C o n tro le d e Q u a lid a d e e m C ito m e tria d e F lu x o. A n a P a u la d e A z a m b u ja

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1 C o n tro le d e Q u a lid a d e e m C ito m e tria d e F lu x o A n a P a u la d e A z a m b u ja

2 C la s s ific a ç ã o d o s P a d rõ e s d e F lu o re s c ê n c ia O c itô m e tro d e flu x o d e v e d ife re n c ia r e n tre o p ic o fra c o e a a u to flu o re s c ê n c ia n o c a n a l d e flu o re s c ê n c ia O s c o n ju g a d o s d e flu o ro c ro m o s : Devem ser fortes (bright) Minima sobreposição (spectral overlap ou spilltover) AcMo adequados

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4 Chave : Separar Sinais Positivos & Negativos Quais fatores determinam a separação? Erro na dispersão Emissão de Fótons Intensidade do Fluorocromo Autofluorescência Celular PMT A Relacionado ao Fluorocromo

5 Chave : Separar Sinais Positivos & Negativos Quais fatores determinam a separação? Detector Dinâmico do Intervalo Relacionado ao Citômetro Ruído Eletrônico Poder do Laser PMT A Filtros de qualidade pobre ou impróprios

6 Chave: Citometros e Reagentes bem caracterizados Quais fatores determinam a separação? lacionados ao Fluorocromo Relacionados ao Citôme tensidade de Fluorescência Detector Dinâmico de intervalo, APC mais brilhantes Qualidade fixada, Característica tofluorecência Celular gher in UV/Violet Region Ruído Eletrônico issão de Fótons Poder do Laser ixa para Fluorocromos vermelhos, Melhor mais alto tecção imperfeita para baixo sinal. ro na Dispersão racterística do painel de anticorpos, ais de outros canais resulta em tecção imperfeita de baixos sinais. Filtros Pobres/Impróprios

7 Chave: Citometros e Reagentes bem caracterizados Quais fatores determinam a separação? elacionados ao Fluorocromo Relacionados ao Citôme tensidade de Fluorescencia Detector Dinâmico de intervalo E, APC mais brilhantes Qualidade fixada, Característica De todas essas coisas voce pode utofluorecência Celular Ruído Eletrônico Higher in UV/Violet Region Medir missão de Fótons Otimizar Poder do Laser aixa para Fluorocromos vermelhos, Melhor mais alto etecção imperfeita para baixo sinal. e/ou Trabalhar-melhorias! rro na Dispersão Filtros Pobres/Impróprios Conhecer o citometro, reagentes, e estudar! aracterística do painél de anticorpos, nais de outros canais resulta em tecção imperfeita de baixos sinais.

8 C la s s ific a ç ã o d o s P a d rõ e s d e F lu o re s c ê n c ia Beads padronizadas sao usadas para determinadas funçoes. ALINHAMENTO COMPENSAÇAO CALIBRAÇAO DETERMINAÇAO DA PERFORMANCE DO INSTRUMENTO Linearidade, detecçao do threshold, variabilidades de análise QUANTIFICAÇAO DA INTENSIDADE DE FLORESCENCIA COMPARAÇAO INTRA-INSTRUMENTO E INTERINSTRUMENTOS

9 C la s s ific a ç ã o d o s P a d rõ e s d e F lu o re s c ê n c ia

10 C a lib ra ç ã o e c o m p e n s a ç ã o d o c itô m e tro d e flu x o O s v a lo re s d o s d e te c to re s d e flu o re s c ê n c ia s ã o a ju s ta d o s d e m o d o a re tira r a flu o re s c ê n c ia d e fu n d o, a q u a l p o d e re s u lta r d e u m a u n iã o n ã o e s p e c í fic a d e a n tic o rp o s n o c o n tro le is o tí p ic o e d a a u to flu o re s c ê n c ia d a s c é lu la s. A s d e fin iç õ e s d e c o m p e n s a ç ã o s ã o a ju s ta d a s p a ra c o rrig ir a s o b re p o s iç ã o e s p e c tra l e d e p e n d e m d a s v o lta g e n s d o d e te c to r e s ta b e le c id a s c o m o c o n tro le is o tí p ic o. A p ó s d e fin ir a s v o lta g e n s, a c o m p e n s a ç ã o é a ju s ta d a n a s c é lu la s flu o re s c e n te s p o s itiv a s.

