VALIDAÇÃO DO TESTE IMUNOCROMATOGRÁFICO RÁPIDO DUAL PATH PLATFORM PARA O DIAGNÓSTICO DA LEISHMANÍASE VISCERAL CANINA

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS EUDSON MAIA DE QUEIROZ JÚNIOR VALIDAÇÃO DO TESTE IMUNOCROMATOGRÁFICO RÁPIDO DUAL PATH PLATFORM PARA O DIAGNÓSTICO DA LEISHMANÍASE VISCERAL CANINA FORTALEZA-CEARÁ

2 EUDSON MAIA DE QUEIROZ JÚNIOR VALIDAÇÃO DO TESTE IMUNOCROMATOGRÁFICO RÁPIDO DUAL PATH PLATFORM PARA O DIAGNÓSTICO DA LEISHMANÍASE VISCERAL CANINA Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientadora: Profa. Dra.: Claudia Maria Leal Bevilaqua FORTALEZA-CEARÁ

3 Q3v Queiroz Júnior, Eudson Maia de Validação do teste imunocromatográfico rápido Dual Path Platform para o diagnóstico da leishmaníase visceral canina / Eudson Maia de Queiroz Júnior. Fortaleza, p. ; il. Orientadora: Profª. Drª. Claudia Maria Leal Beviláqua. Co-orientadora: Profª. Drª. Diana Célia Souza Nunes Pinheiro. Dissertação (Mestrado Acadêmico em Ciências Veterinárias) Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. 1. Diagnóstico. 2. Cães. 3. Leishmaníase visceral. 4. Sorologia. I. Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária. CDD:

4 EUDSON MAIA DE QUEIROZ JÚNIOR VALIDAÇÃO DO TESTE IMUNOCROMATOGRÁFICO RÁPIDO DUAL PATH PLATFORM PARA O DIAGNÓSTICO DA LEISHMANÍASE VISCERAL CANINA Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Aprovada em: / / Banca Examinadora Claudia Maria Leal Bevilaqua Orientadora UECE Fernanda Cristina Macedo Rondon Examinadora UECE Sthenia Santos Albano Amóra Examinadora-UFERSA 4

5 Aos meus pais, Eudson e Lêda. 5

6 AGRADECIMENTOS Agradeço inicialmente a Deus, pela família maravilhosa que escolheu pra mim, que sempre será um símbolo de união e cooperação; Aos meus pais Eudson Maia de Queiroz e Lucileide (Lêda) Xavier de Lima Queiroz, agradeço pelo amor incondicional, pela credibilidade, pelo exemplo de caráter e principalmente por me mostrarem que todas as pessoas são iguais perante o Criador, devendo ser tratadas como tal. Agradeço pelo esforço para garantir que seus filhos tivessem uma boa educação e pelo exemplo de matrimônio; Aos meus irmãos, Érika Régia de Lima Queiroz e Edson Maia de Queiroz Neto, por estarem sempre presentes, seja nas alegrias ou na tristeza; agradeço-lhes pela confiança e por acreditarem em meu potencial, sempre me incentivando a lutar pelos meus sonhos; À Neudete de Sousa Oliveira (Dedê), por todos esses anos de dedicação à família, sempre disposta a fazer nossos caprichos; você é uma segunda mãe para mim e para meus irmãos. Ao meu primo Vanderilo Rodrigues de Oliveira Júnior (In Memorian), por ter me recebido em sua casa, por toda ajuda nos primeiros passos dessa caminhada. Obrigado pelos momentos alegres que você nos proporcionou, saudades!!; À minha noiva, Thamires Soares Guerreiro, pelo carinho, compreensão e amor dedicado; minha baixinha, você é muito importante para mim! Você é uma das razões da minha luta; À Maria Lúcia de Lima Xavier (tia e madrinha), pelo apoio e ajuda fundamental nos primeiros anos da minha vinda para Fortaleza; À Vera Lúcia de Lima Xavier (tia), pelo apoio, pela disposição e o interesse no meu crescimento; À amiga Anelise Maria Costa Vasconcelos Alves, pela amizade incondicional que faz eu me sentir mais seguro e confiante; obrigado pela credibilidade e principalmente pela sinceridade prestada; Às amigas e colegas de laboratório Ana Caroline Moura Rodrigues, Juliana Ribeiro e Rafaele Almeida e ao amigo João Batista e Silva Júnior (Jota), pela participação e cooperação neste trabalho durante as coletas no CCZ e UHV-FAVET; À toda a equipe da UHV-FAVET pelo apoio nas coletas, em especial aos colegas médicos veterinários: Dra. Érika, Dr. Reginaldo e Dr. Marcio. 6

7 À professora Dra. Diana Célia Sousa Nunes Pinheiro por ter aceito ser minha co-orientadora e por toda atenção dispensada durante minhas dúvidas e na elaboração do artigo científico; À minha orientadora Professora Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua, pela oportunidade dada há seis anos quando dei os primeiros passos na iniciação científica. Pelos ensinamentos, orientação e principalmente pelo exemplo a qual almejo seguir; Ao Dr. Alexander Amaral Medeiros, Dra. Evanisa Alves Ventura e toda a equipe do Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) de Fortaleza, por todo apoio para que esse trabalho de concretizasse; À Dra. Fernanda Cristina Macedo Rondon, por toda a atenção dispensada e pela disposição em ajudar. Mesmo naqueles dias mais tumultuados ela sempre arranja um tempinho para as nossas dúvidas e sugestões. Sou muito grato a você, muito obrigado pela confiança, paciência e por ser essa amiga que você é; À Professora Dra. Sthenia Santos Albano Amóra pela confiança em propor que eu realizasse esse trabalho e pela ajuda durante todo o decurso do mestrado, sempre muito atenciosa e disposta a ajudar; À Dra. Ana Lourdes por sempre compartilhar seu tempo com conselhos, gestos de amizade e ensinamentos; Às doutorandas Lorena Mayana Beserra de Oliveira, Iara Térsia Freitas Macedo, pela solidariedade e ensinamentos compartilhados e por toda atenção dispensada no decorrer desse período. A CAPES que proveu apoio financeiro, sob a forma de bolsa de estudos, durante a minha passagem pelo mestrado. 7

