CARACTERÍSTICAS IN VITRO DO ESPERMATOZÓIDE CANINO CRIOPRESERVADO EM ÁGUA DE COCO

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ Faculdade de Veterinária Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias Rita de Cássia Soares Cardoso CARACTERÍSTICAS IN VITRO DO ESPERMATOZÓIDE CANINO CRIOPRESERVADO EM ÁGUA DE COCO Fortaleza - Ceará Dezembro, 2005

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3 2 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ Faculdade de Veterinária Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias Rita de Cássia Soares Cardoso CARACTERÍSTICAS IN VITRO DO ESPERMATOZÓIDE CANINO CRIOPRESERVADO EM ÁGUA DE COCO Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias - Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor em Ciências Veterinárias. Área: Reprodução e Sanidade Animal Orientadora: Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva Fortaleza Ceará Dezembro, 2005

4 3 Universidade Estadual do Ceará Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias Título do trabalho: Características in vitro do espermatozóide canino criopreservado em água de coco Autor(a): Rita de Cássia Soares Cardoso Defesa em: 15/12/2005 Conceito obtido: Satisfatório Nota obtida: 10,0 Banca Examinadora Profa. Dra. Lúcia Daniel Machado da Silva Orientadora Prof. Dra. Maria Denise Lopes Co-orientadora Profa. Dr. Fabiana Ferreira de Souza Examinadora Prof. Dr. José Fereira Nunes Examinador Prof. Dr. Marcos Antônio Lemos de Oliveira Examinador

5 4 DEDICATÓRIA Dedico a Deus por tudo o que representa em minha vida. Por ser a verdadeira força e abrigo nos momentos de aflição.

6 5 AGRADECIMENTOS A DEUS por permitir que eu chegasse até aqui, sendo a minha maior fonte de força nos momentos difíceis. Por ser aquele a me fazer acreditar que tudo o que acontece na vida tem uma explicação mesmo que eu não a compreenda. A meus pais por me proporcionarem uma boa educação. Em especial à minha mãe por sempre pensar em mim em primeiro lugar e na minha felicidade acima de tudo. Agradeço também por ensinar os valores de uma vida honesta e de ajuda ao próximo. À minha orientadora, Profa. Lúcia Daniel Machado da Silva, em primeiro lugar por ser uma amiga e repassar os seus valores de honestidade, humildade e, ainda a simplicidade da vida. Agradeço ainda pelos ensinamentos profissionais, preparandome inicialmente para ser uma Médica Veterinária e, posteriormente, para orientar futuros profissionais. E ainda por estar sempre disposta a ajudar e sempre compreendendo todos os problemas sejam pessoais ou profissionais. À Profa. Dra. Maria Denise Lopes que proporcionou a realização de parte do experimento na UNESP-Botucatu, estando sempre disposta a superar qualquer obstáculo. E ainda, por ser extremamente acolhedora, preocupando-se com nosso bem estar e fazendo-nos sentir protegidos mesmo estando longe de casa. À Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza pela valiosíssima colaboração no experimento, estando sempre disponível não somente para a realização do trabalho, mas também pelo acolhimento em sua cidade.

7 6 À Universidade Estadual do Ceará, em especial ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias nas pessoas dos professores, funcionários e alunos. Aos Laboratórios de Fisiologia e Controle da Reprodução, Tecnologia do Sêmen Caprino e Ovino e MOIFOPA pela concessão no uso de equipamentos para a realização deste experimento. À ACP Biotecnologia na pessoa da Dra. Cristiane Clemente de Mello Salgueiro e do Dr. João Monteiro Gondim pelo fornecimento do diluente ACP 106, objeto de estudo deste trabalho. Ao Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP-Botucatu, onde agradeço à Direção e professores pelo uso das instalações, e ainda, aos funcionários pela hospitalidade. Aos funcionários do Laboratório de Microscopia Eletrônica (Instituto de Biologia da UNESP-Botucatu) pelo preparo do material e fotodocumentação da análise ultra-estrutural espermática. A todos do REPAS (Laboratório de Reprodução de Pequenos Animais e Silvestres), em especial à doutoranda Viviane Helena Chirinéa, pela valiosa ajuda e amizade. Agradeço ainda à Profa. Dra. Maria Isabel Melo Martins pela acolhida em sua residência. À M.Sc. Lilian Rigato Martins pelo auxílio na fotodocumentação dos resultados do teste de interação espermatozóide-oócito. diluentes. À INTERVET pelo fornecimento de água ultra-pura para o preparo dos À Associação Pró-Carnívoros pela concessão no uso do Dry shipper.

8 7 A CAPES, pela concessão da bolsa e ao CNPq pelo apoio finaceiro. Ao Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo por me levar para o mundo da pesquisa, mundo este que eu não quero deixar. Aos colegas do PPGCV pelo ótimo convívio durante disciplinas e pelos bons momentos como Marcos Renato Franzosi Mattos, Lucilene Simões Mattos, Regiane Rodrigues e Ana Carolina Melo. Aos animais experimentais, que mesmo sem saber, contribuíram de forma valiosa, e ainda, aos proprietários dos mesmos. Aos meus cães, Kaue e Tchutchuca, que do modo deles, sabem demonstrar a sua fidelidade, parecendo entender quando precisamos de um carinho. Aos companheiros do Laboratório de Reprodução de Carnívoros (LRC): Janaína de Fátima Saraiva Cardoso, Ana Kelen Felipe Lima, Raimundo Diones Carneiro, Iran Áquila Maciel, Camila Louise Ackerman, Cristina Vidal, Belarmino Eugênio Lopes Neto, Daniel Falcão Menezes Brilhante, Áurea Helena Rocha Lima, Henna Roberta Quintino e Thiago da Silva pelos diversos momentos de alegria e ajuda. Ao amigo Carlos Gabriel de Almeida Dias, que apesar do pequeno convívio, percebe-se que é uma pessoa muito especial, que te faz sempre se sentir bem e cuja amizade vale a pena ser cultivada. Àqueles que fizeram parte do LRC e contribuíram para a realização deste trabalho como o acadêmico Leonardo Tavernezzi. Àqueles companheiros de LRC que são também amigos como a doutoranda Ticiana Franco Pereira da Silva que além de ser uma verdadeira amiga, estando sempre disposta a ajudar, é uma pessoa com quem se tem prazer de conviver e trabalhar.

9 8 Ao amigo Daniel Couto Uchoa, que além de contribuir na realização do experimento, é uma pessoa com quem sempre se pode contar. Ao amigo Alexandre por também contribuir para que eu concluisse mais esta etapa em minha vida, dividindo não só os bons momentos, mas também os difíceis. Por estar presente em todas as etapas do experimento e com quem o trabalho se tornava mais fácil. À minha amiga Christiane Barreto por todos os momentos de alegria, recebendo-me em sua casa e fazendo eu me sentir menos sozinha. Por ser uma verdadeira amiga, pelas conversas, conselhos, risadas, mostrando que a vida deve ser vivida intensamente. Ao meu noivo Edilson Soares Lopes Júnior pelo companheirismo, orientação e ajuda para enfrentar qualquer problema em minha vida. Agradeço ainda pelo carinho, paciência, dedicação, por me fazer rir quando estou triste e por me mostrar que não há problema sem solução e, quando não há solução, enfrentá-los e ver o lado bom. E ainda por seu caráter, mostrando que estamos aqui para ajudar aos outros, sendo sempre humilde, honesto e verdadeiro com os sentimentos.

10 9 RESUMO A avaliação do sêmen geralmente inclui a análise da motilidade, vigor e morfologia espermática. Porém para conhecer a extensão dos danos causados à célula espermática e aperfeiçoar os métodos de criopreservação, é de grande importância a análise de outros parâmetros. Desta forma, o objetivo geral desta tese foi avaliar in vitro a eficácia de um diluente à base de água de coco em pó (ACP-106 ) na manutenção da qualidade do sêmen canino pós-descongelação. Por isso, o estudo foi dividido em quatro etapas. Na primeira etapa, foi realizada uma comparação entre o método de diluição fixa do sêmen com o de concentração fixa utilizando os diluentes à base de água de coco in natura (ACIN) e ACP-106. Na segunda etapa, foi observado o efeito do armazenamento a -10 C sobre a eficiência do ACP-106 e o efeito da diluição pós-descongelação. Na terceira e quarta etapas, o sêmen congelado foi avaliado pelo teste de interação espermatozóide-oócito, análise computadorizada da motilidade, integridade de membrana e avaliação morfológica pela microscopia eletrônica de transmissão. O ACP-106 mostrou-se eficiente em comparação com o ACIN, podendo ser utilizada a diluição 1:1 ou a uma concentração espermática de 200 x 10 6 espermatozóides/ml. Não houve influência do armazenamento a -10 C sobre a eficiência do ACP-106 e a diluição pós-descongelação sobre a longevidade espermática pós-descongelação. O procedimento de congelação-descongelação utilizando ACP-106 foi eficiente na manutenção do potencial fertilizante do espermatozóide canino in vitro, mantendo não somente a sua capacidade de de se ligar, mas também de penetrar na zona pelúcida.

11 10 SUMÁRIO Pág. LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS...11 LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA JUSTIFICATIVA HIPÓTESES CIENTÍFICAS OBJETIVOS CAPÍTULO CAPÍTULO CAPÍTULO CAPÍTULO DISCUSSÃO GERAL CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS

12 11 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS Abreviatura Significado % Porcentagem A ACIN ACP ACP-106 ALH BCF Acrossoma Água de coco in natura Água de coco em pó Diluente para sêmen de carnívoros à base de água de coco em pó Amplitude lateral head Beat cross frequency BSA Bovine serum albumine (Albumina sérica bovina ) º C Graus Celsius C1 Concentração inicial C2 CAPES CASA CBRA C-FDA CLONE cm CNPq Cool CTC DMSO DVM Concentração final Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Computer Aidded Semen Analysis Colégio Brasileiro de Reprodução Animal Diacetato de carboxi-fluoresceína Cryogenics Laboratory of New England Centímetros Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Cooled semen Clortetraciclina Dimetil-sulfóxido Doctor em Veterinary Medicine

13 12 E Ext FAVET FIG FMVZ Fr G GLM Glyc HOST HTR IA IAA Km L Lin LRC LVV MVV min ml M.Sc. mosm MP NCW N OM P PBS ph PI Equatorial region Extended semen Faculdade de Veterinária Figura Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Fresh semen Gravidade General Linear Model Glycerolizated semen Hypoosmotic swelling test (teste hipo-osmótico) Hamilton Thorne Researcher Inseminação artificial Ácido 3-indol acético Kilometer Litro Linearity Laboratório de Reprodução de Carnívoros Low VAP cutoff Medium VAP cutoff Minutos Mililitros Master of Science Miliosmol Midpiece In natura coconut water Nucleus Outer acrosome membrane Probabilidade Phosphate buffer saline Potencial hidrogeniônico Iodeto de propídio

14 13 PCW Powder coconut water PM Plasma membrane PNA Peanut Agglutinin PPGCV Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias PSA Pisum Sativum Agglutinin r Coeficiente de relação RA Reação acrossômica REPAS Laboratório de Reprodução de Pequenos Animais e Silvestres ROS Reactive oxigen species (espécies oxigênio reativas) s Segundos SAS Statistical Analysis System SD Standard deviation SDS Duodecil sulfato de sódio SOD Superoxide dismutase SQA Semen quality analyzer STR Straightness SEM Scanning Electronic Microscopy SOIA Sperm-oocyte interaction assay TAB Tabela TEM Transmission Electronic Microscopy Thaw Frozen/thawed semen THOS Teste hiposmótico TTR Teste de termorresistência UECE Universidade Estadual do Ceará UNESP Universidade Estadual Paulista USA United States of America V/V Volume / Volume VV Volume:Volume

15 14 V1 Volume inicial V2 Volume final VAP Velocity average pathway VCL Velocity curvilinear VSL Velocity straight line µm Micrômetros ZP Zona pelúcida

16 15 LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO 1 Pág. ARTIGO: Efeito da diluição espermática na congelação de sêmen canino utilizando-se a água de coco em pó como diluidor (ACP-106 ) FIGURA 1 Percentual de alterações morfológicas do sêmen canino congelado em ACP-106 a uma concentração de 200 x 10 6 espermatozóides/ml (ACP CONCENTRAÇÃO) e a uma diluição constante de 1:1 (ACP DILUIÇÃO). Letras diferentes implicam em diferença significativa (P< 0,05) entre os métodos de diluição. 78 FIGURA 2 Percentual de alterações morfológicas primárias e secundárias do do sêmen canino congelado em ACP-106 a uma concentração de 200 x 10 6 espermatozóides/ml (ACP CONCENTRAÇÃO) e a uma diluição constante de 1:1 (ACP DILUIÇÃO). Letras diferentes implicam em diferença significativa (P< 0,05) entre os métodos de diluição. 78 ARTIGO: Use of the powder coconut water (ACP-106 ) as an alternative extender for canine semen freezing FIGURA 1 Sperm motility of fresh (Fr), extended (Ext), cooled (Cool), glycerol-supplemented (Glyc) and frozen/thawed (Thaw) semen extended with fresh/in natura (NCW) or powder coconut water (ACP P > 0.05; Student s t test). 90

17 16 FIGURA 2 Sperm vigor of fresh (Fr), extended (Ext), cooled (Cool), glycerolsupplemented (Glyc) and frozen/thawed (thaw) semen extended with fresh/in natura (NCW) or powder coconut water (ACP P > 0.05; Mann-Whitney test). 90 CAPÍTULO 3 FIGURA 1 Percentage of oocytes bound, penetrated and interacted (bound and/or penetrated) by canine spermatozoa after freezing/thawing using ACP-106 (10 replicates). 127 FIGURA 2 Number of canine spermatozoa per oocyte bound, penetrated and interacted (bound and/or penetrated) to the zona pellucida after freezing/thawing using ACP-106 (10 replicates). 128 CAPÍTULO 4 FIGURA 1 Transmission electron micrographs of fresh dog spermatozoa. N: nucleus; A: acrosoma. (a) Fresh spermatozoa presenting an intact acrosome and a plasmalemma in close apposition with the acrosome (arrow). Magnification 1950X. (b) Spermatozoon presenting a swollen plasmalemma but with an intact acrosoma. Magnification 8400X. 142 FIGURA 2 Transmission electron micrograph of dog spermatozoa after cryopreservation with ACP-106. A: acrosoma; N: nucleus; E: equatorial region. (a) Spermatozoon with a swollen intact plasma membrane with plicae (arrows). The acrosoma is swollen with an undulated contour (white arrow head) and vesiculation (black arrow head). The equatorial region is swollen. Magnification 8400X. (b) Vesiculated plasma membrane (arrows) and releasing 143

18 17 of acrosomal contents (arrow heads). Magnification 11500X. (c) Swollen plasma membrane (black arrow) with areas of vesiculation (white arrow). Outer acrosoma membrane presents areas of vesiculation (arrow heads). Equatorial region is intact. Magnification 8400X. FIGURA 3 Transmission electron micrograph of dog spermatozoa after cryopreservation with ACP-106. A: acrosoma; N: nucleus; E: equatorial region; PM: plasma membrane; OM: outer acrosome membrane, MP: midpiece. (a) Swollen and intact plasma membrane (arrow). The acrosome is disrupted and the contents are released (arrow heads). Mid-piece presents a plasmalemma swelling and damages in mitochondrial sheath like content disorganization. Magnification 6300X. (b) Plasma membrane, outer (arrow) and inner (arrow heads) acrosome membrane are swollen and with plicae. Equatorial region is intact. Magnification 8400X. 144

19 18 LISTA DE TABELAS TABELA 1 Classificação morfológica do espermatozóide canino 34 Pág. CAPÍTULO 1 ARTIGO: Comparison of two dilution rates on canine semen quality after cryopreservation in a coconut water extender TABELA 1 Characteristics of fresh semen collected from six stud dogs (n=12 ejaculates) TABELA 2 Sperm motility and vigor during steps of freezing and after thawing using coconut water extender with two different dilution rates TABELA 3 Post-thaw morphology using coconut water extender with two different dilution rates ARTIGO Efeito da diluição espermática na congelação de sêmen canino utilizando-se a água de coco em pó (ACP-106 ) como diluidor TABELA 1 Média e desvio padrão das características físicas e morfológicas da fração espermática dos ejaculados caninos (n=12) TABELA 2 Média e desvio padrão da motilidade e vigor do sêmen canino congelado com um diluidor à base de água de coco em pó (ACP-106 ) em dois métodos diferentes de diluição. ARTIGO Use of the powder coconut water (ACP-106 ) as an alternative extender for canine semen freezing

20 19 TABELA 1 CAPÍTULO 2 ARTIGO TABELA 1 TABELA 2 TABELA 3 CAPÍTULO 3 TABELA 1 TABELA 2 Sperm morphology observed in canine fresh and frozen-thawed semen submitted to extension with fresh/in natura coconut water (NCW) or powder coconut water (ACP-106 ) Effect of storage at 10 C of the ACP-106 extender and post-thaw dilution on the quality of frozen canine semen Sperm motility (%) of non-stored and frozen-thawed canine semen using non-stored or stored ACP-106 during incubation at 37 C for 120 minutes Sperm morphology (%) of fresh and frozen-thawed canine semen using non-stored or stored ACP-106 during incubation at 37 C for 60 minutes Acrosomal status (%) of frozen-thawed canine semen using non-stored or frozen-rewarmed ACP-106, under dilution of one part semen to four parts extender (1:4) Mean ± SD for the sperm quality parameters determined after 126 freezing/thawing using ACP-106 Relationships between (Simple regression model) data for sperm-oocyte interaction assay and results from different sperm parameters (independent variables) 129

21 20 1. INTRODUÇÃO O aumento do interesse por parte dos criadores em incrementar a eficiência reprodutiva de seus animais tem levado a um maior desenvolvimento na criação de cães. Neste sentido, a preservação de gametas masculinos é uma valiosa ferramenta, uma vez que a biotécnica de criopreservação oferece a possibilidade de transportar o sêmen para vários países, bem como de armazená-lo por um tempo prolongado (Ström, 1999). O conceito de preservação de sêmen implica na manutenção de sua capacidade funcional, isto é, na habilidade para produzir ninhadas, o que, necessariamente, envolve a manutenção da integridade celular espermática, a habilidade em penetrar o oócito e a competência para suportar o desenvolvimento embrionário (Harrison et al., 1996). Para obter tal sucesso, é essencial um protocolo de criopreservação que seja eficiente, devendo-se considerar aspectos relacionados à taxa de resfriamento, método de congelação (vapor de nitrogênio ou congeladores programáveis), método de estocagem (palhetas ou pellets), taxa de descongelação bem como diluentes e agentes crioprotetores. Pela avaliação do sêmen criopreservado tenta-se aperfeiçoar os métodos a fim de torná-los mais práticos, bem como obter melhores resultados. Foi objetivando não somente tornar a metodologia mais prática como também criar um produto para ser comercializado, que foi criada a água de coco em pó, denominada de ACP. O diluente padrão à base de água de coco in natura já se mostrou eficiente para a diluição do sêmen de diversas espécies como caprinos (Nunes e Salgueiro, 1999), suínos (Toniolli e Mesquita, 1990) e caninos (Cardoso et al., 2003b). No entanto, esta solução não poderia ser armazenada por um longo período. Para a comercialização de tal diluente, é preciso a comprovação de sua eficiência para a conservação do sêmen. Infelizmente, não há um único teste in vitro que seja capaz de mensurar todas essas funções numa amostra de sêmen. Contudo, uma quantificação fidedigna do total de espermatozóides que possuem estas características, separadamente, pode ser um importante indicador da capacidade funcional espermática (Amann & Hammerstedt, 1993).

22 21 A avaliação padrão do sêmen é, primariamente, baseada em parâmetros físicos. Contudo, há evidências de que tais parâmetros sozinhos não são suficientes para determinar um padrão de fertilidade de um ejaculado (Jeyendran et al., 1984). Este tipo de avaliação também não é suficiente para uma análise do espermatozóide congelado-descongelado, visto que, os mesmos apresentam uma série de danos que não podem ser detectados nesta análise convencional. O processo de fertilização envolve uma complexidade de eventos físicos e bioquímicos que não são mensurados pelos indicadores físicos usados, rotineiramente, nas avaliações do sêmen (Jeyendran et al., 1984). Neste sentido, uma avaliação mais completa in vitro e associada com o teste in vivo é de grande importância para se evidenciar o efeito da criopreservação sobre a qualidade espermática.

23 22 2. REVISÃO DE LITERATURA Histórico da tecnologia da reprodução assistida na espécie canina A tecnologia da reprodução assistida em cães teve início no século XVIII. Spallanzani, em 1776 (Watson, 1979), foi o primeiro a registrar que uma diminuição na temperatura proporcionava uma redução, de forma reversível, na atividade metabólica do espermatozóide, permitindo assim o seu armazenamento. A primeira inseminação artificial (IA), cientificamente registrada, foi realizada na espécie canina e descrita por Spallanzani em 1780 (Seager, 1969). Foi a partir da descoberta da ação crioprotetora do glicerol por Polge et al. (1949) que houve um impacto significativo na metodologia de criopreservação de sêmen. Entretanto, as pesquisas direcionadas para a espécie canina eram raras até bem pouco tempo, situação esta que vem sendo revertida devido a um interesse cada vez maior sobre os animais de companhia, com as pesquisas voltadas para os mesmos aumentando significativamente nos últimos anos (Farstad, 1984; Linde-Forsberg & Forsberg, 1989). O primeiro êxito na congelação de sêmen canino foi citado por Rowson (1954), enquanto Seager (1969) relatou a primeira prenhez resultante de IA com a utilização de sêmen canino congelado. Desde essa época, diversos foram os estudos que se investigaram métodos de preservação de espermatozóides caninos pela congelação, sendo, um dos mais comuns, o descrito por Andersen em No entanto, os resultados obtidos após IA com sêmen canino congelado ainda são bastante heterogêneos (Linde-Forsberg & Forsberg, 1989; England, 1993).

24 23 No Brasil, a primeira notificação de sucesso em inseminação artificial (IA) com sêmen canino congelado foi realizada há pouco mais de 20 anos (Vaske et al., 1981). Uma segunda gestação oriunda de IA com sêmen canino congelado foi confirmada por ultra-sonografia em 2000 em um trabalho realizado pelo LRC UECE (Silva et al., 2001a), mas os resultados obtidos não foram satisfatórios, uma vez que a cadela abortou, sendo constatada infecção por Erlichia canis e Leishmania chagasi. O diluente e seus componentes Para o sucesso da criopreservação, o diluente é de fundamental importância a fim de minimizar os danos espermáticos que impliquem na redução da qualidade do sêmen. Um bom diluente deve proteger os espermatozóides de todos os efeitos críticos do processo de refrigeração, congelação e descongelação. Este deve conter nutrientes para o metabolismo espermático, servir como tampão, ajustando as alterações de ph, promover pressão osmótica compatível com o plasma seminal e conter eletrólitos dentro dos padrões fisiológicos, além de prevenir o crescimento de bactérias (Concannon & Battista, 1989). Existem diferenças na composição lipídica da membrana plasmática do espermatozóide entre as espécies, raças e ainda entre indivíduos da mesma espécie, o que pode explicar o maior ou menor efeito protetor de um diluente aos espermatozóides de um determinado indivíduo (Holt, 2000a). A composição do diluente é de vital importância para criopreservação do sêmen e deve ser específica para cada espécie. Foote (1964) foi um dos primeiros pesquisadores a investigar, sistematicamente, a combinação e a quantidade de vários componentes dos diluentes para a preservação do sêmen de cão. Diversas substâncias podem ser adicionadas ao meio diluente a fim de garantir uma maior eficiência. As mesmas serão descritas a seguir.

25 24 Tampões A atividade metabólica do espermatozóide resulta num acúmulo de íons de hidrogênio, assim a utilização de um tampão no diluidor é necessária para neutralizar o ph ácido do meio, evitando a diminuição da motilidade espermática progressiva. Além disso, o contínuo metabolismo espermático, produzindo como resultado grandes quantidades de catabólitos tóxicos, acarreta num aumento do ácido lático no meio extracelular (Pérez & Pérez, 1994 apud Cunha, 2002; Farstad, 1996; Holt, 2000b). O ph ótimo para o espermatozóide canino varia de 6,5 a 7,0 e a maioria dos diluentes encontra-se na faixa de 6,9 a 7,1 (England, 1993). Substâncias de poder tampão tais como o Tris (Tris-hidroximetil aminometano) e o Tes (N-Tris (hidroximetil) metil 2-amonoetanosulfônico), citrato e fosfato de sódio têm sido utilizadas na composição de diversos meios diluentes para a criopreservação de sêmen canino (Silva e Verstegen, 1995; Santos, 1997; Rota et al., 1998; Cardoso, 2001; Silva, 2001). Agentes crioprotetores Os crioprotetores devem ser adicionados ao meio para que haja uma proteção do espermatozóide durante o equilíbrio, congelação e a descongelação (Squires et. al., 1999), e esses elementos são importantes para evitar a formação de grandes cristais de gelo intracelulares (Medeiros et al., 2002). Esses agentes pertencem a dois grupos: aqueles que penetram nas células como o glicerol, o dimetil sulfóxido (DMSO) e o metanol; e aqueles que permanecem no meio extracelular como as proteínas, os açúcares e a polivinil pirrolidona (England, 1993).

26 25 O glicerol (CH 3 H 8 O 3 ; propanotriol - (1, 2,3); a, ß,?, Trioxipropano), um álcool polihídrico, altamente permeável, é o crioprotetor mais empregado na congelação do sêmen de diferentes espécies (Storey et al., 1996). A sua habilidade em transpor a membrana celular permite a desidratação da célula pela saída de água por osmose (Hammerstedt et al., 1990). A concentração ótima de de qualquer agente crioprotetor depende de diversos fatores como diluente, espécie animal e, ainda, a velocidade de congelação, onde velocidades de congelação mais rápidas requerem baixas concentrações do crioprotetor (England, 1993). Para a congelação do sêmen do cão, as concentrações têm variado de 4 a 11% (v/v), dependendo da composição do diluente e do tampão utilizado. A concentração ótima de glicerol deve permitir uma superioridade dos seus efeitos protetores sobre os seus efeitos tóxicos (Watson, 1979). Terhaer (1993) afirma que o espermatozóide canino é bastante tolerante ao glicerol (apud Rodrigues, 1997). Contudo, altas concentrações podem afetar sua capacidade fertilizante (Neville et al., 1970). Gema de ovo A adição de protetores de resfriamento é necessária para a preservação dos espermatozóides durante o choque térmico, bem como durante a congelação e descongelação (Farstad, 1996). A gema de ovo é o componente de origem biológica mais, largamente, utilizado na composição de diluentes para o sêmen e tem sido utilizada, rotineiramente, como protetor de resfriamento do espermatozóide canino (Oliveira, 2003). A interação entre os fosfolipídeos presentes no sêmen e os componentes lipoprotéicos da gema possibilita a aderência das lipoproteínas à membrana plasmática do espermatozóide, conferindo-lhe proteção durante a criopreservação. Além disso, a

27 26 gema de ovo previne a rotação da cauda do espermatozóide, favorecendo sua motilidade (Holt, 2000b). A sua concentração requerida pode diferir de acordo com a espécie, sendo empregada em concentrações que variam de 3 a 25% (v/v - Watson, 1979). Açúcares Os açúcares são incluídos nos diluentes seminais como substratos energéticos exógenos, como componentes osmóticos e como agentes crioprotetores (Watson, 1979). A maioria dos diluentes utilizados na criopreservação do sêmen canino contém glicose e/ou frutose (Silva et al., 1996; Hay et al., 1997; Rota, 1998; Chirinéa et al. 2003). Investigações iniciais sobre o metabolismo energético do sêmen fresco de cães incubados em glicose ou frutose, indicaram que a frutose é mais eficiente que a glicose na obtenção de níveis energéticos (Rigau et al., 2000 apud Chirinéa, 2004 ) Aditivos Atualmente, componentes aditivos como detergentes, antioxidantes e aminoácidos, têm sido adicionados ao meio diluente (Oliveira, 2003). A adição de diferentes compostos detergentes, como o Equex STM paste ou Orvus ES paste, em diluentes de congelação parece ser benéfica para várias espécies, incluindo a canina (Rota et al., 1997; 1999a; Holt 2000a; Peña & Linde-Forsberg, 2000a). Espécies reativas ao oxigênio (H 2 O 2 ; O 2-, - OH, ROOH) e os antioxidantes têm demonstrado um importante papel na fertilidade e na infertilidade. Algumas

28 27 evidências diretas ou indiretas levam a crer que em vários momentos da criopreservação do sêmen estas espécies são formadas. O controle do nível das espécies reativas de oxigênio pela inclusão de antioxidantes ou pelo uso de condições que reduzam a oxidação durante a congelação tem sido descrito (Bilodeau et al., 2001). Vários aminoácidos, entre eles a glicina, têm sido incluídos na preservação do sêmen (Bilodeau et al., 2001). De acordo com Papa et al. (1993 apud Cunha, 2002) a ação da glicina ainda não está totalmente esclarecida, mas sabe-se, que esse aminoácido participa na síntese de enzimas antioxidantes (Gluthation Peroxidase), inibindo a formação de radicais livres e, conseqüentemente, protegendo a membrana celular da oxidação. Antibióticos A contaminação bacteriana pode afetar negativamente a fertilidade, pela própria presença das bactérias, pela produção de toxinas, por degradação dos componentes do meio, ou ainda, pela utilização de substratos metabólicos. Essa situação determina a necessidade de incorporar aos diluentes substâncias de efeito antimicrobiano (Watson, 1990). A maioria dos pesquisadores da atualidade emprega a benzilpenicilina associada à diidroestreptomicina ou estreptomicina na composição dos diluentes do sêmen canino (Rota et al., 1999a; Peña & Linde-Forsberg, 2000b; Iguer-Ouada & Verstegen, 2001a). Entretanto, outros antibióticos já foram utilizados, com sucesso, como a amicacina (Chirinéa, 2004).

