Promoção de Crescimento de Mudas de Café (Coffea arabica) Inoculadas com Azospirillum brasilense Estirpe Cd

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1 ISSN Seropédica, RJ Março, 2005 Autores Marta dos Santos Freire Ricci Eng a. Agrônoma, Pesquisadora da Embrapa Agrobiologia, C. Postal 74505, BR 465 km 07, Seropédica/RJ, Brasil, , Janaina Ribeiro Costa Eng a. Agrônoma, Pesquisadora da Embrapa Agrobiologia, C. Postal 74505, BR 465 km 07, Seropédica/RJ, Brasil, , Verônica Massena Reis Eng a. Agrônoma, Pesquisadora da Embrapa Agrobiologia, C. Postal 74505, BR 465 km 07, Seropédica/RJ, Brasil, , Fabio Freire de Oliveira Eng o. Agrônomo, Bolsista da Capes / UFRRJ, C. Postal 74505, BR 465 km 07, Seropédica/RJ, Brasil, , oliveiraff@yahoo.com.br. Marinete Flores da Silva Engª. Agrônoma, Bolsista da Capes / UFRRJ, C. Postal 74505, BR 465 km 07, Seropédica/RJ, Brasil, , marineteflores@yahoo.com.br Luís Felipe da Cruz Rodrigues Eng o. Agrônomo, Bolsista da Embrapa Café, C. Postal 74505, BR 465 km 07, Seropédica/RJ, Brasil, , lufecr@msn.com Promoção de Crescimento de Mudas de Café (Coffea arabica) Inoculadas com Azospirillum brasilense Estirpe Cd Introdução Considerando-se que o café é uma cultura perene, a obtenção de mudas de boa qualidade é de fundamental importância no estabelecimento da lavoura cafeeira. Mudas sadias e bem desenvolvidas constitui, sem dúvida, um dos fatores básicos para o sucesso na formação de novas lavouras (GUIMARÃES et al., 1989). As mudas podem ser formadas em sacolas de polietileno (mudas em saquinhos) ou em tubos de polipropileno (tubetes) preenchidos com substrato. Quanto ao substrato para preenchimento dos recipientes, no caso de tubetes, pode-se utilizar substratos comerciais constituídos de casca de pínus compostada, vermiculita expandida, perlita, turfa, além de fertilizantes minerais ou preparar substratos alternativos a partir de terra de subsolo peneirada, estercos de curral ou de cama de aviário, composto orgânico, húmus de minhoca, casca de arroz ou palha de café carbonizadas e fertilizantes minerais (SILVA et al., 2000). No caso de sacolas, geralmente os substratos são constituídos de materiais como a areia, terra de subsolo, esterco de curral, esterco de cama de aviário, composto orgânico, húmus de minhoca e fertilizantes minerais. Na fase de viveiro, o custo de manutenção das mudas aumenta conforme o tempo necessário para o plantio das mesmas no campo. A utilização de bactérias promotoras de crescimento e fixadoras de nitrogênio atmosférico pode constituir-se uma alternativa inovadora para reduzir os custos de produção. A espécie Azospirillum brasilense, por exemplo, foi testada numa ampla faixa de hospedeiros, sendo capaz de promover o crescimento do sistema radicular pela produção de hormônios do grupo das auxinas (OKON & LABANDERA- GONZALEZ, 1994). O objetivo deste trabalho foi verificar a capacidade de promover o crescimento de mudas de café pela inoculação da bactéria fixadora de nitrogênio e promotora de crescimento vegetal Azospirillum brasilense estirpe padrão Cd. Material e Métodos O trabalho foi constituído por dois ensaios conduzidos em 2003 e 2004, a seguir descritos:

