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1 Sysmex Educational Enhancement & Development SEED-África Boletim Informativo No 4 Abril de 2010 Introdução à coagulação O objectivo deste boletim informativo é o de proporcionar à equipa laboratorial uma visão geral do teste do tempo de tromboplastina parcial activada, da heparina e do seu mecanismo de acção. A heparina e o seu mecanismo de acção A heparina é um fármaco que é utilizado nos estádios iniciais do tratamento de doentes que desenvolveram um coágulo sanguíneo, tal como trombose venosa profunda. Como existe sempre o risco de extensão do coágulo, é essencial restaurar o equilíbrio hemostático o mais rapidamente possível. A heparina é ideal para este efeito e tem um início de acção muito rápido. O efeito anticoagulante começa quase imediatamente quando a heparina é administrada por via intravenosa. Em contraste, a varfarina, que é um fármaco anticoagulante oral, não só demora alguns dias até que o efeito anticoagulante se torne evidente, como inicialmente induz um estado pró-coagulante. Este efeito pró-coagulante deve-se ao facto da varfarina não só interferir na produção dos factores de coagulação II, VII, IX e X funcionais como também das proteínas anticoagulantes C e S que ocorrem naturalmente. A proteína C, em virtude da sua semi-vida muito curta, é reduzida antes dos factores de coagulação, aumentando, assim, paradoxalmente o risco de coagulação no dia em que o tratamento anticoagulante com varfarina é iniciado. O tratamento com heparina é habitualmente continuado até que o INR se situe no intervalo terapêutico. Além disso, a heparina também é utilizada para evitar bloqueios nas linhas centrais e nos circuitos de diálise. A heparina é constituída por moléculas de hidratos de carbono complexos que são compostos por resíduos de açúcar repetidos. A heparina não fraccionada é composta por uma sopa de moléculas de açúcar com comprimentos variáveis, enquanto a heparina de baixo peso molecular foi tratada para conter apenas os comprimentos mais curtos. Cada molécula de heparina contém um pentassacarídeo único (5 sequências de açúcar) com uma sequência de ligação com elevada afinidade com a anti-trombina (AT), anteriormente referida como anti-trombina III ou ATIII em TF TF/FVIIa VII/a XIa IX X II XI IXa (VIIIa/Ca ++ /PL) Xa (Va/Ca ++ /PL) Trombina Fibrina AT: Complexo de heparina XIIIa Polímero de fibrinas Figura 1 Gráfico que ilustra o mecanismo de acção da heparina. A heparina liga-se à proteína anticoagulante anti-trombina e acelera a inibição dos factores de coagulação Xla, lxa, Xa activados e da trombina. manuais antigos. Quando a heparina se liga à AT, introduz uma alteração conformacional na AT. Por sua vez, isso acelera a inactivação de trombina, FXa, FIXa e FXIa. A heparina deve ser administrada por injecção, por via subcutânea ou directamente numa veia. Quando é necessária anticoagulação sistémica, a heparina é administrada na forma de dose em bolus a cada 6 horas ou como perfusão contínua. Apesar da acção da heparina ser de início rápido, o grau de anticoagulação não é previsível. Isto deve-se em parte ao facto da heparina se ligar não especificamente a várias proteínas plasmáticas. A heparina ligada a proteínas é incapaz de participar na acção anticoagulante. Isto é particularmente visível nos estádios agudos da doença, devido ao aumento das denominadas proteínas de fase XIII
2 SEED-África Boletim Informativo No 4 Abril de /5 aguda. Por isso, os doentes a receberem heparina têm de ser submetidos a monitorização regular para garantir que o nível de anticoagulação se situa no intervalo terapêutico. A heparina em excesso coloca o doente em risco de hemorragia e uma quantidade demasiado pequena iria agravar a patologia pró-trombótica já existente. Tempo de tromboplastina parcial activada O tempo de tromboplastina parcial activada (APTT) é o segundo teste de coagulação mais pedido. O APTT é um teste laboratorial que é utilizado principalmente para monitorizar os efeitos anticoagulantes da heparina não fraccionada. Também é utilizado para fazer o rastreio de diversos distúrbios hemorrágicos causados por deficiências na via intrínseca de coagulação, ou seja, no factor XI, factor IX, factor VIII, factor V, factor II (protrombina) e fibrinogénio. EXTRÍNSECA TF/FVII COMUM [PT] FX (FV) II (Protrombina) [APTT] INTRÍNSECA FIX FXII FXI (FVIII) Figura 2 Representação gráfica dos componentes da cascata de coagulação que são medidos no tempo de tromboplastina parcial activada. (Identificados por caixas azuis) A palavra parcial refere-se ao facto de ao reagente utilizado no APTT faltar o factor tecidular que é um componente essencial no reagente de tromboplastina utilizado no tempo de protrombina. Contém apenas o componente fosfolípido. A análise original, concebida em 1953 para identificar a hemofilia clássica (deficiência de FVIII), foi denominada tempo de tromboplastina parcial (PTT) e contava com o vidro do tubo de ensaio para iniciar a activação da via intrínseca a denominada activação por contacto. Em 1961, esta análise foi modificada para acelerar o processo de activação através da adição de caulim, que substituiu o vidro do tubo de ensaio como superfície de activação. É por isso que o teste de coagulação actualmente utilizado para avaliar a via intrínseca é referido como tempo de tromboplastina parcial activada, isto é, APTT. Os termos PTT e APTT são habitualmente utilizados