8 RESUMO A leishmaníase visceral (LV) é um grave problema de saúde pública no mundo e o cão é o seu principal reservatório. Na atualidade, a LV tem se expandido para muitos centros urbanos do Brasil, como conseqüência principalmente de falhas nas medidas de controle direcionadas ao reservatório doméstico, que se traduzem nos tipos de diagnósticos utilizados e na demora dos seus resultados. Um novo método de diagnóstico rápido, Dual Path Platform (DPP ) baseado na imunocromatografia, está sendo testado. Assim, o principal objetivo desse estudo foi contribuir para o controle da leishmaníase visceral canina (LVC), através da validação do teste rápido DPP para detecção de anticorpos anti-leishmania chagasi. O teste imunocromatográfico rápido (DPP Bio- Manguinhos ) e o ensaio imunoenzimático (EIE Bio-Manguinhos ) foram validados usando o teste de imunofluorescência indireta (IFI Bio-Manguinhos ) como padrãoouro. Foram examinamos 103 cães divididos em três grupos com diferentes sinais característicos de leishmaníase visceral: assintomáticos (n = 35), oligossintomáticos (n = 31) e sintomáticos (n= 37). Amostras de sangue foram coletadas da veia cefálica dos cães obtendo-se soro utilizado no IFI e EIE, enquanto que foi coletada uma gota de sangue da ponta da orelha de cada cão para a realização do DPP. A análise dos dados foi realizada sobre o total das amostras e sobre os grupos dos diferentes sinais clínicos, usando uma tabela de contingência 2 x 2 e analisados pelo GraphPad PRISM TM 5.0. O DPP sobre o total das amostras, independente de sinais, mostrou sensibilidade de 56,1% e especificidade de 100% quando comparado ao IFI. Quando o DPP foi usado no diagnóstico de cães assintomáticos a sensibilidade foi de 12% e a especificidade de 100%. Examinando cães oligossintomáticos, a sensibilidade foi de 52,4% e especificidade de 100%. Para cães sintomáticos, a sensibilidade e a especificidade do DPP foram de 88,9% e 100%, respectivamente. O teste de EIE sobre o total das amostras, independente dos sinais, mostrou sensibilidade de 50% e especificidade de 100%. Quando EIE foi usado no diagnóstico de cães assintomáticos a sensibilidade foi de 4% e a especificidade de 100%. Examinando cães oligossintomáticos, a sensibilidade do EIE foi de 38,1% e a especificidade de 100%. Para cães sintomáticos a sensibilidade e a especificidade do EIE foram de 88,9% e 100%, respectivamente. Em conclusão, o DPP apresentou elevada sensibilidade no diagnóstico de cães sintomáticos, mas baixa sensibilidade em cães assintomáticos e oligossintomáticos; porém o DPP apresentou desempenho superior aos obtidos pelo EIE, sugerindo que o 8

9 DPP pode ser usado como teste de triagem sorológica do programa de controle da leishmaníase visceral canina. Palavras Chave: Diagnóstico. Cães. Leishmaníase Visceral. Sorologia. 9

10 ABSTRACT Visceral leishmaniasis (VL) is a major public health problem in the world and the dog is the main reservoir for this disease. Currently, the VL has spread to many urban centers in Brazil, mainly as a result of failures in control measures aimed at the domestic reservoir, which are reflected the type of diagnosis used and the delay of its results. A new method for rapid diagnosis, Dual Path Platform (DPP ), based on immunochromatography is being tested. Thus, the main objective of this study was to contribute to the control of canine visceral leishmaniasis (CVL), by validating the DPP rapid test for detection of anti-leishmania chagasi antibodies. The immunochromatographic test (DPP Bio-Manguinhos ) and Enzyme-linked immunosorbent assay (EIE Bio-Manguinhos ) have been validated using Indirect Immunofluorescence (IFI Bio-Manguinhos ) as the gold standard. We examined 103 dogs divided into three groups based on different clinical signs of visceral leishmaniasis: asymptomatic (n = 35), oligosymptomatic (n = 31) and symptomatic (n = 37). Blood samples were collected from the cephalic vein to obtain serum for use with the IFI and EIE. A drop of blood from the tip of the ear was also collected from each dog to utilize with the DPP test. Data analysis was performed on the total sample and group of different clinical signs using a contingency table 2 x 2 and analyzed by GraphPad PRISM TM 5.0. For the total sample, regardless of disease signs, DPP showed sensitivity of 56.10% and specificity of 100% when compared to IFI. When DPP was used in the diagnosis of asymptomatic dogs, the sensitivity was 12% and the specificity was 100%. Examining oligosymptomatic dogs, DPP sensitivity was 52.4% and the specificity was 100%. For symptomatic dogs DPP, the sensitivity and specificity were 88.9% and 100% respectively. EIE on total sample, regardless of signs, showed a sensitivity of 50% and specificity of 100%. When EIE was used in the diagnosis of asymptomatic dogs, the sensitivity was 4% and the specificity 100%. Examining oligosymptomatic dogs, EIE sensitivity was 38.10% and the specificity was 100%. For symptomatic dogs EIE sensitivity and specificity were 88.9% and 100% respectively. In conclusion, the DPP showed high sensitivity in the diagnosis of symptomatic dogs, but low sensitivity in asymptomatic and oligosymptomatic dogs, however the DPP showed superior performance to those obtained by EIE, suggesting that the DPP can be used as serological screening test control program of canine visceral leishmaniasis. 10

11 Keywords: Diagnosis. Dogs. Visceral Leishmaniasis. Serology. 11

12 LISTA DE FIGURAS Pág Figura 1. Formas amastigotas (esquerda) e promastigotas (direita) de Leishmania spp Figura 2. Vetores do gênero Lutzomyia spp, a-fêmea, b-macho... Figura 3. Ciclo clássico de transmissão de Leishmania spp Figura 4. Número de casos e incidência de leishmaníase visceral. Ceará, 2002 a Figura 5. 5a. Cão com dermatite grave, alopecia, hipotricose e hiperqueratose. 5b. Cão com uveíte grave... Figura 6. Teste imunocromatográfico Dual Path Platform (DPP )

13 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Validação do DPP usando IFI como padrão-ouro de acordo com cães assintomáticos, oligossintomáticos e sintomáticos e sobre o total das amostras, com grau de concordância Kappa (к)...44 Tabela 2. Validação do EIE usando IFI como padrão-ouro de acordo com cães assintomáticos, oligossintomáticos e sintomáticos e sobre o total das amostras, com grau de concordância Kappa (к)...44 Tabela 3. Detecção de anticorpos anti-leishmania pelos testes DPP, IFI e EIE no diagnóstico da leishmaníase visceral canina de acordo com as formas clínicas da doença

14 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS WHO Organização Mundial de Saúde LV Leishmaníase Visceral UECE Universidade Estadual do Ceará PH Potencial Hidrogênio Iônico MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento DNA Ácido desoxirribonucleico PCR Reação de polimerase em cadeia RIFI Reação de imunofluorescência indireta ELISA CCZ Ensaio imunoenzimático indireto Centro de Controle de Zoonoses µl Microlitros ml Mililitros kg Quilograma g Grama cm Centímetro C Graus Celsius % Porcentagem 14