2 2 Promoção de Crescimento de Mudas de Café (Coffea arabica) Inoculadas com Azospirillum brasilense Estirpe Cd Ensaio 1 O ensaio foi conduzido na Embrapa Agrobiologia, em Seropédica, RJ, em viveiro telado, no período de outubro de 2002 a agosto de 2003, onde as temperaturas internas, neste período, variaram de 27 a 35ºC. Foi constituído por dois tratamentos: mudas de café arábica (Coffea arábica), cv. Catuaí vermelho IAC 144, inoculadas e não inoculadas com bactérias diazotróficas. As mudas foram cultivadas em sacolas de polietileno (11 cm de diâmetro por 20 cm de altura), preenchidas com um substrato preparado a partir de composto orgânico, barro e areia (1:1:1), com base em volume enriquecido com 10% de fosfato de rocha, que apresentou as seguintes características: ph = 7,3 (em água); Al +3 = 0,0 cmol c dm -3 ; Ca +2 = 5,99 cmol c dm -3 ; Mg +2 = 3,05 cmol c dm -3 ; P trocável = 3078 mg dm -3 ; K + = 49,9 mg dm -3 (EMBRAPA, 1997). O alto teor de P encontrado no substrato foi devido ao uso de fosfato de rocha, não correspondendo o valor encontrado ao P trocável. Os tratamentos foram dispostos atendendo o delineamento inteiramente casualizado, com nove repetições. Cada unidade experimental foi constituída por uma muda de café. As sementes foram colocadas para germinar em canteiros contendo areia lavada. Após a germinação, em cada sacola foi repicada uma plântula no estádio de palito de fósforo. No tratamento inoculado, as plântulas receberam uma suspensão contendo células da bactéria fixadora de nitrogênio da espécie Azospirillum brasilense estirpe Cd T, cedida pela Coleção de Bactérias diazotróficas da Embrapa Agrobiologia. As células foram crescidas em meio NFB modificado pela adição de frutose (0,7 %) e cloreto de amônio (0,217 g L -1 ) por 24 h a 175 rpm. A densidade ótica foi ajustada para 10 8 células viáveis por ml a 436 nm. Cada sacola recebeu 1,0 ml de suspensão. No tratamento não inoculado, as plântulas receberam 1,0 ml de água estéril. Após 10 meses o ensaio foi finalizado, avaliandose a altura das mudas. Em seguida, as mesmas foram cortadas e separadas em parte aérea (folhas, caule + ramos) e raízes. A área foliar foi estimada pelo método da fotocópia (GOMIDE et al., 1977). Em seguida o material vegetal foi colocado separadamente em estufa com circulação forçada de ar, a 65ºC, até atingir peso constante, para tomada do peso do material seco. O material seco foi moído e analisado quanto aos teores de N, P, K, Ca e Mg nas folhas, caule + ramos e raízes. A determinação do teor de N foi feita a partir da digestão sulfúrica e destilação (BREMNER & MULVANEY, 1982); de P, K, Ca e Mg por digestão nítrico-perclórica (BATAGLIA et al., 1983), sendo o P determinado em espectrofotômetro na faixa visível a partir da formação da cor azul do complexo fosfatomolibdato na presença de ácido ascórbico como redutor (EMBRAPA, 1997). O isolamento da bactéria inoculada foi feito inoculando-se 0,1 ml de suspensão das raízes lavadas em meio NFb semi-sólido (DöBEREINER et al., 1995), incubando-se a 35ºC por sete dias. Quando a película fina formada atingiu a superfície, foi transferida para novo meio NFb semi-sólido, e incubado novamente até que um novo véu fosse formado. Nessa fase, as culturas foram riscadas em placas contendo meio NFb sólido (15 g agar/litro ) acrescido de 20 mg de extrato de levedura. Após incubação por três a cinco dias, as colônias aparecem pequenas, secas e brancas. Para a análise de variância dos dados foi utilizado o programa estatístico MSTAT e as médias entre os tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey em nível de 5% de probabilidade. Ensaio 2 Foi conduzido na Embrapa Agrobiologia, em Seropédica, RJ, em casa de vegetação, no período de julho de 2003 a março de 2004, onde as temperaturas internas, neste período, variaram de 20 a 35ºC. O ensaio foi constituído por quatro tratamentos, sendo duas cultivares de café

