Avaliação de atividade antioxidante e prospecção fitoquímica do Zanthoxylum Syncarpum Tull Limãozinho

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1 Avaliação de atividade antioxidante e prospecção fitoquímica do Zanthoxylum Syncarpum Tull Limãozinho José Milton F. Jr*(PQ), Teresinha Thaize N. Alcantara (IC), Mauro Filho A. de Alencar (IC), Rafaella da S. Gomes (IC), Laudelyna R. F. de Oliveira (IC), Fco Felipe S. Gomes(IC), Rui Carlos B. da Silva (PQ), Selene M. Morais (PQ), Maria Goretti de V. Silva (PQ) Rede Nordeste de Biotecnologia/Universidade Estadual do Ceará, Av. Paranjana, Campus do Itaperi Fortaleza/CE milton_uece@yahoo.com.br Resumo A seleção de plantas com princípios farmacológicos vem se destacando como sendo uma área cada vez mais explorada, onde estes princípios ativos dependem de diversos fatores que incluem: conteúdo químico, toxicidade e uso tradicional pela população em diferentes culturas, que é conhecido como etnobotânica, mais especificamente etnofarmacologia. A espécie Zanthoxylum Syncarpum Tull, popularmente conhecida por limãozinho, vem sendo reportada em diversos artigos como sendo rica em alcaloides, apresentando bom potencial antioxidante. Com base nisso, o presente estudo tem por objetivo identificar através de prospecção fitoquímica e cromatografia de camada delgada (CCD) os principais componentes fitoterápicos do extrato das folhas de Zanthoxylum Syncarpum Tull. O extrato metanólico das cascas foi submetido a prospecção fitoquímica para identificação de alguns constituintes. Na amostra foram identificados taninos condensados, flavonóides, esteroides livres e alcaloides. Através da CCD foi confirmada a presença de todos os constituintes citados, com exceção dos esteroides livres. Uma avaliação do potencial inibitório de radicais livres foi realizada, porém, a partir da metodologia aplicada, obteve-se um percentual abaixo de 10%, onde novos estudos complementares deverão ser realizados afim complementar os resultados até então obtidos. Palavras-chave: limãozinho, fitoquímica, antioxidante.

2 Abstract Evaluation of antioxidant activity and phytochemical screening of Zanthoxylum Syncarpum Tull "Limãozinho" The selection of plants with pharmacological principles has a growing area being most explored where these active ingredients depend on many factors including: chemical products, toxicity and popular use by people in different cultures, which is known as ethnobotany, more specifically ethnopharmacology. The species Zanthoxylum Syncarpum Tull, popularly known as "limãozinho", has been reported in several articles as being rich in alkaloids, showing good antioxidant potential. Therefore, this study has objective to explore of phytochemical prospection investigateand thin layer chromatography (TLC) the principal components of the herbal extract of Zanthoxylum Syncarpum Tull. The methanol extract of leaves of limãozinho was subjected to phytochemical study for the identification of some constituents. In the sample were identified condensed tannins, flavonoids, steroids and alkaloids free. TLC has been confirmed through the presence of all constituents listed, with the exception of free steroids. An evaluation of the inhibitory potential of free radicals was performed, but using the methodology applied, there was obtained a percentage lower than 10%, where new complementary studies should be performed in order to complement the results obtained so far. Keywords: limãozinho, phytochemical, antioxidant. Introdução O gênero Zanthoxylum (Rutaceae) compreende cerca de 200 espécies de árvores, arbustos e lianas distribuídas em todo o mundo.. No Brasil são descritas cerca de 25 espécies de Zanthoxylum, onde, dentre estas, a espécie Z. syncarpum Tull. conhecida popularmente por limãozinho, têm sua ocorrência principalmente na região nordeste, em especial nos estados do Ceará, Rio Grande do Norte, Paraíba e Pernambuco. (ROSS,2004; VIEIRA, 2009). As plantas deste gênero apresentam uma grande variedade de metabólitos secundários como alcaloides, flavonoides, cumarínas, Lignanas e terpenos. Este gênero tem sido objeto de estudo devido principalmente às suas