11 A m o s tra s e m a n tic o rp o A ju s ta r o T H R E S H O L D p a ra re m o v e r a m a io ria d o s d e b ris s e m c o rta r a p o p u la ç ã o d e in te re s s e A ju s ta r a s v o lta g e n s d e F L 1, F L 2, F L 3 e F L 4 n a ja n e la D E T E C T O R S /A M P S p a ra s itu a r a p o p u la ç ã o n e g a tiv a n o q u a d ra n te e s q u e rd o in fe rio r;

12 A m o s tra s c o m a n tic o rp o E m c o n d iç õ e s ó tim a s, a flu o re s c ê n c ia F L 1 d e v e s e r d e te c ta d a p o r u m d e te c to r d e F L 1 ; a F L 2 p o r u m d e te c to r d e F L 2 ; a F L 3 p o r u m d e te c to r d e F L 3 e a F L 4 p o r u m d e te c to r d e F L 4. N o e n ta n to, q u a n d o a lg u m a n tic o rp o m o n o c lo n a l m a rc a d o fo rn e c e u m a flu o re s c ê n c ia m u ito a lta, e s ta flu o re s c ê n c ia p o d e s e r d e te c ta d a p a rc ia lm e n te (o u to ta lm e n te ) e m u m d e te c to r q u e n ã o lh e c o rre s p o n d a V a lo re s fa ls o p o s itiv o s o u in fra c o m p e n s a d o s V a lo re s fa ls o -n e g a tiv o s o u h ip e rc o m p e n s a d o s

13 C o m p e n s a ç ã o d a s F lu o re s c ê n c ia s TUBO FITC PE PerCP PECy5 PerCP APC Cy

14 C a lib ra ç ã o c o m B E A D S D is p o n ib ilid a d e d e m ic ro e s fe ra s c o m u m n ú m e ro p ré - d e te rm in a d o d e m o lé c u la s e q u iv a le n te s d e flu o ro c ro m o s s o lú v e is (M E S F ) in v e s tig a lin e a rid a d e e d e fin e o m í n im o d e M E S F d e te c tá v e l p a ra c a d a flu o ro c ro m o. P a ra v a lid a ç ã o d e s e n s ib ilid a d e e lin e a rid a d e (v e rific a r a re s p o s ta d o d e te c to r) u tiliz a -s e s é rie d e b e a d s c o m n í v e is d e In te n s id a d e d e F lu o re s c ê n c ia p ré d e fin id o s. Q u a n d o - s e m p re q u e u tiliz a d o s n o v o s in s tru m e n to s, e p a ra m a n u te n ç ã o e re p a ro. P a ra a ju s ta r o s g a n h o s d e a m p lific a ç ã o o u fo to m u ltip lic a d o re s, u tiliz a -s e e s p é c ie s n o rm a is o u b e a d s d e re fe rê n c ia p re d e fin id o s Q u a n d o - e m c a s o s d e n o v o s in s tru m e n to s, m a n u te n ç ã o e re p a ro, in tro d u ç ã o d e te s te s o u m u d a n ç a s n o s p ro to c o lo s.