3 Promoção de Crescimento de Mudas de Café (Coffea arabica) Inoculadas com Azospirillum brasilense Estirpe Cd 3 arábica, Tupi IAC e Catuaí vermelho IAC 144, inoculadas e não inoculadas com bactérias fixadoras de nitrogênio da espécie Azospirillum brasilense estirpe Cd T, cedida pela Coleção de bactérias diazotróficas da Embrapa Agrobiologia. As sementes foram colocadas para germinar em canteiros contendo areia lavada e, após a germinação, foram repicadas e inoculadas seguindo a mesma metodologia do primeiro ensaio, tendo sido utilizado o mesmo tamanho de sacolas de polietileno. O substrato para preenchimento das sacolas foi preparado com os mesmos materiais e mesmas proporções utilizadas no preparo do substrato do primeiro ensaio, tendo apresentado as seguintes características: ph = 6,7 (em água); Al +3 = 0,0 cmol c dm -3 ; Ca +2 = 5,55 cmol c dm -3 ; Mg +2 = 3,20 cmol c dm -3 ; P trocável = 3473 mg dm -3 ; K + = 30,0 mg dm -3. ). Como no primeiro ensaio, o alto teor de P encontrado no substrato foi devido ao uso de fosfato de rocha. Os tratamentos foram dispostos no delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 2 x 2, correspondendo as duas cultivares avaliadas e aos dois níveis de inoculação (com e sem), com cinco repetições. Cada unidade experimental foi constituída por três mudas, sendo o resultado de cada unidade expresso pela média das mudas. Após oito meses o ensaio foi finalizado, avaliandose a altura das mudas. Como no primeiro ensaio, a parte aérea foi separada em folhas, caule + ramos e raízes. A área foliar foi avaliada com auxílio de um medidor LI-COR Em seguida o material vegetal foi colocado separadamente em estufa com circulação forçada de ar, a 65ºC, até atingir peso constante, para tomada do peso da matéria seca. O material seco foi moído e analisado quanto aos teores de N, P, K, Ca e Mg nas folhas, caule + ramos e raízes. Para o isolamento da bactéria inoculada procedeu-se da mesma forma descrita no primeiro ensaio. Para a análise de variância dos dados foi utilizado o programa estatístico SISVAR versão 4.3 e as médias entre os tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey em nível de 5% de probabilidade. Resultados e Discussão Ensaio 1 As mudas de café quando inoculadas com A.brasiliense estirpe Cd apresentaram valores significativamente maiores de altura, peso de matéria seca de folhas, de caule + ramos e de raízes, quando comparadas às mudas não inoculadas (Tabela 1; Foto 1). Observou-se também uma maior expansão da área foliar nas mudas inoculadas. Tabela 1. Altura, peso de matéria seca de folhas, caule + ramos e de raízes e área foliar de mudas de café, cv. Catuaí vermelho, inoculadas ou não com Azospirilllum brasiliense, cultivadas em viveiro telado. Seropédica, RJ, Peso de matéria seca (g) Área Altura Tratamentos (cm) Folhas Caule + Foliar Raízes ramos (cm 2 ) Inoculadas 31,9 A 6,45 A 2,25 A 2,49 A 55.9 A 26,1 B 3,90 B 1,27 B 1,02 B 43.1 B C.V. (%) 7,3 27,0 54,5 38,0 13,2 1/ Médias seguidas de letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05). As análises de nutrientes realizadas nas folhas das mudas de café demonstraram que as mudas inoculadas com a bactéria acumularam maiores teores de N, P, Ca e Mg (Tabela 2). No caule e nos ramos houve maior acúmulo de P e nas raízes, além do P, evidenciou-se também maior acúmulo de Mg nas mudas inoculadas. Estes resultados podem ser atribuídos ao aumento do sistema radicular das plantas inoculadas, já que esta bactéria é excelente produtora de auxinas (RADWAN et al., 2002).

