NOVOS DESAFIOS NA QUALIDADE DE VIDA DOS ANIMAIS INFECTADOS POR LEISHMANIOSE VISCERAL USO DA MILTEFOSINA

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1 NOVOS DESAFIOS NA QUALIDADE DE VIDA DOS ANIMAIS INFECTADOS POR LEISHMANIOSE VISCERAL USO DA MILTEFOSINA Mv, PhD, Fábio dos Santos Nogueira Sócio Fundador do BRASILEISH; Mestre e Doutor pela UNESP Botucatu SP; Trabalha com Imunoterapia e Imunoprofilaxia da Leishmaniose Visceral Canina (Anfotericina B, Miltefosina, Leishmune, Canileish), Professor de Clínica Médica e Cirúrgica de Pequenos Animais na FEA Andradina SP As leishmanioses são enfermidades infecciosas não contagiosas, causadas por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania e que apresentam diversidades clínicas significantes. Dependendo da apresentação clínica e dos diferentes agentes etiológicos, podem ser classificadas em leishmaniose tegumentar (forma cutânea, muco cutânea, e cutânea difusa) e leishmaniose visceral apresentação clínica grave e fatal da doença. A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) caracteriza pela sua enorme variabilidade de manifestações clínicas, devido basicamente a fatores individuais relacionados exclusivamente ao tipo de resposta imunológica desenvolvida (resposta imune humoral e/ou celular), grau de infestação parasitária, tempo de evolução e órgãos afetados. As alterações dermatológicas também estão presentes na maioria dos casos em animais infectados por leishmaniose visceral e demonstram o comprometimento da epiderme, derme e hipoderme em associação aos anexos cutâneos, refletindo não só a ação espoliativa sistêmica parasitária como também local. Normalmente encontramos casos de dermatite esfoliativa não pruriginosa com ou sem alopecia (principalmente em região periocular, em região de pina, e membros); dermatite ulcerativa com localização predominante em saliências ósseas, junção mucocutânea, focinho, região interdigital e margem interna da pina; necrose isquêmica; dermatite nodular multifocal; dermatite papular; lesões que apresentam dificuldade de cicatrização; além de quadros cutâneos atípicos como hiperqueratose nasal e digital, despigmentação e pêlos opacos. A onicogrifose (crescimento exagerado das unhas) é um sinal clínico bastante presente nos animais infectados e que normalmente chama a atenção do proprietário, e é resultado da estimulação da matriz ungueal. Durante a evolução da enfermidade poderemos ter proliferação generalizada do parasita, com resposta granulomatosa e grande quantidade de parasitos, principalmente em órgãos linfoides (linfonodos, baço, e medula óssea). Ocorre ainda proliferação de linfócitos B, histiócitos, macrófagos, plasmócitos, resultando em linfoadenomegalia generalizada e algumas vezes esplenomegalia. As manifestações oftálmicas ou perioftálmicas são comumente observadas e descritas, e podem muitas vezes representar a primeira alteração visualizada. São encontradas: blefarites, blefaroconjuntivites, ceratoconjuntivite seca ou não, uveítes, distrofias, hifemas, conjuntivite folicular e membranosa e panoftalmites. Sinais clínicos de diáteses hemorrágicas causadas principalmente por vasculites, podem ser observados em animais com LV, bem como petéquias dispersas pelo corpo, hematúria, e principalmente epistaxes. Além de emagrecimento progressivo e caquexia, encontramos em uma porcentagem alta dos cães infectados, uma mioatrofia