15 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Generalidades sobre a Leishmaníase Visceral Definição Agente Etiológico e Taxonomia Ciclo Biológico Epidemiologia Resposta imunológica às leishmaníases Apresentação Clínica Controle DIAGNÓSTICO DA LEISHMANÍASE VICERAL CANINA Diagnóstico clínico Métodos parasitológicos Métodos moleculares Métodos sorológicos JUSTIFICATIVA HIPÓTESE CIENTÍFICA OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS CAPÍTULO CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APÊNDICES

16 INTRODUÇÃO As leishmaníases são doenças causadas por protozoários flagelados pertencentes ao gênero Leishmania, com uma grande diversidade de manifestações clínicas. Apresentam uma incidência anual de 2 milhões de casos humanos, sendo casos de leishmaníase visceral (LV), caracterizada como doença crônica e fatal quando não tratada (WHO, 2010). É causada por Leishmania donovani na Índia e no leste da África, por L. infantum na Europa e norte da África (LUKES et al., 2007, REY, 2008) e nas Américas é causada pelo protozoário Leishmania chagasi (sin. Leishmania infantum) (MOREIRA et al., 2007) e transmitida principalmente por Lutzomyia longipalpis, sendo o cão o principal reservatório doméstico do parasita (SOLANO-GALLEGO et al., Índia, Bangladesh, Nepal, Sudão e Brasil são responsáveis por 90% dos casos registrados no mundo (WHO, 2010). No Brasil, a LV é uma doença endêmica com registro de surtos freqüentes e em franca expansão, ocorrendo registro de casos da doença em áreas antes consideradas livres, como na região Sul (KRAUSPENHAR, et al., 2007; THOMAZ-SOCCOL et al., 2009). No Estado do Ceará, nordeste brasileiro, a doença encontra-se disseminada e a cidade de Fortaleza concentra a maior incidência em humanos (CEARÁ, 2011). Em relação à população canina de Fortaleza, levantamento epidemiológico demonstrou que a doença está difundida tanto nos cães domiciliados quanto nos cães de movimento irrestrito (RONDON et al., 2008). O Ministério da Saúde do Brasil na busca do controle da LV preconiza a eutanásia de cães soropositivos, o controle do vetor, diagnóstico precoce e tratamento de casos humanos (BRASIL, 2006). No entanto o impacto dessas medidas não tem surtido o efeito esperado na redução de casos humanos, determinando assim a necessidade de reavaliação das ações propostas. (WHO, 2010). Por isso, um correto diagnóstico é um importante passo para evitar a eutanásia desnecessária de cães e a transmissão da doença, pois assim evita-se que o cão infectado permaneça no ambiente como fonte de infecção (FERREIRA et al., 2008). Em cães, o diagnóstico clínico isolado da doença não é suficiente para detectar animais positivos, devido ao largo espectro de sinais clínicos, desde animais saudáveis a casos em estágio avançado da doença (CAMARGO; LANGONI et al., 2006). O diagnóstico definitivo da LV pode ser obtido através da demonstração de amastigotas em tecido do animal infectado ou de promastigotas em cultura ou através da detecção do 16

17 DNA utilizando a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Infelizmente, estes métodos requerem procedimentos invasivos, um laboratório bem equipado e técnicos treinados, o que é atualmente inviável em inquéritos epidemiológicos (BRASIL, 2006; GOMES et al., 2008; LIMA et al., 2010). Os métodos sorológicos são os mais utilizados em levantamentos epidemiológicos, sendo os mais empregados o teste de Imunofluorescência Indireta (IFI), Ensaio Imunoenzimático (ELISA) e teste imunocromatográfico rápido (QUEIROZ et al., 2009; PALTRINIERI et al., 2010). O teste imunocromatográfico DPP (Bio-Manguinhos ) é um teste qualitativo para detecção de anticorpos anti-leishmania que utiliza a proteína recombinante K39 (rk39) como antígeno. Esta proteína é o produto de um gene clonado a partir de L. chagasi e que contém uma repetição de 39 aminoácidos conservados entre as espécies viscerotrópicas de Leishmania (Leishmania donovani, L. infantum e L. chagasi). A presença de anticorpos anti-rk39 é indicativo de infecção, e ainda não foi relatado a reatividade com outros tripanossomatídeos (BURNS-JR et al., 1993; BISUGO et al., 2007). Uma das falhas apontadas no controle da leishmaníase visceral canina (LVC) é o longo intervalo de tempo, de 30 a 80 dias, entre o diagnóstico e a retirada dos cães positivos do ambiente, favorecendo a transmissão da doença (LIRA et al., 2006). Desta forma, novas alternativas de diagnóstico são necessárias para auxiliar no controle desta enfermidade e o uso do DPP pode ser um recurso para obtenção de resultados mais eficientes, precisos e confiáveis do diagnóstico da LVC, impedindo que reservatórios transmitam o parasita. Desta forma, o objetivo desse estudo foi contribuir para o controle da leishmaníase visceral canina (LVC), através da validação do teste imunocromatográfico rápido DPP para detecção de anticorpos anti-leishmania chagasi, em cães com e sem sinais clínicos da doença e comparar seus resultados com o teste de Ensaio Imunoenzimático (EIE ), de Bio-Manguinhos. 17

18 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Generalidades sobre a Leishmaníase Visceral Definição A leishmaníase visceral (LV) é uma zoonose sistêmica potencialmente fatal quando não tratada. É conhecida por: calazar, barriga d água, entre outras denominações. Caracteriza-se pela infecção de fagócitos mononucleares pelo protozoário L. chagasi (sin. L. infantum). No Brasil é uma doença endêmica e até o momento seu principal transmissor é o inseto Lutzomyia. longipalpis (BARATA et al, 2004; BRASIL, 2006). Esta enfermidade é um grande problema de saúde pública em mais de 88 países, possuindo uma incidência anual de 500 mil casos humanos (WHO, 2010). Esta zoonose grave afeta milhões de cães na Europa, Ásia, Norte da África e América do Sul (DUPREY et al., 2006) Agente Etiológico e Taxonomia L. chagasi faz parte do Complexo donovani que abrange todas as espécies de leishmânias ditas viscerotrópicas. Durante seu ciclo vital as leishmânias apresentam duas formas distintas, amastigota, encontrada dentro de células do sistema fagocítico mononuclear do hospedeiro vertebrado e promastigota, no tubo digestivo do hospedeiro invertebrado (Fig. 1) (REY, 2008). Os agentes etiológicos da LV são protozoários classificados taxonomicamente como pertencentes ao Reino Protista (HAEKEL 1886); Subreino Protozoa (GOLDFUSS 1817); Filo Sarcomastigophora (HONIBERG ; BALAMUTH 1963); Subfilo Mastigophora (DIESING 1866); Classe Zoomastigophora (CALKINS 1909); Ordem Kinetoplastida (VICK KERMAN 1976); Subordem Trypanosomatina (KENT 1880); Família Trypanosomatidae (GROBBEN 1905); Gênero Leishmania (ROSS 1903); Subgênero Leishmania (SAF JANOVA 1982) e Espécies Leishmania donovani (LAVERAN ; MENSIL 1903), L. infantum (NICOLE 1908) e L. chagasi (CUNHA ; CHAGAS 1937) (CABRERA, 1999). 18