3 propriedades febrífugas, sudoríferas e diuréticas, além de serem também amplamente utilizadas pela medicina popular no tratamento de doenças cardiovasculares, tuberculose, malária, dor de dente e contra alguns tipos de mordidas de cobra. (FACUNDO, 2005) O presente trabalho objetivou uma prospecção fitoquímica detalhada do Zanthoxylum Syncarpum Tull, com avaliação de atividade antioxidante. Procedimentos experimentais gerais Coleta do material vegetal A coleta da planta da espécie Zanthoxylum syncarpum Tull. foi realizada no Campus do Itaperi da Universidade Estadual do Ceará (UECE), na cidade de Fortaleza, no Estado do Ceará (Brasil). Coordenadas de GPS do ponto de coleta: 3 47' " Sul; 38 33' " Oeste. A preparação das exsicatas, identificação e a catalogação foram efetuadas pelo especialista Sr. Raimundo Nonato de Menezes e depositada uma amostra no herbário Prisco Bezerra da Universidade Federal do Ceará, sob número Extração e testes fitoquímicos As folhas de Zanthoxylum Syncarpum Tull foram Secas e trituradas na ordem de 1,1 Kg, onde seus componentes foram extraídos na presença de Etanol, a temperatura ambiente. O solvente foi destilado a pressão reduzida em um evaporador rotativo e o material resultante foi concentrado em banho Maria, onde o mesmo forneceu 114 g do extrato etanólico bruto das folhas, consistindo um material de coloração verde musgo. O rendimento do material resultante em relação à amostra bruta inicial foi de 10,4%.

4 Etapa Experimental A etapa de prospecção de constituintes do extrato hidroalcoolico foi realizada no laboratório de Bioquímica da Universidade Estadual do Ceará durante o mês de junho de Foram realizados testes para fenóis e taninos, antocianinas, antocianidinas e flavonoides, flavonóis, flavanonas, flavanonóis e xantonas, esteroides e triterpenoides (Lieberman-Buchard), saponinas, alcaloides e cromatografia em camada delgada conforme metodologia de Matos (1997). Para os testes fitoquímicos tomou-se inicialmente 3 g de extrato etanólico concentrado, onde o mesmo, sofreu dissolução em 30 ml etanol comercial. Após a diluição, o material foi dividido em sete (7) tubos de ensaios, com 1 ml cada. Com auxílio do tubo de ensaio nº 1, obtido na etapa anterior, adicionouse a este três gotas de solução alcoólica de FeCl 3 (2%) para a identificação de fenóis e taninos. Para o teste de antocianinas, antocianidinas e flavonoides tomaram-se os tubos 2, 3 e 4, onde o primeiro foi acidulado a ph 3 com uso de HCl 0,1 M. Os outros tubos foram alcalinizados a ph 8,5 e 11, com auxílio de NaOH 0,1M respectivamente. Para cada um dos referidos casos, o aparecimento de cores diversas indica a presença de vários constituintes, de acordo com a tabela seguinte. Quadro 01: Relação entre cores obtidas na modificação do ph do meio versus os constituintes obtidos. CONSTITUINTES COLORAÇÃO EM MEIO ÁCIDO PH 3 ALCALINO PH 8,5 ALCALINO PH 11 Antocianinas e Vermelho Lilás Azul Púrpura Antocianidinas Flavonas, Flavonois e Amarelo Xantonas Chalconas e Vermelho Vermelho

5 Auronas Púrpura Flavanonois Vermelho-Laranja Para a avaliação da presença de Flavonoides, Flavanonas, flavanonóis e Xantonas, tomou-se inicialmente o tubo de número 5 e adicionar 5 gotas de HCl concentrado, juntamente com raspas de Magnésio. Após o fim da efervescência, indicativo do término da reação, observou-se a mudança de cor. Para a avaliação de esteroides e triterpenoides, tomou-se uma das amostras bruta, adicionou-se 2 ml de clorofórmio, filtrou-se a mistura em um funil contendo algodão e algumas decigramas de Na 2 SO 4 anidro, logo após a filtragem, adicionou-se 1 ml de anidrido acético e logo após, três gotas de H 2 SO 4 concentrado, ao término, observou-se o ocorrido para diagnóstico de as espécies supracitadas. Para se averiguar a presença de saponinas, novamente tomou-se o extrato bruto em clorofórmio, resultante da etapa anterior, dissolveu-se em 8 ml de H 2 O destilada e logo após, filtrou-se a mistura para um tubo de ensaio. Posteriormente, com o tubo fechado, misturou-se a solução para a observação de formação de espuma persistente para a determinação de saponinas. Para a confirmação dos alcaloides, previamente diagnosticados a partir da literatura (OLIVEIRA JR, 2009), tomou-se dois tubos com a amostra bruta, acidificou-se com 10 ml de HCl 0,1 ml, logo após adicionou-se 3 gotas de reagente de Mayer no primeiro tubo e outras 3 gotas de reagente de Dragendorff no segundo tubo, após o procedimento observou-se o aparecimento ou não de precipitado. Na triagem química foi realizado o estudo fitoquímico preliminar da amostra vegetal por meio de reações cromatográficas que indicam os grupos marcadores químicos. Foi feita a identificação e separação por cromatografia em camada delgada (CCD) de grupos específicos de fármacos ativos. O material analisado na forma de CCD inicialmente sofreu exposição em luz ultra violeta (UV) em 365 nm e 254 nm para identificação de cromóforos. Foram submetidos também testes em placas de CCD na presença de eluentes de clorofórmio com borrifamento de reagente de Dragendorff, para identificação de