2 preferencialmente em músculos esqueléticos mastigatórios e temporal. Alguns autores demonstraram sua patogenia, que além da presença de parasitos, observa-se necrose e atrofia de fibra muscular, infiltrado mononuclear, vasculite neutrofílica, e presença de imunocomplexos e anticorpos séricos anti-miofibrilas. O comprometimento osteoarticular é pouco evidenciado em cães com a doença; porém, quando presentes, são caracterizados por poliartrite do tipo erosiva decorrente do processo inflamatório pelo depósito de imunocomplexos. As lesões renais associadas, são decorrentes do depósito de imunocomplexos nos glomérulos e por ativação do complemento, causando normalmente a morte do animal por glomerulonefrites. O tipo de resposta imunológica apresentada pelo animal após a infecção, celular ou humoral, associada a outros fatores, como genética, idade, sexo, nutrição, co-infecções, condições imunossupressoras, presença de ecto ou endoparasitas, e virulência da Leishmania, podem contribuir para uma maior susceptibilidade ou resistência à enfermidade ou mesmo a intensidade destas manifestações. Durante muito tempo, baseado somente em exame físico e nas manifestações clínicas apresentadas, os animais foram classificados segundo Mancianti et al. em: assintomáticos cães com ausência de manifestações clínicas; oligossintomáticos cães que apresentavam até três manifestações clínicas da doença; e sintomáticos cães que apresentavam todas ou mais de três manifestações típicas da enfermidade. No entanto, em um contexto atual, esta classificação apresenta um limitado valor, pois não se considera anormalidades clínico patológicas em órgãos internos, sem sinal clínico aparente. Assim, atualmente, os animais são classificados de acordo com um estadiamento clínico (proposto pelo Grupo de Estudos Europeu LEISHVET) e baseado principalmente na sorologia quantitativa (R.I.F.I. diluição total), achados laboratoriais relacionados com enfermidade renal progressiva, na severidade das lesões e nas alterações analíticas apresentadas, com posterior tratamento e prognóstico individual. Estadiamento Clínico, Prognóstico e Tratamento individual:

3 Atualmente, no Brasil, o tratamento de cães com Leishmaniose vem sendo discutido no âmbito judicial, devido à proibição pelo Conselho Federal de Medicina Veterinária através de um parecer técnico nº. 299/2004 da Advocacia Geral da União de 2004 (proibição do uso do Antimoniato de N-metil Glucamina) e pela Portaria Interministerial de 2008 (Ministério da Saúde e Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento) que proíbe a utilização de drogas de uso humano (Antimoniato de N-metil Glucamina, Anfotericina B e Lipossomal) e/ou não registrados no MAPA para tais fins. Este debate é apresentado pela Organização Mundial de Saúde (OMS); Organização Panamericana de Saúde (OPAS); Ministério da Saúde (MS); Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA); e Conselho Federal de Medicina Veterinária (CFMV) que recomendam a eutanásia de cães infectados, mas reconhecem que esse propósito é difícil de levar a termo. Entendem da necessidade de novos trabalhos que provem a não infectância dos animais tratados (com a utilização de provas laboratoriais de infectividade Xenodiagnóstico) e da utilização de drogas não utilizadas para o tratamento da Leishmaniose Humana (receio da resistência parasitária). As drogas de escolha utilizadas frequentemente para o tratamento da LVC no Mundo todo, são: Antimoniato de N-metil Glucamina, Anfotericina B, Miltefosina e Alopurinol. No Brasil, diversos autores recomendam à utilização da Imunoterapia em dose dupla (Antígeno A2 com saponina - Leishtec ) e células inativadas de Propionibacterium acnes (Infervac ) com excelentes resultados. Vários outros compostos incluindo domperidona, pentamidinas, aminosidinas, metronidazol, espiramicina, marbofloxacina e cetaconazol, estão sendo