19 a b Figuras. 1a. Formas amastigotas (esquerda) e 1b. promastigotas (direita) de Leishmania spp. A seta vermelha indica amastigotas parasitando macrófago. A seta preta indica o cinetoplasto. Fonte: e Ciclo biológico O ciclo biológico de L. chagasi é do tipo heteroxênico, envolvendo como principal transmissor as fêmeas de L. longipalpis e os vertebrados que funcionam como hospedeiros e reservatórios (GOMES et al., 1995; BRASIL, 2006). No velho mundo a transmissão dos parasitas Leishmania spp ocorre através de flebotomíneos pertencentes ao gênero Phlebotomus e no novo mundo através do gênero Lutzomyia (Fig. 2), que são encontrados em regiões de climas quentes e temperados, apresentando atividade crepuscular e pós-crepuscular (RATH et al., 2003). A infecção do vetor ocorre pela ingestão, durante o repasto sanguíneo, de amastigotas de Leishmania spp existentes no interior dos macrófagos, células do Sistema Mononuclear Fagocitário, presentes na pele do hospedeiro infectado. Na porção média do tubo digestivo do inseto, as amastigotas transformam-se em promastigotas, e se multiplicam até originarem as promastigotas metacíclicas infectantes. O parasita leva aproximadamente de 6 a 9 dias para completar seu desenvolvimento no vetor, mas esse tempo pode variar dependendo da espécie de flebotomíneo. Ainda é escasso o conhecimento acerca da longevidade e da fecundidade de flebotomíneos infectados por Leishmania spp (KAMHAWI et al., 2006). 19

20 Figura 2: Vetores do gênero Lutzomyia spp, a-fêmea, b-macho. Fonte: Durante o processo de digestão do sangue, ingerido pelo flebotomíneo, há formação de uma matriz, formada principalmente por quitina, conhecida como matriz peritrófica, cuja função é proteger o epitélio intestinal do inseto. Porém, essa matriz peritrófica acaba por proteger as formas promastigostas do parasita da ação de enzimas digestivas do flebotomíneo. A matriz peritrófica garante proteção por tempo suficiente para que cerca de 50% das formas iniciais do parasita, ingeridas pelo inseto, se diferenciem em formas mais resistentes (KAMHAWI et al., 2006; PIMENTA et al., 1997). Após resistirem à ação das enzimas presentes na porção média do tubo digestivo do vetor as leishmânias escapam da matriz peritrófica, através da excreção da enzima quitinase, aderem ao epitélio intestinal onde completam o seu ciclo de vida dentro do inseto vetor, se desenvolvendo e se diferenciando até darem origem às formas infectivas (LEHANE et al., 1997). Vale ressaltar que o crescimento parasitário no vetor só será abundante se, após o repasto sanguíneo infectante, a fêmea vier a alimentar-se de sucos vegetais ou de substâncias açucaradas. Se, em lugar disso, houver nova refeição de sangue, por volta do quarto ou quinto dia, os flagelados degeneram ou a infecção torna-se leve. Assim, será improvável que os parasitos possam ser inoculados em novos hospedeiros pela picada dos insetos (REY, 2008). No Brasil, a transmissão se dá pela picada dos vetores L. longipalpis e acreditase que L. cruzi em alguns municípios de Mato Grosso do sul (BRASIL, 2006), porém admite-se a hipótese da transmissão entre a população canina pela ingestão de carrapatos Rhipicephalus sanguineus infectados (COUTINHO, 2005; PAZ et al., 2010) e transmissão venérea (SILVA et al., 2009). Porém, não existem evidências sobre a importância epidemiológica destes mecanismos de transmissão para humanos ou na 20

21 manutenção da enfermidade. Até o momento, só foi comprovada a transmissão direta no cão, através do coito (PAZ et al., 2010) Epidemiologia Figura 3. Ciclo clássico de transmissão de Leishmania spp Fonte: Organização Mundial da saúde (2008) A LV é encontrada nas Américas Central e do Sul, Ásia, África e região do Mediterrâneo. Nas Américas a LV ocorre desde o México até a Argentina. A LV foi descrita em 12 países, porém Venezuela, Colômbia, Bolívia, Equador, Peru e Brasil apresentam prevalência mais elevada (AGUILLAR et al., 1998; DAVIES et al., 2000). A LV inicialmente descrita como doença de ambiente silvestre ou rural, na atualidade é apontada como doença reermegente, com incidência crescente e em franco processo de urbanização em cidades de grande e médio porte (ALVES ; BEVILACQUA, 2004; MONTEIRO et al., 2005; BRASIL, 2006). O cão é considerado o principal reservatório doméstico de L. chagasi, tanto em ambiente urbano quanto rural. Os reservatórios silvestres da doença são raposas (Cerdocyon thous), marsupiais (Didelphis albiventris) e roedores (Nectomys squamipes) (DANTAS-TORRES et al., 2006; REY, 2008). A importância do cão como reservatório de L. chagasi deve-se ao fato de apresentar intenso parasitismo cutâneo e ser capaz de transmitir o parasita ao vetor mesmo assintomático, constituindo-se em elo essencial para disseminação e amplificação de focos e normalmente antecedendo o acometimento de casos humanos (MADEIRA et al., 2004; NUNES et al., 2010). No Brasil, historicamente, os casos de LV concentravam-se na região Nordeste. Entretanto, nos últimos anos, as regiões sudeste e norte assumiram uma proporção significativa desses casos. Recentemente, ocorreram relatos de LVC no Paraná 21

22 (THOMAZ-SOCCOL et al., 2009) e no Rio Grande do Sul (KRAUSPENHAR, et al., 2007) anteriormente consideradas áreas livres da doença. No Ceará, observa-se uma incidência crescente da LV nos últimos anos (Fig. 4), sendo que em 2008 foram notificados 814 casos humanos, sendo 576 confirmados em 97 municípios. Destes, foram confirmados 31 óbitos, sendo 15 em Fortaleza. Em 2009, foram confirmados 666 casos, em 102 municípios, com 33 óbitos, sendo 10 óbitos em Fortaleza, atingindo todas as faixas de idade, embora 36% tenham ocorrido em crianças de 1 a 4 anos (243 casos). Quanto ao sexo, apesar de 64% terem sido do sexo masculino, ocorreram casos no sexo feminino em todas as faixas de idade. A letalidade é elevada (5,6% em 2008 e 5% em 2009). Os municípios com maior número de casos confirmados em 2009 foram Fortaleza (390 casos), Sobral (92 casos) e Barbalha (25 casos) (CEARÁ, 2009; CEARÁ, 2011). A ampla distribuição geográfica da LV deve-se a urbanização desordenada, migração humana constante, desmatamento acentuado, adaptação do vetor a novos ecótopos e a presença do cão, reservatório da LV no ambiente doméstico (ALVES ; BEVILACQUA, 2004; LAINSON ; RANGEL, 2005). Figura 4: Número de casos e incidência de leishmaníase visceral. Ceará, 2002 a Fonte: Secretária da Saúde do Estado do Ceará Resposta Imunológica às leishmaníases Estudos recentes indicaram que a patogenia das Leishmaníases se processa por uma resposta não adequada por parte do sistema imunológico, sendo relatado que o 22