29 28 Diluentes utilizados na criopreservação de sêmen canino A adaptação dos diluentes na preservação de espermatozóides do cão ocorreu de forma empírica, baseando-se naqueles empregados no resfriamento e congelação do sêmen de outras espécies (Farstad, 1996). Pesquisas foram realizadas utilizando leite desnatado (Santos, 1997), glicina-gema (Santos, 1997; Cunha & Lopes, 2001), lactose-gema (Olar et al., 1989) e o tampão TRIS (Ström et al., 1997; Silva et al., 2003, Silva et al., 2006). Além disso, outros diluentes têm sido desenvolvidos por empresas. Estão disponíveis comercialmente: o Triladyl (Minitub, Tyefenbach, Alemanha) o qual foi testado por Nothling et al.. (1995); Laiciphos 478 e Biociphos W482 (IMV, França), testado por Silva & Verstegen (1995); e o CLONE (Cryogenic Laboratories of New England, Inc), utilizado por Ström et al. (1997). No estado do Ceará, já foi testado um diluente à base de água de coco para a congelação de sêmen canino, que foi originariamente desenvolvido para a conservação de sêmen de caprinos (Salles & Nunes, 1992) e se mostrou eficiente para a conservação de sêmen canino (Cardoso et al., 2003b, 2005). A água de coco A água proveniente do fruto do coqueiro Cocos nucifera L. (membro da família Palmae) é uma solução estéril, ligeiramente ácida, contendo proteínas, sais, açúcares, vitaminas, fatores de crescimento (fitormônios) e muito pouco fosfolipídeo (Laguna, 1996). O coco verde apresenta cerca de 400 ml de água que contém propriedades nutritivas, sendo considerada como um repositor de sais e algumas de suas aplicações terapêuticas, é a utilização, na forma de soro oral ou intravenoso, em

30 29 casos de cólera, problemas intestinais e estomacais (Jayalekshmy et al., 1984, Maciel et al., apud Magalhães et al., 2005). A água de coco contém ainda outros compostos que mostram atividades semelhantes àquelas das citocininas e que são derivados das purinas (difeniluréia), possuindo atividades biológicas consideradas excelentes para as células (Nunes & Salgueiro, 1999). O isolamento da citocinina na água de coco foi realizado por Letham (1974 apud Nunes & Combarnous, 1995). Depois de várias pesquisas, verificou-se que a auxina principal era o ácido 3-indol-acético (Letham, 1974 apud Nunes &Combarnous, 1995). Nunes & Combarnous (1995) também isolaram essa substância na água de coco, verificando que a mesma apresentava uma ação benéfica sobre a motilidade do sêmen de caprinos e ovinos incubado a 37?C. A água de coco sofre mudanças na sua composição durante o desenvolvimento do fruto. Além do grau de maturação, outros fatores como variedade, região e época do ano também têm influência sobre as suas características físicoquímicas (Jayalekshmy et al., 1984, Maciel et al., apud Magalhães et al., 2005). Os açúcares, no início da maturação, encontram-se sob a forma de redutores (glicose e frutose), próximo ao 6 e 7 mês, alcançando níveis máximos de 5%. Com a maturação do fruto, a concentração de açúcares redutores diminui em até 1%, porém são formados os não redutores (sacarose), sendo, ao final da maturação, o teor de açúcares totais de, aproximadamente, 2% (Campos et al., 1996, Jayalekshmy et al., apud Magalhães et al., 2005). A água de coco in natura proveniente de frutos com idade de seis meses (variedade verde da praia) apresenta uma osmolaridade em torno de 500 mosmol/l e um ph de 4,5 a 5,0 (Nunes & Combarnous, 1995). Para uma perfeita compatibilização da água de coco in natura como diluente para o sêmen canino, deve ser feita uma correção da osmolaridade para mosmol/l e do ph para 6,2 a 6,6 (Silva, 1999). Para tal correção, após filtrar a água de coco, adiciona-se água destilada e uma solução de citrato de sódio a 5% (Nunes, 1995).

31 30 A solução citada anteriormente já foi utilizada com eficiência na congelação de sêmen canino (Cardoso et al., 2003b). Testando-se alguns outros protocolos, observaram-se melhores resultados (aproximadamente 50% de espermatozóides móveis) utilizando a solução citada anteriormente contendo 20% de gema de ovo e 6% de glicerol. Apesar da água de coco ser um diluente eficiente na conservação do sêmen de diversas espécies, era necessário preparar a solução para cada utilização. Foi observado que acima de dois dias, havia um aumento de osmolaridade e diminuição do ph (dados não publicados) no diluente à base de água de coco, o que prejudicava a sua utilização para a congelação de sêmen canino, não estando dentro dos padrões fisiológicos para a espécie. Devido aos excelentes resultados obtidos com os primeiros estudos com a água de coco in natura na conservação, principalmente, de células espermáticas realizados pelo pesquisador José Ferreira Nunes durante as décadas de 80 e 90, levou à elaboração de um produto genuinamente nordestino, o meio de conservação à base de água de coco em pó (ACP ). Para a produção do ACP, inicialmente, obtém-se o fruto (coco) numa sequência de procedimentos iniciada pela rigorosa seleção e higienização do produto, seguida de colheita do líquido endospérmico do coco (água de coco) sob forma asséptica. Então dese ser realizada a filtração e o líquido é bombeado sem intermitência e de forma contínua para o sistema de secagem. A amostra seca é transformada em pó fino e uniforme, amorfo, destituído de água livre, com alta solubilidade (Nunes et al., 2005). A uniformidade do produto, obtida mediante rigoroso controle de processamento, em condições específicas, leva à manutenção dos valores agregados do endosperma líquido do coco (Nunes et al., 2005). Tal produto foi registrado como ACP (ACP Biotecnologia, Fortaleza - Ceará, Brasil). A água de coco em pó, após reconstituição, foi testada para a refrigeração do sêmen de eqüinos (Sampaio-Neto et al., 2002), e diluição para

32 31 inseminação artificial em caprinos (Salgueiro et al., 2002). No entanto, outras utilizações para o ACP estão em fase experimental como: meio diluente para vacinas virais animais, meio de conservação e criopreservação de órgãos para transplante, meios de cultivo de microrganismos (fungos, bactérias, vírus), protozoários e insetos, bebidas isotônicas, repositores energéticos, alimentos funcionais, produtos nutricionais para pacientes hospitalares, dentre outros (Nunes et al., 2005). Métodos de avaliação da qualidade espermática Métodos in vitro mais utilizados A alta taxa de fertilidade é o objetivo principal quando se trabalha com criopreservação de sêmen. Contudo, testes de fertilidade, além de apresentarem um alto custo, têm a desvantagem de mostrar baixa confiabilidade se poucos animais são usados (Woelders, 1991; Rota et al., 1999a). As análises in vitro têm a vantagem de mostrar quais aspectos da função espermática estão prejudicados ou intactos, sendo isso de especial interesse ao se trabalhar com o aprimoramento de técnicas de preservação de sêmen, bem como para a pesquisa fundamental. Várias técnicas in vitro têm sido descritas para a avaliação de sêmen. A combinação de diferentes métodos de avaliação fornece um resultado mais confiável do que um único teste quando se deseja prever a fertilidade in vivo (Ström, 1999). Entretanto, rotineiramente, usa-se o método de avaliação clássica que inclui basicamente a análise da motilidade, vigor e morfologia espermáticos. A seguir, serão descritos alguns dos diversos métodos que podem ser usados para se avaliar o sucesso da criopreservação de sêmen canino.

33 32 Motilidade espermática Há muito tempo, o parâmetro mais, rotineiramente, utilizado para a avaliação do sêmen é a motilidade espermática. A proporção de espermatozóides exibindo uma motilidade progressiva é, geralmente, estimada subjetivamente em microscópio óptico (Cardoso et al., 2003), de contraste de fase (Peña & Linde- Forsberg, 2000a) ou, mais objetivamente, utilizando-se a análise computadorizada (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001). Este parâmetro é utilizado na avaliação do sêmen congelado-descongelado, para a verificação da proporção de espermatozóides que mantiveram a motilidade após o processo de criopreservação (Ström, 1999). Seager & Fletcher (1972) ressaltam que a avaliação da motilidade espermática é a observação da porcentagem de espermatozóides móveis da amostra, a qual deve ser avaliada imediatamente após a colheita ou descongelação do sêmen. Em seguida, pode-se avaliar o vigor espermático, que é a qualidade da motilidade exibida pelos espermatozóides móveis. Para tanto, faz-se uso de uma escala compreendida numa faixa de 0 a 5, cujas classificações variam de autor para autor (Platz & Seager, 1977; Christiansen, 1988; Johnston et al., 2001) A avaliação da motilidade pode ser prejudicada pela concentração espermática, fato relatado por Cardoso et al. (2005) e Garner et al. (2001), onde estes últimos autores descrevem a dificuldade na avaliação em amostras com baixas concentrações espermáticas. Além disso, a viscosidade nos meios de criopreservação, principalmente, devido à gema de ovo, também prejudica a motilidade (Hirai et al., 1997), o que pode levar a subestimar este parâmetro. Já foi demonstrado que tanto nos ejaculados a fresco (Casey et al., 1993), como nos congelados (Januskauskas et al., 1996), há uma proporção de espermatozóides que são vi áveis mesmo estando imóveis, podendo adquirir motilidade após estimulação com cafeína (Larsson et al., 1976). Portanto, a avaliação da motilidade não pode ser usada como uma mensuração dos espermatozóides vivos e

34 33 mortos, mas fornece a informação de um fator que é necessário para a capacidade fertilizante do espermatozóide, pois é a manifestação da sua competência estrutural e funcional (Peña Martinez, 2004). Embora a motilidade esteja, geralmente, correlacionada com integridade de membrana plasmática (Kumi-Diaka, 1993) e com a morfologia (Ellington et al., 1993), relatos de correlações entre motilidade espermática e fertilidade ainda são conflitantes (Kjaestad et al., 1993; Sanchez-Partida et al., 1999). Morfologia espermática A morfologia espermática é um parâmetro indispensável na avaliação seminal, pois está intrínsecamente implicada a problemas na fertilidade tanto na espécie canina como em outras espécies animais (Oettlé, 1993). No entanto, até o momento, ainda não foi descrita a evidência de uma relação entre a morfologia espermática e a fertilidade no cão. Os poucos trabalhos que evidenciam uma possível relação ainda são conflitantes (Oettlé & Soley, 1985; Renton et al., 1986; Oettlé, 1993). Oettlé (1993) relata que à medida que se aumenta o percentual de espermatozóides anormais, a fertilidade é reduzida, sendo que quando a proporção de espermatozóides morfologicamente normais está abaixo de 60%, a fertilidade é adversamente afetada. Vários métodos têm sido desenvolvidos para avaliar a morfologia da célula espermática. Esfregaços úmidos de sêmen podem ser examinados por microscopia de contraste de fase após fixação com glutaraldeído ou tampão salina formolizada para proteger a célula e realizar observação futura (CBRA, 1998). A morfologia também pode ser avaliada, microscopicamente, após coloração com os corantes Wright, Rosa de Bengala, Diff-Quik e Spermac (Purswell et al., 1992; Oettlé & Soley, 1985), Giemsa (Cardoso et al., 2003b), Hematoxilina-eosina (Silva et al., 2003) e eosinanigrosina (Peña, 2000). Após a coloração, as células espermáticas devem ser examinadas, preferencialmente, a uma magnificação de 1000X, sob óleo de imersão e,

35 34 geralmente, um mínimo de 100 células é avaliado. Existem alguns métodos de classificação das alterações morfológicas, nos quais um deles consiste na divisão em alterações primárias e secundárias (Johnston et al., 2001). As alterações primárias resultam da espermatogênese anormal, causando anormalidades na cabeça (microcefalia, macrocefalia), peça intermediária (espessa, dupla, enrugada) e cauda (dupla). As alterações secundárias podem resultar tanto de problemas na maturação espermática ou no manuseio da amostra seminal (temperatura inadequada, esfregaço mal confeccionado). Da mesma forma que para as primárias, as secundárias podem estar presentes na cabeça (destacada), peça intermediária (quebrada) e cauda (enrolada, quebrada) (Feldman & Nelson, 1996). As alterações secundárias podem representar uma resposta transitória ao estresse e são consideradas menos prejudiciais à fertilidade do que as primárias. Entretanto, uma alta proporção de espermatozóides apresentando peça-intermediária reversa ou mesmo cauda enrolada ou quebrada, irá comprometer a motilidade e a fertilidade (Peña Martinez, 2004). Existem outros métodos de classificação das alterações, como por exemplo, a divisão em defeitos maiores e menores e ainda a divisão quanto à região do espermatozóide em que está situada a alteração, ou seja, cabeça, peça intermediária e cauda. Os defeitos maiores são àqueles que podem ter um efeito negativo maior na fertilidade, diferentemente dos menores. Oettlé (1993) descreve a união dessas duas últimas categorias, nas quais para cada região da célula espermática, os defeitos são agrupados em maiores e menores como mostrados na tabela 1.

36 35 Tabela 1. Classificação morfológica do espermatozóide canino * CABEÇA PEÇA CAUDA ACROSSSOMA INTERMEDIÁRIA MAIORES Macrocefalia Gota citoplasmática Cauda dupla Vacúolos Microcefalia Quebrada Distribuição Piriforme anormal Cabeça dupla MENORES Cabeça destacada Gota citoplasmática Enrolada Reação Descondensação distal Quebrada acrossômica nuclear Edema * Adaptado de Oettlé (1993) Ao se desenvolver novos protocolos para a criopreservação, uma avaliação ultraestrutural das células espermáticas deve ser realizada para assegurar que os ejaculados com uma alta proporção de espermatozóides morfologicamente normais seja usada. Contudo, certas alterações estruturais não são geralmente causadas pela preservação (Watson, 1979); dessa forma, outras análises devem ser realizadas para se avaliar o processo de criopreservação. Capacitação O espermatozóide necessita sofrer uma série de reações na membrana plasmática durante a permanência no trato genital feminino, conhecida como capacitação, para ser capaz de fertilizar o oócito (Petrunkina et al., 2003). Em cães, algumas substâncias têm sido descritas para a avaliação do status de capacitação como, por exemplo, a clortetraciclina (CTC), lectinas e ainda, a

37 36 mensuração das características de motilidade pela análise computadorizada, sendo indicativo de capacitação ou hiperativação (Rota et al., 1999b). Recentemente, o termo criocapacitação tem sido introduzido para explicar o fato de que os procedimentos de criporeservação induzem alterações similares a da capacitação no espermatozóide (Cormier & Bailey, 2003). Estas similaridades entre o espermatozóide capacitado e o criopreservado consistem em alterações na reorganização, fluidez e influxo de cálcio através da membrana plasmática (Green & Watson, 2001). Esta criocapacitação é, em parte, responsável pela redução na longevidade e fertilidade do espermatozóide congelado-descongelado (Peña Martínez, 2004). Morfologia acrossomal O acrossoma é uma vesícula contendo várias enzimas hidrolíticas incluindo pró-acrosina, hialuronidase, esterases e hidrolases ácidas, envolvidas no processo de fecundação (Garner & Hafez, 1995), desempenhando um papel crucial na função espermática. Após o espermatozóide ter sofrido reação acrossômica (RA), que consiste na fusão da membrana plasmática com a membrana acrossomal externa, ocorre a vesiculação e liberação de enzimas acrossomais que auxiliam na penetração da zona pelúcida (Eilts, 2005). As mudanças físicas da RA após criopreservação são indicativas de que o espermatozóide não pode mais fertilizar, embora ainda possa estar móvel (Eilts, 2005). O acrossoma do espermatozóide congelado-descongelado, frequëntemente, apresenta alterações morfológicas (Watson, 1990). Portanto, a análise acrossomal pode ser considerada um parâmetro de grande utilidade ao se avaliar os métodos de criopreservação.

38 37 A microscopia eletrônica de transmissão permite um exame detalhado do acrossoma, mas é laboriosa e consome muito tempo. O acrossoma do espermatozóide canino pode ser avaliado mais rapidamente e, facilmente, utilizando-se a microscopia óptica em esfregaços corados com eosina nigrosina (Oettlé, 1986, Peña et al., 1998a), Giemsa (Dahlbom et al., 1997) Rosa de bengala/azul de Tripan/Marrom de Bismarck (Talbot & Chacon, 1981) e Spermac (Oéttle, 1993, Ström et al., 1997). Recentemente, dois métodos têm sido desenvolvidos para avaliação acrossomal utilizando-se microscopia de fluorescência (Peña, 1997, Hewitt & England, 1998; Rota et al., 1999b). No primeiro método, detecta-se o material intracelular associado ao acrossoma e, conseqüentemente, requer a permeabilização das células antes de marcá-las. No segundo método, as células não precisam ser permeabilizadas. Na primeira categoria, utiliza-se lectinas marcadoras, anticorpos intracelulares, antígenos intracelulares e antígenos acrossomais. Na segunda, utiliza-se as clortetraciclinas (CTC) e os anticorpos externos (Peña, 1997, Peña Martínez, 2004). As lectinas mais utilizadas são: Pisum Sativum Agglutinin (PSA) e Peanut Agglutinin (aglutinina do amendoim) (PNA), que se ligam ao conteúdo acrossomal (Rijsselaere et al., 2005). Estas aglutininas podem ser usadas em associação com corantes fluorescentes como Hoechst e carboxifluoresceína/iodeto de propídio (Rijsselaere et al., 2005). A vantagem dos corantes fluorescentes consiste no fato de não ser preciso a remoção do meio de criopreservação uma vez que não há a interferência de glóbulos de gordura ou de outro material não corado (Peña et al., 1998b). Outro método já descrito para a avaliação acrossomal é a quantificação da liberação de enzimas acrossomais, como por exemplo, a acrosina, para avaliar, indiretamente, a integridade acrossomal do espermatozóide canino (Froman et al., 1984). A imunoflorescência indireta usando anticorpos monoclonais e policlonais e CTC também foi utilizada para a avaliação do status acrossomal (Brewis et al., 2001).

39 38 Citometria de fluxo O uso do método de citometria de fluxo para avaliação da integridade da membrana espermática e do acrossoma do espermatozóide canino pode facilitar o aperfeiçoamento e desenvolvimento de novos protocolos de criopreservação e permitir uma comparação precisa entre diferentes métodos de criopreservação, uma vez que a citometria de fluxo permite uma análise mais acurada do que as convencionais (Peña, 2000). A citometria de fluxo é um método objetivo e acurado para a análise de células espermáticas utilizando corantes fluorescentes e não utilizando fixadores. Esse método permite uma avaliação de múltiplas características, simultaneamente, na mesma amostra por um sistema de coloração dupla ou tripla. Além disso, dados de milhares de células podem ser obtidos num curto espaço de tempo, no qual não somente a morfologia geral do espermatozóide canino, bem como a integridade de organelas específicas pode ser analisada (Peña et al., 1998b). Peña et al. (2001) observaram uma correlação alta (90%) e significativa (P< 0,001) entre a análise por fluxo citométrico e a microscopia de fluorescência para avaliar a integridade da membrana. Além disso, o primeiro método mostrou-se superior em determinar o percentual de espermatozóides com acrossoma danificado, provavelmente, por analisar um número maior de células. A base da citometria de fluxo depende da excitação e emissão de fluorescência das células que foram coradas com corantes fluorescentes. As células espermáticas são carreadas num fluxo de circulação rápida por meio de raios laser que estimulam o corante (Garner et al., 1986). A luz emitida pelas células pode ser refletida por espelhos e as cores vermelha e verde podem ser mensuradas, individualmente, nas células (Garner et al., 1986).

40 39 A citometria de fluxo aplicada ao estudo do espermatozóide canino oferece uma vantagem significativa para a pesquisa, já que fornece informações sobre a viabilidade e outras características celulares de forma rápida para um grande número de células. As técnicas microscópicas para repetidas avaliações são mais laboriosas e consomem mais tempo e, geralmente, não mais do que 200 espermatozóides são contados (Peña et al., 1998b). Termorresistência (TTR) A avaliação da longevidade dos espermatozóides in vitro pode ser realizada pelo teste de termorresistência (TTR). A manutenção do sêmen à temperatura semelhante à corporal mimetiza, parcialmente, a situação in vivo e, repetidas observações da viabilidade e integridade acrossômica, durante a incubação, têm sido realizadas para avaliar a longevidade espermática (Ström, 1999). Uchoa et al. (2002) observaram que o sêmen canino a fresco apresenta uma boa termorresistência, uma vez que o mesmo pode ser conservado por 180 minutos a 37?C após diluição em solução à base de água de coco. No entanto, Ström et al. (1997) acreditam que a termorresistência pós-descongelação pode ser mais baixa para o espermatozóide canino do que para outras espécies. Concannon e Battista (1989) sugerem que o TTR deve ser usado mais, freqüentemente, para avaliar as técnicas de congelação. Por outro lado, também tem sido questionado se ao avaliar-se a capacidade fecundante do espermatozóide canino, a motilidade imediatamente após a descongelação pode ser mais importante do que sua sobrevivência após incubação (Olar, 1984). Ström et al. (1997) observaram que o espermatozóide canino mesmo com uma baixa termorresistência não tem, necessariamente, um baixo potencial fertilizante, visto que o sêmen congelado com o método CLONE apresentou uma baixa

41 40 termorresistência e mostrou altos índices de fertilidade após inseminação vaginal (59,3%) e intra-uterina (86,4%) (Govette et al., 1996). Portanto, devido aos resultados divergentes a respeito de uma possível correlação entre o TTR e a fertilidade na espécie canina, ainda não é possível sugerir a aplicação desse teste como um parâmetro confiável na avaliação do sêmen canino. Teste hiposmótico O teste hiposmótico (THOS) avalia a integridade funcional da membrana espermática (Spittaler & Tyler, 1985), sendo essa importante para o metabolismo espermático. Essa análise é um teste de endosmose que determina as mudanças na membrana espermática, onde o transporte através dessa é um processo bioquímico importante para a viabilidade espermática e capacidade fertilizante (Jeyendran et al., 1984). No espermatozóide canino, o choque hiposmótico induz um progressivo destacamento do acrossoma, cuja membrana é uma estrutura muito lábil que pode ser alterada por processos como a congelação, descongelação, resfriamento e diluição para inseminação artificial (Oettlé, 1986). England & Plummer (1993) verificaram existir uma correlação negativa entre a osmolaridade e a porcentagem de espermatozóides caninos edemaciados em soluções aquosas hiposmóticas à base de sacarose, frutose e citrato de sódio. Além disso, esses pesquisadores demonstraram não existir correlação entre a porcentagem de espermatozóides edemaciados e outros parâmetros seminais, tais como a motilidade, morfologia e porcentagem entre vivos e mortos. Inamassu et al. (1999) observaram existir no sêmen canino fresco uma correlação positiva entre a turgidez espermática em resposta ao teste hiposmótico e a morfologia espermática. A edemaciação em resposta ao HOST já foi positivamente correlacionada com a motilidade espermática (Kumi-Diaka, 1993), com a motilidade e a viabilidade (Rodríguez-Gil et al., 1994), mas não foi encontrada correlação alguma com

42 41 motilidade, morfologia e viabilidade por England e Plummer (1993). Uma relação entre o HOST e a capacidade fertilizante do espermatozóide canino ainda não foi observada. Avaliação ultra-estrutural por microscopia eletrônica Uma membrana plasmática intacta é um pré-requisito para a função espermática normal, incluindo a fertilização (Ström, 1999). Durante o processo de criopreservação, a membrana plasmática pode ser destruída pela transição de lipídios, saída de água, estresse mecânico, soluções hipertônicas e, possivelmente, cristais de gelo (Woelders, 1991). Entretanto, todos esses danos que o espermatozóide sofre ainda não são bem descritos para os cães (Rodriguez-Martinez et al., 1993). É muito difícil detectar os danos celulares associados com a criopreservação (Hammerstedt et al., 1990). Microanálises pelo raio-x permitem a localização quantitativa dos elementos celulares na microscopia eletrônica (Rodriguez-Martinez & Ekwall, 1989). A integridade da membrana plasmática e acrossoma do espermatozóide humano congelado, avaliado pela microscopia eletrônica, tem mostrado ser positivamente correlacionada com a fertilidade, utilizando-se a inseminação artificial (Mahadevan & Trounson, 1984). Utilizando esse método, Rodriguez-Martinez et al. (1993) observaram que o espermatozóide canino descongelado apresenta um alto grau de danos acrossômicos, incluindo perda do conteúdo, rarefação e edemaciação do acrossoma, perda de material acrossômico eletro-denso e vesiculação da membrana acrossomal. Porém, verificaram que o plasmalema, aparentemente, permanecia intacto na maioria dos casos. Esses autores sugeriram que tal fato poderia ser a razão para a baixa porcentagem de anormalidades acrossômicas normalmente notificadas quando se utilizava a microscopia de contraste de fase.

43 42 Análise espermática computadorizada (CASA) A análise espermática computadorizada (CASA) tem sido desenvolvida e está continuamente sendo aperfeiçoada desde que foi introduzida no início dos anos 80 (Amann & Hammerstedt, 1980). Günzel-Apel et al. (1993) foram os primeiros a descrever a análise do sêmen canino com a CASA. Posteriormente, outros autores (Ohl et al., 1994; Rawlings et al., 1994) relataram o uso de sistemas de CASA nesta espécie. Atualmente, a análise computadorizada é largamente utilizada em humanos e seu uso já está sendo proposto para as espécies animais (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b) na prática clínica e em atividades de pesquisa. A CASA permite uma avaliação objetiva e precisa não somente sobre a proporção de células móveis em uma amostra de sêmen, mas também sobre a qualidade do movimento das mesmas. As trajetórias do espermatozóide são individualmente determinadas pela função flagelar, nos quais características como velocidade, freqüência de batimento flagelar e amplitude irão, corretamente, refletir a condição fisiológica de cada célula (Peña, 2000). Os dados obtidos através desse método correspondem a centenas de mensurações espermáticas individuais, fornecendo informações sobre a qualidade média da motilidade em uma amostra de sêmen (Günzel-apel et al., 1993) e também sobre diferentes subpopulações espermáticas coexistindo na amostra (Peña Martínez, 2004). Foi observado que algumas características do movimento espermático avaliadas pela CASA podem estimar a fertilidade in vivo e in vitro em humanos e touros (Tardif et al., 1998, Larsen et al., 2000). Contudo, estudos similares objetivando estimar a fertilidade em cães não foram realizados. A CASA também foi descrita para a determinação da morfometria e tem mostrado acurácia quando a técnica é padronizada (Rijsselaere et al., 2004). Contudo, não há informação sobre a análise morfométrica do espermatozóide canino congeladodescongelado (Eilts, 2005).