6 alcalóides, vanilina para identificação de esteroides triterpenos e cloreto férrico para flavonoides e taninos. Na avaliação da atividade antioxidante foi utilizado o método de varredura do radical livre DPPH. Em um tubo de ensaio, colocaram-se 3,9 ml de uma solução metanólica 6,5 x 10-5 M do radical livre DPPH. Em seguida foi adicionado ao tubo 0,1 ml da solução metanólica das amostras a serem testadas nas concentrações de 100, 50, 10, 5 e 1 ppm. Após o intervalo de 60 minutos, mediu-se então a absorbância num espectrofotômetro Spekol no comprimento de onda de 515 nm. Calculou-se então o Índice Varredor da amostra em percentual (IV%) usando a fórmula: IV% = (ADPPH AAMOSTRA/ADPPH ) x 100, onde A é a absorbância ao final dos 60 minutos. Todos os experimentos foram feitos em triplicata. A determinação do teor de fenóis totais presentes nas amostras de extrato etanólico das espécies estudadas foi feita por meio de espectroscopia na região do visível utilizando o método de Folin Ciocalteu (BONONI et al, 2004). O extrato etanólico (100 mg) foi dissolvido em metanol, transferido quantitativamente para um balão volumétrico de 100 ml e o volume final foi completado com metanol. Uma alíquota de 7,5 ml desta solução foi transferida para um balão volumétrico de 50 ml; esta segunda solução teve seu volume acertado novamente com metanol. Uma alíquota de 100 μl desta última solução foi agitada com 500 μl do reagente de Folin- Ciocalteu e 6 ml de água destilada por 1 min; passado este tempo, 2 ml de Na 2 CO 3 a 15% foram adicionados à mistura e agitada por 30 s. Finalmente, a solução teve seu volume acertado para 10 ml com água destilada. Após 2 h, a absorbância das amostras foi medida a 750 nm, tendo como branco todos os reagentes, menos o extrato. O teor de fenóis totais (FT) foi determinado por interpolação da absorbância das amostras contra uma curva de calibração construída com padrões de ácido gálico (10 a 350 μg/ml) e expressos como mg de EAG (equivalentes de acido gálico) / g de extrato. A Equação da curva de calibração do ácido gálico foi Y = -0, ,0129 X, e o coeficiente de correlação R = 0,9987. Todas as análises foram realizadas em triplicata.

7 Resultados e Discussão Inicialmente, para os testes prévios de fenóis e taninos, com utilização das técnicas referidas na metodologia, obteve-se uma mudança na tonalidade do composto inicial para um verde profundo, onde, de acordo com Matos (1997), ocorre devido à presença de taninos condensados, onde estes, segundo Rufino (2008), são formados por estruturas poliméricas, dadas pela união de um flava-3-oles. Existem 15 classes destas estruturas polifenólicas, porém, somente três destas são de real importância para a alimentação, são elas: procianidinas, prodelfinidinas e propelargonidinas. Segundo o mesmo autor, os taninos condensados podem ser considerados como uma boa fonte de fibras dietéticas. Para o teste de antocianinas, antocianidinas e flavonoides, após os procedimentos adotados na metodologia experimental, a solução de trabalho, ao ser regulada com ph 11, apresentou uma coloração amarela, sinalizando a presença de Flavonas, Flavonóis e Xantonas. Para os demais valores de ph não houveram mudanças de coloração significativas. Estes compostos identificados fazem parte de um subgrupo de polifenóis, conhecido como flavonoides, que por sua vez, por apresentarem uma estrutura mais complexa se dividem em vários grupos, dentre estes, os acima citados. As antocianinas e antocianidinas não foram identificadas neste procedimento. Esta etapa confirmou-se com a reação do Mg (s) + HCl (l) P.A. em um tubo de ensaio contendo 3 ml de amostra bruta, onde, segundo a metodologia sugerida por Barbosa (2001), quando ocorrer o aparecimento ou intensificação da cor vermelha, é indicativo da presença dos metabólitos relacionados anteriormente. Na etapa posterior, foram realizados testes para detecção de esteróides e triterpenóides, onde, após a aplicação da metodologia sugerida por Matos (1997), a coloração azul evanescente, passando posteriormente para o verde profundo, indica a presença de esteroides livre em solução.