23 surgimento da doença, bem como sua evolução seriam consequência de complexas interações entre o parasita e a resposta imune desencadeada pelo hospedeiro (MANNA et al., 2006; MIRANDA et al., 2007; BANETH et al., 2008). Para que ocorra o estabelecimento da infecção por Leishmnia spp é necessário que o parasita adentre as células fagocitárias (monócitos, macrófagos residentes e as células dendríticas) e polimorfonucleares neutrófilos. As células fagocitárias da imunidade inata utilizam mecanismos químicos e celulares de resposta rápida para controlar o crescimento e/ou eliminação do agente invasor (ABBAS et al., 2008; PALTRINIERI, 2010). Após a fagocitose dos protozoários, estes ativam mecanismos intrínsecos capacitando-os a resistirem à ação de enzimas hidrolíticas e espécies reativas ao oxigênio, (PALTRINIERI, et al., 2010 ASSCHE et al., 2011). Os protozoários ao conseguirem escapar dos mecanismos da resposta inata, podem desenvolver dois tipos de respostas adquiridas: uma celular, com participação dos linfócitos T, e outra do tipo humoral, com a produção de anticorpos e envolvimento de linfócitos B (ABBAS et al., 2008). A LV por ser provocada por um parasita estritamente intracelular, necessita da participação dos linfócitos T helper 1 (Th1) e células de memória, presentes na resposta celular, para que os macrófagos consigam controlar de modo eficaz a infecção (ABBAS et al., 2008). Contrariamente, os animais que desenvolvem resposta predominantemente do tipo humoral, com a participação de células T helper 2 (Th2) e elevada produção de anticorpos, apresentam quadros clínicos severos com prognóstico reservado, devido à deposição de complexos imunes (CIARAMELLA ; CORONA, 2003; MIRANDA et al., 2007). Quando a resposta celular por linfócitos Th1 é majoritária (Th1 > Th2), observase um padrão de resistência à infecção por Leismania spp, mediada por interferon-γ (IFN- γ), fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e as interleucinas IL-2 e IL-12; todos com características protetoras em relação à doença, por ativarem macrófagos responsáveis pela eliminação dos parasitas (FERRER, 2002; CIARAMELLA ; CORONA, 2003; BARBIÉRI, 2006 ). Ao contrário, quando a resposta celular por linfócitos Th2 é predominante e mediada pelas interleucinas IL-4, IL-6 e IL-10 observa-se maior susceptibilidade, a progressão clínica da doença (CIARAMELLA ; CORONA, 2003). É relatado que em zonas endêmicas, casos de leshmaníase visceral podem surgir secundariamente a fatores que provocam imunossupressão, como várias parasitoses, 23

24 infecções, medicamentos e doenças crônicas. Todos esses fatores levam à ruptura do equilíbrio entre o hospedeiro e o parasita, alterando o tipo de resposta imune que o animal desenvolve (FERRER, 2002) Apresentação clínica A LV é caracterizada por apresentar evolução crônica com envolvimento sistêmico através de sinais como hepatoesplenomegalia e caquexia podendo levar à morte se não tratada. No entando, dependendo da fase da doença e do tipo de resposta imune do hospedeiro, pode apresentar-se assintomático (SIMÕES-MATTOS et al., 2002; MAIA-ELKHOURY et al., 2008). Na doença canina, de acordo com as manifestações clínicas, o hospedeiro pode ser classificado como assintomático, que não apresentam sinais clínicos característicos de infecção; oligossintomático, onde se observa a presença de linfoadenopatia, leve perda de peso e alterações dermatológicas; e sintomático, ou seja, diversos sinais da doença são evidentes, como alterações dermatológicas, incluindo alopecia, dermatite furfurácea e úlceras, bem como onicogrifose, linfadenopatia, emagrecimento acentuado, ceratoconjuntivite e paresia dos membros posteriores (MANCIANTI, et al., 1988; BRASIL, 2006). Figuras. 5a. Cão com dermatite grave, alopecia, hipotricose e hiperqueratose. 5b. Cão com uveíte grave. Fonte: adaptado de Ciaramela ; Corona, A LVC por ser uma doença de sintomatologia inespecífica, é difícil de ser diagnosticada apenas pela história do animal e apresentação clínica (KONTOS; 24

25 KOUTINAS, 1993). Os responsáveis pela grande variedade de sinais clínicos presentes na LVC são os complexos imunes que se depositam em vários órgãos e tecidos dos vertebrados, como pele, vasos sanguíneos, tecidos oculares e em várias articulações, o que conduz ao aparecimento de diversos sintomas, como úlceras cutâneas e das pontas das orelhas, epistáxis, uveíte, conjuntivite e episclerite imunomediada e claudicação por poliartritre (KONTOS; KOUTINAS, 1993; CIARAMELLA; CORONA, 2003; TROTZ-WILLIAMS; GRADONI, 2003) Controle A estratégia para o controle da LV no Brasil inclui a identificação precoce e o tratamento de casos humanos, borrifação de inseticidas de poder residual vinculada aos casos humanos. Recomenda-se também, o destino adequado do lixo, a remoção de entulhos e da matéria orgânica do peridomicílio, além da identificação de cães sorologicamente positivos, seguida pela suas eutanásias e atividades de educação em saúde (BRASIL, 2006). De acordo com Gontijo ; Melo (2004) as medidas de controle preconizadas pelo Ministério da Saúde não tem sido totalmente efetivas, uma vez que doenças transmitidas por vetores biológicos associados a reservatórios domésticos e a aspectos ambientais são reconhecidamente de difícil controle, aliado ao recente processo de urbanização da doença e a falta de conhecimento sobre esses focos. Em 2003, o Ministério da Saúde promoveu mudanças no programa de controle da LV visando melhorar as normas de vigilância e controle e as recomendações passaram a ser específicas para cada situação epidemiológica e de acordo com cada área a ser trabalhada. Dessa forma, os municípios foram classificados conforme a média da incidência dos casos de LV humana dos últimos cinco anos, sendo assim dispostos: área de transmissão esporádica (< 2,4 casos positivos); área de transmissão moderada (2,4 a 4,4 casos); área de transmissão intensa (>4,4 casos) e áreas silenciosas, estas foram incorporadas ao programa para evitar ou minimizar os problemas referentes à leishmaníase visceral em novas áreas (BRASIL, 2006). Nos últimos anos, surgiram novas alternativas para o controle e prevenção da LV como o uso de coleiras impregnadas com deltametrina que conseguiram controlar a incidência da doença canina (KILLICK-KENDRICK et al., 1997), assim como, o surgimento da vacina para os cães (LEMESRE et al, 2007). As coleiras impregnadas 25