44 43 Utilizando o sistema de videomicrografia Cellsoft e analisador de movimento celular Strömberg-Mika, Günzel-Apel et al. (1993) encontraram uma significativa correlação entre os parâmetros mensurados subjetivamente e aqueles obtidos com o uso da CASA. O Hamilton Thorne analyzer Ivos.10 (HTR-IVOS10) é um recente sistema de análise computadorizada proposto para avaliação de sêmen humano (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b) e também está sendo utilizado em algumas espécies animais ao redor do mundo (Farrell et al., 1995; Abaigar et al., 1999). Na espécie canina, o HTR foi utilizado para a descrição da motilidade em ejaculados de cães da raça Beagle (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b), mostrando uma variabilidade abaixo de 10%. O HTR, que já foi validado para a espécie canina, representa uma importante ferramenta para futuros estudos andrológicos. Embora todos estes equipamentos para análise computadorizada também já tenham sido validados para a espécie canina, ainda estão muito longe de se tornar comum na prática veterinária devido ao alto custo dos mesmos bem como a necessidade de padronização das técnicas (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b). No entanto, há disponível um equipamento com um preço mais acessível, é o Analisador de qualidade espermática (SQA), que já foi validado para a avaliação do sêmen canino criopreservado (Iguer- Ouada & Verstegen, 2001b). Este equipamento registra variações na densidade óptica, convertendo esta informação, por cálculos matemáticos, num índice de motilidade espermática (SMI). Este equipamento mostrou uma boa repetibilidade de resultados em amostras seminais de boa e ótima qualidade, observando altas correlações entre vários parâmetros seminais (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b). No entanto, ainda não foi determinada uma correlação entre o SMI e a fertilidade in vivo (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b). Testes de interação espermatozóide-oócito Além dos testes já mencionados para a avaliação de um único parâmetro da função espermática, há aqueles testes que avaliam múltiplos parâmetros, tais como a

45 44 interação oócito-espermatozóide (ligação e penetração na zona pelúcida - ZP) e a fertilização in vitro. A ligação do espermatozóide à ZP é um evento crítico na interação gametogênica que culmina com a fertilização do oócito (Mayenco-Aguirre & Pérez-Cortez, 1998). Essa ligação é mediada por receptores na membrana plasmática espermática e uma ou mais glicoproteínas da ZP (Hoodbhoy & Dean, 2004) A habilidade de um espermatozóide de interagir corretamente com o oócito é crucial e, dependente de vários fatores, incluindo a motilidade espermática e a fluidez da membrana. As análises da interação oócito espermatozóide avaliam indiretamente danos moleculares, que são impossíveis de serem avaliados em análises convencionais. (Ström, 1999). Portanto, a habilidade do espermatozóide em se ligar à ZP é um teste potencialmente valioso ao se avaliar técnicas para resfriamento e congelaçãodescongelação de sêmen. Testes avaliando essa habilidade têm sido desenvolvidos para bovinos (Fazelli et al., 1993a), eqüinos (Fazelli et al., 1993b) e suínos (Fazelli et al., 1995). Os testes de ligação do espermatozóide canino com a ZP podem ser realizados utilizando-se oócitos homólogos intactos (Ström Holst et al., 2001b) ou, ainda, bisseccionados (hemi-zona) (Mayenco-Aguirre & Pérez-Cortez, 1998). Segundo Olar (1984), a avaliação da capacidade fecundante do espermatozóide canino imediatamente após a descongelação seria um parâmetro mais importante do que a simples observação da manutenção da motilidade após um período de incubação. Em um trabalho pioneiro, Froman et al. (1984) verificaram a capacidade fecundante in vitro de espermatozóides caninos frescos e congelados e observaram que o processo de congelação afeta bastante a taxa de penetração em oócitos de camundongas, sendo este talvez o motivo para as baixas taxas de fertilidade in vivo obtidas com o sêmen congelado. A interação espermatozóide-ooócito pode ser avaliada pela fluorescência ou pela microscopia óptica (aceto-orceína), onde se observa a presença de cabeças

46 45 espermáticas ligadas à ZP ou no espaço perivitelínico e ooplasma do oócito (Hewitt & England, 1997). Para a realização deste teste, Hay et al. (1997) relatam que podem ser utilizados oócitos caninos colhidos de ovários após a ovariosalpingohisterectomia, os quais podem ser utilizados, tanto imediatamente após a cirurgia, quanto após congelação a -18 C, para a avaliação do sêmen congelado de cães domésticos, lobos cinzentos (Canis lupus) e lobos vermelhos (Canis rufus). Esses autores sugerem ainda que as amostras de sêmen que retêm a motilidade após a descongelação também retêm o movimento progressivo, indicando que se elas sobreviverem a congelação serão capazes de progredir. Verificaram ainda que a baixa motilidade e aumento nos danos acrossômicos nas células espermáticas caninas após a descongelação estão correlacionados com penetração reduzida em oócitos homólogos. Mayenco-Aguirre & Pérez-Cortez (1998) relataram que na espécie canina, a ligação à zona pelúcida de oócitos homólogos é, significativamente, afetada pela concentração espermática, sendo sugestivo o uso de concentrações superiores a 1 x 10 6 espermatozóides capacitados e móveis/ml. Segundo esses autores, a partir dessa concentração espermática sugerida, foi obtida uma taxa de ligação de 86%. Em adição, Ivanova et al. (1999) observaram que diferentes cães apresentam uma variação individual quanto à possibilidade de terem seu sêmen congelado, com conseqüente variação na porcentagem de espermatozóides ligados à zona pelúcida. Além disso, Ström-Holst et al. (2000) mostraram que a adição da pasta Equex STM ao diluente tem um efeito benéfico sobre a capacidade de espermatozóides caninos descongelados em se ligarem à zona pelúcida de oócitos homólogos. O teste de penetração oocitária consome menos tempo do que fertilização in vitro, visto que, não há a necessidade de maturar o oócito e somente a penetração é avaliada e não o seu desenvolvimento (Hewitt & England, 1997). A penetração do espermatozóide na zona e/ou ooplasma mostrou-se intimamente associada à

47 46 motilidade espermática (Hay et al., 1997), mas não se correlacionou com o status acrossomal (Rodrigues et al., 2004). Outros métodos de avaliação in vitro No cão, assim como em outras espécies, uma avaliação objetiva do espermatozóide pode ser realizada em muitas situações clínicas ou atividades de pesquisa. A avaliação da motilidade é, essencialmente, subjetiva, podendo causar uma alta variabilidade entre laboratórios ou observadores. Para controlar esta variabilidade, várias tentativas têm sido realizadas para padronizar a análise da motilidade espermática (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b). Várias técnicas têm sido propostas para superar essa subjetividade e fazer com que a análise da motilidade seja mais confiável. A turbidimetria é uma técnica baseada na avaliação espermática pelo swim-up, no qual a turbidez é registrada pela espectroscopia (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b). A espectroscopia a laser consiste na análise do movimento espermático induzido por variações no comprimento da onda. Contudo, se esses métodos físicos são interessantes, eles somente dão a informação sobre as características dos espermatozóides como um todo sem descrever os parâmetros individuais. Além disso, esses testes são de difícil realização na prática clínica, bem como necessitam de um equipamento de alto custo (Iguer-Ouada & Verstegen, 2001b). Para a avaliação espermática individual, bem como da velocidade, técnicas envolvendo o filtro de acetato/nitrato (England & Allen, 1990) e progressão no muco cervical (Mole & Fitzgerald, 1990) têm sido propostas. No entanto, tais técnicas consomem muito tempo e os resultados são pouco confiáveis.

48 47 O armazenamento de espermatozóides em um reservatório é necessário para que ele se mantenha funcional até o momento da fertilização (England e Pacey, 1998). Vários estudos in vivo relataram que as principais reservas espermáticas do cão estão localizadas nas criptas uterinas e na junção útero-tubárica (Rijsselaere et al., 2004). Testes in vitro que investiguem a interação do espermatozóide com fragmentos do oviduto podem fornecer informações não somente sobre a fisiologia e os mecanismos dessa ligação como também comparar a capacidade de ligação dos ejaculados (Petrunkina et al., 2004). Apesar de vários aspectos dessa ligação já terem sido estudados como o efeito do estágio do ciclo estral e da região do oviduto, a capacidade de ligação do espermatozóide com explants de oviduto ainda não foi correlacionado com a fertilidade (Petrunkina et al., 2003, 2004). Avaliação da função espermática in vivo Apesar de inúmeros testes in vitro, a forma mais segura de avaliar-se o sucesso da congelação de sêmen é pelos resultados obtidos após inseminação artificial (IA) com o sêmen descongelado. Quando novos métodos para criopreservação de sêmen são desenvolvidos, testes de fertilidade são necessários para confirmar os resultados das avaliações in vitro. É importante ressaltar que a fertilidade de um ejaculado é dependente da fertilidade da fêmea (Eilts, 2005). Amann (2005) relata que a fertilidade de um garanhão pode ser tão alta quanto 95% se a fertilidade da fêmea é de 90% e tão baixa quanto 24% se a fertilidade da fêmea é de 25%. Para o cão, mesmo que sua fertilidade já houvesse sido testada num grande grupo de fêmeas férteis, a sua fertilidade não poderia ser prevista ao se utilizar um outro grupo de cadelas que tivessem uma fertilidade diferente (Eilts, 2005). Há outros fatores que podem influenciar o resultado das inseminações artificiais com sêmen congelado-descongelado, tais como diferenças na qualidade e congelabilidade dos ejaculados de diferentes cães, o número de espermatozóides

49 48 inseminados, momento da inseminação e o local de deposição do sêmen. Portanto, é necessário controlar esses fatores para poder avaliar os efeitos dos diferentes métodos de criopreservação (Eilts, 2005). As taxas de gestação obtidas com o sêmen canino congelado têm variado consideravelmente e são, geralmente, mais altas quando o sêmen é depositado no útero, comparado à deposição vaginal (Concannon & Battista, 1989; Olar et al., 1989). Entretanto, Silva (1995) descreve resultados semelhantes para a IA intrauterina e a IA intravaginal utilizando-se a sonda de Osíris com o sêmen congelado, o que implica que a própria metodologia de inseminação pode influenciar os resultados. Uma vez que muitos dos parâmetros avaliados in vitro não são correlacionados com a fertilidade, a inseminação artificial de um grande número de fêmeas é ainda o teste mais confiável ao se comparar os métodos de preservação de sêmen (Amann & Hammerstedt, 1993). Em cães, testes de fertilidade são difíceis de serem realizados devido ao número limitado de cadelas disponíveis e a longa duração do seu ciclo estral. Eilts (2005) relata que para se ter uma significância estatística, na qual a diferença na taxa de fertilidade entre dois grupos seja de 30%, são necessárias 37 cadelas por grupo.

50 49 3. JUSTIFICATIVA O interesse pela IA com sêmen congelado de cães aumentou muitos anos depois do uso dessa biotécnica na pecuária. Tradicionalmente, o interesse dos proprietários de cães consistia mais em evitar a reprodução do que em incrementá-la. Entretanto, nas duas últimas décadas, a situação tem, substancialmente, mudado e a IA com sêmen congelado tem sido um assunto de interesse mundial. Esse interesse pode ser explicado pelo crescente valor dos cães de raça pura, bem como pelo fato da criação de cães ter se tornado um hobby bastante difundido (Peña, 2000). Apesar do crescente interesse pelo uso da IA com sêmen congelado de cães, tal biotécnica ainda não é tão usada no manejo reprodutivo da criação de cães no Brasil. Uma razão para o ceticismo dos criadores são os resultados insatisfatórios de fertilidade, bem como as ninhadas pequenas. Portanto, são necessárias investigações objetivando a melhora do potencial fertilizante do espermatozóide canino congelado (Peña, 2000). O sêmen canino já foi criopreservado por diversos métodos e com diferentes diluentes. Mais recentemente, o diluente à base de água de coco foi utilizado para a criopreservação do sêmen desta espécie (Cardoso et al., 2000, 2003b, Cardoso, 2001). A água de coco mostra toda uma riqueza de substâncias que participam inclusive no metabolismo de espermatozóides; sendo desenvolvido, no Nordeste do Brasil, um diluente à base de água de coco para a conservação de sêmen de caprinos (Salles & Nunes, 1992) e que foi adaptado para a espécie canina (Cardoso et al., 2000). Apesar de sua eficiência como diluente, era necessário preparar uma nova solução para cada uso. A difusão do uso da água de coco está limitada, em primeiro lugar, a inexistência da padronização de um insumo tão importante (Nunes et al., 2005). Uma série de fatores como variedade, tipo de cultivar, idade, sanidade e fatores ambientais

51 50 influenciam, substancialmente, sua composição (Nunes et al., 2005). Sua labilidade tem dificultado os esforços de inúmeros pesquisadores, muitos deles ligados à industrialização, de obter na prateleira, a água de coco in natura, sob forma estável e duradoura (Nunes et al., 2005). Portanto era preciso o desenvolvimento de um método de armazenagem da água de coco que mantivesse as mesmas características bioquímicas que a qualificam como um bom diluente. Objetivando ainda a comercialização do referido diluente, pesquisadores do Ceará desenvolveram a água de coco em pó que já foi testado em outras espécies (Salgueiro et al., 2002, Sampaio Neto et al., 2002)), mas não ainda na espécie canina. Embora o diluente à base de água de coco padrão (ACIN) já tivesse sido eficaz para a congelação de sêmen canino, não se conhecia a eficiência da água de coco em pó, na qual na espécie canina recebe o nome de ACP-106. Para verificar a eficiência deste diluente, é necessária uma avaliação mais precisa do espermatozóide, podendo-se ter um maior conhecimento do tipo e da extensão dos danos causados à célula espermática pelo processo de criopreservação com ACP-106. Um dos principais danos causados à célula espermática são as mudanças semelhantes à capacitação resultantes da desestabilização de membrana, tendo sido sugerido que a prevenção ou a diminuição dessas alterações podem aumentar as taxas de concepção (Watson, 1995). Portanto diferentes testes in vitro podem fornecer informações importantes a respeito dessas alterações, sendo útil para o aperfeiçoamento ou mesmo o desenvolvimento de novos métodos de criopreservação (Watson, 1995). Mesmo com as inúmeras vantagens das avaliações in vitro, é pela taxa de fertilidade que se pode avaliar, definitivamente, o sucesso da criopreservação. As análises in vitro fornecem informações das características do espermatozóide congelado e, consequëntemente, facilitam o aperfeiçoamento das técnicas existentes, bem como o desenvolvimento de novas. Além disso, os resultados dessas análises podem ser utilizados para as comparações e correlações entre características in vitro e

52 51 teste de fertilidade, determinando quais parâmetros das avaliações in vitro podem melhor prever os resultados in vivo (Ström, 1999). Dessa forma, uma avaliação detalhada dos danos que o espermatozóide sofre com a criopreservação utilizando o ACP-106 poderá ajudar no aperfeiçoamento dessa técnica, podendo a mesma ser utilizada em escala comercial, permitindo o armazenamento e subseqüente difusão de material genético. Além disso, esse método de preservação de sêmen poderá, futuramente, ser estudado em espécies canídeas ameaçadas de extinção (Wildt et al., 1995) e o conhecimento dos fatores que interferem no sucesso da congelação de sêmen canino com um diluente à base de água de coco poderá acelerar a adaptação dessa biotécnica para as espécies selvagens. É importante ressaltar que o mercado pet é um dos maiores setores financeiros da atualidade, dando-se destaque para a criação comercial de cães. Além disso, estudos da criopreservação do sêmen proporcionam o crescimento científico da Medicina Veterinária, levando à formação de recursos humanos. E ainda, o desenvolvimento de um novo produto, disponível comercialmente, promoverá uma maior geração de empregos.

53 52 4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS O diluente para sêmen de cães à base de água de coco em pó (ACP-106 ) é eficiente para a criopreservação de sêmen. A concentração espermática influencia na qualidade seminal canina pósdescongelação utilizando ACP-106. diluente. O armazenamento do ACP-106 a -10 C não altera a sua eficiência como Utilizando diferentes análises in vitro, é possível estabelecer quais parâmetros seminais serão mais correlacionados com os resultados das interações espermatozóides-oócitos.

54 53 5. OBJETIVOS Geral Avaliar a eficácia de um diluente à base de água de coco em pó (ACP-106 ) na criopreservação de sêmen canino. Específicos Comparar a eficiência dos diluentes à base de água de coco in natura (ACIN) e em pó (ACP-106 ) na criopreservação de sêmen canino; Comparar dois métodos de diluição na criopreservação de sêmen canino utilizando os diluentes ACIN e ACP-106 ; 106 ; Verificar o efeito do armazenamento a 10 C sobre a eficiência do ACP- Investigar a influência da diluição pós-descongelação na longevidade do sêmen canino criopreservado com ACP-106 ; Verificar a eficiência do processo de criopreservação com o ACP-106 pela análise computadorizada, integridade de membrana e interação oócito-espermatozóide; Verificar a possibilidade de se estabelecer quais parâmetros seminais são os melhores representantes dos resultados das interações espermatozóides-oócitos;

55 54 Caracterizar as alterações ultra-estruturais do espermatozóide canino criopreservado em ACP-106 pela microscopia eletrônica de transmissão.

56 55 6. CAPÍTULO 1 COMPARAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE DOIS MÉTODOS DE DILUIÇÃO NA CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN CANINO UTILIZANDO OS DILUENTES À BASE DE ÁGUA DE COCO IN NATURA (ACIN) OU EM PÓ (ACP-106 )

57 56 Comparison of two dilution rates on canine semen quality after cryopreservation in a coconut water extender Anmal Reproduction Science, artigo aceito para publicação (in press) Efeito da diluição espermática na congelação de sêmen canino utilizando-se a água de coco em pó (ACP-106 ) Ciência Animal, artigo submetido para publicação Use of the powder coconut water (ACP-106 ) as an alternative extender for canine semen freezing Animal Reproduction, artigo submetido para publicação

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66 65 Efeito da diluição espermática na congelação de sêmen canino utilizando-se a água de coco em pó (ACP-106 ) como diluidor Effect of sperm dilution on canine semen freezing using powder coconut water (ACP-106 ) Rita de Cássia Soares Cardoso 1, Alexandre Rodrigues Silva 1, Lúcia Daniel Machado da Silva 2 1. Doutorando (a) PPGCV/FAVET-UECE /Bolsista CAPES 2. Professor Adjunto FAVET-UECE/ Bolsista CNPq. Laboratório de Reprodução de Carnívoros-FAVET/UECE

67 66 RESUMO O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da diluição seminal sobre a qualidade espermática após a descongelação de sêmen canino usando a água de coco em pó (ACP 106). Foram coletados doze ejaculados e o sêmen foi dividido em duas alíquotas, uma para diluição 1:1 e outra para a concentração de 200x10 6 espermatozóides/ml. O sêmen foi inicialmente diluído em ACP 106 contendo 20% de gema de ovo. Após a diluição, o sêmen foi submetido ao resfriamento por 40 minutos em caixa térmica (15 C) e 30 minutos em refrigerador (4 C). Posteriormente o ACP acrescido de gema de ovo e glicerol (concentração final de 6%) foi adicionado ao sêmen. Os ejaculados foram congelados em vapores de nitrogênio líquido e armazenados a -196 C. Após uma semana, o sêmen foi descongelado a 37 C por 1 minuto e os parâmetros microscópicos foram avaliados. Não houve efeito do método de diluição sobre a motilidade e vigor. Após a descongelação as médias destes parâmetros foram 45,39 ± 13,91% e 3,08 ± 0,67 para o grupo diluído 1:1 e 55,0 ± 18,34% e 3,58 ± 0,47 para o grupo diluído a uma concentração de 200x10 6 espermatozóides/ml, respectivamente. Também não foi observado efeito dos métodos de diluição sobre a morfologia espermática (P>0,05) enquanto os defeitos de cauda foram os mais observados (P<0,05). O percentual de alterações morfológicas após a descongelação para os dois grupos foram 36,06% para a diluição 1:1 e 29,28% para a concentração fixa. Conclui-se que o ACP 106 é eficiente para a criopreservação de sêmen canino utilizando-se uma concentração espermática de 200 x 10 6 espermatozóides/ml ou a uma diluição constante (1:1) com o método de congelação e descongelação descrito neste trabalho.

68 67 ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the effect of sperm dilution using powder coconut water (ACP 106) extender on the post-thaw sperm quality. Twelve ejaculates were collected from six dogs. Semen was divided into 2 aliquots, one for dilution 1:1 and another for concentration of 200x10 6 spermatozoa/ml. Semen was initially extended with ACP 106 containing 20% egg yolk. After dilution, semen was submitted to cooling for 70 minutes. After this step, extender added by egg yolk and glycerol at a final concentration of 6% was added to semen. Ejaculates were frozen in nitrogen vapors and stored at -196?C. After one week, straws were thawed at 37?C for 1 minute and the microscopic criteria were evaluated. The method of sperm dilution had not a significant effect on post-thaw motility and vigor. After thawing, motility and vigor values were 55.0 ± 18.34% and 3.58 ± 0.47 for semen diluted 1:1 and ± 13.91% and 3.08 ± 0.67 for semen diluted at 200 x 10 6 spermatozoa/ml. The method of sperm dilution didn t affect sperm morphology either (P>0.05) and tail defects were the most observed (P<0.05). The percentage of post-thaw sperm abnormalities was 29.2 ± 9.04 % for dilution 1: ± 10.82% for dilution at 200x10 6 spermatozoa/ml. The ACP 106 is efficient for canine semen cryopreservation at a constant dilution rate (1:1) or at 200x10 6 spermatozoa/ml using the freezing/thawing processes described here. Palavras-chave: ACP, água de coco, sêmen, cão, congelação Keywords: PCW, coconut water, sperm, dog, freezing

69 68 Introdução Diversas pesquisas têm sido desenvolvidas objetivando aperfeiçoar os protocolos já existentes para a congelação de sêmen canino através do uso de diferentes crioprotetores, processos de congelação/descongelação e uma variedade de diluidores como o lactose, Pipes, Tes e Tris, que é o mais utilizado para a conservação de sêmen canino (England, 1993). Vários pesquisadores tentaram desenvolver um bom diluidor, ou seja, que apresente as seguintes características: atoxicidade, isotonicidade, boa capacidade tamponante, bem como praticidade, baixo custo e eficiência (Mies Filho, 1987; Fontbonne, 1993). Recentemente, foi desenvolvida a água de coco em pó (ACP ) que já foi testada com sucesso em diferentes espécies tais como eqüinos (Sampaio Neto et al., 2002), caprinos (Salgueiro et al., 2002) e caninos (Cardoso et al., 2004). O ACP foi desenvolvido devido à impossibilidade de armazenamento da água de coco e ainda objetivando a padronização e comercialização do referido diluidor, mesmo naquelas regiões onde o fruto não existe. Embora a água de coco em pó já tenha sido testada com sucesso para a congelação de sêmen canino, onde se obteve aproximadamente 60% de espermatozóides móveis após a descongelação (Cardoso et al., 2004), ainda faz-se necessário o aperfeiçoamento deste protocolo de congelação. Vale ressaltar que, para a espécie canina, o diluidor recebe a denominação de ACP 106. Utilizando-se a solução à base de água de coco (50% água de coco in natura + 25% água destilada + 25% citrato de sódio a 5%), o sêmen canino é comumente congelado na proporção de uma parte de sêmen para uma parte de diluidor (1:1), não se levando em conta a concentração espermática (Cardoso et al., 2003b, Cardoso et al., 2004). Utilizando outros diluidores, o sêmen canino já foi congelado em diferentes concentrações espermáticas como 40 (Olar et al., 1989), 44 (Dobrinski et al., 1993), 50 (Rota et al., 1997a), 66 (Fontbonne e Badinand, 1993), 100 (Thomas et al., 1993, Wilson, 1993, Ström et al., 1997), 150 (Farstad e Andersen-Berg, 1989) e 200 x 10 6 espermatozóides/ml (Silva e Verstegen, 1995, Silva et al., 1996). Contudo ainda há pouca informação sobre o efeito da concentração espermática sobre a qualidade do sêmen canino pós-descongelação. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do ACP 106, comparando-se um método de diluição fixa (uma parte de sêmen:uma parte de diluidor ou 1:1) com um método de concentração fixa (200 x10 6 espermatozóides/ml) na congelação de sêmen canino.

70 69 Material e Método Animais experimentais Foram utilizados seis cães: 1 American Sttafordshire Terrier, 2 Boxers, 1 Brazilian Mastiff, 1 Dobermann e 1 Rottweiler, com idade variando de 1 a 5 anos. Os animais pertenciam a canis particulares e foram mantidos em boxes individuais. Os cães foram alimentados com ração comercial e tinham livre acesso à água. Coleta e avaliação de sêmen Foram coletados dois ejaculados de cada cão através da técnica de manipulação digital (Christiansen, 1986), utilizando-se tubos de vidro graduados acoplados a um funil e sendo coletado o sêmen na sua forma fracionada. Os parâmetros macroscópicos (cor e volume) foram avaliados no sêmen a fresco (fração espermática). A motilidade e o vigor (em escala de 0 a 5) foram avaliados no sêmen a fresco e após a diluição inicial, o resfriamento, a adição de glicerol e a descongelação, utilizando-se um microscópio óptico (x100). A morfologia espermática foi avaliada através da contagem de 200 células após coloração de um esfregaço com eosina-nigrosina. As células foram classificadas como normal ou apresentando alterações primárias ou secundárias. As alterações foram apresentadas de acordo com a sua localização (cabeça, peça intermediária e cauda). Esta avaliação também foi realizada através da microscopia óptica, em aumento de 1200x, no sêmen a fresco e congelado/descongelado. A concentração espermática foi mensurada através de contagem em câmara de Neubauer (Cardoso et al., 2003a). Diluição do sêmen Para a congelação do sêmen, foi utilizada a água de coco em pó (ACP 106, ACP Biotecnologia, Fortaleza-Ceará, Brasil), onde era composta por 1,2g de ACP em 5,0 ml de água ultra-pura autoclavada e 5,0 ml de solução de citrato de sódio a 1%. O diluidor continha 20% de gema de ovo e 6% de glicerol (concentração final no diluidor). Foram testadas duas taxas de diluição: uma parte de sêmen para uma parte de diluidor (DILUIÇÃO) e outra a uma concentração de 200 x 10 6 espermatozóides/ml (CONCENTRAÇÃO). Após a mensuração da concentração espermática, o sêmen foi dividido em duas alíquotas. No primeiro grupo, foi utilizada a diluição de uma parte de sêmen para uma parte de diluidor. Para o segundo grupo, foi calculado o volume total de diluidor necessário para uma

71 70 concentração de 200 x 10 6 espermatozóides/ml. O volume total de diluidor para cada protocolo foi dividido em duas partes (A e B). A parte A continha apenas o ACP acrescido de gema de ovo e a Parte B, similar a anterior, mas contendo 12% de glicerol. Após diluição inicial e a adição de glicerol, a concentração final de glicerol no diluidor foi de 6%. Processamento do sêmen Após a divisão do sêmen em duas alíquotas, uma para cada protocolo a ser testado, a diluição fixa (1:1) foi processada inicialmente na diluição de uma parte de sêmen para meia parte de diluidor. Para o grupo com concentração espermática, o sêmen foi diluído inicialmente com metade do volume de diluidor necessário para a concentração de 200 x 10 6 espermatozóides/ml. Nesta etapa, foi utilizada somente a parte A do diluidor. Após esta diluição inicial com a parte A em temperatura ambiente (aproximadamente 27 C), as amostras foram armazenadas em tubos de vidro e estes colocados em um recipiente com água e acondicionados em caixa térmica com gelo reciclável (15?C) por 40 minutos. Após este período, o sêmen foi transferido para um refrigerador até atingir 4 C (30 minutos) e a parte B foi dividida em três partes iguais e adicionada ao sêmen em três etapas, com intervalos de cinco minutos (Cardoso et al., 2003b). O sêmen foi envasado em palhetas de 0,25mL, e depois dispostas horizontalmente em rampa de congelação a uma altura de 5 cm do nível de nitrogênio líquido por cinco minutos e, finalmente, armazenadas em nitrogênio líquido (-196?C). Após uma semana, as amostras foram descongeladas em banho-maria (37?C) por um minuto e avaliadas microscopicamente (Cardoso et al., 2003b). Foram obtidas vinte e quatro palhetas para cada método de diluição, correspondendo a duas palhetas por réplica (n=12). Análise estatística Com exceção da cor, os demais parâmetros foram expressos na forma de média e desvio padrão. Os dados de motilidade e alterações morfológicas foram transformados em arco seno. Para avaliar o efeito da diluição espermática sobre estes parâmetros, utilizou-se o teste t de Student e para o vigor, utilizou-se o teste de Mann-Whitnney. Estes mesmos testes foram utilizados para avaliar o efeito das etapas do processo de congelação sobre os parâmetros avaliados (P<0,05).