investigados como agentes anti-leishmania em cães, porém sem apresentar ainda resultados satisfatórios. O tratamento visa à melhora clínica das manifestações apresentadas, redução da carga parasitária, reestabelecimento da resposta imune celular controladora da infecção e o bloqueio da transmissão para os flebotomíneos. Antes de iniciar qualquer terapia, recomenda-se à realização de uma avaliação laboratorial do paciente através de hemograma, bioquímica sérica para função renal e hepática, urinálise, e proteinograma para comparação e avaliação da eficácia do tratamento. Provas parasitológicas (citologia de linfonodo e/ou medula óssea) são importantes para avaliar e monitorar à redução da carga parasitária. Neste sentido, à reação em cadeia pela polimerase em tempo real (rt PCR) representa um grande avanço no diagnóstico, não só por quantificar à carga parasitária bem como demonstrar a infectividade dos animais após tratamento (rt PCR de fragmento de pele). Estudos têm demonstrado à concordância do Xenodiagnóstico e rt PCR de fragmento de pele quando realizados no mesmo pavilhão auricular. A Miltefosina (Hexadecilfosfocolina) (figura 1) é uma droga que originalmente foi estudada e classificada como droga antitumoral por Unger et al., Figura 1: Melteforan 20mg/mL. Fonte: Vibarc.com.br Na década de 90 foi identificado seu potencial leishmanicida e atualmente representa o primeiro e único agente anti-leishmania eficaz registrado, de administração oral, e com estudos em parceria com a OMS (Organização Mundial de Saúde). Estudos experimentais in vitro e in vivo mostraram a eficácia deste fármaco para o tratamento de infecções causadas por L. donovani e L. infantum. Seu mecanismo de ação se baseia na inibição da biossíntese de receptores GPI (glicosil fosfatidil-inositol), molécula chave para a sobrevivência intracelular da Leishmania. Interfere

4 também na síntese da fosfolipase e da proteinaquinase C, que são leishmania específicas. A ação antimetabólica deste composto pode levar a alterações da biossíntese de glicolipídeos e glicoproteínas da membrana do parasito, provocando a apoptose da célula protozoária. Lux et al. (2000) mostraram que a síntese de lipofosfoglicano (LPG) e glicoproteína (GP63) está inibida em parasitas tratados com este fármaco. Outros estudos sugeriram que este fármaco possui propriedades imunomoduladoras. Um estudo comparativo entre a miltefosina, na dose de 20mg/kg por via oral durante 5 dias, e o antimoniato de meglumina, na dose de 200 mg/kg por via subcutânea durante 5 dias, demonstrou uma redução maior da carga parasitária de L. infantum no baço de camundongos tratados com miltefosina, e com eficácia mantida durante 7 semanas depois do tratamento (Oliva et al 1995). Em 2007, a Miltefosina foi lançada no mercado veterinário europeu com o nome comercial de Milteforan, pelo Laboratório Virbac S.A. e com indicação exclusiva para o tratamento de cães com leishmaniose visceral. Em um estudo clínico multicêntrico, controlado e aleatório, em cães infectados naturalmente por L. Infantum na Espanha e França, o Milteforan demonstrou eficácia clínica, laboratorial e parasitária (na dose de 2mg/kg). Os animais foram tratados durante 28 dias e avaliados e submetidos à score clínico, coleta de amostra de sangue e aspirado de medula óssea. Após 42 dias de observação os animais tratados com Miltefosina apresentaram redução estatisticamente significativa do score clínico, 90 % de cura parasitológica em esfregaço de medula óssea, e não apresentaram alterações significativas nos valores hematológicos e bioquímicos. Em outro estudo multicêntrico (França, Espanha e Itália), aberto em