26 com deltametrina (Scalibor ) demonstraram não só uma redução na taxa de alimentação dos flebotomíneos (DAVID et al., 2001; REITHINGER et al., 2004), como também diminuição do tempo de vida dos flebotomíneos, o que levou a diminuição da taxa de propagação da doença (REITHINGER et al., 2004). A primeira vacina desenvolvida para o controle da LVC, Leishmune produzida pela empresa Fort Dodge Saúde Animal, utiliza o antígeno purificado FML (complexo glicoprotéico) de L. donovani que nos cães vacinados promoveu um aumento da resposta imune celular do tipo Th1, ocorrendo regressão dos sinais clínicos e aparentemente, esta alternativa parece bloquear a transmissão da doença (SARAIVA et al., 2006; DANTAS-TORRES, 2006). Aparentemente o aumento dos títulos de IgG2 está associado com a expansão da produção de interferon-γ e interleucina-2 pelas Th1, promovendo proteção e resistência (LEMESRE et al., 2007). Recentemente, através da publicação do Ato n.10, em outubro de 2011 no diário oficial da união, o MAPA renovou o registro da vacina Leishmune, através do deferimento de solicitação de correção de fórmula, o que autoriza a continuidade da comercialização dessa vacina no Brasil (MAPA, 2011). Em 2008, entrou no mercado brasileiro uma nova vacina, Leish-Tec da empresa Hertape Calier Saúde Animal, que utiliza como antígeno a proteína recombinante A2, que é específica do estágio amastigota, sendo descrita em várias espécies de Leishmania spp. Resultados preliminares mostraram que os animais vacinados desenvolveram perfil imunológico protetor (Th1), ou seja, alta resposta imune celular. Ademais não desenvolveram reação pós-vacinal e permaneceram soronegativos frente aos exames sorológicos de rotina (COELHO et al., 2003, ZANIN et al., 2007, FERNANDES et al., 2008). No entanto, ainda faltam os últimos resultados relacionados à fase III de teste de eficácia de vacinas exigidos pelo MAPA DIAGNÓSTICO DA LEISHMANÍASE VISCERAL CANINA O diagnóstico da leishmaníase visceral canina pode ser realizado através de métodos clínicos, parasitológicos, sorológicos e moleculares Diagnóstico clínico 26

27 Em áreas endêmicas o diagnóstico da LV é dificultado pelo fato dos sintomas não serem patognomônicos da doença. Desta forma o diagnóstico clínico isoladamente, não é suficiente para identificar um cão infectado (CAMARGO; LANGONI, 2006), tornando a utilização de exames laboratoriais de suma importância para confirmação diagnóstica (BRASIL, 2006) Métodos parasitológicos A observação direta do parasita fornece prova definitiva da infecção, pois uma vez que o parasito é visualizado, a infecção é confirmada sem qualquer dúvida. A pesquisa de parasitos pode ser feita em esfregaços de medula óssea, obtidos por punção de costela, da crista ilíaca ou do fêmur, esfregaços de linfonodo e, muito raramente, esfregaços de baço ou ainda através de biópsia cutânea (FAYET, 1999; CIARAMELLA; CORONA, 2003; QUEIROZ et al., 2009). As amastigotas do parasita são reconhecidas por seu formato, que varia de esférico a ovóide, medindo cerca de 2 a 6 μm de diâmetro, contendo núcleo arredondado e cinetoplasto ligeiramente arredondado (IKEDA-GARCIA; FEITOSA, 2006). A parasitemia encontrada no exame parasitológico é muito variável, não tendo correlação com a intensidade da sintomatologia (PALTRINIERI et al., 2010). Em algumas situações é muito difícil observar parasitas, principalmente em animais em fase inicial da doença, sendo comum a ocorrência de resultados negativos. Dessa forma, este diagnóstico apresenta alta especificidade, mas a sua sensibilidade é baixa, de cerca de 50% no caso de esfregaços de medula óssea, decaindo para valores de 30% em esfregaços de linfonodo (FAYET, 1999). Quando os parasitas não são visíveis utiliza-se métodos parasitológicos indiretos, como, cultura a partir de aspirados de medula óssea e de linfonodos, através da utilização de meios específicos, como o Novy-MacNeal-Nicolle (NNN) ou o RPMI (TROTZ-WILLIAMS; GRADONI, 2003). As culturas são incubadas a uma temperatura de C obtendo-se crescimento de promastigotas após cinco dias. A inoculação em animais de laboratório, mais comumente hamsters, tem sido utilizada em estudos experimentais, contudo seu uso não tem valor prático no diagnóstico da doença devido à longa espera para se obter um resultado (BRASIL, 2006; IKEDA-GARCIA; FEITOSA, 2006; GOMES et al., 2008). 27

28 2.2.3 Métodos moleculares Dentre as mais modernas técnicas utilizadas para o diagnóstico das leishmaníases, destacam-se as técnicas moleculares. A reação em cadeia pela polimerase (PCR) é a que mais vem sendo utilizada em trabalhos sobre diagnóstico da LV canina (SOLANO-GALLEGO et al., 2001; GOMES et al., 2007). Esta técnica baseia-se na amplificação in vitro de seqüências de nucleotídeos específicas presentes no parasita, sendo um método bastante sensível e específico para detectar DNA de Leishmania spp em ampla variedade de amostras clínicas do homem, cães, reservatórios silvestres e vetores (GOMES et al., 2008). As leishmânias, como os outros membros da ordem Kinetoplastida, apresentam uma rede de moléculas de DNA circular denominado de DNA do cinetoplasto ou kdna, nas suas mitocôndrias. O kdna é formado por arranjos de maxicírculos e minicírculos, onde os minicírculos representam 95% do kdna. Os minicírculos são compostos por cerca de pares de bases (pb), apresentando uma região conservada entre os cinetoplastídeos, que contem cerca de pb que podem ser utilizados como alvo da PCR e uma região não conservada ou variável, que pode apresentar diferenças entre cepas de uma mesma espécie. (RAY, 1989; CAVALCANTI et al., 2008; GOMES et al., 2008). Em casos fortemente suspeitos, mas em que as técnicas sorológicas ou a observação direta do parasita são inconclusivas, indica-se a PCR (MANNA et al., 2007). Os estudos têm demonstrado resultados mais vantajosos com amostras de pele, conjuntiva, medula óssea e aspirados de linfonodos, com menor sensibilidade e especificidade quando o sangue periférico é utilizado como amostra, provavelmente devido ao número de parasitas presentes nesse tecido (SOLANO-GALLEGO et al., 2001; NUNES et al., 2007; FERREIRA et al., 2008). Em aspirado de medula óssea, a especificidade da PCR pode chegar a 100% e a sensibilidade entre 80-93,3%, sensibilidade bem superior quando comparados aos métodos diretos e cultura de parasitas que apresentam sensibilidade entre 50-60% (TAVARES, et al., 2003; MARTIN-SANCHEZ et al., 2004). Faz-se o uso principalmente da PCR convencional e da PCR em tempo real quantitativa (qpcr). A qpcr permite a monitorização das amplificações das seqüências específicas de DNA durante o decorrer da reação e possibilitam a eliminação da etapa laboriosa pós-amplificação (preparo do gel para eletroforese), convencionalmente 28