72 71 Resultados e Discussão O sêmen a fresco (n=12) apresentou coloração branca opalescente. As características físicas estão detalhadas na TAB. 1. Observa-se que as características físicas dos ejaculados frescos estão de acordo com os valores considerados normais para a espécie canina (Jonhston et al., 2001). Foi observado um declínio significativo da motilidade e do vigor a partir do resfriamento (TAB. 2) até a descongelação para os dois grupos, com exceção do vigor para o grupo que utilizou a diluição 1:1, onde não se obsevou diferença entre as etapas de adição de glicerol e descongelação. Cardoso et al. (2002) e Silva et al. (2001) também observaram este declínio em ambos os parâmetros a partir do resfriamento e até a descongelação, utilizando diluidores à base de água de coco e Tris, respectivamente. Além disso, não houve efeito do método de diluição sobre a motilidade e vigor. Este resultado difere do encontrado por Peña e Linde- Forsberg (2000) que, testando a diluição em concentrações espermáticas de 50, 100, 200 e 400 x 10 6 espermatozóides/ml, observou efeito da concentração espermática, encontrando melhores resultados de motilidade progressiva imediatamente após a descongelação com 200x 10 6 espermatozóides/ml. Neste trabalho somente foi testado uma diluição para uma concentração fixa de 200x 10 6 espermatozóides/ml e uma outra diluição a uma relação constante de 1:1 (sêmen:diluidor), sem levar em conta a concentração espermática. Uma vez que a concentração espermática média dos ejaculados foi de 1,6 x 10 9 espermatozóides/ml, para a diluição a uma concentração de 200x 10 6 espermatozóides/ml foi necessário utilizar um grande volume de diluidor. De acordo com Mann (1964), o espermatozóide dos mamíferos responde à diluição excessiva exibindo perda de motilidade e aumento no número de espermatozóides mortos. Por outro lado, a diluição a uma taxa constante, não leva em consideração a concentração espermática, consequentemente havendo variação na quantidade de glicerol/célula. Como a concentração espermática média foi de 1,6 x 10 9 espermatozóides/ml, após a diluição (1:1), esta concentração foi de 800 x 10 6 espermatozóides/ml. Entretanto, é importante lembrar que a concentração espermática variou de 530 a 2760 x 10 6 espermatozóides/ml. Então, após a diluição, este parâmetro variou de 265 a 1370 x 10 6 espermatozóides/ml. Dessa forma, a diluição a uma taxa constante pode levar a uma grande variação de resultados, mas esta diluição foi escolhida, pois é comumente utilizada para a diluição não somente com a solução

73 72 à base de água de coco (Cardoso et al., 2003) como em outros diluidores (Silva et al., 1998; 2003) para a congelação de sêmen canino. Colas (1975) relata que obteve melhores resultados de fertilidade com sêmen ovino, quando este foi diluído a uma concentração constante de 900 x 10 6 espermatozóides/ml do que a uma taxa constante de 1:4. Isto sugere que o nível ótimo de glicerol no sêmen diluído pode estar relacionado à sua concentração final em relação ao espermatozóide (Colas, 1975). Da mesma forma que para a motilidade e o vigor, não foi observado efeito do método de diluição sobre a morfologia espermática (P>0,05), sendo os grupos similares quanto às alterações de cabeça, peça intermediária e cauda e, ainda, quanto às alterações secundárias (FIG. 1 e 2) e totais. Para os dois métodos de diluição, os defeitos de cauda (FIG. 1) foram os mais observados (P<0,05). O percentual de alterações morfológicas após a descongelação para os dois grupos (36,06% vs 29,28%) é similar aos encontrados por Cardoso et al. (2003) e Silva et al. (2003) utilizando uma solução à base de água de coco e Tris, respectivamente. Para a avaliação da morfologia espermática, foi realizada a coloração de eosina-nigrosina, que não se mostrou tão eficiente. Embora ela seja classificada como uma coloração vital é difícil a avaliação do percentual de células vivas após a descongelação, visto que se observa uma população espermática que não se cora adequadamente, dificultando a interpretação, por isso este parâmetro não foi mensurado. Este fato já foi observado por Peña (2004), relatando que essa população de espermatozóides que não se cora adequadamente, poderia apresentar lesão de membrana, mas talvez ainda fosse viável. Além disso, como não há fixação no processo de coloração, observou-se que a vida útil da lâmina torna-se mais curta, podendo ocasionar defeitos aos espermatozóides (principalmente de cauda) que não existiam no momento da coloração. È importante ressaltar que só foi realizada a avaliação clássica da morfologia espermática, sendo importante a realização de outras avaliações como, por exemplo, a do status acrossomal. Há ainda pouca informação a respeito do efeito da concentração espermática sobre a congelação de sêmen canino. Estudos em outras espécies, especialmente a eqüina, sugerem que este fator pode influenciar sobre a sobrevivência espermática pós-descongelação (Peña e Linde-Forsberg, 2000). Palácios et al. (1992) relataram melhores resultados de motilidade pós-descongelação quando o espermatozóide eqüino foi congelado a uma concentração de 800 x 10 6 espermatozóides/ml do que a 100 x10 6 espermatozóides/ml.

74 73 Usando o diluidor Tris para a congelação de sêmen canino a uma concentração de 50 x10 6 espermatozóides/ml, Rota et al. (1997b) obtiveram resultados similares de motilidade após a descongelação (56,4%). Além disso, 56,5% dos espermatozóides mostraram uma membrana intacta. Ström et al. (1997) obtiveram uma melhor motilidade após a descongelação utilizando o diluidor Tris e o CLONE. Nesse experimento, o sêmen foi congelado a uma concentração de 100x10 6 espermatozóides/ml e foi observado aproximadamente 70% de espermatozóides móveis e 50% apresentando acrossoma normal. Silva et al (1996) utilizaram sêmen congelado a uma concentração de 200 x 10 6 espermatozóides/ml e obtiveram 60% de cadelas prenhes após inseminação intravaginal e intrauterina. É relatado que para altas concentrações espermáticas (1000 x 10 6 espermatozoides/ml), a motilidade pós-descongelação foi melhor quando uma rápida taxa de resfriamento foi utilizada durante a congelação, ao passo que para baixas concentrações (200 x 10 6 espermatozóides/ml), a motilidade foi melhor quando se utilizou uma lenta taxa de resfriamento (Parlevilet et al., 1992). Em nosso trabalho, foi utilizada uma taxa de resfriamento moderada, explicando-se talvez o fato dela ter sido eficiente para as duas diluições. Outros pesquisadores também utilizaram uma taxa similar a deste trabalho, mas em concentrações espermáticas diferentes como 100 x 10 6 (Bueno et al., 2001), 200 x 10 6 (Eilts, 2003) e para uma diluição de 1:2 (Oliveira, 2003). Conclusão Com base nos resultados, conclui-se que o ACP 106 foi capaz de preservar a motilidade, vigor e morfologia espermática pós-descongelação em índices aceitáveis para a realização de inseminação artificial, sendo efeiciente para a criopreservação de sêmen canino diluído a uma concentração espermática final de 200 x 10 6 espermatozóides/ml ou a uma diluição constante (1:1). Embora o método de diluição a uma taxa constante seja mais prático, a utilização de uma concentração fixa tem como vantagens a simplificação do cálculo do número de espermatozóides por palheta e o melhor aproveitamento do ejaculado. É importante ressaltar que o resultado deste trabalho é o primeiro passo para a padronização de um protocolo de congelação de sêmen canino com o diluidor ACP 106, facilitando a futura comercialização deste diluidor para a referida espécie.

75 74 Agradecimentos Os autores agradecem ao Laboratório de Tecnologia de Sêmen caprino, em nome dos Doutores José Ferreira Nunes e Cristiane Clemente de Mello Salgueiro pela concessão da água de coco em pó (ACP 106) e à Intervet pela água ultra-pura utilizada no preparo do diluidor. Além disso, agradecemos ao Médico Veterinário M.Sc. Daniel Couto Uchoa (Canil Grande Canafístula) pela utilização dos animais para a coleta de sêmen. Referências bibliográficas BUENO, R, COSTA, E.P., GUIMARÃES, J.D., VALENTIM, F.M. Qualidade espermática do sêmen criopreservado de cães. I Efeito do meio diluidor. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. v.53, n.3, p , CARDOSO, R.C.S., SILVA, A.R., SILVA, L.D.M. Determinação da concentração espermática no sêmen de cães Pastores Alemães através da espectrofotometria. Rev. Bras. Reprod. Anim. v.27 (3), p , 2003a. CARDOSO R.C.S., SILVA A.R., UCHOA D.C., SILVA L.D.M. Efeito dos estágios do processo de congelação sobre a qualidade do sêmen canino diluído em solução à base de água de coco. Rev. Bras. Reprod. v.26 (1), p.26-31, 2002 CARDOSO R.C.S., SILVA A.R., UCHOA D.C., SILVA L.D.M. Cryopreservation of canine semen using a coconut water extender with egg yolk and three different glycerol concentrations. Theriogenology, v. 59, p , 2003b. CARDOSO, R.C.S., SILVA, A.R., SILVA, L.D.M. Use of the alternative extender powder coconut water (PCW 106 ) for canine semen freezing. In: INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON CANINE AND FELINE REPRODUCTION, 5, 2004, São Paulo. Abstracts Book...São Paulo, 2004, p.96-97, Resumo. COLAS, G. Effect of initial freezing temperature, addtion of glycerol and dilution rate on the survival and fertilizing ability of deep-frozen ram semen, J. Reprod. Fertil. v.42, p , CHRISTIANSEN, Ib.J. Reprodução no cão e no gato. São Paulo:Manole,363p, 1986 (mudar para 1988). DOBRINSKI, I., LULAI, C., BARTH, A.D., POST, K. Effects of four different extenders and three different freezing rates on post-thaw viability of dog semen. J. Reprod. Fertil. v.47(suppl), p , 1993.

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78 77 Tabela 1. Média e desvio padrão das características físicas e morfológicas da fração espermática dos ejaculados caninos (n=12) Parâmetros Média ± desvio padrão Motilidade (%) 95,25? 0,79 Vigor (0-5) 5,00? 0,00 Volume (ml) 1,18 ± 0,49 Concentração espermática 1607,50 ± 727,70 (x 10 6 espermatozóides/ml) Alterações de cabeça (%) 14,56 ± 4,50 primárias 1,05 ± 1,24 secundárias 13,51 ± 4,82 Alterações de peça intermediária (%) 1,53 ± 0,94 primárias 0,40 ± 0,52 secundárias 1,13 ± 0,91 Alterações de cauda (%) 6,43± 2,95 primárias 0,10 ± 0,32 secundárias 6,33 ± 2,98 Alterações totais (%) 22,24 ± 8,54 Tabela 2. Média e desvio padrão da motilidade e vigor do sêmen canino congelado com um diluidor á base de água de coco em pó (ACP 106 ) em dois métodos diferentes de diluição. ACP DILUIÇÃO Motilidade (%) Vigor (0-5) ACP CONCENT ACP DILUIÇÃO ACP CONCENT Fresco 95,23 ± 3,63ª A 95,23 ± 3,63ª A 5,0 ± 0,0 aa 5,0 ± 0,0 aa Diluição inicial 95,67 ± 4,03ª A 94,85 ± 3,91ª A 4,96 ± 0,14ª A 4,71 ± 0,40ª A Resfriamento 91,25 ± 4,33 ba 89,62 ± 4,77 ba 4,58 ± 0,36 ba 4,29 ± 0,45 ba Adição de glicerol 79,17 ± 10,62 ca 81,15± 8,70 ca 4,0 ± 0,60 ca 3,75 ± 0,45 ca Descongelação 55,0 ± 18,34 da 45,39± 13,91 da 3,58 ± 0,47 ca 3,08 ± 0,67 da ACP CONCENT = ACP CONCENTRAÇÃO (concentração de 200 x 10 6 espermatozóides/ml); ACP DILUIÇÃO (diluição constante de uma parte de sêmen:uma parte de diluidor ). a,b,c,d Letras minúsculas diferentes na mesma coluna implicam em diferença significativa (P<0,05). Letras maiúsculas diferentes na mesma linha implicam em diferença significativa entre os tratamentos.

79 78 Percentual (%) a a a a Concentração Diluição 5 a a 0 Cabeça Peça intermediária Cauda Figura 1. Percentual de alterações morfológicas do sêmen canino congelado em ACP-106 a uma concentração de 200 x 10 6 espermatozóides/ml (ACP CONCENTRAÇÃO) e a uma diluição constante de 1:1 (ACP DILUIÇÃO). Letras diferentes implicam em diferença significativa (P< 0,05) entre os métodos de diluição. 40 a Concentração Percentual (%) a a a Diluição 0 Primárias Secundárias Figura 2. Percentual de alterações morfológicas primárias e secundárias do do sêmen canino congelado em ACP-106 a uma concentração de 200 x 10 6 espermatozóides/ml (ACP CONCENTRAÇÃO) e a uma diluição constante de 1:1 (ACP DILUIÇÃO). Letras diferentes implicam em diferença significativa (P< 0,05) entre os métodos de diluição.

80 79 Use of the powder coconut water (ACP-106 ) as an alternative extender for canine semen freezing R. C. S. Cardoso 1 ; A. R. Silva 1, L. D. M. Silva 1 1 Laboratory of Carnivore Reproduction PPGCV/UECE, Paranjana 1700, Itaperi, Fortaleza- Ceará, , Brazil. Corresponding author: R. C. S. Cardoso: Major Weyne 662 Jardim América, , Fortaleza Ceará, Brazil. Phone: , Fax: ; address: cardosorcs@yahoo.com.br Article type: Biotechnology Running title: Use of ACP-106 for canine semen freezing

81 80 Abstract This study aimed to test the efficiency of powdered coconut water (ACP ) as an alternative extender for canine semen freezing. Ejaculates from six dogs were collected by manual stimulation and evaluated grossly and microscopically. Semen was divided into two aliquots, one for in natura coconut water (NCW) and another for powder coconut water (ACP-106 ). Semen was initially extended with A-fraction (room temperature/27 C) at a proportion of one part semen:half part extender (1: ½). Extenders containing 20% egg yolk was used for this initial dilution in both groups. After dilution, the semen was cooled for 40 minutes in a thermal box (15 C) and for 30 minutes in a refrigerator (4 C). The other half of the extender (B-fraction) containing egg yolk and glycerol (12%) was added to semen in both groups. Subsequently, the final concentration of glycerol in the extender was 6%. Ejaculates were frozen in 0.25 ml straws 5 cm above the surface of liquid nitrogen and stored at -196 C. After one week, straws were thawed at 37 C for 1 minute and the microscopic criteria were evaluated. Both extenders were efficient in conserving sperm motility, vigor and morphology after freezing/thawing processes. Results showed that ACP-106 can be used as a new option for canine semen freezing. However, further in vivo studies must be conducted to test its efficiency. Keywords: canine, semen, freezing, coconut water, ACP.

82 81 1. Introduction The goal of using extenders when freezing semen is to minimize the damages resulting from the process, maximizing the recovery of viable spermatozoa. For this reason, scientific research has been carried out in an attempt to improve different protocols for this procedure by using different cryoprotective agents, freezing/thawing processes, and a large number of extenders, such as lactose, Pipes, Tes and Tris, which is the most extensively used extender for canine semen conservation (England, 1993; Silva et al., 2002,2003). Other authors have been trying to develop alternative non-toxic, isotonic, buffering, low cost, practical and effective extenders. Recently, it has been shown that fresh coconut water (in natura) is an effective extender for freezing canine semen (Cardoso et al., 2003). However, the use of this extender presents some disadvantages such as the impossibility to store the coconut water for long periods of time and limited availability of fruits around the world. Furthermore, biochemical constitution of one coconut can be very different from another, and this can directly affect the ability of the solution to preserve spermatozoa. Thus, studies were conducted aiming at developing the powdered coconut water, registered under the brand name ACP, and that has already been tested for goat (Salgueiro et al., 2002), stallion (Sampaio Neto et al., 2002) and canine semen (Cardoso et al., 2004). After reconstitution, the biochemical characteristics of ACP are very similar to those of fresh coconut water. The product is easily stored before use, and the powder can be readily sent to regions where fresh coconuts are not available. In addition, the composition of this extender is standardized, since it is obtained from fruits of the same plantation. ACP has been approved for different animal species, and it is registered under the number ACP-106 for dogs. This study was conducted to compare powdered coconut water (ACP ) with fresh coconut water-based extender, known to be effective for freezing canine semen.

83 82 2. Materials and methods 2.1 Animals Six proven stud dogs from private kennels were selected for this experiment: one Brazilian Mastiff, one Doberman, one American Staffordshire Terrier, one Rottweiler and two Boxers, aged 1 to 6 years. The animals were kept in individual boxes and fed with dry food once daily, with free access to water. 2.2 Semen collection and evaluation Each dog was submitted to two seminal collections by manual stimulation. Ejaculates were collected into a sterile glass tube connected to a funnel and fractions were separated by color modification (Johnston et al., 2001). The sperm-rich fraction was evaluated and later individually frozen. Semen volume and color were grossly evaluated. Sperm motility (percentage of mobile spermatozoa) and vigor (sperm motility status), scored on a scale from 0 (without movement) to 5 (fast progressive movement), were evaluated by light microscopy (100x) (Johnston et al., 2001). Sperm morphology was evaluated by microscopic analysis (1000x) of a slide stained with eosin-nigrosin, counting 200 cells per slide (Johnston et al.; 2001). Sperm concentration was determined by Neubauer counting chamber (Johnston et al., 2001). Only samples that presented a volume > 0.6 ml, concentration > 200 x 10 6 spermatozoa/ml, sperm motility > 80% and vigor > 4 were used in the study Semen extension Semen samples were submitted to a volume:volume extension based on a proportion of one part semen to one part extender (1:1). Initially, samples were divided into two aliquots, which were diluted in one of the two different media to be tested. The first one was a solution based

84 83 on in natura coconut water (NCW Cardoso et al., 2003), constituted by 50% coconut water, 25% ultra-pure water and 25% anhydrous monosodium citrate solution (5%). The second one was powder coconut water (ACP Biotecnologia, Fortaleza-Ceará, Brazil) that was prepared according to the manufacturer's recommendation. ACP was obtained by an atomization process in a Spray Dryer (Salgueiro et al., 2002) Semen freezing Semen was frozen by adding the A-fraction of the extender to the semen at room temperature immediately after the initial analysis. The final dilution was, therefore, one part semen: one part extender dilution, the A-fraction was added to semen at a one part semen to a half part extender ratio (1:0.5). A cooling period was then allowed when the semen was stored in a sealed tube and placed in a beaker of water in a thermal box (15 C) for 40 minutes. The semen was then transferred to a refrigerator for a further 30 min, where it reached 4 C. At the end of this time period, another half part of extender containing glycerol (B-fraction) was divided into three equal parts and added to the sample three times at 5 minutes intervals. After this dilution, the final glycerol concentration in the extender was 6%. Sperm was packaged in 0.25 ml plastic straws and frozen in nitrogen vapor (5 cm above surface of liquid nitrogen) before being plunged into the liquid nitrogen (-196 C). After one week, samples were thawed in a water bath for 1 minute at 37 C for microscopic evaluation. Twenty four straws were obtained for each dilution method, that is, two straws for replicate (n = 12). 2.5 Statistical analysis The results were expressed as means and standard deviations and were analyzed using the Statview 5.0 software (SAS Institute Inc., Cary, NY, USA). Differences among the seminal parameters of dogs were analyzed by the Kruskal-Wallis test. Sperm motility (%) and

85 84 morphology (%) were transformed to arcsine. The effects of extenders on sperm motility and morphology, as well as the effects of the incubation period on motility were evaluated by the Student t test (P<0.05). The same effects on vigor were analyzed by the Mann-Whitney test (P<0.05). 3. Results Fresh canine semen has a white milky appearance. The volume of the sperm-rich fraction was 1.20 ± 0.50mL, with a sperm concentration of 1.60 ± 0.7 x 10 9 spermatozoa/ml. Sperm motility was ± 0.85%, and vigor was 5.0 ± 0.6. Morphologically normal spermatozoa rate was ± 5.07 %. Statistical analysis demonstrated the population of dogs was homogeneous, since no differences were detected among the samples (P > 0.05). Fig. 1 and 2 show similar patterns of sperm motility and vigor for the use of NCW and ACP throughout each of the evaluation stages. After thawing, a reduction in the seminal parameters was seen for both treatments, with significant differences at each evaluation stage (P < 0.05), except for initial dilution. Table 1 shows the evaluation of sperm morphology prior and after freezing/thawing. A significant reduction in the proportion of morphologically normal spermatozoa was seen after thawing for both extenders (P<0.05), but there was no difference between them. Tail defects were the most frequently observed (P<0.05). 4. Discussion Several protocols have been developed for canine semen freezing and researchers are always trying to develop more practical and less expensive methods. The fresh coconut water extender (Nunes, 1995) was proven to be effective for freezing canine semen (Cardoso et al., 2003), but the solution could not be stored for more than two days (data not published).

86 85 Therefore, a powdered form of coconut water (ACP ) was developed, and has already been tested for goat (Salgueiro et al., 2002), and stallion semen (Sampaio Neto et al., 2002). Other studies on cryopreservation of dog semen using ACP (Cardoso et al., 2004, Silva et al., 2004) have also been published. A reduction in motility and vigor was seen in both groups from cooling up to thawing, except for vigor (P>0.05), when it was compared glycerol addition and thawing stages. Silva et al. (2001) and Cardoso et al. (2002) reported a similar reduction in seminal parameters during freezing the stages. Our findings agree with those of Zalewski and Andersen Berg (1983), who found that no damage occurred during dilution. The post-thaw sperm motility and vigor observed for both extenders were within the optimum range for insemination (Concannon & Battista, 1989), and were similar to those reported in previous studies using coconut water extender (Cardoso et al., 2003) and Tris (Silva et al, 2002, 2003). In addition, the percentage of normal spermatozoa after thawing was different from fresh semen for both extenders, but the frozen-thawed semen was considered as being of good quality (Jonhston et al., 2001). The reduction in sperm motility and vigor observed with all extenders after thawing may also be associated to a greater incidence of detached heads and coiled tails, because the larger the number of sperm abnormalities, the lower the sperm motility (Morton e Bruce, 1989). Oéttle (1993) reported that normal morphology values below 60% adversely affect fertility rates. Burgess et al. (2001) reported decreased numbers of live spermatozoa after freeze-thawing, with more marked significant increases in acrosomal defects after freeze-thawing than after cooling. This finding suggests that freeze-thawing either causes immediate damage or exacerbates the damage already caused by cooling (Burgess et al., 2001). These findings are in agreement with those of Rodrigues-Martinez et al. (1993) and Ström Holst et al. (1998),

87 86 who reported that freeze-thawing changed the morphology of sperm, including swelling of the acrosome. Although there was no difference between ejaculates, an effect of the dog was correlated to post-thaw sperm motility, and there was an interaction between dog and extender. The significant effect of the dog on post-thaw sperm motility confirms the suitability of using ejaculates from different dogs in a repeated measurement experimental design (Steel e Torrie, 1980). A spray drier was used to produce the powdered form of coconut water. After spray-drying, coconut water retains its functional properties and can still be used as an extender. The product was standardized for a ph 6.6 and mosmol/l, ideal for canine semen (Johnston et al., 2001). However, ACP has the disadvantage of not allowing complete dissolution of egg yolk in the solution, resulting in higher content of debris that could possibly affect sperm motility (Hirai et al., 1997). In conclusion, ACP-106 can be successfully used for freezing canine semen as an alternative extender in locations where coconuts are not readily available. ACP 106 is more practical to be used for freezing canine semen when compared to NCW. In addition, further in vitro and mainly in vivo studies are needed to prove the efficiency of ACP 106 for the canine species. 6. References Burgess CM, Bredl JCS, Plummer JM, England GCW Vital and ultrastructural changes in dog spermatozoa during cryopreservation. J Reprod Fertil Suppl, 57: Cardoso RCS, Silva AR, Silva LDM. Use of the alternative extender powder coconut water (PCW 106 ) for canine semen freezing. In abstracts of International Symposium on Canine and Feline Reproduction, 2004, São Paulo, Brazil, São Paulo: pp

88 87 Cardoso RCS, Silva AR, Uchoa DC, Silva LDM Efeito dos estágios do processo de congelação sobre a qualidade do sêmen canino diluído em solução à base de água de coco. Rev Bras Reprod, 26 (1): Cardoso RCS, Silva AR, Uchoa DC, Silva LDM Cryopreservation of canine semen using a coconut water extender with egg yolk and three different glycerol concentrations. Theriogenology, 59: Concannon PW, Battista M. Canine semen freezing and artificial insemination In: Kirk RW (Ed), Current Veterinary Therapy X: Small Animal Practice. Philadelphia, USA: WB Saunders. pp England GCW Cryopreservation of dog semen: a review. J Reprod Fertil, 47: Hirai M, Cerbito WA, Wijaiagunawardane MPB, Braun J, Leidl W, Ohosaki K, Matsuzawa T, Miyazawa K, Sato K. 1997: The effect of viscosity of semen diluents on motility of bull spermatozoa. Theriogenology 47, Johnston SD, Kustritz MVR, Olson PNS Canine and feline theriogenology. 1.ed. Philadelphia, USA: W.B. Saunders. pp Morton DB, Bruce SG Semen evaluation, cryopreservation and factors relevant to the use of frozen semen in dogs. J Reprod Fertil, 39: Oettlé EE Sperm morphology and fertility in the dog. J Reprod Fertil, 47: Rodrigues-Martinez H, Ekwall H, Linde-Forsberg C Fine structure and elemental composition of fresh and frozen dog spermatozoa. J Reprod and Fertil Suppl, 33: 77-82, Salgueiro CCM, Nunes JF, Oliveira, KPL. Vieira VL, Gondim JM, Mateos-Rex E Utilization of extenders based on coconut water in natura and in powder on the does artificial insemination at fixed time. Braz. J Reprod Anim; 5: Sampaio Neto JC, Salgueiro CCM, Mateos-Rex E, Nunes JF. Utilization of ACP 105 extender in the refrigeration of stallion semen Braz J Anim Reprod, 5:

89 88 Silva AR, Cardoso RCS, Uchoa DC, Silva LDM Efeito das etapas do processo de criopreservação sobre a qualidade do sêmen canino diluído em tampão tris. Rev Bras Reprod Anim, 25: Silva AR, Cardoso RCS, Uchoa DC, Silva LDM Effect of Tris-buffer, egg yolk and glycerol on canine semen freezing. The Vet J, 164: Silva AR, Cardoso RCS, Uchoa DC, Silva LDM Quality of canine semen submitted to single or fractioned glycerol addition during the freezing process. Theriogenology,, 59: Silva AR, Cardoso RCS, Silva LDM. Comparison between powder coconut water (PCW106 ) and tris buffer as extenders for canine semen cryopreservation. In abstracts of International Symposium on Canine and Feline Reproduction, 2004, São Paulo, Brazil, São Paulo: pp Steel RGD, Torrie JH. Principles and procedures of statistics a biometrical approach ed. Singapore: McGraw Hill. Ström Holst B, Rota A, Andersen Berg K, Linde-Forsberg C, Rodrigues-Martinez H Canine sperm head damage after freezing-thawing: ultrastructural evaluation and content of selected elements. Reprod Dom Anim, 33: Nunes JF Utilização da água de coco como diluidor do sêmen de caprinos e ovinos. Ciência Animal, 7: Zalewski W, Andersen Berg K Acrossomal damage caused by processing of frozen semen from the silver fox (Vulpes argentus) and the blue fox (Alopex lagopus). Zuchthygiene, 18:

90 89 5. Acknowledgements The authors thank Dr. José Ferreira Nunes and Dr. Cristiane Clemente de Melo Salgueiro for providing ACP-106, DVM DC Uchoa for providing the animals and Intervet for providing ultra-pure water for extenders prepare. This research was supported by CNPq (Research Nacional Council/Conselho Nacional de Pesquisa). RCS Cardoso and AR Silva are supported by grants from CAPES, and LDM Silva by grant from CNPq. 6. List of abbreviations ACP - powdered coconut water NCW - in natura coconut water Table 1: Sperm morphology observed in canine fresh and frozen-thawed semen submitted to extension with fresh/in natura coconut water (NCW) or powder coconut water (ACP-106 ) Sperm morphology (%) Extenders Fresh Semen NCW ACP 106 Normal sperm 77.5 ± 5.1 a 71.4 ± 6.4 b 70.7 ± 9.0 b Head abnormalities 13.5 ± 5.3 a 10.7 ± 5.1 a 9.0 ± 5.5 a Midpiece abnormalities 1.9 ± 1.4 a 2.8 ± 1.6 a 2.4 ± 1.9 a Tail abnormalities 8.9 ± 4.7 a 15.2 ± 3.8 a 17.9 ± 5.7 a Values in the same column followed by different superscripts are significantly different (P < 0.05; Student s t test)

91 Sperm motility (%) Fr Ext Cool Glyc Thaw NCW ACP 106 Evaluation stages Figure 1: Sperm motility of fresh (Fr), extended (Ext), cooled (Cool), glycerol-supplemented (Glyc) and frozen/thawed (Thaw) semen extended with fresh/in natura (NCW) or powder coconut water (ACP P > 0.05; Student s t test). Sperm vigor (0-5) 5 4,5 4 3,5 NCW ACP Fr Ext Cool Glyc Thaw Evaluation stages Figure 2: Sperm vigor of fresh (Fr), extended (Ext), cooled (Cool), glycerol-supplemented (Glyc) and frozen/thawed (thaw) semen extended with fresh/in natura (NCW) or powder coconut water (ACP P > 0.05; Mann-Whitney test).