4 4 Promoção de Crescimento de Mudas de Café (Coffea arabica) Inoculadas com Azospirillum brasilense Estirpe Cd Ensaio 2 Foto 1. Aspecto das mudas inoculadas e não inoculadas com Azospirilllum brasiliense estirpe Cd, cultivadas em viveiro telado. Seropédica, RJ, Tabela 2. Teores médios de N total, P, K, Ca e Mg nas folhas de mudas de café, cv. Catuaí vermelho, inoculadas ou não com Azospirilllum brasiliense, cultivadas em viveiro telado. Seropédica, RJ, Tratamentos Inoculadas Parte da N P K Ca Mg Planta g kg 1 Inoculadas 29,0 A 1,51 A 14,7 A 15,2 A 4,58 A Folhas 13,0 B 1,14 B 15,1 A 13,7 B 4,13 B C.V. (%) 32,9 20,0 13,8 8,70 6,0 Inoculadas Caule + 13,3 A 1,23 A 11,8 A 5,6 A 1,89 A ramos 12,7 A 1,00 B 10,2 A 4,9 A 1,78 A C.V. (%) 16,4 20,1 16,4 14,4 16,8 Inoculadas 20,5 A 2,53 A 15,4 A 11,7 A 6,72 A Raízes 20,2 A 1,69 B 12,7 A 9,0 A 4,90 B C.V. (%) 9,9 21,9 23,5 28,0 25,0 1/ Médias seguidas de letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05). No processo de isolamento da bactéria, a formação do véu característico do gênero Azospirillum, foi observada somente nas amostras das mudas inoculadas, assim como a formação de colônias brancas e secas características da espécie A. brasiliense, o que caracteriza que essa espécie foi mais competitiva em relação a outras bactérias do solo. Portanto, pode-se concluir que a superioridade das mudas inoculadas em relação às não inoculadas, especialmente em relação ao N acumulado nas folhas, foi devido à sua presença. Comparando-se a altura média das cultivares, sem considerar o fator inoculação, a cultivar Catuaí vermelho foi significativamente mais alta que a Tupi. Porém esta diferença deve-se à características genéticas das cultivares, tendo em vista que a Tupi apresenta porte baixo, enquanto a Catuaí vermelho apresenta porte médio a alto (Tabela 3 e Fotos 2 e 3). Contudo, quando inoculadas, nenhuma cultivar respondeu positivamente a este tratamento quanto à altura. Tais resultados são contrários aos obtidos para a cultivar Catuaí no primeiro ensaio, quando essa cultivar respondeu à inoculação (Tabela 1). Tabela 3. Altura, peso de matéria seca de folhas, caule + ramos e de raízes e área foliar de mudas de café, inoculadas ou não com Azospirilllum brasiliense, cultivadas em casa de vegetação. Seropédica, RJ, Tratamentos Altura Peso de matéria seca (g) (cm) Folhas Caule + ramos Raízes Cultivar Catuaí vermelho Inoculadas 20,9 a 1,98 b 0,644 a 1,11 a 21,0 a 2,35 a 0,647 a 1,18 a Média 21,0 A 2,18 A 0,646 B 1,14 B Cultivar Tupi Inoculadas 15,8 a 2,27 a 0,994 a 1,41 a 16,0 a 2,37 a 1,025 a 1,67 a Média 15,9 B 2,32 A 1,010 A 1,54 A C.V. (%) 6,5 11,3 7,4 18,7 1/ Médias seguidas de letras minúsculas (comparam o fator inoculação) e maíusculas (cultivares) iguais na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05). Inoculadas Foto 2. Aspecto das mudas de café arábica, cv. Tupi, inoculadas e não inoculadas com Azospirilllum brasiliense estirpe Cd, cultivadas em casa de vegetação. Seropédica, RJ, 2004.