29 necessária para visualização do produto amplificado na PCR convencional (CAVALCANTI et al., 2008; MAIA; CAMPINO, 2008). Como uma das características da infecção por Leishmania spp é o animal apresentar parasitas em latência, as abordagens quantitativas são necessárias para elucidar o status de positivos dos cães pela PCR em cães de áreas endêmicas, facilitando a monitorização da carga parasitária e sua resposta ao tratamento, bem como o acompanhamento do desenvolvimento de novas vacinas (MARY et al., 2004 ; VITALE et al., 2004; FRANCINO et al., 2006). A qpcr é consideravelmente mais sensível que a PCR convencional, como demonstrando por Francino et al. (2006) que verificaram que a PCR convencional somente poderia ser positiva em amostras com carga parasitária superior a 30 Leishmania spp/ml, enquanto a qpcr detecta cargas parasitárias em concentrações maiores que 0,2 Leishmania spp/ml de amostra. Os resultados da qpcr tornam-se extremamente importantes quando se busca um diagnóstico sensível e rápido, particularmente em casos onde os diagnósticos sorológicos são duvidosos. Assim, pode-se observar que as vantagens da qpcr em relação à PCR convencional são inúmeras e incluem, rapidez na obtenção dos resultados, reprodutibilidade e capacidade quantitativa (CAVALCANTI et al., 2008; GOMES et al., 2008). Infelizmente, o elevado custo dos métodos moleculares não permite que sejam realizados de forma rotineira pelos laboratórios oficiais das leishmaníases, por requerer laboratórios bem equipados e habilidade técnica (BRASIL, 2006) Métodos sorológicos Os métodos sorológicos, de Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e o Ensaio Imunoenzimático (ELISA), são os mais utilizados tanto na prática clínica quanto em inquéritos epidemiológicos, sendo métodos preconizados pelo Ministério da Saúde (BRASIL, 2006). Utiliza-se com menor frequência outros testes sorológicos, como a imunodifusão, imunomigração rápida e o teste de aglutinação direta (FAYET, 1999). Os métodos diagnósticos utilizados em inquéritos epidemiológicos devem possuir alta sensibilidade e especificidade, pois através de uma alta sensibilidade consegue-se detectar o maior número de doentes, evitando a permanência de animais positivos na população e através de uma alta especificidade, evita-se que cães não infectados com o parasita pesquisado sejam sacrificados (ALVES; BEVILACQUA, 2004). 29

30 Reação de Imunofluoresçência Indireta RIFI A RIFI é indicada como referência pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) para o diagnóstico sorológico da LVC (GRADONI ; GRAMICCIA., 2000). É o teste de eleição para inquéritos epidemiológicos, por apresentar sensibilidade e especificidade adequadas, quando comparada a outras técnicas (ALVES; BEVILACQUA, 2004). No entanto, relata-se a ocorrência de reações cruzadas com outros tripanossomatídeos, como Leishmania braziliensis. (DA COSTA et al., 2003; MADEIRA et al., 2006a; MADEIRA et al., 2006b). O kit de Imunofluorescência Indireta (IFI-BioManguinhos ) é distribuído pelo Ministério da Saúde para laboratórios públicos, apresentando sensibilidade de 68% e especificidade de 87,5% (LIRA, 2006). Assim, a baixa especificidade observada no Kit IFI de Bio-Manguinhos deve-se provavelmente ao antígeno bruto de L. major-like que é empregado (LIRA et al., 2006). Este antígeno é inespecífico por se tratar de uma espécie de leishmânia causadora de leishmaníase cutânea sugerindo assim ocorrência de reações cruzadas com outros tripanossomatídeos. De acordo com Mancianti et al. (1996), a RIFI apresenta sensibilidade de 98,4% e especificidade de 100%, fato este observado quando utiliza-se o antígeno bruto de L. infantum, espécie causadora da leishmaníase visceral. Vale ressaltar, que no município do Rio de Janeiro, Brasil, cães soropositivos pelos testes sorológicos IFI e EIE de Bio-Manguinhos, demonstraram através de análises isoenzimáticas a infecção por L. braziliensis, co-infecção por L. chagasi e L. braziliensis e infecção por Trypanossoma caninum. Demonstrando que os kits IFI e EIE não são capazes de discriminar a infecção por diferentes tripanossomatídeos (SILVA et al., 2011). O material recomendado para a realização do IFI é o soro sangüíneo e o resultado considerado sororreagente é aquele que possua título igual ou superior ao ponto de corte que é a diluição de 1:40 (BRASIL, 2006). No entanto, a técnica de imunofluorescência indireta é mais usada nos levantamentos epidemiológicos no Brasil através do uso da coleta de sangue canino em papel de filtro, demonstrando resultados conflitantes. Figueiredo et al. (2010) trabalhando com 146 cães negativos à imunofluorescência indireta utilizando sangue em eluato de papel de filtro, detectaram que 34,9% e 6,8% desses cães foram positivos à imunofluorescência indireta e ao ELISA quando o soro foi utilizado, respectivamente. Demonstrando a possibilidade de 30