15 C A L IB R IT E 4 c o re s

16 B e a d s d e c o m p e n s a ç ã o - C A L IB R IT E

17 C O M P B e a d s 8 c o re s

18 C O M P B e a d s 8 c o re s

19 C o m p e n s a ç ã o M u ltic o lo r Um fato da vida na citometria de fluxo: sobreposiçao/compensaçao Compensação subtração dessas sobreposições Melhor determinação usando beads anti-igk, coloração única com cada anticorpo, e calcular por software. (Policro flow é muito complexo para compensar manualmente por pares!) Rápido e sem sujeiras para contruir um painel trabalhoso: Usar fluorocromos com alta sobreposição para marcadores que não são co-expressos (CD4/CD8). Evitar fluorocromos que fazer sobreposição dotsplot ajuda. A plic a tion note: S elec ting R ea g ents for M ultic olor Flow C ytom etry. H o ld e n M a e c k e r a n d J o e T ro tte r. B D B io s c ie n c e s, S a n

20 C o m p e n s a ç ã o M u ltic o lo r Compensação é o processo matemático pelo qual nós corrigimos os dados multiparamétricos do citômetro de fluxo para diminuir a sobreposição espectral. E sta sobreposição, ou (overlap ou spillover ) resulta do uso de corantes fluorocromos que sao mensuráveis em mais de um detector. The process of compensation is a simple application of linear algebra, with the goal to correct for spillovers of all dyes into all detectors, such that on output, the data are effectively normalized so that each parameter contains information from a single dye. Roendenter, Cytometry 45: (2001)

21 R eg ra bá s ic a : C onheç a s eu ins trum ento R u le 1 : C h o o s e th e b rig h te s t s e t o f flu o ro c h ro m e s fo r y o u r p a rtic u la r in s tru m e n t c o n fig u ra tio n. A s e le ç ã o d o s re a g e n te s c o m e ç a c o m a c o n fig u ra ç ã o d o c itô m e tro d e flu x o. O tip o e o n ú m e ro d e la s e rs e d e te c to re s d ita s e o s is te m a ó p tic o p o d e e x c ita r u m flu o ro c ro m o e d e te c ta r a p ro p ria d a m e n te u m a c o m b in a ç ã o d e flu o ro c ro m o s. O d e s ig n d o s is te m a ó p tic o e o s in s tru m e n t s e ttin g s, in c lu in d o a s v o lta g e n s d o s P M T, ta m b é m tê m im p a c to n a e fic iê n c ia d e u m c o ra n te p a rtic u la r. E s c o lh a d o s filtro s ó p tic o s A plic a tion note: S elec ting R ea g ents for M ultic olor Flow C ytom etry. H o ld e n M a e c k e r a n d J o e T ro tte r. B D B io s c ie n c e s, S a n

22 M a e c k e r H T, F re y T, N o m u ra L E, T ro tte r J. S e le c tin g flu o ro c h ro m e c o n ju g a te s fo r m a x im u m s e n s itiv ity. Cytometry A ;6 2 : Fluoroc hrom es : G o for the brig ht... R u le 2 : C h o o s e flu o ro c h ro m e s to m in im iz e th e p o te n tia l fo r s p e c tra l o v e rla p. D a d a s a s m u ita s d ife re n ç a s n a c o n fig u ra ç ã o d o s in s tru m e n to s, é im p o s s í v e l e n c o n tra r o "m e lh o r" flu o ro c ro m o p a ra u s a r e m c o m b in a ç õ e s d e 6, 8, o u m a is c o re s. N o e n ta n to, p a ra u m c itô m e tro d e flu x o p a rtic u la r é p o s s í v e l c la s s ific a r c o ra n te s d is p o n í v e is d e a c o rd o c o m s e u b rilh o s o b re e s s e in s tru m e n to (q u a n d o c o n fig u ra d o c o m u m d e te rm in a d o c o n ju n to d e la s e rs e filtro s ). M a s c o m o e x a ta m e n te p o d e m o s d e fin ir e m e d ir o b rilh o?

23 N orm a lized S ig na l/b a c kg round: S ta in Index S ta in In d e x (S I) = D /W

24 M a e c k e r H T, F re y T, N o m u ra L E, T ro tte r J. S e le c tin g flu o ro c h ro m e c o n ju g a te s fo r m a x im u m s e n s itiv ity. Cytometry A ;6 2 : S ta in In d e x (S I) = D /W O b je tiv o : N o rm a liz a r o s in a l p a ra re tira r o b a c k g ro u n d (a u to flu o re s c ê n c ia ), c o lo ra ç o e s n ã o e s p e c í fic a s, e le tro n ic n o is e, e b a c k g ro u n d ó p tic o d e o u tro s flu o ro c ro m o s (in te rfe rê n c ia o u s p illo v e r).