5 Promoção de Crescimento de Mudas de Café (Coffea arabica) Inoculadas com Azospirillum brasilense Estirpe Cd 5 qual foi significativamente menor quando as mudas foram inoculadas. Tabela 4. Teores médios de N total, P, K, Ca e Mg nas folhas de mudas da cultivar Catuaí vermelho, em função da inoculação ou não com A.brasiliense, cultivadas em casa de vegetação. Seropédica, RJ, Inoculadas Foto 3. Aspecto das mudas de café arábica, cv. Catuaí vermelho, inoculadas e não inoculadas com Azospirilllum brasiliense estirpe Cd, cultivadas em casa de vegetação. Seropédica, RJ, Em relação ao peso de matéria seca, a cultivar Catuaí respondeu negativamente à inoculação para peso de folhas secas (Tabela 3), não havendo resposta para as demais partes da planta. Não houve resposta da cultivar Tupi à inoculação para nenhuma das variáveis avaliadas. Duas hipóteses podem explicar os resultados obtidos. A primeira é que as cultivares respondem diferentemente à inoculação com bactérias promotoras de crescimento. A segunda hipótese leva em consideração os resultados positivos obtidos no primeiro ensaio para a cultivar Catuaí em relação a todas as variáveis avaliadas (Tabelas 1 e 2). Considera-se que a falta de resposta das cultivares observada no segundo ensaio, especialmente a Catuaí, pode estar associada às altas temperaturas ocorridas no interior da casa de vegetação (> 40ºC), onde as mudas foram cultivadas, que podem ter prejudicado o desenvolvimento da bactéria, anulando o seu efeito sobre as mudas. Os teores de N total, P, K, Ca e Mg encontrados nas folhas, ramos + caule e raízes, demonstram a falta de resposta da cultivar Catuaí à inoculação (Tabela 4), reforçando a hipótese do não desenvolvimento da bactéria devido às elevadas temperaturas na casa de vegetação. Com relação à cultivar Tupi, os resultados foram semelhantes (Tabela 5), exceto para o teor de N nas folhas, o Parte da Planta Folhas Caule + ramos Tratamento N P K Ca Mg g kg 1 Inoculadas 1,69 A 2,64 A 13,1 A 17,3 A 5,52 A 1,66 A 2,56 A 12,1 A 18,0 A 5,74 A C.V. (%) 18,5 18,8 7,7 13,5 13,4 Inoculadas 0,80 A 1,86 A 4,39 A 3,35 A 2,34 A 0,82 A 1,87 A 5,13 A 3,71 A 1,75 A C.V. (%) 9,7 30,8 84,8 26,4 33,7 Inoculadas 1,26 A 2,07 A 14,0 A 7,89 A 12,2 A Raízes 1,26 A 1,97 A 14,8 A 8,18 A 11,9 A C.V. (%) 6,9 27,0 6,2 5,7 2,9 1/ Médias seguidas de letras maiúsculas iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05). Tabela 5. Teores médios de N total, P, K, Ca e Mg nas folhas de mudas da cultivar Tupi, em função da inoculação ou não com Azospirilllum brasiliens, cultivadas em casa de vegetação. Seropédica, RJ, Parte da Planta Folhas Caule + ramos Tratamento N P K Ca Mg g kg 1 Inoculadas 1,77 B 2,16 A 13,1A 15,6 A 5,02 A 2,07 A 2,12 A 12,2 A 14,9 A 4,86 A C.V. (%) 18,5 18,8 7,7 13,5 13,4 Inoculadas 0,87 A 2,17 A 4,15 A 5,25 A 2,45 A 0,92 A 1,94 A 6,19 A 4,96 A 2,79 A C.V. (%) 9,7 30,8 84,8 26,4 33,7 Inoculadas 1,38 A 2,08 A 15,7 A 8,74 A 13,3 A Raízes 1,42 A 2,20 A 15,4 A 8,18 A 13,0 A C.V. (%) 6,9 27,0 6,2 5,7 2,9 1/ Médias seguidas de letras maiúsculas iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey (P<0,05). Pelos resultados obtidos nos dois ensaios, especialmente em relação à cultivar Catuaí, tornase necessário a realização de um novo ensaio em local com temperatura adequada, como o viveiro telado, utilizando as mesmas cultivares utilizadas no segundo ensaio.