grande escala, porém, com um seguimento mais prolongado (56 dias de observação), os animais apresentaram resultados semelhantes com melhora clínica e parasitária. A carga parasitária foi avaliada em cães infectados naturalmente para L. Infantum e submetidos ao tratamento com Miltefosina na dose de 2mg/kg durante 30 dias. Amostras de sangue e aspirado de linfonodo de 18 cães, antes e depois do tratamento, foram submetidas à reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qpcr), a cada 30 dias durante 12 meses. Após 1 mês de tratamento houve redução estatisticamente significativa de 91,8% na carga parasitária do aspirado de linfonodo, que se manteve durante todo o período de observação. Após a administração oral, a absorção da droga é completa no trato gastrintestinal, com biodisponibilidade absoluta de 94% em cães, atingindo a concentração máxima entre um período de 4 a 48 horas e tem meia-vida de 159 horas para a sua eliminação. Seus efeitos secundários podem incluir transtornos digestivos como vômito, diarreia e anorexia em alguns animais, e por isto deve ser administrado durante a alimentação. As limitações da terapia em cães, no Brasil, pelo uso de antimoniatos, Anfotericina B e Anfotericina B Lipossomal (proibição e disputa judicial do uso destes fármacos) demonstram a necessidade em se buscar uma droga exclusiva de uso veterinário. Segundo o Manual de Leishmaniose Visceral Grave (Ministério da Saúde, 2006), os antimoniais pentavalentes e a Anfotericina B e Lipossomal são drogas de escolha para o tratamento da Leishmaniose Visceral Humana em virtude de sua comprovada eficácia terapêutica. A Miltefosina não vem sendo utilizada no Brasil para o tratamento da Leishmaniose Visceral Humana, devido aos poucos estudos conduzidos com Leishmania infantum e por apresentar resultados insignificantes. Assim, considerando a preocupação do Ministério da Saúde sobre a geração e circulação de cepas parasitárias resistentes; considerando a Portaria Interministerial (art. 3, cita ensaios clínicos controlados, acompanhados de seu protocolo, utilizando drogas não destinadas ao tratamento de seres humanos, devem ser solicitados e autorizados pelo MAPA ; considerando o posicionamento do CFMV na carta de Brasília (Brasília, 2010) com previsão orçamentária para estímulo às pesquisas sobre tratamento canino; considerando que o II e III Fórum de Discussão sobre o tratamento da Leishmaniose Visceral Canina (Brasília, 2009 e 2015) conclui como padrão ouro para determinar e avaliar a infectividade do animal tratado o Xenodiagnóstico; e considerando a Nota Técnica n 3-CPV/DFIP/DAS/MAPA de 19 de setembro de 2008 que não impede o tratamento da doença com produtos que venham a ser registrados no MAPA; foi proposto ao MAPA e ao MS um ensaio clínico para avaliar à eficácia terapêutica da Miltefosina (Milteforan ) em cães infectados, avaliando principalmente à melhora clínica, redução da carga parasitária e principalmente o bloqueio da transmissão. Este estudo foi aprovado pelos órgãos competentes e teve início em 2013, na cidade de Andradina SP, em canil construído, telado e com monitoramento- figura 2.