92 91 7. CAPÍTULO 2 EFEITO DO ARMAZENAMENTO A -10 C DO DILUIDOR ACP- 106 E DA DILUIÇÃO PÓS-DESCONGELAÇÃO SOBRE A QUALIDADE DO SÊMEN CANINO CONGELADO (Effect of storage at 10 C of the ACP-106 extender and post-thaw dilution on the quality of frozen canine semen) Ciência Rural, submetido para publicação

93 92 Efeito do armazenamento a 10 C do diluidor ACP 106 e da diluição pós-descongelação sobre a qualidade do sêmen canino congelado (Effect of storage at 10 C of the ACP 106 extender and post-thaw dilution on quality of frozen canine semen) Rita de Cássia Soares Cardoso 1*, Alexandre Rodrigues Silva 1 and Lúcia Daniel Machado da Silva 1 Resumo O objetivo do presente estudo foi comparar a eficiência da água de coco na forma de pó (ACP 106) preparado no momento da congelação (grupo-não armazenado) e àquele armazenado na forma congelada (grupo-armazenado). Além disso, objetivou-se avaliar o efeito da diluição pós-descongelação (taxas de 1:0 e 1:4) sobre a longevidade espermática. Foram coletados dez ejaculados oriundos de cinco animais através da manipulação digital. A fração espermática foi inicialmente diluída à temperatura ambiente (27 C) utilizando as soluções fresca e congelada, ambas contendo 20% de gema de ovo. Após a diluição, o sêmen foi submetido ao resfriamento, diluído em ACP 106-gema de ovo-glicerol, congelado em vapores de nitrogênio e armazenado em nitrogênio líquido (-196 C). Após uma semana, as amostras foram descongeladas e submetidas às avaliações de motilidade espermática progressiva, morfologia, status acrossomal, integridade funcional de membrana (Teste hipoosmótico- HOST) e termorresistência. Com relação à motilidadeespermática pós-descongelação, não foi observada diferença entre os diluidores nem entre as taxas de diluição pós-descongelação, exceto por uma maior motilidade aos 90 minutos no grupo usando ACP 106 armazenado e a uma taxa de diluição 1:4. A taxa de espermatozóides e acrossomas normais (sêmen fresco e congelado-descongelado) durante 60 minutos de incubação foi similar para os grupos não 1. Laboratory of Carnivore Reproduction, State University of Ceará, Fortaleza-Ceará, Brazil * Corresponding author: Major Weyne 662 Jardim América, , Fortaleza Ceará, Brazil.

94 93 armazenado e armazenado. Uma redução significativa (P < 0.05) na funcionalidade de membrana espermática foi observada após a descongelação para o grupo com ACP 106 não armazenado (53.6 ± 9.3%) e armazenado (53.1 ± 17.1%), mas não houve diferenças entre eles. O armazenamento a -10 C não diminuiu a eficiência do ACP 106 para a criopreservação de sêmen canino. A diluição pós-descongelação não influencia a sobrevivência espermática pós-descongelação, mas este procedimento melhora a avaliação da motilidade por diminuir a viscosidade no diluidor. Abstract The aim of present study was to compare the efficiency of powder coconut water (ACP 106) prepared at the moment of freezing (non stored group) and the one stored in a frozen form (stored group). Moreover, this study aimed to evaluate the effect of post-thaw sperm dilution (1:0 and 1:4 rates) on the sperm longevity. Ten ejaculates were collected from five dogs by digital manipulation. The sperm-rich fraction was initially extended at room temperature (27 C) using a non stored and stored solution containing 20% egg yolk. After dilution, the semen was submitted to cooling, diluted in ACP 106-egg yolk-glycerol, frozen in nitrogen vapor and stored in liquid nitrogen (-196 C). After one week, samples were thawed and submitted to evaluations of progressive sperm motility, morphology, acrosomal status, functional integrity of membrane (hypoosmotic test-host) and thermoresistance tests. Regarding post-thaw motility, there was no difference between extenders either post-thaw dilution rates, except for group using stored ACP 106; where it was observed a higher motility for 1:4 dilution rate at 90 minutes. Normal sperm and acrosome rates (fresh and frozen-thawed semen) during 60 minutes incubation were similar for non-stored and stored ACP 106. A significant reduction (P < 0.05) in sperm membrane functionality was found after thawing for non-stored (53.6 ± 9.3%) and stored (53.1 ± 17.1%) ACP 106 but no Tel ; address: cardosorcs@yahoo.com.br

95 94 differences were observed between them. The storage at 10 C did not decrease the efficiency of ACP 106 for canine semen cryopreservation. Post-thaw dilution did not influence the posthaw survival, but this procedure improves the evaluation of sperm motility for decrease viscosity in the extender. Introduction The cryopreservation of canine semen has been significantly increased since SEAGER (1969) reported the first pregnancy using frozen dog semen. Since then, researchers tried to develop new extenders and methods or more commonly improve the protocols used for other species. Lactose, pipes and Tris had been used for other species and methods using this extenders were efficient for canine semen freezing (ENGLAND, 1993; SILVA et al., 2002, 2003). Coconut water extender had been developed for goat semen (NUNES, 1995) and it was adapted for canine semen (CARDOSO et al., 2003, 2005). Recently, coconut water in a powder form (ACP ) was developed since it was impossible to storage it for more than two days (data not published). For canine semen, powder coconut water is named ACP 106 and resulted in good values for post-thaw sperm motility (CARDOSO et al., 2004). However, it is necessary to improve the protocol for ACP 106 in some aspects to provide a method more practical. One of these features consists in the extender storage method since most of extenders are stored in a frozen form. Tris, witch is one of the most used extender for canine semen can be stored in a frozen form, being warmed at the moment of freezing (PEÑA et al 1998). Regarding ACP, it is prepared a fresh solution to each freezing because it is not known the effect of freezing on ACP efficiency.

96 95 Moreover, it is important to check the effect of post-thaw dilution on canine semen. This procedure can reduce the toxic effects of glycerol and egg yolk since the thaw medium contains additional metabolizable substrate and buffering capacity (ROTA et al., 1997, 1998). Moreover this is a lack of information about this effect on canine semen (PEÑA AND LINDE-FORSBERG, 2000). These authors reported that the highest post-thaw dilution rate evaluated (1:4) resulted in a higher sperm longevity. The aim of the present work was to compare powder coconut water (ACP 106) prepared at the moment of freezing and the one stored in a frozen form. Moreover, this study aimed to evaluate the effect of post-thaw sperm dilution at two different rates (1:0, 1:4) on the post-thaw sperm longevity. Material and Methods Animals Five proven stud Boxer dogs, aged from one to six years, from a private kennel were selected for this experiment. The animals were maintained in individual boxes and fed dry food once daily, with free access to water. Extenders ACP 106 (ACP Biotecnologia, Fortaleza-Ceará, Brazil) was prepared according to the manufacturer's recommendation. This solution was stored at -10 C. At the moment of freezing, it was rewarmed and for the other group, a fresh solution was prepared for each freezing process. For both groups, the ACP 106 solution was divided into two fractions. The A-fraction extender consisted of stock solution containing 20% egg yolk. The B-fraction was

97 96 prepared from A but containing 12% glycerol (v/v). The ph and osmolarity of ACP without egg yolk and glycerol was standardized for ph 6.6 and 300mOsm/L respectively. Semen collection and processing Each dog was submitted to two seminal collections by manual stimulation. Ejaculates (N=10 replicates) were frozen at a 1:1 dilution rate. After the initial analysis, the A-fraction was added to semen at one part semen to a half part extender ratio (1:0.5) at room temperature (27 C). A cooling period was then allowed when the semen was stored in a sealed tube and placed in a beaker of water in a thermal box (15 C) for 40 min. The semen was then transferred to a refrigerator for a further 30 min, where it reached 4 C. At the end of this time period, another half part of extender containing glycerol (B-fraction) was divided into three equal parts and added to the sample three times at 5 min intervals. After this dilution, the final glycerol concentration in the extender was 6%. Sperm was packaged in 0.25 ml plastic straws and frozen in nitrogen vapor (5 cm above surface of liquid nitrogen) before being plunged into the liquid nitrogen (-196 C). After 1 week, samples were thawed in a water bath for 1 min at 37 C. Twenty straws were obtained for each group, that is, two straws for replicate (n= 10). Sperm dilution After collection, two aliquots of fresh semen were diluted in non-stored and stored ACP 106 at a 1:4 dilution rate and kept at 37 C in water bath for evaluation. Frozen-thawed semen was diluted at a 1:0 and 1:4 dilution rate. For group using non-stored ACP 106, it was prepared a new extender and for group using the one frozen stored, it was used a rewarmed (37 C) solution for post-thaw dilution.

98 97 Semen evaluation Sperm concentration Sperm concentration was measured by counting in a Neubauer chamber. Sperm motility Sperm motility (%) was assessed using light microscopy (100x magnification). Spermatozoal longevity (thermoresistance test) was verified in fresh and frozen-thawed semen. Semen was kept at 37 C in water bath and motility was evaluated at 0, 30, 60, 90 e 120 minutes after dilution. Sperm morphology and acrosomal status Sperm cell morphology and acrosomal status were evaluated by phase-contrast microscopy (1000x) analyzing a slide stained with Bengal Rose (RODRIGUES, 1997), counting 200 cells per slide. Acrosome was classified as normal, detached, lost or presenting cysts, swelling or abnormal distribution (OETTLÉ, 1993). Normal sperm rate and acrosomal status were evaluated immediately after collection and 60 minutes pos-dilution. In frozen thawed semen, analysis was performed immediately after thaw and after 60 min only in 1:4 diluted samples. Hypo-osmotic swelling test (HOST) For the evaluation of sperm membrane function, a HOST (England and Plummer, 1993) was performed for fresh and frozen-thawed semen. A hypo-osmotic solution at 150 mosm/l, constituted by 7.35g sodium citrate plus 13.51g fructose dissolved in 1000mL distilled water was used. After collection and immediately after thawing, 0.01mL semen was diluted in 0.09mL hypo-osmotic solution and kept in a water bath at 37ºC. After 45 min, 200

99 98 spermatozoa were counted and the ones presenting swollen coiled tails were considered as presenting a functional sperm membrane (ENGLAND AND PLUMMER, 1993). Statistical analysis The data were expressed as mean and standard deviation and were analyzed by the Statview 5.0 software (SAS Institute Inc., 1998). Percentage data were subjected to arcsine transformation. The effects of the extender storage on progressive sperm motility, morphology, acrosome integrity and HOST as well as the effects of post thawing dilutions and incubation period on sperm motility and morphology were evaluated by the Student s t test (P < 0.05). To evaluate dog effect and their interactions with effects of the storage and post thawing dilutions on the variables considered in the study, data were subjected to analysis of variance followed by Fisher s PSLD test (P < 0.05). Presence of correlations among post thaw sperm motility and morphologically normal spermatozoa, normal acrosomes, HOST and sperm motility at 60 and 120 min were analyzed by Spearman s Correlation Test (P < 0.05) only for 1:4 diluted samples using non-stored and stored ACP 106. Results During incubation at 37 C, motility for fresh semen was similar for both extenders (Table 1). After thawing, there was no difference between extenders either post-thaw dilution rates, except for group using stored ACP 106; where it was observed a higher motility for 1:4 dilution rate at 90 minutes (Table 1). Moreover there was a significant decline on motility after thawing (Table 1).

100 99 Normal sperm and acrosome rates (fresh and frozen-thawed semen) during 60 minutes incubation were similar for non-stored and stored ACP 106 (Table 2 and 3). In both extenders, there was not a significant decrease on these parameters immediately after thawing. During post-thaw incubation at 37 C, a significant reduction on normal sperm and acrosome rates at 60 minutes was observed only in the group using stored ACP 106 (Table 2 and 3). Moreover, there was no difference between post-thaw acrosome abnormalities rate, except for a significant increase on absent acrosomes at 60 minutes using stored ACP 106 (Table 3). Regarding HOST, 95.3 ± 2.8% sperm with functional membrane were observed in fresh semen. A significant reduction (P < 0.05) in sperm membrane functionality was found after thawing for both treatments, although no differences were observed between extenders. Values of 53.6 ± 9.3% and 53.1 ± 17.1% normal functional spermatozoa were observed after thawing for non-stored and stored ACP 106, respectively. The effect of the dog was significant on post-thaw sperm normal rate but not on normal acrosome rate. Moreover, this effect was observed on post-thaw sperm motility at 30 and 90 minutes during incubation at 37 C. Regarding post-thaw sperm motility, there was an interaction between dog and kind of extender (stored or non-stored) at 30 and 90 min incubation and an interaction between the extender and dilution rate at 90 min. Using non-stored ACP 106, there was a significant correlation (P<0.05) between HOST after thawing and post-thaw normal sperm rate at 60 minutes incubation (r 2 =73.6%). Furthermore, it was found a significant correlation between motility (post-thaw) at 60 min and at 120 min for non-stored (r 2 =73.9%). and stored ACP 106 (r 2 =67.9%). Discussion This work aimed to test the effect of storage at 10 C on efficiency of ACP 106 for canine semen freezing. There was no difference between stored and non-stored extender regarding

101 100 post-thaw motility and morphology. However it would be of great value to make a biochemical analysis to evaluate the effect of freezing on biochemical constitution. Moreover, it was observed that ACP has the disadvantage to no permit a complete dissolution of egg yolk in the solution, increasing the amount of debris which can affect the sperm motility (HIRAI et al., 1997). Further studies are necessary to check the ideal concentration of egg yolk in this extender. Nevertheless, post-thaw dilution improved the evaluation of sperm motility. Immediately after thaw, motility observed in this study was similar to that reported by Peña and LINDE-FORSBERG (2000) using 1:0 and 1:4 post-thaw dilution rates but these authors found a significant effect of this feature on progressive sperm motility immediately after thaw. Like in the present work, these authors didn t find differences between post-thaw dilutions during 120 minutes incubation. After 60 min incubation, motility in the present work was a little lower than the values reported by ROTA et al., (1997) using a Tris-egg yolk extender. However, PEÑA AND LINDE-FORSBERG (2000) and ROTA et al. (1997) using a Tris-egg yolk extender plus Equex STM paste found a much better longevity post-thawing. Probably, these better results can be influenced by use of Equex STM paste, where these authors reported that both viability and longevity were enhanced by using this substance. The active compound in Equex STM paste is thought to be the detergent SDS, which probably exerts its action through the alteration of the egg yolk contained in the extender (PURSEL et al., 1978). Post-thaw injury to spermatozoa and to other viable cells due to the abrupt removal of glycerol is usually attributed to the occurrence of osmotic shock (FRIM AND MAZUR, 1983, SCHNEIDER and MAZUR, 1984).This osmotic stress would be more pronounced when thawed spermatozoa are further diluted in a glycerol-free medium because it induces an abrupt removal of glycerol from the spermatozoa to reach the equilibrium on both sides of the

102 101 plasma membrane, and, therefore, cells have to accommodate new volumes changes in addition to those suffered during the thawing. However, in this work, it was not observed a significant effect of post-thaw dilution on sperm motility. Although values for post-thaw motility were low after 60 minutes incubation, sperm and acrosome normal rate were still high for stored and non-stored ACP 106 (Table 2 and 3). PEÑA and LINDE-FORSBERG (2000) reported that the osmotic stress after thawing can impair the straight movement of spermatozoa but maintaining intact sperm membranes. Probably the high acrosoma normal rate could be, in part, caused by an inefficacy of Bengal Rose stain to evaluate acrosomal damage. The type of injury to frozen-thawed spermatozoa is characterized by swelling and coiling of the distal end of the sperm tail. The osmotic shock phenomenon can be used as a measurement of sperm behavior to osmotic conditions (CORREA and ZAVOS, 1995). Since osmotic shock involves structural changes on the sperm membrane, its functional status must be evaluated (CORREA and ZAVOS, 1995). For data pooled across extenders (stored and non-stored ACP 106), the tail defects were the most observed. In this experiment, it was evaluated the functional integrity of sperm membrane by hypoosmotic test (HOST). During the HOS test, the biochemically active spermatozoa, when exposed to hypoosmotic stress due to the influx of water, undergoes swelling and subsequently increases in volume to establish an equilibrium between the fluid compartment within the spermatozoon and the extracellular environment (JEYENDRAN et al., 1984). The percentage of functional sperm membrane was approximately 53% for both extenders and these values are close to values for motility immediately after thawing. Maybe, almost all of mobile spermatozoa maintained a functional membrane after freezing-thawing process. The present work found a correlation only between HOST after thawing and post-thaw normal sperm rate at 60 minutes incubation using non-stored ACP and motility (post-thaw)

103 102 at 60 min and at 120 min for non-stored and stored ACP 106. OETTLÉ (1986) observed that motility of dog spermatozoa during cooling and after freezing does not correlate well with acrosomal integrity. The significant effects of dog upon the post-thaw sperm motility (30 and 90 min incubation) and sperm normal rate confirm the suitability of using ejaculates from different dogs as subjects in a repeated measurement experimental design (STEEL E TORRIE, 1980). Conclusion The storage at 10 C did not decrease the efficiency of ACP 106 for canine semen cryopreservation. The ACP 106 storage in a frozen form would provide a more practical freezing protocol. Post-thaw dilution did not influence the pos-thaw survival during incubation at 37 C, but this procedure improves the evaluation of sperm motility for decrease viscosity in the extender. Acknowledgments The authors thank Dr. José Ferreira Nunes and Dr. Cristiane Clemente de Melo Salgueiro for providing ACP 106, DVM DC Uchoa for providing the animals and Intervet for providing ultra-pure water for extenders prepare. This research was supported by CNPq (Research Nacional Council/Conselho Nacional de Pesquisa). RCS Cardoso and AR Silva are supported by grants from CAPES, and LDM Silva by grant from CNPq. References CARDOSO, R.C.S. et al. Comparison of two dilution rates on canine semen quality after cryopreservation in a coconut water extender. Animal Reproduction Science, in press, CARDOSO, R.C.S.; SILVA, A.R.; SILVA, L.D.M. Use of the alternative extender powder coconut water (PCW 106 ) for canine semen freezing, Embu das Artes, SP. In: INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON CANINE AND FELINE REPRODUCTION, 5., 2004, SP. Proceedings...São Paulo, 2004, p

104 103 CARDOSO R.C.S. et al. Cryopreservation of canine semen using a coconut water extender with egg yolk and three different glycerol concentrations. Theriogenology, v.59, p , CORREA, J.R.; ZAVOS PM. Frozen-thawed bovine spermatozoa diluted by slow or rapid dilution method: measurements on occurrence of osmotic shock and sperm viability. Theriogenology,v.44, p , ENGLAND, G. C. W. Cryopreservation of dog semen: a review. J. Reprod. Fert. Suppl., v.47, p , ENGLAND, G.C.W.; PLUMMER, J.M. Hypo-osmotic swelling of dog spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility Supplement, v.47, p , FRIM, J.; MAZUR, P. Interactions of cooling rate, warming rate, glycerol concentration, and dilution procedure on the viability of frozen-thawed human granulocytes. Cryobiology, v.20, p , HIRAI, M. et al. The effect of viscosity of semen diluents on motility of bull spermatozoa. Theriogenology, v.47, p , JEYENDRAN, R.S. et al. Development of an assay to asses the functional integrity of the human sperm membrane and its relationship to other semen characteristics. Journal of Reproduction and Fertility, v.70, p , OETTLE, E.E. Changes in acrosome morphology during cooling and freezing of dog semen. Anim Reprod Sci, v.12, p , OETTLÉ, E. E. Sperm morphology and fertility in the dog. Journal of Reproduction and Fertility Supplemment,.v.47, p , PEÑA, A.I et al. Effect of different glycerol treatments on frozen-thawed dog sperm longevity and acrossomal integrity. Theriogenology,v.50, p , 1998.

105 104 PEÑA, A., LINDE-FORSBERG, C. Effects of spermatozoal concentration and post-thaw dilution rate on survival after thawing of dog spermatozoa. Theriogenology, v.54, p , PURSEL, V.G. et al. Effect of Orvus ES Paste on acrosome morphology, motility and fertilizing capacity of frozen-thawed boar sperm. J Anim Sci, v.47, p , RODRIGUES, B. A. Efeito do diluidor à base de albumina sérica bovina (BSA) sobre a viabilidade in vitro do sêmen canino criopreservado f. Dissertação (Mestrado em Reprodução Animal), Universidade Federal do Rio Grande do Sul. ROTA, A. et al. Effects of Equex STM Paste on viability of frozen-thawed dog spermatozoa during in vitro incubation at 38 C. Theriogenology, v.47, p , ROTA, A. et al. Cryosurvival of dog spermatozoa at different glycerol concentrations and freezing-thawing rates. Reproduction in Domestic Animals, v.33, p , SCHNEIDER, V. MAZUR, P. Osmotic consequences of cryoprotectant permeability and its relation to the survival of frozen-thawed embryos. Theriogenology, v.21, p.68-79, SEAGER, S.W.J. Successful pregnancies utilizing frozen dog semen. A. I. Digest, v.17, p. 6-7, SILVA, A.R. et al. Effect of Tris-buffer, egg yolk and glycerol on canine semen freezing. The Vet J, v.164, p , SILVA, A.R. et al. Quality of canine semen submitted to single or fractioned glycerol addition during the freezing process. Theriogenology, v.59, p , STEEL, R.G.D.; TORRIE, J.H. Principles and procedures of statistics a biometrical approach. Singapore: McGraw Hill, 2.ed

106 105 Table 1. Sperm motility (%) of non-stored and frozen-thawed canine semen using non-stored or stored ACP 106 during incubation at 37 C for 120 minutes Time Non-stored * Fresh semen Stored * Frozen-thawed semen Non-stored ACP 106 Stored ACP 106 ACP 106 ACP 106 1:0 1:4 1:0 1: ± 2.9 Aa 94.2 ± 2.9 Aa 59.0 ± 12.9 Ba 63.0 ± 11.6 Ba 58.0 ± 17,5 Ba 58.5 ± 17.3 Ba ± 4.6 Ab 82.0 ± 10.1 Ab 37.0 ± 17.7 Ba 34.0 ± 14.3 Bb 37.0 ± 20,6 Bb 39.6 ± 21.7 Ba ± 21.4 Ac 64.5 ± 25.9 Abc 15.0 ± 17.6 Bb 13.0 ± 10.3 Bc 8.7 ± 13.6 Bc 18.6 ± 17.5 Bb ± 23.3 Ad 33.3 ± 23.4 Acd 6.0 ± 10.8 Bc 5.5 ± 12.6 Bd 0.1 ± 0.3 Bd 11.1 ± 15.2 ABc ± 31.4 Ad 39.0 ± 30.4 Ad 1.0 ± 3.2 Bc 2.6 ± 6.3 Bd 0.0 ± 0.0 Bd 2.0 ± 3.5 Bd * Diluted one part semen to four parts extender (1:4) A,B Values followed by different capital letters differ between columns (P < Student s t test); a,b,c,d Values followed by different lower case letters differ between rows (P < Student s t test);

107 106 Table 2. Sperm morphology (%) of fresh and frozen-thawed canine semen using non-stored or stored ACP 106 during incubation at 37 C for 60 minutes Fresh semen Frozen-thawed semen Non-stored Stored Non-stored Stored ACP 106 * ACP 106 * ACP 106 * ACP 106 * 0 ' 60 ' 0 ' 60 ' 0 ' 60 ' 0 ' 60 ' Normal sperm 95.0 ± 4.9 A 83.7 ± 19.4 AB 95.0 ± 4.9 A 92.1 ± 4.3 A 92.0 ± 2.9 AB 87.6 ± 6.5 B 93.7 ± 2.2 A 90.6 ± 3.4 B Abnormalities Head 3.0 ± 3.9 AB 2.4 ± 2.1 AB 3.0 ± 3.9 AB 3.4 ± 2.7 AB 2.0 ± 2.0 A 3.6 ± 2.2 AB 1.9 ± 1.4 A 2.4 ± 2.1 B Midpiece 0.3 ± 0.4 A 0.6 ± 0.7 A 0.3 ± 0.4 A 0.5 ± 0.5 A 0.6 ± 0.6 A 0.2 ± 0.4 A 0.3 ± 0.3 A 0.4 ± 0.4 A Tail 1.6 ± 1.1 A 13.0 ± 18.2 BC 1.6 ± 1.1 A 3.9 ± 2.2 B 4.9 ± 2.2 BC 8.1 ± 4.8 C 4.0 ± 2.8 B 4.5 ± 3.1BC Total 5.0 ± 4.9 A 16.3 ± 19.4 AB 5.0 ± 4.9 A 7.9 ± 4.4 AB 8.0 ± 2.9 AB 12.4 ± 6.5 B 6.3 ± 2.2 A 9.4 ± 3.4 B * Diluted one part semen to four parts extender (1:4) A,B C Values followed by different capital letters differ between columns (P < Student s t test).

