo ficar mais próximo de 30 μg/l (75 nmol/l) seria sensato. Provavelmente seria adequado no inverno e improvável de produzir quaisquer problemas de toxicidade no verão. Roger Bouillon: Uma medição sérica deve de fato ser realizada na prática geral apenas quando o resultado tenha implicações diagnósticas ou terapêuticas. Para uma população (Norte Americana) por outro lado saudável, suplementação de vitamina D deve ser na ordem de IU/dia, dependendo da idade, de acordo com uma recente declaração do IOM Se isso for aplicado na prática, então as concentrações de 25-OHD serão >20 μg/l (5 nmol/l) na maioria dos indivíduos normais, e medição adicional da 25-OHD não é necessária. Então, teste rotineiro de deficiência de vitamina D como parte de uma avaliação geral da saúde não é recomendada. Contanto que não haja prova formal de que suplementação mais alta do que a normal de vitamina D tenha efeitos extraesqueléticos, é duvidoso se as medições da 25- OHD possam ter reais implicações práticas. Notas de Rodapé 9Abreviações não padronizadas: 25-OHD, 25-hidroxivitamina D; 1,25-OHD, 1,25- dihidroxivitamina D; NHANES, Levantamento Nacional do Exame de Nutrição e Saúde; PTH, hormônio paratireóide; MS/MS, espectrometria de massa em conjunto; UV, ultravioleta; LC- MS/MS, cromatografia líquida MS/MS; VDR, receptor da vitamina D; IOM, Instituto de Medicina. Contribuições dos Autores: Todos os autores confirmaram que eles contribuíram para o conteúdo intelectual desse paper e satisfizeram os 3 seguintes requisitos: (a) contribuições significantes para a concepção e design, aquisição de dados, ou análise e interpretação dos dados; (b) rascunhando ou revisando o artigo para conteúdo intelectual; e (c) aprovação final do artigo publicado. Revelações dos Autores de Potenciais Conflitos de Interesse: Na submissão do manuscrito, todos os autores completaram o formulário de Revelações de Potenciais Conflitos de Interesse. Potenciais conflitos de interesse: Emprego ou Liderança: Nada a declarar. Consultor ou Papel Consultivo: M. Kleerekoper, Johnson & Johnson and Roche Diagnostics; J. Eisman, Amgen, Lilly, Merck Sharp & Dohme, Sanofi-aventis, Servier, and Novartis. Posse dos Valores: Nada a declarar. Honorários: M. Kleerekoper, Johnson & Johnson; J. Eisman, Amgen, Lilly, Merck Sharp & Dohme, Sanofi-aventis, Servier, and Novartis. Fundo de Pesquisas: J. Eisman, Amgen, Eli Lilly, Merck Sharp & Dohme, decode Genetics, Sanofi-aventis, Servier, and Novartis. Testemunho Hábil: J. Eisman, Merck Sharp & Dohme. Papel do Patrocinador : As organizações patrocinadoras não desempenharam papel algum no

8 design do estudo, escolha dos pacientes inscritos, revisão e interpretação dos dados, ou preparação ou aprovação do manuscrito. Recebido para publicação em 17 de Fevereiro de Aceito para publicação em 1 de Março de The American Association for Clinical Chemistry This article has been translated with the permission of AACC. AACC is not responsible for the accuracy of the translation. The views presented are those of the authors and not necessarily those of the AACC or the Journal. Reprinted from Clin Chem, 2011; 57 no , by permission of AACC. Original copyright 2010 American Association for Clinical Chemistry, Inc. When citing this article, please refer to the original English publication source in the journal, Clinical Chemistry. Este artigo foi traduzido com a permissão da AACC. AACC não é responsável pela acurácia da tradução. Os pontos de vista apresentados são aqueles dos autores e não necessariamente os da AACC ou do Jornal. Reimpresso da ClinChem, 2011; 57 no , por permissão da AACC. Cópia original 2010 American Association for Clinical Chemistry, Inc. Quando citar este artigo, por favor refira-se à fonte de publicação original em inglês na revista,clinical Chemistry.

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