25 T e s te s fe ito s c o m u m m e s m o A c M o c o n ju g a d o c o m o s d iv e rs o s re a g e n te s n u m m e s m o in s tru m e n to (B D L S R II) R e a g e n te s s o z in h o s, n ã o p a rte d e u m c o q u e te l O b je tiv o e v ita r S p e c tra l o v e rla p (o r s p illo v e r)

26 R u le 3 : R e s e rv e th e b rig h te s t flu o ro c h ro m e s fo r d im a n tib o d ie s, a n d v ic e v e rs a. O rdena r os Fluoroc rom os pos s íveis pelo brilho rela tivo P E > A P C >P E -C y 7 > P e rc P -C y 5.5 >A le x a > P E -T e x a s > P e rc P > F IT C > P a c ific B lu e > A m C y a n > A P C - C y 7 A plic a tion note: S elec ting R ea g ents for M ultic olor Flow C ytom etry. H o ld e n M a e c k e r a n d J o e T ro tte r. B D B io s c ie n c e s, S a n

27 B R ILH O = E FIC IÊ N C IA R e g ra B á s ic a (R o e d e re r): T H E L O W E R T H E A N T IG E N D E N S IT Y, T H E B R IG H T E R T H E F L U O R O C H R O M E T O B E U S E D R o e d e s r, v e r Roederer

28 R u le 4 : A v o id s p illo v e r fro m b rig h t c e ll p o p u la tio n s in to d e te c to rs re q u irin g h ig h s e n s itiv ity fo r th o s e p o p u la tio n s. P E -C y 5 é m u ito fo rte (a lto S ta in In d e x ), m a s te m c o n s id e rá v e l s p illo v e r (o u s e ja, a d ic io n a b a c k g ro u n d ) n o d e te c to r A P C. S e e s s e s d o is flu o ro c ro m o s s ã o u s a d o s ju n to s, a s e n s ib ilid a d e d e re s o lu ç ã o n o A P C v a i s e r re d u z id a, s e c o m p a ra d a p o r e x e m p lo, a u m a c o m b in a ç ã o d e P e rc P -C y 5.5 e A P C. E s te é u m c a s o e m q u e p o d e s e r q u e te n h a m o s q u e s a c rific a r u m a c e rta q u a n tid a d e d e b rilh o e n u m d e te c to r p a ra e v ita r s p illo v e r (e p e rd a d a s e n s ib ilid a d e d e re s o lu ç ã o ) n o o u tro. A plic a tion note: S elec ting R ea g ents for M ultic olor Flow C ytom etry. H o ld e n M a e c k e r a n d J o e T ro tte r. B D B io s c ie n c e s, S a n

29 P E S IG N A L Q U E N C H E D B Y A P C PE COMPBEADS LOADED WITH PE PE COMPBEADS LOADED WITH PE AND APC

30 W IT H O U T F R E T F R O M P E T O A P C APC COMPBEADS LOADED WITH PE APC COMPBEADS LOADED WITH PE AND APC

31 R u le 5 : T a k e s te p s to a v o id ta n d e m d y e d e g ra d a tio n, a n d c o n s id e r its im p a c t u p o n re s u lts. P o te n c ia l p a ra d e g ra d a ç ã o d o s c o ra n te s ta n d e m A P C -C y 7 e P E -C y 7 p o r e x e m p lo, p o d e m d e g ra d a r n a p re s e n ç a d e lu z, fix a ç ã o, te m p e ra tu ra s e le v a d a s e e m itir s in a l n o d e te c to r p a i (A P C o u P E ). E s te p ro c e s s o c o m e ç a e m u m a s u b p o p u la ç ã o c a u s a n d o fa ls o p o s itiv o s e m A P C o u P E E v ita r e x p o s iç ã o a lu z o u c a lo r, o u c o m flu o ro c ro m o s n ã o ta n d e m (A P C H 7 ). A plic a tion note: S elec ting R ea g ents for M ultic olor Flow C ytom etry. H o ld e n M a e c k e r a n d J o e T ro tte r. B D B io s c ie n c e s, S a n