indistintamente, apesar de, falando com rigor, dever ser apenas utilizado o termo APTT. Reagentes de APTT Os reagentes de APTT têm dois componentes principais: um activador e uma fonte de fosfolípidos. O activador pode ser de natureza particulada (caulim, celite ou sílica) ou solúvel (ácido elágico). O papel do activador é o de fornecer uma superfície com carga negativa que é necessária para a activação dos denominados factores de contacto. Os factores de contacto incluem quininogénio de alto peso molecular (HMWK - high molecular weight kininogen), précalicreína e factor XII (FXII). A calicreína é formada a partir de pré-calicreína através da activação do HMWK. Durante esta fase de activação por contacto, o FXII é activado para FXIIa com a ajuda do HMWK e da calicreína e, por sua vez, converte o FXI em FXIa. A calicreína é formada a partir de pré-calicreína através da activação do HMWK. Os fosfolípidos são necessários para o fornecimento de uma superfície para a reunião do complexo tenase (FIXa-FVIIIa), que converte o FX em FXa, e o complexo protrombinase (FXa-FVa), que converte a protrombina em trombina. A composição dos fosfolípidos é altamente variável, tanto em termos de concentração como de fonte. Os fosfolípidos podem ser de origem animal ou vegetal ou serem fabricados sinteticamente a fim de produzir uma forma pura. Por consequência, esta diversidade na concentração e na composição dos reagentes de APTT resulta numa grande variação na sua reacção à heparina, às deficiências dos factores de coagulação e aos anticoagulantes lúpicos (ver mais à frente). A variabilidade sofre um impacto ainda maior pelo tipo de sistemas de detecção utilizados pelos sistemas automáticos, ou seja, mecânicos versus ópticos. Tendo em conta a falta de uniformidade da composição e da reactividade dos reagentes de APTT, é absolutamente essencial que cada laboratório possua um mecanismo de controlo de qualidade sólido e estabeleça o seu intervalo de referência próprio para a interpretação dos resultados do APTT gerados localmente. A escolha do reagente deve ter em consideração a indicação principal para o teste de APTT, uma vez que alguns reagentes são concebidos para serem especificamente sensíveis ou insensíveis aos anticoagulantes lúpicos. Anticoagulantes lúpicos Um anticoagulante lúpico é um anticorpo direccionado contra um complexo fosfolípido-proteína. O nome anticoagulante deriva do facto de estes anticorpos
3 SEED-África Boletim Informativo No 4 Abril de /5 tenderem a provocar o prolongamento dos testes de coagulação dependentes de fosfolípidos, como o APTT. No entanto, o nome é um termo erróneo uma vez que está associado a episódios trombóticos e perda da gravidez em doentes com doença auto-imune subjacente. Como realizar um APTT manual Este é realizado em banho-maria com os mesmos requisitos básicos da PT, excepto que os reagentes necessários são um reagente de APTT, como Actin FS ou Actin FSL e cloreto de cálcio. a) Escolher o reagente de APTT O reagente contém ácido elágico como activador e fosfatídeos de soja purificada como fosfolípidos. Actin FSL utiliza o mesmo activador mas fosfolípidos diferentes, nomeadamente uma mistura de soja e fosfatídeos de cérebro de coelho. Actin FSL é um reagente de APTT para utilização geral enquanto Actin FSL é formulado especificamente para ser sensível à detecção de anticoagulantes lúpicos. Para o teste de APTT de rotina recomenda-se que os laboratórios utilizem o reagente Actin FS. Este é fornecido na forma líquida com um prazo de validade de aproximadamente 2 anos e apresentações de 2 ml e 10 ml. A estabilidade do reagente após a abertura é a seguinte: 1 semana: 2 a 8 C se mantido fechado, 2 dias: 15 C (no analisador), 24 horas: a 37 C se mantido fechado (em banho-maria). b) Cloreto de cálcio O cloreto de cálcio é um reagente essencial para a reacção de APTT. Os iões do cálcio são removidos do plasma durante a colheita da amostra para os tubos de citrato de sódio. A fase de recalcificação no APTT é o que desencadeia a cascata de coagulação. c) Método de teste Verifique se a temperatura da água no banho-maria está a 37 C. Isto é essencial uma vez que os factores de coagulação são enzimas que foram concebidas para funcionarem de forma ideal a essa temperatura. Aqueça os reagentes (Actin FS e cloreto de cálcio) para 37 C (dispense a quantidade necessária de cada reagente para o número de testes planeado em tubos de ensaio separados e coloque-os num suporte no banhomaria). Adicione 100 μl de plasma do doente a um tubo de ensaio de vidro e coloque-o no suporte no banho-maria. Adicione 100 μl de reagente de APTT Actin FS, misture O activador de ácido elágico fornece uma superfície com carga negativa xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx Fase de activação por contacto: Adição de reagente de APTT (activação de FXII para FXIIa) FXII FXIIa FXI FXIa Prekallikrein (HMWK) Kallikrein Incubação durante 3 minutos Ca ++ Recalcificação de reagente CACI 2 (formação de fibrina) FIX FX FIXa FVIIIa PL - Ca ++ Protrombina FXa FVa PL - Ca ++ Trombina Tempo em s desde a adição de CACI 2 até à formação de coágulo = resultado de APTT Figura 3 Ilustração das fases da reacção de APTT (PL = fosfolípido)
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6 Sysmex South Africa (Pty) Ltd. Fernridge Office Park Block 2, 5 Hunter Avenue, Ferndale, Randburg 2194 Phone Fax info@sysmex.co.za
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