31 falsos negativos com a utilização de eluato de sangue, favorecendo a permanência do cão infectado no meio ambiente. Silva et al. (2011) utilizando 144 cães soropositivos ao IFI com o uso de eluato de sangue em papel de filtro, encontraram 28% e 22% de positividade quando se testou o soro dos mesmos animais no IFI e no EIE, respectivamente. O que demonstra uma elevada ocorrência de falsos positivos quando se utiliza o eluato de papel de filtro, levando à eutanásia de animais não infectados pelo programa de controle da leishmaníase visceral. O RIFI é um dos testes mais sensíveis, no entanto, um resultado negativo não exclui que o animal esteja afetado, uma vez que há animais que demoram algum tempo a desenvolver a resposta humoral e a atingir títulos de anticorpos considerados positivos. Assim, em animais clinicamente suspeitos ou com resultados duvidosos devese repetir o teste passadas 4 a 6 semanas ou recorrer a outro tipo de teste (BRASIL 2006). Ensaio Imunoenzimático (ELISA) O ELISA é bastante útil para análises de laboratório, possibilitando a análise de grande quantidade de amostras em pouco tempo (MAIA; CAMPINO, 2008), sendo, por isso, um teste mais rápido e de fácil execução (CAMARGO; LANGONI, 2006) quando comparado ao RIFI. A técnica de ELISA permite detectar baixos títulos de anticorpos e é acurado na identificação de casos assintomáticos (CÂNDIDO et al., 2008). Moreira et al. (2007) demonstraram que o ELISA utilizando antígeno bruto de L. chagasi obteve sensibilidade 95,65% em animais assintomáticos seguido de 87,8% para o grupo de sintomáticos, no entanto, obteve uma sensibilidade de apenas 68% para os animais oligossintomáticos e especificidade de 100% para todos os grupos de animais. Contudo, o kit ELISA (EIE - Bio-Manguinhos ), preconizado pelos órgãos da Saúde Pública que utiliza o antígeno solúvel e lisado de Leishmania major-like, possui uma sensibilidade 72% e especificidade 87,5% (LIRA et al., 2006). Esta diminuição na especificidade observada no kit EIE de Bio-Manguinhos pode ser devido ao uso de antígeno não específico para Leishmania viscerotropica. A sensibilidade e a especificidade desse método diagnóstico dependem do tipo de antígeno empregado (espécie ou forma evolutiva do parasita) e de outros fatores como tempo de incubação ou tipo de microplacas utilizadas (REITHINGER et al., 2002). 31

32 As técnicas que utilizam antígenos brutos são limitadas em termos de especificidade, apresentando reações cruzadas não somente com outras espécies da família Trypanosomatidae, mas também com outros organismos filogeneticamente distantes (GONTIJO; MELO, 2004). Rotineiramente os métodos sorológicos utilizam parasitas totais ou lisados, o que normalmente diminui a especificidade. Assim, pesquisas tem sido realizadas para a identificação de antígenos dominantes, que se caracterizam por induzir a formação de anticorpos específicos e detectáveis nos testes sorológicos, contribuindo para maior confiabilidade do diagnóstico sorológico (ALVES; BEVILACQUA, 2004) Assim, a busca por testes ELISA mais específicos, possibilitaram o emprego de novos antígenos, tais como, os antígenos recombinantes rk39, rk9 e rk26 ou purificados como as glicoproteínas de membrana gp63, gp72 e gp70, específicas do gênero Leishmania spp que aparentemente conferem grande sensibilidade ao teste sorológico (SCALONE et al., 2002; ROSATI et al., 2003). A proteína rk39 tem sido utilizada no diagnóstico da LV pela técnica de ELISA apresentando valores de sensibilidade maiores que 93% e especificidade variando de 84 a 100% (QU et al., 1994; ZIJLSTRA et al., 1998; BRAZ et al., 2002; De ASSIS et al., 2008; PEDRAS et al., 2008). Testes Imunocromatográficos Nos últimos anos vários testes imunocromatográficos rápidos comerciais foram desenvolvidos, utilizando como antígenos proteínas recombinantes como rk39 e rk26, como também a utilização de proteínas extraídas de bactérias, tais como as proteínas A e G, que fazem parte dos reagentes marcadores dos testes para o diagnóstico da LV humana (CARVALHO et al., 2003; CHAPPUIS et al., 2006; SUNDAR, et al., 2006; De ASSIS et al., 2008; WELCH et al., 2008,) e canina (REITHINGER et al., 2002; da COSTA et al., 2003; METTLER et al., 2005; BISUGO et al., 2007; LEMOS et al., 2008; LIMA et al., 2010). A maioria dos testes imunocromatográficos emprega anticorpos monoclonais anti-igg de cão e antígenos de Leishmania de diferentes fontes adsorvidos em membranas de nitrocelulose (GRADONI, 2002). Os antígenos que formam a linha teste são rk26 ou rk39, e o anticorpo anti-igg canino, constituindo a linha-controle. A presença de anticorpos anti-rk39 ou rk26 é indicativo de infecção, e ainda não foi 32

33 relatada a reatividade com outros tripanossomatídeos (BURNS-JR et al., 1993; BISUGO et al., 2007). Mais recentemente surgiu a marcação com o complexo proteína A adicionado de ouro coloidal. Essa técnica consiste na adsorção, pelas moléculas da proteína A, de partículas de ouro, muito pequenas (5-20 nm) e elétrondensas. A proteína A é extraída da bactéria Staphylococcus aureus e, além da afinidade pelo ouro coloidal, tem afinidade por uma região comum às moléculas das imunoglobulinas (segmento Fc), especialmente a IgG. Essa técnica tem sido utilizada em testes imunocromatográficos, apresentando grande precisão para localizar moléculas protéicas e grande resolução, pois as partículas de ouro coloidal são muito pequenas (MONGODIN et al., 2000; IIJIMA et al., 2011). Os graus de sensibilidade e especificidade de testes imunocromatográficos, que utilizam o antígeno recombinante rk39 em humanos, mostram sensibilidade que variam de 89-98% e especificidade que variam de % (CARVALHO et al., 2003; CHAPPUIS et al., 2006; SUNDAR, et al., 2006; de ASSIS et al., 2008; WELCH et al, 2008,). Em cães, os resultados diferem mais, mostrando sensibilidade que varia de 72-97,06% e especificidade de % (REITHINGER et al., 2002; da COSTA et al., 2003; METTLER et al., 2005; BISUGO et al., 2007; LEMOS et al., 2008; LIMA et al., 2010). Dual Path Platform (DDP ) é uma inovadora tecnologia de imunoensaio cromatográfico para testes de diagnóstico rápido, que foi desenvolvido pela empresa norte americana Chembio e a empresa nacional Bio-Manguinhos, Rio de Janeiro, Brasil. ( O teste DDP utiliza a proteína recombinante K39 (rk39) como antígeno, uma sequência de 39 aminoácidos clonada da região quinase específica de L. chagasi que tem sido amplamente avaliada no diagnóstico da LV canina (BURNS-JR et al., 1993). O DPP é caracterizado por ser rápido, pois o resultado é conhecido após 15 minutos da coleta da amostra biológica (soro, plasma e sangue total), é de fácil manipulação, pois não precisa de pessoa especializada para a sua execução. O antígeno rk39 de L. chagasi que pode promover maior sensibilidade e especificidade à técnica, portanto sua validação se faz necessária. 33