108 107 Table 3. Acrosomal status (%) of frozen-thawed canine semen using non-stored or frozen-rewarmed ACP 106, under dilution of one part semen to four parts extender (1:4). Fresh semen Frozen-thawed semen Acrosome Non-stored * Stored * Non-stored ACP 106 Stored ACP 106 ACP 106 ACP ' 60 ' 0 ' 60 ' 0 ' 60 ' 0 ' 60 ' Normal 99.7 ± 0.6 A 98.9 ± 1.8 A 99.7 ± 0.6 A 98.8 ± 1.8 A ± 1.87A ± 2.06AB ± 1.09A ± 2.28B Absent 0.0 ± 0.0 A 0.0 ± 0.0 A 0.0 ± 0.0 A 0.1 ± 0.2 A 0.00 ± 0.00A 0.47 ± 1.31A 0.09 ± 0.18A 0.65 ± 0.54B Swollen 0.1 ± 0.2A 0.4 ± 0.7AB 0.1 ± 0.2A 0.4 ± 0.7AB 0.20 ± 0.26AB 0.41 ± 0.32B 0.42 ± 0.59AB 0.52 ± 0.52AB Breakaged 0.2 ± 0.6A 0.5 ± 0.9AB 0.2 ± 0.6A 0.7 ± 1.8AB 0.71 ± 1.75AB 1.19 ± 1.37B 0.54 ± 0.76AB 1.40 ± 1.68B Cystic 0.0 ± 0.0A 0.2 ± 0.4AB 0.0 ± 0.0A 0.1 ± 0.3AB 0.33 ± 0.88AB 0.45 ± 0.79AB 0.15 ± 0.24AB 0.46 ± 0.59B Abnormal 0.1 ± 0.3 A 0.2 ± 0.7AB 0.1 ± 0.3A 0.0 ± 0.0AB 0.00 ± 0.00AB 0.00 ± 0.00B 0.00 ± 0.00AB 0.10 ± 0.30AB * Diluted one part semen to four parts extender (1:4) A,B Values followed by different capital letters differ between columns (P < Student s t test);

109 CAPÍTULO 3 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL FERTILIZANTE DE ESPERMATOZÓIDES CANINOS CONGELADOS- DESCONGELADOS COM ACP-106 UTILIZANDO O TESTE IN VITRO DE INTERAÇÃO ESPERMATOZÓIDE-OÓCITO (Evaluation of in vitro fertilizing potential of frozen-thawed dog spermatozoa diluted in ACP-106 using an in vitro sperm-oocyte interaction assay) Reproduction in Domestic Animals, artigo submetido para publicação

110 109 Evaluation of fertilizing potential of frozen-thawed dog spermatozoa diluted in ACP 106 using an in vitro sperm-oocyte interaction assay Rita de Cássia S. Cardoso a, Alexandre R. Silva a, Lúcia D. M. Silva a, Viviane H. Chirinéa b, Fabiana F. Sousa c, Maria D. Lopes b a Laboratory of Carnivore Reproduction FAVET, UECE, Paranjana 1700, Itaperi, , Fortaleza, Ceará, Brazil b Laboratory of Reproduction of Small and Wild Animals Department of Animal Reproduction and Veterinary Radiology, FMVZ, UNESP, Distrito de Rubião Júnior, , Botucatu, São Paulo, Brazil. c Laboratory of Animal Reproduction - UNIRP, Rod. BR 153, Km 69, São José do Rio Preto, São Paulo, Brazil Abridged title: Evaluation of frozen dog semen using a gametes interaction assay

111 110 Contents The aim of present study was to evaluate frozen canine semen with ACP 106 using an in vitro sperm-oocyte interaction assay (SOIA). Ten ejaculates from five stud dogs were diluted in ACP 106 containing 20% egg yolk, submitted to cooling in a thermal box for 40 minutes and in a refrigerator for 30 minutes. After this period, a second dilution was performed using ACP 106 containing 20% egg yolk and 12% glycerol. Samples were thawed at 38 C for 1 minute. Post-thaw motility was evaluated by light microscopy and by using a computer aided semen analysis (CASA). Plasma membrane integrity and sperm morphology/acrosomal status were evaluated by fluorescent probes (C-FDA/PI) and Bengal Rose, respectively. Moreover, frozen-thawed semen was analyzed by a sperm-oocyte interaction assay. Subjective post-thaw motility was 52.0 ± 14.8% and it was significant higher than the total motility estimated by CASA (23.0 ± 14.8%) because this system considered the egg yolk debris as immotile spermatozoa. Although normal sperm rate and acrosomal integrity evaluated by Bengal Rose stain was 89.6 ± 3.1 and 94.3 ± 3.1%, respectively, post-thaw percentage of intact plasma membrane was only 35.1 ± 14.3%. Regarding SOIA, the percentage of interacted oocytes (bound, penetrated and bound and/or penetrated) was 75.3%. Using regression analysis, it was found significant relations between some CASA patterns and data for SOIA. In conclusion, the freezing-thawing procedure using ACP 106 was efficient for maintain the in vitro fertility potential of dog spermatozoa.

112 111 Introduction Despite the widespread use of conventional semen analysis under light microscopy in which semen samples are analyzed for characteristics of motility, morphology and concentration, the method is subjective and may be unreliable (Linford et al. 1976). The ultimate functional test is the ability of the spermatozoon to fertilize the oocyte. The oocyte penetration assay is a more rapid test of spermatozoal function than in vitro fertilization since simply assesses the presence of decondensing spermatozoal heads within the oocyte (Hewitt and England, 1997). Tests to determine the capacity of spermatozoa to bind and penetrate intact zona pellucida or hemizonae have been applied in the canine species (Hay et al. 1997; Mayenco-Aguirre and Pérez Cortés, 1998, Ström-Holst et al. 2001). The results suggest that these tests are useful for evaluating canine sperm function (Ström- Holst et al. 2001). In vitro methods for the prediction of the fertilizing potential of a semen sample are important both when developing new methods for cool storage or deep freezing of semen and when evaluating the fertility of an individual male. Protocols for canine semen freezing had been evaluated by sperm-oocyte interactions test (Ivanova et al. 1999, Ström Holst et al. 2000a). Cryopreservation of canine semen using powder coconut water (ACP 106) extender had only been evaluated by gross evaluation and the post-thaw values for these characteristics were acceptable for artificial insemination (Cardoso et al. 2004). ACP 106 can be another alternative for canine semen freezing as it presents good extender characteristics such as atoxicity, isotonicity, buffering system and elements necessary for sperm metabolism. However, other more accurate methods are necessary to check the efficiency of ACP 106,

113 112 since a combination of tests measuring different aspects of sperm function provides information about several different sperm characteristics required for fertilization. The commercialization of ACP 106 will take place earlier if its efficiency is confirmed. The aim of present study was to evaluate the functional status of cryopreserved dog spermatozoa that had been frozen in ACP 106 extender by means of sperm-oocyte interaction assay. Material and Methods Semen collection and evaluation of ejaculates Semen was collected by manual stimulation twice from five dogs of different breeds (one Brazilian Mastiff and four Boxers), aged one to six years, from a private kennel. Each dog selected for experiment presented sperm motility of = 80%, = 20% of sperm defects, as estimated subjectively using light microscopy (100x). Sperm concentration was measured using a Neubauer counting chamber and should be > 200 x 10 6 spermatozoa/ml. Sperm freezing ACP 106 (ACP Produtos Biotecnológicos, Fortaleza-Ceará, Brazil) was prepared according to the manufacturer's recommendation. This solution was stored at -10 C and at the moment of freezing, it was rewarmed. The ACP 106 solution was divided into two fractions. The A-fraction extender consisted of stock solution containing 20% egg yolk. The B-fraction was prepared from A but containing 12% glycerol (v/v). The ph and osmolarity of ACP without egg yolk and glycerol was standardized for ph 6.6 and 300mOsm/L respectively.

114 113 After the initial analysis, semen was initially extended in ACP 106 (A-fraction) at room temperature (27ºC). A cooling period was then allowed when the semen was stored in a sealed tube and placed in a beaker full of water in a thermal box (15 C) for 40 min. The semen was then transferred to a refrigerator for a further 30 min, where it reached 4 C. At the end of this time period, another part of extender containing glycerol (B-fraction) was divided into three equal parts and added to the sample three times at 5 min intervals. After this dilution, the final glycerol concentration in the extender was 6% and the final dilution provided a sperm concentration of 200 x 10 6 spermatozoa/ml. Sperm was packaged in 0.25 ml plastic straws and frozen in nitrogen vapor (5 cm above surface of liquid nitrogen) before being plunged into the liquid nitrogen (-196 C). After 15 days, samples were transferred to a dry-shipper and transported to another laboratory for further analyses. Immediately before evaluations, samples were thawed in a water bath at 38 ºC for 1 minute. Computer aided semen analysis (CASA) The Hamilton-Thorne computer-aided semen analyzer, version 10 Ivos (HTR analyzer, Hamilton-Thorne Research, Beverly, MA, USA), validated for dog semen analysis (Iguer-Ouada and Verstegen, 2001), was used to objectively assess motility parameters. After thawing, semen samples (10µL) were mounted on a Makler chamber and allowed to settle 1 min before the analysis at 38ºC by a phase-contrast microcopy system with stroboscopic illumination, which was a compound of the HTR analyzer. Three different, non-consecutive, randomly selected microscopic fields were scanned by the Ivos 10. The data were computerized and mean ± SD values generated. The following parameters were measured for each sample: the number of counted cells; the percentage of total motile spermatozoa; the percentage of progressive motile spermatozoa; velocity average pathway (VAP) - the average velocity of smoothed cell path in

115 114 µm/sec; the velocity straight line (VSL) - the average velocity measured in a straight line from the beginning to the end of track in µm/sec; the curvilinear velocity (VCL) the average velocity measured over the actual point-to-point track followed by the cell in µm/sec; the amplitude lateral head (ALH) amplitude of lateral head displacement in µm; the beat cross frequency (BCF) frequency of sperm head crossing the sperm average path in Hertz; the straightness (STR) the average value of the ratio VSL/VAP in percentage (straightness estimates the proximity of the cell path to a straight line, with 100% corresponding to the optimal straightness); and the linearity (LIN) the average value of the ratio VSL/VCL in percentage (linearity estimates the proximity of the cell track to a straight line). According to low VAP cut-off (LVV) and medium VAP cut-off (MVV), the overall sperm population was subdivided in 4 categories: Rapid, with VAP > MVV; Medium, with (LVV < VAP < MVV); Slow, with VAP < LVV; and Static, constituted by the fraction of all cells which are not moving during the analysis. Plasma membrane integrity Sperm membrane integrity was assessed using 6-carboxy- fluorescein diacetate (C- FDA) and propidium iodide (PI), as described by Rota et al. (1997). Thawed semen (10µL) was diluted with staining medium (40 µl) and incubated for ten minutes. A 5 µl of stained suspension was placed on a slide and covered with a coverslip and the fields were observed with epifluorescence microscopy (LEICA Episcopic Fluorescent Attachment EFA Halogen Lamp Set, Sweden). For each sample stained with C-FDA/PI, 200 sperm cells were counted and classified as having (stained in green with C-FDA and unstained with PI ) or not (stained partial or totally in red with PI) an intact plasmalemma. Sperm morphology

116 115 Sperm morphology was evaluated by phase-contrast microscopy (1000x) analyzing a slide stained with Bengal Rose, counting 200 cells per slide. Sperm morphologic abnormalities were classified as primary and secondary (Silva et al. in press). Sperm-oocyte interaction assay (SOIA) Oocyte preparation Ovaries were obtained from 22 bitches of unknown age or cycle stage and collected after ovariohysterectomies and transported to the laboratory in warm saline (38 C) within 2 h of surgery. Ovaries (n=44) were dissected from the tracts in sterile saline plus gentamicine, washed and placed in sterile 35mm gridded dishes with 10 ml Phosphate Buffer Saline (PBS) containing 0.4% w/v bovine serum albumin (BSA). Oocytes were recovered from the ovarian cortex by slicing finely the ovary with a scapel (#22 blade). After removal of debris, the dish was analyzed under a stereomicroscope and Cumulus-oocyte complexes with a uniformly dark ooplasm, an intact zona pellucida and a multilayered cumulus cell mass (Grade 1) were selected for experiment. Selected oocytes were washed five times in PBS and transferred to 95µL droplets (10ova/droplet) of TALP containing 0.3% w/v BSA. Droplets (n=3) were overlaid with mineral oil equilibrated with sterile saline and maintained at 38 C for 30 minutes under humidified atmosphere containing 5% CO2 before co-incubation with sperm (Hay et al. 1997). Sperm preparation Semen samples were thawed (38 C) and evaluated for sperm motility. Spermatozoa were washed at room temperature, suspended in TALP (1:1) and centrifuged at 700G/5min. The supernatant was discarded and sperm pellet was adjusted at 40 x 10 6 motile cells/ml by dilution in Sperm-TALP.

117 116 Sperm oocyte binding and penetration assay Sperm suspension (5µL) was added to the oocytes in each droplet of TALP to create a final volume of 100µL, resulting in a final concentration of 2 x 10 6 motile sperm/ml. A minimum of 30 oocytes (3 droplets) was used per replicate. The droplets with spermatozoa and oocytes were incubated for 18h at 38ºC under humidified atmosphere containing 5%CO2 and 95% air. After incubation, the oocytes were washed in PBS plus BSA and transferred to 1% sodium citrate solution for 10 min at room temperature to expand cumulus cell and then vortexed for 3 min to detach cumulus cells, aiming to facilitate the observation of spermatozoa that had firmly bound to the zona pellucida or had penetrate the ooplasm. For staining both bound and penetrated sperm heads, oocytes were transferred to Hoechst in 2.3% Na-citrate (100µL/mL) for 20 minutes. Stained oocytes were placed on a clean slide and sandwiched with a coverslip supported by silicon to prevent damage to the oocytes (Hay et al. 1997). The counts were made under fluorescent examination (LEIKA Episcopic Fluorescent Attachment EFA Halogen Lamp Set /400x, Sweden) to identify the percentage of oocyte with spermatozoa bound to the zona pelucida, oocyte penetrated by spermatozoa into the perivitelline space or ooplasm, and the number of spermatozoa bound plus penetrated to the oocytes. From these data, it was calculated the percentage of oocytes bound or penetrated by spermatozoa and the percentage of oocytes interacted to spermatozoa (bound and/or penetrated). Statistical analysis Ten replicates were used in this study. Sperm cell characteristics and data for zona pellucida binding assay were reported as means ± SD and analyzed by the Statview 5.0 software (SAS Institute Inc., Cary, 1998). A simple linear regression model was applied to identify the correlations between sperm-oocyte interactions and sperm parameters, which

118 117 were considered as independent variables. A Spearman correlation test was applied to verify correlations among results of sperm motility evaluated by light microscopy and CASA. Probabilities < 0.05 were considered significant. Percentage data were Arcsine transformed. Differences regarding sperm populations and plasma membrane integrity were verified by Student s t test (P<0.05). The existence of a dog effect on all the parameters studied was verified by analysis of variance followed by Fisher s PLSD test (P<0.05). Results The overall characteristics of fresh semen were: ± x 10 6 spermatozoa/ml concentration, percentage of sperm motility ranged from 90 to 100% (97.5 ± 3.5) and the proportion of morphologically normal spermatozoa was 92.5 ± 3.4%. There was no difference among dogs in sperm characteristics before freezing. Post-thaw sperm quality patterns are shown in Table 1. Sperm motility patterns were subjectively evaluated by light microscopy (400x) and by CASA (Hamilton Thorne Analyzer IVOS 10). Unfortunately, CASA was not so accurate for the analysis of frozen-thawed canine semen using ACP 106. Although the subjective motility was correlated with total motility determined by CASA, the latter was significant lower than the first (Student s t test, P< 0.05). Moreover, a significant higher percentage of static sperm population was observed and this had not observed on subjective evaluation. It was sometimes necessary to dilute the sample with saline (1:1) because viscosity was too high and the CASA could not perform the analysis. Regarding plasma membrane integrity (Table 1), the percentage of non-intact spermatozoa was significant higher than the intact ones (P = 0.01). The group of non-intact spermatozoa included those with a damaged plasmalemma but intact acrosoma, when the

119 118 acrosome stained green with C-FDA but the post-acrosomal region stained red with PI, and those that had both a damaged plasmalemma and a damaged acrosomal membrane, when the cells remained unstained with C-FDA but stained red with PI (Rota et al. 1997). Sperm abnormalities were represented mainly by secondary defects (damaged acrosomes and coiled tails). For sperm-oocyte interaction assay, 5.71 ± 2.21 ovaries were used for each replicate. The number of oocytes obtained from each ovary ranged from 0 to 103. A total of 1247 oocytes were evaluated, from those 710 of them were Grade 1 and 30 Grade 1 oocytes were used for each frozen-thawed semen sample. The data for SOIA are shown in figures 1 and 2. We found significant relationships between sperm parameters and SOIA data, as shown in Table 2. Moreover, an effect of the individual dog was observed on VAP values (P=0.04). Discussion Evaluation of frozen-thawed semen with ACP 106 by CASA presented some problems. We believed that total and progressive motility were underestimated since we observed a higher motility by subjective analysis. This fact can be explained in the following way. It was observed that egg yolk is not totally dissolved when ACP is used, increasing the amount of debris that can be recognized by CASA as immotile spermatozoa. Hirai et al. (1997) described the effect of the egg yolk percentage on the viscosity of extenders and motility of spermatozoa evaluated by using a computer-assisted system. These authors reported that any factor that changes the pattern of sperm motion could affect parameters like the percentage of progressively motile spermatozoa. It is well established that the viscosity in the medium surrounding the spermatozoa affects the pattern of sperm motion (Amman and Hammerstedt, 1980). Hirai et al. (1997) demonstrated that the addition of egg yolk could alter

120 119 the movement pattern of spermatozoa, and increasing amounts of egg yolk in the extender decrease the velocity of progressively motile spermatozoa in frozen-thawed bull semen. Moreover, they reported that this increase in the amount of egg yolk did not improve the accuracy of computer-detected false spermatozoa, which were actually egg yolk particles or debris. Verstegen et al. (2002) suggested that the extender used to dilute semen must not contain particles of a size similar to sperm cells heads (e.g., non-clarified egg yolk and whole milk extenders), because they will not be differentiated from non-motile sperm. Others authors, however, reported that this problem can be solved by a solved by a special software feature that can make an identification of tail-structures in immotile spermatozoa, reducing the number of false sperms (Hirai et al. 1997). Nevertheless, Hirai et al. (1997) used an analysis system that is different from the one used in our study. Further studies are necessary to determine the ideal concentration of egg yolk in ACP 106 extender or to test methods that can reduce or minimize the amount of egg yolk debris in the extender. Regarding other motion patterns evaluated by CASA, we observed a high mean ALH, which could suggest that the motile spermatozoa exhibited a hyperactivation movement, as reported by Peña and Linde-Forsberg (2000a). VAP, VCL and VSL values were lower than the one reported by Peña and Linde-Forsberg (2000a), possibly due the low number of motile cells that were counted. Our results of plasma membrane integrity after thawing (35.1%) were lower than the one reported by Ström et al. (1997), Rota et al. (1997) and Peña and Linde-Forsberg (2000b). Using the same fluorescent probes (C-FDA and PI), these authors found approximately 74%, 56% and 64%, respectively, of intact plasma membranes immediately post-thawing. The plasma membrane integrity reflects sperm viability and the cryopreservation process damages this membrane (Cormier et al. 1996, Correa et al. 1996). Cryopreservation can causes irreversible damages to the plasma membrane and lead to cell death (Holt, 2000) or to

121 120 changes similar to those seen during sperm capacitation in the surviving spermatozoa, shortening their lifetime (Pérez et al. 1996, Watson, 2000). These changes are caused by a process named cryocapacitation (Cormier and Baley, 2003). Similarities between capacitated and cryopreserved spermatozoa have been demonstrated regarding plasma membrane reorganization and fluidization and calcium influx (Green and Watson, 2001). Plasma membrane integrity and function are essential for cell viability, as the selective permeability of the plasma membrane maintains intracellular metabolic activities, ph and ionic composition. In the sperm cell, a functional plasma membrane is also essential for the events leading to fusion with the oocyte (Curry and Watson, 1996). It is important to determine the possible causes for a low percentage of intact plasma membrane. We found a high ALH that could indicate a hyperactivation movement and this is a sperm feature indicative of capacitation (Peña, 2004). Evidence about the involvement of reactive oxygen species (ROS) on sperm capacitation has accumulated (Medeiros et al. 2002). An increased generation of ROS may be a component of capacitation-like alterations observed in cryopreserved semen (Medeiros et al. 2002). There is a substance named indol-3-acetic acid (IAA) on coconut water (Nunes, 1995). Although its toxic effects are unknown, reactive oxygen species can be formed after peroxidation and produce citotoxic substances (Pires de Melo et al. 1997). The effects of ROS are prevented or diminished by the detoxifying enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase, peroxidases (GPx and PHGPx), and by reducing agents, such as glutathione, ascorbic acid, taurine and hypotaurine, present in the sperm cell and sperm environment (Hinton et al. 1995, Lapoint et al. 2000). Regarding sperm morphology, secondary defects were observed most often, and are considered to be less harmful to fertility than primary defects, although they represent transient response to stress. It is obvious that a large proportion of spermatozoa with reflexed mid-piece or coiled and bent tails will compromise motility and fertility (Peña, 2004).

122 121 Although the percentage of sperm membrane integrity was low (35.1%), the normal sperm rate evaluated by Rose Bengal stain was high (89.6%), meaning that this evaluation should not be used alone. Conventional staining methods for light microscopy are not suitable for the assessment of cryopreserved spermatozoa because glycerol and egg yolk, essential ingredients in most cryopreservation media for dog spermatozoa, interfere with most fixatives used in differential staining. The use of fluorescent dyes has overcome this problem, as fluorescent stained sperm can be used in assessing functional and morphological aspects without interference of the extracelullar media (Peña, 2004). The zona pellucida binding assay has been used for dog sperm evaluation (Hay et al. 1997, Ström Holst et al. 2000a,b). We used a methodology similar to Hay et al. (1997), but we found approximately 15% of penetrated oocytes while their values were approximately 70%. However, these authors considered penetrated oocytes when spermatozoa were bound to zona pellucida and or entered the ooplasm. When we put together the two categories in what we called interacted, our results were similar to them. Ström Holst et al. (2000a) obtained 84 and 89% for oocytes with spermatozoa bound to zona pellucida after gentle and tough washing of the sperm oocyte complexes, respectively. We found some significant relationships between CASA patterns and data for SOIA. However, it is important to emphasize that total and progressive motility was underestimated by CASA as previous reported. Thus, the use of CASA patterns (total and progressive motility) as a predictor of sperm-oocyte interactions using frozen-thawed semen with ACP 106 is not suitable. Nevertheless, we can consider the normal acrossome rate as a prognostic value for the number of spermatozoa that penetrate the ZP in vitro. Canine semen freezing using ACP 106 was previously evaluated using only subjective motility and gross morphology (Cardoso et al. 2004). These analyses showed that ACP 106 is efficient for canine semen freezing. However, damage to associated molecular

123 122 binding structures cannot be detected using routine morphological techniques (Ström Holst et al. 2000a). Therefore, the ability of the spermatozoon to bind to the zona pellucida is a potentially valuable test when evaluating techniques for chilling and freeze thawing semen (Ström Holst et al. 2000a). In spite of the low percentage of intact plasma membrane, good results were obtained in the present work (75%) for sperm-oocyte interactions (oocytes bound, penetrated and bound and/or penetrated by spermatozoa). It has been suggested that both acrosome-intact and acrosome-reacted spermatozoa are capable of binding to the ZP in the canine species (Kawakami et al. 1993). In conclusion, the freezing-thawing procedure using ACP 106 was efficient in maintaining the in vitro fertility potential of dog spermatozoa. References Amman RP, Hammertedt RH, 1980: Validation of a system for computerized measurements of spermatozoal velocity and percentage of motile sperm. Biology of Reproduction 2, Cardoso RCS, Silva AR, Uchoa DC, Silva LDM, 2004: Use of the alternative extender powder coconut water (PCW 106 ) for canine semen freezing. In: International symposium on canine and feline reproduction, 5, 2004, São Paulo. Abstracts Book...São Paulo, 2004, Cormier N, Sirard MA, Bailey JL, 1996: Premature capacitation of bovine spermatozoa is initiated by cryopreservation. J. Androl. 18, Cormier N, Bailey JL, 2003: A differential mechanism is involved during heparin- and cryopreservation-induced capacitation. Biol. Reprod. 69,

124 123 Correa JR, Rodriguez MC, Patterson DJ, Zavos PM, 1996: Thawing and processing of cryopreserved bovine spermatozoa at various temperatures and their effects on sperm viability. Theriogenology 46, Curry MR, Watson PF, 1995: Sperm structure and function. In: Grudzinskas JG, Yovich JL (eds), Gametes - The Spermatozoon. Cambridge University Press, pp Green CE, Watson PF, 2001: Comparison of the capacitation-like state of cooled boar spermatozoa with true capacitation. Reproduction 122, Hay MA, King WA, Gartley CJ, Leibo SP, Goodrowe KL, 1997: Canine spermatozoa cryopreservation and evaluation of gamete interaction. Theriogenology 48, Hewitt DA, England GCW, 1997: The canine oocyte penetration assay; its use as an indicator of dog spermatozoal performance in vitro. Anim. Reprod. Sci. 50, Hinton BT, Palladino MA, Rudolph D, Labus JC, 1995: The epididymis as protector of maturing spermatozoa. Reprod Fertil Dev 7, Hirai M, Cerbito WA, Wijaiagunawardane MPB, Braun J, Leidl W, Ohosaki K, Matsuzawa T, Miyazawa K, Sato K, 1997: The effect of viscosity of semen diluents on motility of bull spermatozoa. Theriogenology 47, Holt W V, 2000: Basic aspects of frozen storage of semen. Anim. Reprod. Sci. 62, Ivanova M, Mollova M, Ivanova-Kicheva MG, Petrov M, Djarkova Ts, Somlev B, 1999: Effect of cryopreservation on zona-binding capacity of canine spermatozoa in vitro. Theriogenology 52, Kawakami E, Vandervoot C, Mahi-Brown CA, Overstreet JW, 1993: Induction of acrosome reactions of canine sperm by homologous zona pellucida. Biol. Reprod. 48, Lapoint S, Bilodeau JF, Lemieux D, Asselin E, Fortier MA, Sirard MA, 2000: Epithelial and stromal uterine cells cultured in vitro protect bovine sperm from hydrogen peroxide. Theriogenology 54,

125 124 Linford E, Glover FA, Bishop C, Stewart DL, 1976: The relationship between semen evaluation methods and fertility in the bull. J. Reprod. Fert. 47, Mayenco-Aguirre AM, Pérez Cortés AB, 1998: Preliminary results of hemizona assay (HZA) as a fertility test for canine spermatozoa. Theriogenology 50, Medeiros CMO, Forell F, Oliveira ATD, Rodrigues JL, 2002: Current status of sperm cryopreservation: why isn t it better? Theriogenology 57, Peña AI, Canine fresh and cryopreserved semen evaluation. Anim. Reprod. Sci , Peña A, Linde-Forsberg, C, 2000a: Effects of Equex, one-or two- step dilution, and two freezing rates on post-thaw survival of dog spermatozoa. Theriogenology 54, Peña A, Linde-Forsberg, C, 2000b: Effects of spermatozoal concentration and post-thaw dilution rate on survival after thawing of dog spermatozoa. Theriogenology 54, Pérez LJ, Valcárcel A, de las Heras MA, Moses D, Baldasarre H, 1996: Evidence that frozen/thawed ram spermatozoa show accelerated capacitation in vitro as assessed by Chlortetracycline assay.theriogenology 46, Pires de Melo M, Curi TCP, Curi R, 1997: Peroxidase activity may play a role in the citotoxic effect of indol acetic acid. Photoch. Photobiol. 65, Rota A, Ström B, Linde-Forsberg C, Rodriguez-Martinez H, 1997: Effects of Equex STM Paste on viability of frozen-thawed dog spermatozoa during in vitro incubation at 38 C. Theriogenology 47, Silva AR, Cardoso RCS, Silva LDM. Influence of temperature during glycerol addition and post-thaw dilution on the quality of canine frozen semen. Reprod. Dom. Anim. in press. Ström Holst B, Larsson B, Rodriguez-Martinez H, Lagerstedt AS, Linde-Forsberg C, 2001: Prediction of the Oocyte Recovery Rate in the Bitch. J. Vet. Med. A 48,

126 125 Ström Holst B, Larsson B, Linde-Forsberg C, Rodriguez-Martinez H, 2000a: Evaluation of chilled and frozen thawed canine spermatozoa using a zona pellucida binding assay. J. Reprod. Fertil. 119, Ström Holst B, Larsson B, Linde-Forsberg C, Rodriguez-Martinez H, 2000b: Sperm binding capacity and ultrastructure of the zona pellucida of stored canine oocytes. J. Reprod. Fertil. 119, Ström B, Rota A, Linde-Fosberg C, 1997: In vitro characteristics of canine spermatozoa subjected to two methods of cryopreservation. Theriogenology 48, Verstegen J, Iguer-Ouada M, Onklin K, 2002: Computer assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology Watson PF, 2000: The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Anim. Reprod. Sci

127 126 Table 1. Mean ± SD for the sperm quality parameters determined after freezing/thawing using ACP 106 Sperm quality patterns Mean ± SD Range Subjective motility (%) 52.0 ± CASA patterns Number of counted cells (%) ± Total of motile sperm (%) 23.0 ± Progressive motility 18.0 ± VAP (µm/sec) 85.3 ± VSL (µm/sec) 76.9 ± VCL (µm/sec) ± ± ALH (µm) 4.8 ± BCF (Hertz) 20.5 ± Straightness (%) 89.6 ± Linearity (%) 69.8 ± Fast (%) 19.3 ± Medium (%) 3.7 ± Slow (%) 24.3 ± Static (%) 52.6 ± Intact membrane rate (%) * 35.1 ± Normal sperm rate (%) 89.6 ± Acrosomal integrity (%) 94.3 ± VAP: velocity average pathway; VSL: velocity straight line; VCL: curvilinear velocity; ALH: amplitude lateral head; BCF: beat cross frequency; * Evaluation by epifluorescency microscopy.