8 Seguindo-se a metodologia sugerida por Matos (1997), a presença de saponinas não foi detectada, tendo em vista que, quando o produto obtido e relacionado na etapa metodológica, quando submetido à intensa agitação, não houve o aparecimento de espuma consistente. Para a identificação de alcalóides, confirmando o que foi encontrado na literatura (OLIVEIRA JR, 2009),foi detectada a presença destes, pois, de acordo com a metodologia aplicada, observou-se claramente a formação de material precipitado na presença de reagentes de Mayer e Dragendorff. Os alcaloides, nas plantas e na pele de alguns anfíbios funciona como mecanismo de defesa contra seus predadores, sistema de armazenamento de energia e proteção contra a intensidade dos raios UV. Eles também correspondem aos principais terapêuticos naturais com ação: anestésica, analgésica, psicoestimulantes, neurodepressores, etc. Figura 01: Precipitado obtido pela confirmação do teste para alcaloides. Diante dos testes realizados na prospecção fitoquímica, pode-se determinar a presença dos seguintes constituintes: Quadro 02: Substâncias presentes no Zanthoxylum Syncarpum Tull a partir da prospecção fitoquímica Constituintes Avaliados Prospecção Fitoquímica Taninos Condensados + Antocianinas - Antocianidinas -

9 Flavonas + Flavonóis + Xantonas + Esteroides + Triterpenoide - Saponinas - Alcaloides + A partir da técnica de cromatografia em camada delgada (CCD), as amostras submetidas apresentaram fluorescência quando exposta a luz ultravioleta no comprimento de onda de 254 nm, indicando assim a presença de cromóforos, derivados da presença de grupos carreadores de cor, geralmente compostos que apresentam insaturações, podendo apresentar ou não conjugação. Quadro 03: resultados obtidos a partir da cromatografia em camada delgada Eluente/Revelador Vanilina Dragendorff Luz UV CHCl acoet Quanto aos testes com eluente Clorofórmio (CHCl 3 ), a amostra do extrato metanólico do Limãozinho não foi eluida quando o este foi utilizado. Não houve a separação dos constituintes da amostra, pois a amostra ficou retida no local da aplicação devido ao clorofórmio ser um solvente apolar.

10 Figura 02: Cromatografia em camada delgada da amostra de Limãozinho eluída em clorofórmio Pode-se observar ainda a partir da Figura 02 a confirmação para alcalóides de forma bem discreta, detectada com o aparecimento da coloração alaranjada/amarronzada, quando se utilizou o Reagente de Dragendorff como revelador, porém, estes alcalóides foram bem melhor caracterizados nos testes com tubo de ensaio. Quando o solvente foi substituído pela mistura clorofórmio + MetOH (1:1) houve uma melhor corrida dos constituintes da amostra sem, no entanto, haver separação das frações. Figura 03: Cromatografia em camada delgada do extrato metanólico do limãozinho com o solvente clorofórmio + metanol (1:1). Na Determinação do Teor de Fenóis Totais, onde o resultado expresso por mg de ácido gálico (EAG) / g de extrato bruto foi de 166,74 mg EAG/g, demonstrou alto teor de fenóis totais, sendo uma fonte natural de compostos fenólicos e possíveis alternativas para atividades biológicas. Para a avaliação de atividade antioxidante, partindo-se das soluções (triplicatas) previamente citadas na metodologia, obteve-se os valores de inibição de radicais livres na ordem de 2,32 ppm, onde, de acordo com o IV 50 da mesma, essa concentração inibiu em torno de 50% dos radicais livres. Comparando-se com o padrão quercetina, que apresenta IV 50 = 0,23 ppm, a