32 THE SCORPION TAIL OF TANDEM DYES PE PE-TR PE-CY5.5 PE-CY7 EMISSION

33 R e g ra s p a ra e s c o lh a d o s re a g e n te s R e g ra 1 : E s c o lh a o s flu o ro c ro m o s c o n fo rm e s e u in s tru m e n to. R e g ra 2 : E s c o lh a o s flu o ro c ro m o s p a ra m in im iz a r o p o te n c ia l d e s o b re p o s iç ã o (spectral overlap). R e g ra 3 : R e s e rv e o s flu o ro c ro m o s m a is fo rte s p a ra o s a n tic o rp o s m a is fra c o s, e v ic e v e rs a. R e g ra 4 : E v ita r spillover d e p o p u la ç o e s c e lu la re s d e u m d e te c to r e m o u tro (P E c y 5 x A P C ) R e g ra 5 : E v ita r d e g ra d a ç ã o d o s a n tic o rp o s ta n d e m, e c o n s id e ra r n o s re s u lta d o s.

34 R e fe rê n c ia s R o e d e re r, M. C y to m e try 4 5 : ( ) M a e c k e r H T, F re y T, N o m u ra L E, T ro tte r J. S e le c tin g flu o ro c h ro m e c o n ju g a te s fo r m a x im u m s e n s itiv ity. Cytometry A ;6 2 : M a n u a l d o F A C S C a lib u r (B D B io s c ie n c e s, S a n J o s e, C a lifo rn ia, E U A ). B IO, C T. T re in a m e n to p a ra Q u a n tific a ç ã o d e L in fó c ito s T C D 4 /C D 8. B D B io s c ie n c e s. M a n e jo D e l C itó m e tro d e F lu jo (C T F ) m o d e lo F A C S c a n d e B e c to n D ic k in s o n. P ro to c o lo s e n In m u n o lo g í a C e lu la r, S a la m a n c a, E s p a n h a. G u ia d o E q u ip a m e n to e G u ia d e S o ftw a re (C e ll Q u e s t P ro ) B D F A C S C a lib u r. W o o d B. 9 -C o lo r a n d 1 0 -C o lo r F lo w C y to m e try in th e C lin ic a l L a b o ra to ry. A rc h P a th o l L a b M e d ; R o e d e re r M. C o m p e n s a tio n. In : R o b in s o n J P, D a rz y n k ie w ic z Z, D e a n P N, D re s s le r L G, R a b in o v itc h P S, S te w a rt C C, T a n k e H J, W h e e le s s L L, e d ito rs. C u rre n t P ro to c o ls in C y to m e try. N e w Y o rk : J o h n W ile y & S o n s, In c.; S h a p iro H M, P e rlm u tte r N G, S te in P G : A F lo w C y to m e te r D e s ig n e d fo r F lu o re s c e n c e C a lib ra tio n. C y to m e try 3 3 : ( ). H o ffm a n R A a n d C h a s e E S, R e s o lu tio n o f D im ly F lu o re s c e n t P a rtic le s : A P ra c tic a l M e a s u re o f F lu o re s c e n c e S e n s itiv ity. C y to m e try 3 3 : ( ). B a g w e ll C B a n d A d a m s E G. F lu o re s c e n c e s p e c tra l o v e rla p c o m p e n s a tio n fo r a n y n u m b e r o f flo w c y to m e try p a ra m e te rs. A n n N Y A c a d S c i ;6 7 7 : H e rz e n b e rg L A, T u n g J, M o o re W A, H e rz e n b e rg L A, P a rk s D R. In te rp re tin g