128 127 Oocytes (%) Bound Penetrated Interacted Figure 1. Percentage of oocytes bound, penetrated and interacted (bound and/or penetrated) by canine spermatozoa after freezing/thawing using ACP 106 (10 replicates).

129 Spermatozoa per oocyte Bound Penetrated Interacted Figure 2. Number of canine spermatozoa per oocyte bound, penetrated and interacted (bound and/or penetrated) to the zona pellucida after freezing/thawing using ACP 106 (10 replicates).

130 129 Table 2. Relationships between (Simple regression model) data for sperm-oocyte interaction assay and results from different sperm parameters (independent variables) Relations P value R value Percentage of bound oocyte vs VCL Percentage of penetrated oocyte vs total motility (CASA) Percentage of penetrated oocyte vs progressive motility (CASA) Percentage of penetrated oocyte vs percentage of rapid (CASA) Number of bound spermatozoa vs VAP Number of bound spermatozoa vs VSL Number of bound spermatozoa vs VCL Number of bound spermatozoa vs normal sperm rate Number of penetrated spermatozoa vs VAP < Number of penetrated spermatozoa vs VSL Number of penetrated spermatozoa vs VCL Number of penetrated spermatozoa vs normal acrosome rate Number of interacted spermatozoa vs VAP < Number of interacted spermatozoa vs VSL < Number of interacted spermatozoa vs VCL

131 CAPÍTULO 4 INTEGRIDADE E MUDANÇAS ULTRA-ESTRUTURAIS NO ESPERMATOZÓIDE CANINO FRESCO E APÓS CRIOPRESERVAÇÃO COM ÁGUA DE COCO EM PÓ (ACP- 106 ) (Integrity and ultrastructural changes in fresh dog spermatozoa and after cryopreservation with powder coconut water ACP-106 )

132 131 Integrity and ultrastructural changes in dog spermatozoa after cryopreservation with powder coconut water (ACP 106) Running title: Ultrastructural changes of frozen dog spermatozoa Rita de Cássia Soares Cardoso 1*, Alexandre Rodrigues Silva 1, Viviane Helena Chirinéa 2, Lúcia Daniel Machado da Silva 1, Maria Denise Lopes 2 1 Laboratory of Carnivore Reproduction FAVET-UECE, Paranjana 1700, Itaperi, , Fortaleza, Ceará, Brazil 2 Laboratory of Reproduction of Small and Wild Animals Department of Animal Reproduction and Veterinary Radiology, FMVZ, UNESP, Distrito de Rubião Júnior, , Botucatu, São Paulo, Brazil. * Corresponding author: Major Weyne 662 Jardim América, , Fortaleza Ceará, Brazil. Tel ; address:

133 132 Abstract The structural details of any sperm morphoanomaly or the extent of membrane damage are best evaluated using the high resolution of transmission electron microscopy. Dog spermatozoa has been cryopreserved with a new extender that is powder coconut water (ACP 106) but the fine appearance of canine spermatozoa after freezing-thawing using this method has not been described. So, this work was aimed to characterize the ultrastructural changes in canine spermatozoa after freezing-thawing using ACP 106 extender. Semen from three dogs was collected by digital manipulation. Samples were extended in ACP 106-egg yolk-glycerol, frozen and stored in liquid nitrogen (-196 C). After thawing (37 C), semen was submitted to evaluation of acrosomal status by Bengal Rose stain, plasma membrane integrity by fluorescent probes (C-FDA/PI) and sperm fine-structural appearance by transmission electronic microscopy (TEM). Evaluation of acrosomal status by light microscopy showed 7.8 % of abnormalities and the fluorescent probes revealed 67.3 % of spermatozoa presented a non-intact plasma membrane. Regarding TEM results, the most postthawing changes observed on plasmalemma were swelling with plicae formation. The ultrastructural acrosoma changes were swelling, vesiculation and loss of contents. The postthawing ultrastructural changes in frozen-thawed dog spermatozoa using ACP 106 extender were similar to previous reports where the methods presented a high fertility rate. We can suggest that ACP 106 might be efficient for freezing of canine semen like other extenders. Key words: spermatozoa, dog, freezing, electronic microscopy.

134 133 Introduction Automated sperm morphometric evaluation has the potential to eliminate several drawbacks inherent to the current methods of sperm morphology evaluation, and allows for the identification of subtle sperm characteristics that cannot be detected by visual light microscopic evaluation. Canine sperm morphology assessment has been previously attempted by means of scanning (SEM) and transmission electron microscopic (TEM) images [1-4]. These studies evaluated mainly the membrane and acrosomal damage that occurred following cryopreservation, elucidating major changes in the acrosomal region after freezing and thawing. The structural details of any sperm morphological anomaly or the extent of membrane damage are best evaluated using the high resolution of transmission electron microscopy [5,2]. The cryopreservation procedures currently used are known to induce a series of osmotic, chemical and mechanical stresses to the sperm cells [6], causing not only the death of some spermatozoa but severe latent damages in the sperm population that survives cryopreservation, compromising the life span and fertilizing capacity of frozen-thawed spermatozoa [7]. Dog spermatozoa have been cryopreserved with a new extender that is powder coconut water (ACP 106) and evaluated for motility, morphology, acrosomal status and oocyte-sperm interaction assay (unpublished data). The protocol for this extender has been improved after new tests were performed. Before improving the cryopreservation method, however, it is important to understand the effects of cryoinjury on the reduction of sperm longevity after thawing. [4]. This study was carried out in order to characterize the type and extent of ultrastructural changes present in canine spermatozoa after freezing-thawing using ACP 106 extender.

135 134 Material and Methods Animals Three proven stud dogs of different breeds, one Brazilian Mastiff and three Boxers, from a private kennel were selected for this experiment. The dogs were aged from one to six years. The animals were maintained in individual boxes and fed dry food once daily, with free access to water. Semen collection and freezing Each dog was submitted to one seminal collection by manual stimulation, and the sperm-rich fraction was used for the experiment. For sperm freezing, it was used ACP 106 extender (ACP Biotecnologia, Fortaleza-Ceará, Brazil) that was prepared according to the manufacturer's recommendation. This solution was stored at -10 C and at the moment of freezing, it was rewarmed. The ACP 106 solution was divided into two fractions. The A- fraction extender consisted of stock solution containing 20% egg yolk. The B-fraction was prepared from A but containing 12% glycerol (v/v). The ph and osmolarity of ACP without egg yolk and glycerol was standardized for ph 6.6 and 300mOsm/L respectively. After the initial analysis, semen was initially extended in ACP 106 (A-fraction) at room temperature (27ºC). A cooling period was then allowed when the semen was stored in a sealed tube and placed in a beaker full of water in a thermal box (15 C) for 40 min. The semen was then transferred to a refrigerator for a further 30 min, where it reached 4 C. At the end of this time period, another part of extender containing glycerol (B-fraction) was divided into three equal parts and added to the sample three times at 5 min intervals. After this dilution, the final glycerol concentration in the extender was 6% and the final dilution provided a sperm concentration of 200 x 10 6 spermatozoa/ml.sperm was packaged in 0.25

136 135 ml plastic straws and frozen in nitrogen vapor (5 cm above surface of liquid nitrogen) before being plunged into the liquid nitrogen (-196 C). After 15 days, samples were transferred to a dry-shipper and transported to another laboratory for further analyses. Immediately before evaluations, samples were thawed in a water bath at 37ºC/1 min. Acrosomal status Post-thawing acrosomal status was evaluated by phase-contrast microscopy (1000x) analyzing a slide stained with Bengal Rose, counting 200 cells per slide. Acrosome was classified as normal, detached, lost, presenting cysts, swelling or abnormal distribution [1]. Plasma membrane integrity Sperm membrane integrity was assessed using 6-carboxy-fluorescein diacetate (C-FDA) and propidium iodide (PI), as described by Rota et al.[8]. Thawed semen (10µL) was diluted with staining medium (40 µl) and incubated for ten minutes at room temperature (23 C). A 5 µl of stained suspension was placed on a slide and covered with a coverslip and the fields were observed with epifluorescence microscopy (LEICA Episcopic Fluorescent Attachment EFA Halogen Lamp Set, Sweden). For each sample stained with C-FDA/PI, 200 sperm cells were counted and classified as having (stained in green with C-FDA and unstained with PI ) or not (stained partial or totally in red with PI) an intact plasmalemma. Semen processing for transmission electron microscopy Semen samples from three dogs (both fresh and frozen-thawed semen) were individually centrifuged at 720G / 5 min. Pellets were extended with 3% glutaraldehyde in phosphate buffer and kept at 5ºC prior to procedure. For transmission electron microscopy, fixed samples were pooled individually for each category (fresh and frozen-thawed semen), post-

137 136 fixed in phosphate buffer plus osmium tetroxide (1%), in acetone solutions and embedded in Araldite. Ultra fine sections (50nm) were obtained and stained with uranyl acetate and lead citrate before examination by a transmission electronic microscope (Philips CM 100, German). Spermatozoa were documented by micrographs and results were subjectively described. Results In fresh samples, most spermatozoa presented a normal appearance (Fig. 1a) but the plasma membrane was often ballooning and had plicae (Fig. 1b). The electron-microscopic examination showed that the spermatozoa subjected to freezing-thawing with ACP 106 presented great changes in their morphology, when compared to fresh semen. After freezing-thawing, the changes observed most often on plasmalemma were swelling with plicae formation (Fig 2.a) and, in most cases, remained apparently intact. Other changes observed were vesiculation (Fig. 2 b-c) and disruption. Regarding the morphological changes in the acrosome, TEM showed swelling (Fig. 2a, 3b), vesiculation (Fig. 2a) and loss of electron-dense acrosomal material (Fig. 3a-b). An acrosomal defect commonly observed was undulated contour (Fig. 2c). Regarding plasma membrane integrity, it was observed a high rate of non-intact sperm plasma membrane (67.3 %). Evaluation by Bengal Rose stain revealed 7.8% of acrossomal abnormalities. Discussion An intact plasma membrane (PM) is a prerequisite for normal sperm function including fertilization [9]. During the cryopreservation process, sperm membranes are

138 137 considered as the principal sites of damage associated with temperature changes [6,7]. The integrity of sperm plasma membrane can be evaluated by hyposmotic test [10], fluorescent probes [11], and scanning and transmission electron microscopy [3]. Although the transmission electron microscopy (TEM) is labor intensive and time consuming, it can also allow detailed examination of the acrosomal status. Bacetti et al. [12] reported that the study of spermatozoon alterations in cases of human infertility has demonstrated that electron microscopy can be a valuable tool in understanding not only the presence but also the nature of the defects. With regards to the integrity of the plasma membrane, most spermatozoa appeared to have an intact membrane in spite of the swelling. According to Hurtgen and Johnson [13], undulating plasma membranes and undulant acrosomes were also a regular acrosomal pattern in fertile stallions, suggesting that these deviations are more due to fixation procedures than to freezing procedures. Chirinéa et al. [14] reported the occurrence of slightly swollen plasmalemma above the acrosomal region observed in fresh canine spermatozoa, and explained that this is a consequence of the semen sample being exposed to glutaraldehyde during fixation procedure for TEM. Moreover, canine spermatozoa suffer several alterations in head region after cryopreservation, but plasmalemma seems to be intact The most important changes after freezing-thawing are related to acrosomal status. Although this experiment did not quantify the abnormalities, the main acrosomal defects were swelling, vesiculation and loss of acrosomal contents. These defects are called capacitationlike changes [15] and could be a result of acrosome reaction [16]. In fact, Rodriguez-Martinez et al. [2] suggested that the alterations found in the fine structural appearance of canine frozen semen could be interpreted as a false acrosomal reaction. The physical change of the acrosome reaction after cryopreservation is an indication that the cell cannot fertilize, even though it may be motile [16]. Similarities between capacitated and cryopreserved

139 138 spermatozoa have been demonstrated regarding plasma membrane reorganization and fluidization and calcium influx [17]. Physiologically, some features can induce acrosome reaction such as intracellular calcium [18], ph [19], inositol triphosphate [20] and dyacilglycerol [21]. Thus, glycerol might be an important feature of the cryopreservation procedures leading to changes in acrosome. Such changes were previously reported for frozen dog spermatozoa [2, 3]. Ström Holst et al. [3] found 89% of swollen acrosomes after freezing-thawing using the CLONE method. Since insemination with spermatozoa that was cryopreserved by this method resulted in high whelping rates, it was suggested that swelling of the acrosoma does not impair fertilization. For frozen-thawed spermatozoa with ACP 106, we can suggest the same explanation since the defects were similar. Moreover, evaluation of frozen-thawed spermatozoa with ACP 106 by oocyte-sperm interaction assay (unpublished data) showed 75% of oocyte-sperm interactions (oocyte bound, penetrated and bound plus penetrated by spermatozoa These acrosomal defects do not impair fertilization, at least in vitro. Since acrosomal swelling might short the cells life span, it is important to detect the ideal moment to perform artificial insemination [22]. Although most of frozen-thawed spermatozoa presented acrosomal defects, evaluation by phase contrast microscopy showed only 7.8 % of acrosomal defects, which has been discussed by Rodriguez-Martinez et al. [2]. The intact membrane might account for low percentages of acrosomal abnormalities usually reported when using phase contrast microscopy alone. Nevertheless, evaluation by fluorescent probes (C-FDA/PI) was more efficient and showed 67.3 % of non-intact membranes. In addition, changes in mid-piece were still observed, as plasmalemma swelling and damages in mitochondrial sheath like content disorganization. Burgess et al. [4] reported a

140 139 slight but not significant increase in the number of spermatozoa with damaged mid-piece membranes after 4 h post-thaw incubation. As reported previously, TEM was a valuable tool in performing a deep analysis of spermatozoa since evaluation by phase contrast was not efficient in making a reliable analysis of the acrosoma. Other authors reported a series of changes after freezing-thawing procedures using different extenders. It was not different for ACP 106 and the changes found were similar to those reported in previous studies. Thus, we can suggest that ACP 106 might be efficient for freezing canine semen like other extenders. However, further in vivo studies are necessary to confirm this hypothesis. Since many spermatozoa presenting acrosomal defects were found, investigations have to be carried out to further improve this protocol. Acknowledgements The authors thank Dr. José Ferreira Nunes and Dr. Cristiane Clemente de Mello Salgueiro for providing ACP 106, DVM DC Uchoa for providing the animals and Intervet for providing ultra-pure water for extenders prepare. This research was supported by CNPq (Research Nacional Council/Conselho Nacional de Pesquisa). RCS Cardoso and AR Silva are supported by grants from CAPES, and LDM Silva by grant from CNPq. References [1]Oettlé EE. Sperm morphology and fertility in the dog. J Reprod Fertil Suppl 1993;47: [2]Rodriguez-Martinez H, Ekwall H, Linde-Forsberg C. Fine structure and elemental composition of fresh and frozen dog spermatozoa. J Reprod Fertil Suppl 1993;47:

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143 142 N (a) (b) A Figure 1. Transmission electron micrographs of fresh dog spermatozoa. N: nucleus; A: acrosoma. (a) Fresh spermatozoa presenting an intact acrosome and a plasmalemma in close apposition with the acrosome (arrow). Magnification 1950X. (b) Spermatozoon presenting a swollen plasmalemma but with an intact acrosoma. Magnification 8400X.

144 143 A A N N E (a) (b) E A N E (c) Figure 2. Transmission electron micrograph of dog spermatozoa after cryopreservation with ACP 106. A: acrosoma; N: nucleus; E: equatorial region. (a) Spermatozoon with a swollen intact plasma membrane with plicae (arrows). The acrosoma is swollen with an undulated contour (white arrow head) and vesiculation (black arrow head). The equatorial region is swollen. Magnification 8400X. (b) Vesiculated plasma membrane (arrows) and releasing of acrosomal contents (arrow heads). Magnification 11500X. (c) Swollen plasma membrane (black arrow) with areas of vesiculation (white arrow). Outer acrosoma membrane presents areas of vesiculation (arrow heads). Equatorial region is intact. Magnification 8400X.

145 144 A A N PM N OM (a) MP (b) E Figure 3. Transmission electron micrograph of dog spermatozoa after cryopreservation with ACP 106. A: acrosoma; N: nucleus; E: equatorial region; PM: plasma membrane; OM: outer acrosome membrane, MP: midpiece. (a) Swollen and intact plasma membrane (arrow). The acrosome is disrupted and the contents are released (arrow heads). Mid-piece presents a plasmalemma swelling and damages in mitochondrial sheath like content disorganization. Magnification 6300X. (b) Plasma membrane, outer (arrow) and inner (arrow heads) acrosome membrane are swollen and with plicae. Equatorial region is intact. Magnification 8400X.

146 DISCUSSÃO GERAL Capítulo I: Comparação da eficiência de dois métodos de diluição na criopreservação do sêmen canino utilizando os diluentes à base de água de coco in natura (ACIN) ou em pó (ACP-106 ) Vários protocolos têm sido desenvolvidos para a congelação de sêmen canino e os pesquisadores estão sempre tentando desenvolver métodos mais práticos e com um menor custo. Uma solução fresca à base de água de coco in natura foi eficaz para a congelação de sêmen da referida espécie (Cardoso et al., 2003), mas esta solução não pode ser armazenada por mais que dois dias (dados não publicados). Portanto, a água de coco em pó (ACP ) foi desenvolvida e já foi testada para o sêmen de caprinos (Salgueiro et al., 2002) e equinos (Sampaio Neto et al., 2002). Para a espécie canina, nenhum trabalho desenvolvido. Como a solução à base de água de coco in natura já era eficiente para a congelação de sêmen canino (Cardoso et al., 2003), era preciso realizar uma comparação entre esta e a água de coco em pó para poder ser, futuramente, usada para a congelação do sêmen da referida espécie. Além disso, há carência de informações sobre alguns aspectos na criopreservação de sêmen canino. Um destes é o efeito da diluição espermática. Os grupos de pesquisa trabalham com o sêmen congelado em diversas concentrações, não se levando em conta que possa haver um efeito da mesma. Este efeito consiste, principalmente, no fato de não se observar a quantidade de glicerol por célula criopreservada. Portanto,objetivou-se comparar uma concentração fixa de 200 x 10 6 /espermatozóides/ml com uma fixa de uma parte de sêmen: uma parte de diluente nos meios à base de água de coco in natura ou em pó (ACP-106 ).

147 146 O método de diluição não afetou a motilidade e o vigor espermático pósdescongelação em ambos os diluentes, mas foi observado que a concentração espermática pode prejudicar a avaliação da motilidade. Foi observado em nosso trabalho que na concentração fixa de 200 x 10 6 /espermatozóides/ml há uma tendência em subestimar a motilidade. Este fato já foi relatado por Garner et al. (2001) que encontraram que a maior parte da dificuldade em avaliar tal parâmetro foi devido a uma considerável variabilidade quando concentrações espermáticas menores foram examinadas. Os resultados deste experimento diferem do encontrado por Peña e Linde- Forsberg (2000b) que, testando a diluição em concentrações espermáticas de 50, 100, 200 e 400 x 10 6 espermatozóides/ml, observou efeito da concentração espermática, encontrando melhores resultados de motilidade progressiva imediatamente após a descongelação com 200x 10 6 espermatozóides/ml. Em nosso trabalho, não testamos diferentes concentrações espermáticas e sim uma concentração fixa de 200x 10 6 espermatozóides/ml e uma diluição a uma taxa constante de 1:1 (sêmen:diluente), sem levar em conta a concentração espermática. Uma vez que a concentração espermática média dos ejaculados foi de 1,6 x 10 9 espermatozóides/ml, para a diluição a uma concentração de 200x 10 6 espermatozóides/ml, foi necessário utilizar um grande volume de diluente. De acordo com Mann (1964), o espermatozóide dos mamíferos responde à diluição excessiva exibindo perda de motilidade e aumento no número de espermatozóides mortos. Por outro lado, a diluição a uma taxa constante, não leva em consideração a concentração espermática, consequentemente havendo variação na quantidade de glicerol/célula. Como a concentração espermática média foi de 1,6 x 10 9 espermatozóides/ml, após a diluição (1:1), esta concentração foi de 800 x 10 6 espermatozóides/ml. Entretanto, é importante lembrar que a concentração espermática variou de 530 a 2760 x 10 6 espermatozóides/ml. Então, após a diluição, este parâmetro variou de 265 a 1370 x 10 6 espermatozóides/ml. Dessa forma, a diluição a uma taxa constante pode levar a uma grande variedade de resultados, mas esta diluição foi escolhida, pois é comumente

148 147 utilizada para a diluição não somente com a solução à base de água de coco (Cardoso et al., 2003b) como em outros diluentes (Silva et al., 2003) para a congelação de sêmen canino. O método de diluição também não afetou o percentual de espermatozóides normais após a descongelação. É provável que uma diluição excessiva altere o metabolismo e até afete a motilidade, mas estas não sejam suficientes para causar tantas anormalidades morfológicas. É importante notar que, em ambos os grupos, o sêmen era de boa qualidade, estando em uma faixa ideal para realização de inseminação artificial (Concannon & Battista, 1989). Ainda há uma carência de informações sobre o efeito da concentração sobre a congelação de sêmen canino. Peña & Linde-Forsberg (2000b) avaliaram os efeitos e interações na congelação de sêmen canino com Tris e utilizando quatro diferentes concentrações espermáticas (50 x 10 6, 100 x 10 6, 200 x 10 6 e 400x 10 6 espermatozóides/ml). No experimento citado, a motilidade espermática variou de 49,7 a 65,0% e o percentual de espermatozóides vivos variou de 55,0 a 63,7%. Estes autores sugerem que espermatozóides caninos congelados em concentrações de 200 x 10 6 espermatozóides/ml e diluídos imediatamente após a descongelação com tampão Tris em taxas de 1:2 ou 1:4 tem uma melhor sobrevivência do que quando congelados em concentrações maiores ou menores. Estudos em outras espécies, especialmente eqüinos, sugerem que a diluição pode ter influência na sobrevivê ncia espermática (Peña & Linde-Forsberg, 2000b). Palacios et al. (1992) relatam uma melhor motilidade pós-descongelação quando espermatozóides eqüinos foram congelados a uma concentração de 800 x 10 6 espermatozóides/ml quando comparados com 100 x 10 6 espermatozóides/ml. Para o sêmen ovino, uma melhor sobrevivência espermática foi observada quando o sêmen foi diluído a uma concentração constante de 900 x 10 6 espermatozóides/ml, onde a quantidade de glicerol permanece constante, do que a uma taxa constante (1:4) quando a quantidade de glicerol poderia ser variável. Isto sugere que o nível ótimo de glicerol

149 148 no sêmen diluído é provavelmente associado a uma concentração final em relação ao espermatozóide (Colas, 1975). No tocante ao sêmen bovino, Garner et al. (2001) relataram que altas diluições são mais prejudiciais à função mitocondrial. Não foi observado um efeito do cão, bem como ejaculado (em cada cão) sobre a qualidade seminal após diluição inicial, resfriamento, adição de glicerol e descongelação. Além disso, não houve uma interação cão x tratamento. Da mesma forma que para a motilidade e o vigor, não foi observado efeito do método de diluição sobre a morfologia espermática (P>0,05). Os grupos foram similares quanto ao total de alterações de cabeça, peça intermediária e cauda e, ainda, quanto ao total de alterações secundárias e totais, exceto por um maior percentual de alterações totais de cauda no grupo ACP-106 (concentração fixa) quando comparado ao grupo ACIN (diluição fixa ou 1:1). Para a avaliação da morfologia espermática, foi realizada a coloração de eosina-nigrosina, onde esta não se mostrou tão eficiente. Embora ela seja classificada como uma coloração vital é difícil a avaliação do percentual de vivos após a descongelação, visto que se observa uma população espermática que não se cora adequadamente, dificultando a interpretação, por isso este parâmetro não foi mensurado. Este fato já foi observado por Peña-Martinez (2004), relatando que esta população de espermatozóides que não se cora adequadamente, poderia apresentar lesão de membrana, mas talvez ainda fosse viável. Além disso, como não há fixação no processo de coloração, a vida útil da lâmina torna-se mais curta, ocasionando defeitos aos espermatozóides (principalmente de cauda) que não existiam no momento da coloração. É importante ressaltar que só foi realizada a avaliação clássica da morfologia espermática, sendo importante a realização de outras avaliações como, por exemplo, a do status acrossomal. Comparando-se todos os tratamentos, foi observada uma superioridade do diluente ACIN (diluição 1:1) sobre o ACP-106 (concentração fixa). Essa