11 amostra apresentou um resultado relevante, pois, quanto mais próximo do padrão, melhor será a atividade antioxidante deste. Segundo Ribeiro (2006) a presença de compostos fenólicos pode atribuir à propriedade antioxidante de uma espécie, o que incentiva o estudo desta atividade através de outros métodos. Por essa razão, estão sendo traçados novas metodologias de análise sobre o potencial antioxidante desta espécie, o que estimula ainda mais o estudo e isolamento dos metabólitos desta espécie e dos seus possíveis potenciais. Conclusão: Para a prospecção fitoquímica, pode-se confirmar a presença de Taninos condensador, derivados de estruturas fenólicas. Alguns flavonoides como Flavonas, flavonóis e xantonas e outros constituintes como os esteroides e alcaloides, todos seguindo rigorosamente a metodologia proposta por Matos (1997), também foram identificados. Os testes em cromatografia em camada delgada (CCD) além de demonstrar a presença de cromóforos, demonstraram uma possível presença de Taninos condensados, alcaloides, flavonoides. As avaliações do teor de fenóis totais demonstraram resultados bastante satisfatórios, indicando uma possível atividade antioxidante, onde esta suposição foi confirmada com a determinação do potencial de inibição de radicais livres, que apresentou resultados bastante significativos em relação ao padrão quercetina.

12 Referencias BARBOSA, W.L.R.; TAVARES, I.C.C.; PINTO, P.L.N.; OLIVEIRA, F.Q. Manual para análise fitoquímica e cromatográfica de extratos vegetais. 1 ed. Vol4. Revista Científica da UFPA, Belém, BONOLI, M.; VERARDO, V.; MARCONI, E.; CABONI, M. F. 52 ed. J. Agric. Food Chem COSTA, A. S. V.; PESSANHA, G. G.; CARVALHO. M. G; FILHO. R. B. Identificação de substancias secundárias presentes em leguminosas utilizadas como adubo verde. 42 ed. Revista Ceres, Rio de Janeiro, FACUNDO, V.A.; SILVEIRA, A.S.P.; FILHO, R.B.; REZENDE, A.C.P.C. Constituintes químicos de Zanthoxylum ekmanii (URB.) ALAIN. Quim. Nova, Vol. 28, Nº. 2, LEBRINI, M.; ROBERT, F.; ROOS,C. Alkaloids Extract from Palicourea guianensis Plant as Corrosion Inhibitor for C38 Steel in 1 M Hydrochloric Acid Medium, Int. J. Electrochem. Sci., 6 Ed - Cayenne, French Guiana, pp MATOS, F.J.A.. Introdução a fitoquímica experimental. 2ª Ed. Fortaleza: Edições UFC, OLIVEIRA JR, E.P.; LIMA, G.V.; MORAIS, S.M.; COSTA, S.M.O.; MAGALHÃES, C.E.C.; SILVA, R.C.B. Uso do extrato de Z. syncarpum Tull como inibidor da corrosão do cobre,32ª Reunião anual da Sociedade Brasileira de Química, Fortaleza, CE, (Congresso). RIBEIRO, S. M. R. Caracterização e avaliação do potencial antioxidante de mangas (Mangifera indica L.) cultivadas no estado de Minas Gerais Tese (Doutorado em Bioquimica Agricola) p. 149 Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, M.G., 2006.

13 ROSS, S.A.; SULTANA, G.N.; BURANDT, C.L.; ELSOHLY, M.A.; MARAIS, P.J. FERREIRA, D. Syncarpamide, a New Antiplasmodial (+)-Norepinephrine Derivative from Zanthoxylum syncarpum. 67ª ed. J. Nat. Prod RUFINO, M.S.M. Propriedades funcionais de frutas tropicais brasileiras não tradicionais. Mossoró. UFERSA. 2008, 237f. (Tese de Doutorado), VAYA J., AVIRAM M. Nutritional antioxidants: mechanisms of action, analyses if activities and medical applications. Curr Med Chem Imm Endoc Metab, VIEIRA, M.G.S.; FREITAS, J,V,B,; LIMA, M.N.; GRAMOSA, N.V. Constituintes químicos voláteis das folhas e galhos de Zanthoxylum syncarpum Tull. Quim. Nova, Vol. 32, No. 2, 2009.