6 6 Promoção de Crescimento de Mudas de Café (Coffea arabica) Inoculadas com Azospirillum brasilense Estirpe Cd Conclusões 1. No primeiro ensaio a inoculação de Azospirillum brasilense estirpe Cd T promoveu o crescimento e maior acúmulo de nutrientes em mudas de café arábica, cv. Catuaí. 2. No segundo ensaio não houve resposta das cultivares à inoculação, possivelmente devido às altas temperaturas ocorridas no interior da casa de vegetação. Referências Bibliográficas BATAGLIA, O. C.; FURLANI, A. M. C; TEIXEIRA, J. P. F.; FURLANI, P. R.; GALLO, J. R. Métodos de análise química de plantas. Campinas: Instituto Agronômico, p. (Instituto Agronômico. Boletim Técnico, 78). BREMNER, J. M.; MULVANEY, C. S. Nitrogentotal. In: PAGE, A. L.; MILLER, R. A.; KEENEY, D. R. (Ed). Methods of soil analysis. 2. ed. Madison: American Society of Agronomy, Part. 2. p (Agronomy, 9). DÖBEREINER, J.; BALDANI, V. L. D.; BALDANI, J. I. Como isolar e identificar bactérias diazotróficas de plantas não-leguminosas. Brasília: EMBRAOA-SPI: Itaguaí, RJ: EMBRAPA- CNPAB, p. EMBRAPA. Centro Nacional de Pesquisa de Solos (Rio de Janeiro, RJ). Manual de métodos de análise de solo. 2.ed. rev. e atual. Rio de Janeiro, p. (EMBRAPA-CNPS. Documentos; 1). GOMIDE, M. B.; LEMOS, O. V.; CARVALHO, M. M. de; CARVALHO, J. G. de.; DUARTE, C. de S. Comparação entre métodos de determinação de área foliar em cafeeiros Mundo Novo e Catuaí. Ciência e Prática, Lavras, v. 1, n. 1, p , GUIMARÂES, P. T. G.; CARVALHO, M. M. de; MENDES, A. N. G.; BARTHOLO, G. F. Produção de mudas de café: coeficientes técnicos da fase de viveiro. Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v. 14, n. 162, p. 5-10, OKON, Y.; LABANDERA-GONZALEZ, A. C. Agronomic applications of Azospirillum: An evaluation of 20 years worldwide field inoculation. Soil Biology & Biochemistry, Oxford, v. 26, p , RADWAN, T.; EL-S. EL-D.; MOHAMED, Z. K.; REIS, V. M. Production of indole-3-acetic acid by different strains of Azospirillum and Herbaspirillum spp. Symbiosis, Rehovot, v. 32, p , SILVA, E. M. da; CARVALHO, G. R.; ROMANIELLO, M. M. Mudas de cafeeiro: tecnologias da produção. Belo Horizonte: EPAMIG, p. (EPAMIG. Boletim Técnico, 60). Circular Técnica, 11 Exemplares desta publicação podem ser adquiridas na: Embrapa Agrobiologia BR465 km 7 Caixa Postal Seropédica/RJ, Brasil Telefone: (0xx21) Fax: (0xx21) Home page: sac@cnpab.embrapa.br 1ª impressão (2005): 50 exemplares Comitê de publicações Expediente Eduardo F. C. Campello (Presidente) José Guilherme Marinho Guerra Maria Cristina Prata Neves Verônica Massena Reis Robert Michael Boddey Maria Elizabeth Fernandes Correia Dorimar dos Santos Felix (Bibliotecária) Revisor e/ou ad hoc: Segundo Urquiaga e Eliane Maria Ribeiro da Silva Normalização Bibliográfica: Dorimar dos Santos Félix. Editoração eletrônica: Marta Maria Gonçalves Bahia.