150 149 superioridade pode ser devido à dificuldade na avaliação quando uma concentração mais baixa foi utilizada (ACP-106 /concentração de 200 x 10 6 espermatozóides/ml), onde esse fato foi observado também no ACIN. Apesar dessa inferioridade, os resultados com ACP-106 /concentração de 200 x 10 6 espermatozóides/ml foram bons e estes não diferiram do método de diluição 1:1. Em outra fase do experimento, esse protocolo foi usado e os resultados foram melhores. Estes resultados serão descritos posteriormente. Capítulo II: Efeito do armazenamento a 10 C do diluente ACP-106 e da diluição pós-descongelação sobre a qualidade do sêmen canino congelado. No primeiro capítulo foi observado que o ACP-106 foi eficiente para a criopreservação de sêmen canino, podendo o mesmo ser congelado tanto a uma concentração fixa como a uma diluição fixa. Nesta segunda fase do trabalho, o método de diluição fixa (1:1) foi escolhido por conferir uma maior praticidade ao trabalho, podendo-se determinar a concentração espermática posteriormente. Os resultados com ACP-106, descritos no capítulo anterior, foram satisfatórios. No entanto, é necessário aperfeiçoar este protocolo para que o mesmo se torne mais prático. Um ponto que precisa ser investigado é o armazenamento do diluente visto que a maioria dos diluentes é armazenada na forma congelada e, para o ACP-106, é preparada uma nova solução para cada congelação por este efeito ainda não ser conhecido. Um outro fator importante a ser estudado é o efeito da diluição pósdescongelação. Tal procedimento reduz os efeitos tóxicos do glicerol e gema de ovo visto que o meio de descongelação contém substratos metabolizáveis adicionais, bem como, capacidade tamponante. Há pouca informação sobre este efeito no sêmen canino. É de nosso conhecimento apenas o trabalho desenvolvido por Pena & Linde- Forsberg (2000b) que observaram que a mais alta taxa de diluição avaliada (1:4) resultou em maior longevidade espermática. Portanto, foi realizada uma comparação

151 150 com o ACP-106 preparado no momento da congelação com o armazenado na forma congelada (-10 C). Além disso, foi investigado o efeito da diluição pós-descongelação. Não foi observada diferença entre o diluente preparado no momento da congelação e o armazenado na forma congelada quanto à motilidade, vigor, morfologia espermática e acrossomal. No entanto, seria de grande valor investigar o efeito da congelação sobre a composição bioquímica do ACP-106. Foi observado que não há uma completa dissolução da gema de ovo no diluente, aumentando a quantidade de debris e isto pode afetar o movimento espermático (Hirai et al., 1997). Além disso, os debris prejudicam na avaliação da motilidade. Esta dissolução incompleta da gema de ovo leva a uma variação na concentração deste protetor de resfriamento, o que pode levar a uma variação nos resultados. Com relação ao efeito da diluição pós-descongelação, não foi observada influência deste fator nem imediatamente após a descongelação e nem durante a incubação por 120 minutos. Esses resultados diferem, em parte, daqueles encontrados por Peña e Linde-Forsberg (2000b) que observaram um efeito, imediatamente, após a descongelação, mas não durante a incubação por 120 minutos. Estes autores observaram ainda este efeito após 5 horas de incubação, onde amostras não diluídas apresentaram menores valores de motilidade. A motilidade no presente trabalho aos 60 minutos de incubação foi apenas um pouco menor que a encontrada por Rota et al. (1997), usando um diluente à base de Tris. No entanto, melhores resultados de longevidade foram encontrados por Peña & Linde-Forsberg (2000b) e Rota et al. (1997) também usando Tris, mas adicionado de Equex STM. Provavelmente, estes últimos resultados foram influenciados pelo Equex STM, onde foi observado que a viabilidade e longevidade são melhoradas com a adição dessa substância. A injúria pós-descongelação sofrida pelo espermatozóide e outras células viáveis ocasionada pela retirada brusca do glicerol é geralmente atribuída ao choque

152 151 osmótico (Frim & Mazur, 1983, Schneider & Mazur, 1984). Este choque deverá ser mais pronunciado quando os espermatozóides são diluídos em meio livre de glicerol porque isto induz a uma retirada abrupta do glicerol do espermatozóide com o objetivo de alcançar um equilíbrio em ambos os lados da membrana. Dessa forma, as células tentam se acomodar a novas mudanças de volume em adição àquelas mudanças já sofridas durante a descongelação (Peña & Linde-Forsberg, 2000b). Embora os valores de motilidade fossem baixos após 60 minutos de incubação, a taxa de espermatozóides e acrossomas normais foram altas para o ACP- 106 fresco (87,6 ± 6,5%/97,50 ± 2,06%) e congelado (90,6 ± 3,4%/96,87 ± 2,28). Peña & Linde-Forsberg (2000b) relatam que o estresse osmótico pós-descongelação pode ser capaz de prejudicar o movimento espermático retilíneo, mas mantendo as membranas espermáticas intactas. Essa alta taxa de acrossomas normais pode ser, em parte, devido a ineficiência da coloração de Rosa de Bengala em avaliar danos acrossomais. A injúria do espermatozóide congelado-descongelado é caracterizada por edemaciamento e enrolamento da parte final da cauda espermática (Correa & Zavos, 1995). Para os dados agrupados dos diluentes (fresco e congelado), os defeitos de cauda foram os mais observados. Foi realizada a avaliação da integridade funcional das células espermáticas através do teste hipoosmótico (HOST). Durante o HOST, os espermatozóides bioquimicamente ativos, quando expostos a um estresse osmótico devido ao influxo de água, sofrem edemaciamento, aumentando em volume a fim de estabelecer um equilíbrio entre o compartimento fluido (dentro do espermatozóide) e o meio extracelular (Jeyendran et al., 1984). O percentual de membranas funcionais foi para ambos diluentes aproximadamente 53%, sendo estes valores próximos aos resultados de motilidade pós-descongelação. Talvez a maioria dos espermatozóides móveis tenha mantido uma membrana funcional após o processo de congelação-descongelação.

153 152 Nesta segunda etapa do experimento, foi observado um efeito significativo do cão sobre a motilidade espermática pós-descongelação (30 e 60 minutos de incubação), bem como sobre a taxa de espermatozóides normais imediatamente após a descongelação. Este efeito do cão confirma o fato de se considerar o uso de ejaculados de diferentes cães no delineamento experimental (Steel & Torrie, 1980). Capítulo III: Avaliação do potencial fertilizante de espermatozóides caninos congelados-descongelados com ACP-106 utilizando o teste in vitro de interação espermatozóide - oócito Apesar do largo uso de análises convencionais através da microscopia óptica em que o sêmen é avaliado quanto à motilidade, morfologia e concentração, estes métodos são subjetivos e imprecisos (Linford et al., 1976). Métodos in vitro para predição do potencial fertilizante de uma amostra de sêmen são importantes tanto ao se desenvolver novos métodos de resfriamento e congelação de sêmen ou avaliar a fertilidade de um reprodutor. Como a realização de inseminações artificiais na espécie canina apresenta algumas dificuldades como: disponibilidade de animais e infra-estrutura para mantê-los e, ainda o longo intervalo interestral da cadela, os testes de interação entre oócito e espermatozóides têm se tornado uma valiosa ferramenta na avaliação da função espermática canina (Ström- Holst et al., 2001). A criopreservação de sêmen canino utilizando ACP-106 foi avaliada somente através de métodos convencionais como motilidade, morfologia e status acrossomal e estes resultados foram bons (Cardoso et al., 2004, 2005-dados não publicados). Dessa forma, outros métodos mais acurados são necessários a fim de investigar a eficiência do referido diluente, uma vez que uma combinação de testes pode fornecer informações sobre várias características espermáticas necessárias para a

154 153 fertilização. Portanto, resolveu-se avaliar a funcionalidade espermática através do teste de interação espermatozóide-oócito. Durante este fase do experimento, mas antes do referido teste, as amostras de sêmen foram avaliadas pela análise espermática computadorizada (CASA) e quanto à integridade de membrana com provas fluorescentes. 1. Avaliação através de sistema de análise computadorizada (CASA) A avaliação do sêmen canino congelado-descongelado através da CASA apresentou alguns problemas. Acreditamos que a motilidade total e progressiva foram subestimadas uma vez que foi observada uma motilidade mais alta, na mesma amostra, através da análise subjetiva. Este fato pode ser explicado da seguinte forma. Foi observado em estudos prévios que o ACP-106 tem a desvantagem de não permitir a completa dissolução da gema de ovo na solução, aumentando a quantidade de debris que podem ser reconhecidos como espermatozóides imóveis. Hirai et al. (1997) descreveu o efeito da percentagem de gema de ovo na viscosidade dos diluentes e na motilidade espermática avaliada através de CASA. Estes autores relataram que qualquer fator que altere o padrão de movimento espermático pode alterar a motilidade progressiva e, já é bem estabelecido que a viscosidade no meio altera este padrão (Amman & Hammerstedt, 1980). Hirai et al. (1997) também observaram que um aumento na quantidade de gema de ovo prejudica o reconhecimento de falsos espermatozóides bovinos, onde estes eram partículas de gema de ovo ou outros debris. Verstegen et al. (2002) sugeriram que o diluente não deve conter partículas de tamanho similar à cabeça espermática (gema de ovo e leite) porque elas não serão diferenciadas de espermatozóides imóveis. No entanto, é relatado que este problema pode ser resolvido através de softwares que identifiquem estruturas de cauda em espermatozóides imóveis (Hirai et al., 1997). Estudos adicionais seriam necessários a fim de investigar a concentração ideal de gema de ovo no diluente ACP-106 ou mesmo métodos que possam reduzir a quantidade de debris no diluente.

155 154 Com relação às outras características do movimento espermático avaliadas pelo CASA, foi observado um valor alto de ALH (amplitude lateral de cabeça) o que poderia sugerir que os espermatozóides exibiram um movimento de hiperativação. Este fato já foi observado por Peña & Linde-Forsberg (2000a). A motilidade hiperativada é essencial para a fertilização de oócitos in vitro e in vivo (Fahrig, 2003). Já foi observada uma correlação entre ALH e fertilidade em ratos e no homem (Moore & Akhondi, 1996, Peedicayil et al., 1997). Os valores de VAP, VCL e VSL foram mais baixos que o relatado por Peña & Linde-Forsberg (2000b). Há evidências do envolvimento de espécies oxigênio reativas na capacitação (Medeiros et al., 2002). Um aumento na quantidade destes compostos pode ser um fator envolvido nas alterações similares à capacitação que ocorrem no espermatozóide criopreservado (Medeiros et al., 2002). Existe uma substância chamada ácido 3-indol acético (IAA), presente na água de coco (Nunes, 1995). Embora seus efeitos tóxicos não sejam conhecidos, espécies oxigênio reativas podem ser formadas após peroxidação e com isso produzir substâncias tóxicas (Pires de Melo et al., 1997). O efeito destas substâncias podem ser diminuídos através de peroxidases, catalases, bem como agente redutores (glutationa, ácido ascórbico, taurina e hipotaurina) presente nas células espermáticas e ambiente espermático (Hinton et al. 1995, Lapoint et al. 2000). 2. Avaliação pela microscopia de epifluorescência Os resultados da integridade da membrana plasmática pós-descongelação (35,1%) foram mais baixos que os de Ström et al. (1997), Rota et al. (1997) e Peña e Linde-Forsberg (2000a), utilizando as mesmas provas fluorescentes, sendo observado 74%, 56% e 64% de membranas intactas. A integridade da membrana plasmática reflete a viabilidade espermática e o processo de criopreservação danifica esta membrana (Cormier et al., 1996, Correa et al., 1996). O processo de criopreservação causa danos irreversíveis à membrana plasmática e conduz a morte celular (Holt,

156 b) ou, nos espermatozóides sobreviventes, causar alterações similares a dos espermatozóides capacitados, encurtando a sua vida útil (Pérez et al., 1996, Watson, 2000). Apesar da percentagem de membranas espermáticas intactas ter sido baixa, a taxa de espermatozóides normais avaliada pela coloração de Rosa de Bengala foi alta (89,6%), significando que esta avaliação não pode ser usada sozinha. Os métodos convencionais de coloração para uso em microscopia óptica não são desejáveis para a avaliação do espermatozóide criopreservado, pois o glicerol e a gema de ovo, ingredientes necessários na maioria dos meios de congelação de sêmen canino, interferem com os fixadores utilizados nas colorações. O uso de provas fluorescentes tem superado este problema, pois não há interferência do meio extracelular na avaliação (Peña-Martinez, 2004). 3. Avaliação pelo teste de interação espermatozóide-oócito Utilizamos uma metodologia para o teste de interação oócitoespermatozóide similar à descrita por Hay et al. (1997) e a mesma mostrou-se fácil de ser realizada apesar de minuciosa. No presente trabalho, foi encontrado, aproximadamente, 15% de oócitos penetrados sendo diferente de Hay et al. (1997) que encontraram uma taxa de 70%. No entanto, estes autores agruparam em uma única categoria a taxa de oócitos que se ligaram à zona pelúcida ou penetraram no ooplasma, chamando-a de penetrados. Quando agrupamos também as duas categorias (ligados e penetrados) a qual chamamos de interagidos, nossos resultados foram similares aos destes autores. Melhores resultados foram obtidos por Ström Holst et al. (2000) que obtiveram 84 e 89% de oócitos que se ligaram à zona pelúcida após lavagem suave e forte dos complexos oócito-espermatozóide, respectivamente. Encontramos algumas correlações entre os dados do CASA e os do teste de interação espermatozóide-oócito. Contudo, é importante lembrar que a motilidade total e progressiva avaliada pelo CASA pode ter sido subestimada. Então, talvez não seja

157 156 confiável estabelecer um valor preditivo para o CASA, com relação a estes parâmetros, sobre a fertilidade in vitro utilizando sêmen canino congeladodescongelado com ACP-106. Vale ressaltar que as correlações entre a motilidade total e progressiva e o percentual de oócitos penetrados foram as mais baixas quando comparadas a outras observadas neste trabalho. Por outro lado, as velocidades espermáticas, avaliadas pelo CASA, como VCL (velocidade curvilínea), VAP (velocidade média da trajetória) e VSL (velocidade progressiva) apresentaram uma alta e positiva correlação com o número de espermatozóides ligados e penetrados no oócito. Portanto podemos considerar tais parâmetros do CASA como preditivos para o número de espermatozóides que interagem com o oócito, seja por ligação ou penetração, ou ambos. Além disso, também podemos considerar a taxa de espermatozóides e acrossomas normais avaliados através da coloração de Rosa de bengala como um valor prognóstico para o número de espermatozóides que ligaram e penetraram no oócito, respectivamente. No presente trabalho, mesmo com um baixo percentual de espermatozóides com membrana intacta, a taxa de oócitos interagidos (ligados, penetrados e ligados mais penetrados) foi satisfatória. Na espécie canina, tem sido sugerido que espermatozóides tanto com acrossoma intacto e acrossoma reagido são capazes de se ligar à zona pelúcida (Kawakami et al. 1993). No entanto, Hoodbhoy & Dean (2004) relatam que somente espermatozóides móveis e com acrossomas intactos podem penetrar o cumulus oophorus e se ligar à zona pelúcida. Diversos aspectos do mecanismo de interação do espermatozóide com o oócito precisam ser elucidados. Acredita-se que a fusão do da célula espermática com o gameta feminino inicia-se na região equatorial do espermatozóide (Kaji & Kudo, 2004) e esta região permanece intacta após o espermatozóide ter sofrido reação do acrossoma (Fahrig, 2003). Dessa forma, pode ser que o espermatozóide com acrossoma reagido possa ser capaz de se ligar à zona pelúcida, mas não capaz de penetrar o oócito visto que o acrossoma contém enzimas que são necessárias neste processo (Kaji & Kudo, 2004). Kawakami et al. (1993) observou a ligação do espermatozóide com acrossoma reagido na zona pelúcida após um minuto de incubação. Os testes de interação do espermatozóide com

158 157 oócitos requerem, normalmente, dezoito horas de incubação (Hay et al., 1997). Dessa forma, é importante investigar se a ligação de um espermatozóide com acrossoma reagido é verdadeira e, se o mesmo é capaz de penetrar no ooplasma. Capítulo IV: Integridade e mudanças ultra-estruturais no espermatozóide canino fresco e após criopreservação com diluente para sêmen de carnívoros à base de água de coco em pó (ACP-106 ) Avaliou-se o sêmen canino através de diversos métodos como motilidade, morfologia espermática e acrossomal, integridade funcional, microscopia de fluorescência, análise computadorizada e, ainda, através de interações espermatozóides-oócitos. Embora a criopreservação de sêmen canino com ACP-106 tenha sido eficiente, com base nos métodos que avaliamos, algumas mudanças na metodologia precisam ser realizadas objetivando não só incrementar a eficiência como também tornar o método mais prático. No entanto, antes que este protocolo seja aperfeiçoado, é importante entender as crioinjúrias que causa uma redução na longevidade espermática (Burgess et al., 2001). Estas crioinjúrias podem ser mais bem caracterizadas através de uma avaliação ultra-estrutural (Oettlé & Soley, 1988; Rodríguez-Martínez et al., 1993). A avaliação ultra-estrutural do espermatozóide canino neste estudo caracterizou principalmente as alterações na membrana plasmática e no acrossoma. Com relação à membrana plasmática, é sabido que integridade da mesma é um pré-requisito fundamental para a função espermática normal (Ström, 1999). Durante o processo de criopreservação, as membranas espermáticas são consideradas os principais locais de danos associados com mudanças de temperatura (Hammerstedt et al., 1990, Watson, 1995). A integridade da membrana plasmática pode ser avaliada através do teste hipoosmótico (England & Plummer, 1993), provas fluorescentes (Peña & Linde-Forsberg, 2000) e microscopia eletrônica de varredura e de transmissão

159 158 (Ström Holst et al., 1998). Bacetti et al. (2002) relatam que o estudo das alterações do espermatozóide, em casos de infertilidade humana, tem demonstrado que a microscopia eletrônica pode ser uma valiosa ferramenta para o entendimento não somente da presença, mas também da natureza dos defeitos. A maioria dos espermatozóides parecia apresentar uma membrana intacta mesmo apresentando edemaciamento da mesma. De acordo com Hurtgen & Johnson (1982), membranas plasmáticas e acrossomais ondulantes, observadas no edemaciamento, consistem num padrão regular em garanhões férteis, sugerindo que estas alterações são mais devido ao procedimento de fixação do que aos de congelação. Chirinéa et al. (2005) relataram a ocorrência de um leve edemaciamento da membrana plasmática acima da região acrossomal observadas em espermatozóides frescos caninos, explicando que isto seria uma conseqüência da exposição das amostras de sêmen ao glutaraldeído durante a fixação. As principais alterações pós-descongelação estão relacionadas ao acrossoma. Embora este experimento não tenha quantificado estas alterações ultraestruturais, as mais observadas foram: edemaciamento, vesiculação e perda do conteúdo acrossomal. Tais defeitos são denominados mudanças tipo capacitação (Bailey et al., 2000) e podem ser resultantes de reação do acrossoma (Eilts, 2005). De fato, Rodriguez-Martinez et al. (1993) sugeriram que as alterações ultra-estruturais observadas no sêmen canino congelado podem ser interpretadas como uma falsa reação do acrossoma. As mudanças físicas ocorridas nesta reação após a criopreservação são indicativas de que o espermatozóide não pode fertilizar mesmo que estejam móveis (Eilts, 2005). Similaridades entre o espermatozóide capacitado e criopreservado têm sido demonstradas em relação à reorganização, fluidez e influxo de cálcio na membrana plasmática (Green & Watson, 2001). Fisiologicamente, alguns fatores podem induzir reação do acrossoma como o cálcio intracelular (Dragileva et al., 1999), ph (Florman et al., 1989), inositol trifosfato (Walensky & Snyder, 1995), e diacilglicerol (Roldan, 1998). Então, um

160 159 importante ponto a ser considerado nos procedimentos de criopreservação e que pode induzir reação do acrossoma é o glicerol. As alterações aqui descritas já foram previamente relatadas para o espermatozóide canino (Rodriguez-Martinez et al., 1993, Ström et al., 1998). Ström et al. (1998) encontraram 89% de acrossomas edemaciados após congelaçãodescongelação utilizando o método CLONE. As inseminações artificiais utilizando o sêmen criopreservado com este método em altas taxas de concepção, sendo sugerido que o edemaciamento de acrossoma não prejudica a fertilização. Para o espermatozóide criopreservado com ACP-106, pode-se sugerir a mesma afirmativa uma vez que os defeitos foram similares. Além disso, a avaliação do espermatozóide congelado-descongelado com ACP-106 pelo teste de interação oócitoespermatozóide (dados não publicados) mostrou um total de 75% de interações (oócitos somente ligados, somente penetrados e ligados mais penetrados). Ao menos in vitro, tais defeitos não prejudicaram a função espermática, permitindo não somente a ligação, mas também a penetração no oócito. Para a inseminação artificial, é importante determinar o momento de realizá-la, pois o edemaciamento de acrossoma diminui a vida útil do espermatozóide (Jones & Stewart, 1979). Alterações na peça intermediária também foram observadas na avaliação ultra-estrutural. Tais defeitos incluíram edemaciamento da membrana plasmática e danos na área mitocondrial tais como desorganização do conteúdo. Burgess et al. (2001) relatou um leve, mas não significante aumento no número de espermatozóides com peça intermediária apresentando membrana plasmática não intacta após 4 horas de incubação pós-descongelação. As mudanças aqui descritas para os espermatozóides caninos após criopreservação com ACP-106 não foram diferentes das já relatadas por outros autores utilizando diluentes diferentes.

161 CONCLUSÕES O sêmen canino pode ser, eficientemente, congelado com o diluente à base de água de coco in natura (ACIN) ou em pó (ACP-106 ) após diluição 1:1 ou a uma concentração de 200 x 10 6 espermatozóides/ml. Embora o método de diluição a uma taxa constante seja mais prático, a utilização de uma concentração fixa tem a vantagem de simplificar o cálculo do número de espermatozóides por palheta. O armazenamento do a -10 C não diminui a eficiência do ACP-106 para a criopreservação de sêmen canino. Além disso, proporciona uma maior praticidade ao protocolo de congelação. A diluição pós-descongelação não influencia a sobrevivência espermática pós-descongelação durante incubação a 37 C, mas este procedimento melhora a avaliação da motilidade por diminuir a viscosidade no meio. O procedimento de congelação-descongelação utilizando ACP-106 foi eficiente na manutenção do potencial fertilizante do espermatozóide canino in vitro, mantendo a sua capacidade de não somente de se ligar, mas também de penetrar a zona pelúcida. A microscopia eletrônica de transmissão foi uma valiosa ferramenta na caracterização dos danos espermáticos sofridos no processo de criopreservação, refirmando que as membranas são os principais locais que sofrem danos, onde as membranas acrossomais são as mais afetadas. O percentual de espermatozóides e acrossomas normais são preditivos do número de espermatozóides ligados e penetrados no oócito, respectivamente.

162 PERSPECTIVAS Com a comprovação da eficiência ACP-106 para a criopreservação de sêmen canino, baseada na análise da motilidade, morfologia, integridade funcional e interação oócito-espermatozóide, podemos sugeri-lo como uma nova opção de diluente para a referida biotécnica. No entanto, objetivando um maior embasamento científico para esta sugestão, seria de relevante importância a comprovação da fertilidade in vivo utilizando sêmen congelado com ACP-106.

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189 12. ANEXOS 188

190 Anexo I. Água de coco em pó (ACP ). 189

191 C 15 C + Etapa 3 4 C Etapa 1 Etapa 2 Etapa 5-60 C - 60 C Etapa 6 5 cm C Etapa 4 N 2 Líquido Anexo II. Esquema de congelação para o sêmen canino utilizando ACP-106 Etapa 1: Diluição a temperatura ambiente com ACP -gema de ovo; Etapa 2: Resfriamento em caixa térmica por 40 minutos; Etapa 3: Resfriamento em refrigerador por 30 minutos; Etapa 4: Diluição com ACP -gema de ovo-glicerol; Congelação em vapores de nitrogênnio por 5 minutos; Etapa 5: Armazenamento em nitrogênio líquido.

192 191 Anexo III. Composição dos corantes para avaliação da morfologia espermática 1. Solução de eosina-nigrosina Eosina amarealada 1g Nigrosina 2g Tricitrato de sódio 2H 2 O 2,941g 100 ml de água destilada OBS: Após preparo, a solução fica em repouso por 24h, filtrada e conservada a 4 C. 2. Solução Rosa de Bengala 20 ml de água destilada 0,58g de citrato de sódio 0,8 ml de formaldeído 0,3g de Rosa de Bengala OBS: Após a mistura dos três primeiros componentes, a solução é homogeneizada e acrescenta-se a Rosa de Bengala Anexo IV. Composição da solução trabalho para verificação da integridade de membrana por microscopia de fluorescência 1. Solução estoque de fluoresceína 6-Diacetato de carboxifluoresceína - 9,2 mg DMSO - 20 ml

193 Solução estoque de iodeto de propídio Iodeto de propídio - 10 mg Solução fisológica 20 ml 3. Solução de formaldeído Solução 1:80 de formalina 40%, em solução fisiológica 4. Solução trabalho Solução estoque de fluoresceína - 20 µl Solução estoque de iodeto de propídio - 10 µl Citrato de sódio 3% - 0,96 ml Anexo V. Composição dos meios usados para o teste de interação oócito espermatozóide 1. Solução estoque de íons Cloreto de sódio (NaCl) - 2,28 M (6,665g / 50mL) Cloreto de potássio (KCl) 158mM (0,88g / 50mL) Bicarbonato de sódio (NaHCO 3) mm (1,05g / 50mL) Fosfato de sódio (NaH 2 PO 4 H 2 O) 35mM (0,235g / 50mL) Cloreto de cálcio (CaCL 2.2H 2 O) 16,46 mm (1,47g / 50mL) Cloreto de magnésio (MgC l2.6h 2 O) 10mM (1,015g / 50mL) Hepes - 1M (1,19g / 5mL)

194 Solução de estoque TL 2.1. Espermatozóide TL Osmolaridade 295 mosm/l 19,81 ml de H 2 O 1,085mL de NaCl 0,49mL de KCl 2,50mL de NaHCO 3 0,25mL de NaH 2 PO 4 H 2 O 0,09mL de Lactato de sódio 0,25mL de Hepes 0,25mL de CaCL 2.2H 2 O 0,275mL de MgCL 2.6H 2 O 2.2. FIV TL Osmolaridade 295 mosm/l 44,125mL de H 2 O 1,25mL de NaCl 0,50mL de KCl 2,50mL de NaHCO 3 2,50mL de NaH 2 PO 4 H 2 O 0,045mL de Lactato de sódio 0,25mL de CaCL 2.2H 2 O 0,125mL de MgCL 2.6H 2 O

195 Solução TALP 3.1. TALP-SPERM (ph 7,4) 9,5mL Espermatozóide TL 60mg de BSA (Fração V) 100µL de Piruvato de Sódio (2,2 mg/ml) 83,5µL de Gentamicina (50mg/mL) 10µL de Vermelho Fenol (1mg/100mL) 3.2. TAP-FIV (ph 7,4) 9,5mL de FIV TL 30,0mg de BSA (Fração V) 10µL de Piruvato de Sódio (2,2mg/mL) 83,5µL de Gentamicina (50mg/mL) 10µL de Heparina (2,0mg/mL) 10µL de Vermelho Fenol (1mg/100mL) OBS. Todas as solução são preparadas com água MiliQ.

196 195 (a) (b) Anexo VI.Espermatozóides caninos criopreservados em ACP-106. (a) Apresentando cauda reflexa e corado com eosina-nigrosina; (b) Apresentando cauda enrolada (seta preta), acrossoma normal (seta branca) e corado com Rosa de Bengala.

197 196 (a) (b) Anexo VII. Espermatozóides caninos criopreservados em ACP-106 e corados com 6- Diacetato de carboxi-fluoresceína/iodeto de propídio. (a) Espermatozóide com membrana plasmática não intacta (corado totalmente em vermelho com iodeto de propídio - seta branca); Espermatozóide com membrana plasmática não intacta na região equatorial (corado em vermelho) e região acrossomal intacta (corado em verde com 6-Diacetato de carboxi-fluoresceína ponta de seta branca). (b) Espermatozóides com membrana plasmática intacta (corado em verde com 6-Diacetato de carboxifluoresceína seta branca).

198 197 Anexo XIII. Oócitos (n=2) de cadelas apresentando espermatozóides caninos criopreservados em ACP-106 ligados à zona pelúcida (seta branca e ponta de seta branca) e penetrados no ooplasma (seta preta).