5 Figura 2 Canil telado e com monitoramento foto do acervo Dr. Fabio dos Santos Nogueira Todos os animais tiveram acompanhamento durante 12 meses, com avaliação clínica, laboratorial (hemograma completo e bioquímica sérica); provas parasitológicas (citologia de linfonodo/medula óssea; imunohistoquímica de pele); provas moleculares (rt PCR de linfonodo, medula óssea e fragmento de pele); e Xenodiagnóstico, antes e após a terapia com a Miltefosina. Foram incluídos neste estudo 35 cães, naturalmente infectados por Leishmania infantum, adultos, de ambos os sexos, com função hepática e renal normais, e parasitologicamente positivos. Todos os animais foram tratados com Miltefosina na dose de 2mg/kg durante 30 dias, e submetidos aos exames já descritos, em momentos distintos durante o período de observação - figura 3. Os resultados demonstraram que a Miltefosina promove uma melhora clínica significante, intensa redução da carga parasitária (comprovada pela citologia e rt PCR de medula óssea e linfonodo) e diminuição da infectividade (comprovada pelo Xenodiagnóstico e pelo rt PCR de pele), bloqueando assim a transmissão. Este estudo ainda não foi publicado e aguarda a aprovação e liberação do produto pelo Ministério da Saúde (MS) e Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). Figura 3 Cão avaliado após tratamento com Miltefosina por 30 dias Referências Bibliográficas: Solano-Gallego et al. LeishVet guidelines for the practical management of canine leishmaniosis. Parasites & Vectors 2011, 4:86. Nogueira, FS. Avaliação Clínico-Laboratorial de cães naturalmente infectados por Leishmaniose Visceral, submetidos à terapia com Anfotericina B. [Tese]. Botucatu: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista; Jericó et al. Tratado de Medicina Interna de Pequenos Animais. Ed Roca, 2015, p Milteforan monografia do produto -

6 CÓDIGO EXAME AMOSTRA 39 HEMOGRAMA COMLETO LEISHMANIOSE CANINA (DPP + ELISA + RIFI) LEISHMANIOSE FELINA (ELISA + RIFI) PERFIL COMPLEMENTAR PARA LEISHMANIOSE Sangue em tubo de tampa roxa com EDTA. Sangue total (2,0 ml) colhido em tubo de tampa vermelha ou 0,5 ml de soro sem hemólise. Sangue total colhido em tubo sem anticoagulante Sangue em tubo de tampa vermelha e de tampa roxa PRAZO (dias) PERFIL DIAGNÓSTICO COMPLETO DE LEISHMANIOSE 408 PESQUISA DE LEISHMANIOSE LEISHMANIOSE CANINA DILUICAO TOTAL PESQUISA DE SPOROTRIX SCHENKII IMUNOHISTOQUÍMICA PARA LEISHMANIOSE LEISHMANIA CHAGASI-MÉTODO PCR REAL TIME QUALITATIVO LEISHMANIOSE NANINA + PESQUISA DE HEMATOZOÁRIOS PERFIL DIAGNÓSTICO AMPLIADO DE LEISHMANIOSE LEISHMANIOSE FELINA DILUIÇÃO TOTAL PERFIL COMBO DE LEISHMANIA - IMUNOHISTOQUMICA + SOROLOGIA PERFIL LEISHMANIOSE (DPP + ELISA+ RIFI) E PROTEINAS TOTAIS E FRACOES LEISHMANIA CHAGASI - METODO PCR REAL TIME QUANTITATIVO PERFIL LEISHMANIOSE SOROLOGIA + IMUNO- HISTOQUIMICA PERFIL PCR DOADORES DE SANGUE - PCR PARA EHRLICHIA, BABESIA, LEISHMANIA CHAGASI QUALITATIVO Sangue em tubo de tampa roxa com EDTA e tampa vermelha Lâminas de punção de linfonodos reativos, medula óssea ou baço; imprint de lesão ulcerada em lâmina. Sangue total (2,0 ml) colhido em tubo de tampa vermelha ou 0,5 ml de soro sem hemólise. Swab ou imprint de lesão ulcerada em lâmina 04 Fragmento de tecido em formol a 10% 06 roxa (EDTA) ou Punção de medula óssea em EDTA Sangue em tubo de tampa roxa com EDTA e tampa vermelha vermelha e punção de medula óssea ou linfonodo infartado para PCR e Cultura Tubo de tampa vermelha IHQ(fragmento de pele ou linfonodo em formol a 10%) Ou ICQ (punção de linfonodo infartado ou medula óssea vermelha) vermelha. Punção de medula óssea em EDTA ou sangue total em tubo de tampa roxa. vermelha e fragmento de tecido fixado em formol a 10% ou punção de medula ou linfonodo Punção de medula óssea, baço ou sangue (EDTA - tubo de tampa roxa). 07

7 O que você quer no próxima INFORMATIVO? Responda a este e nos dê a sua sugestão, opinião ou dúvida. Teremos o maior prazer em ouvi-lo. EQUIPE DE MÉDICOS VETERINÁRIOS - TECSA Laboratórios Primeiro Lab. Veterinário certificado ISO9001 da América Latina. Credenciado no MAPA. PABX: (31) sac@tecsa.com.br RT - Dr. Luiz Eduardo Ristow CRMV MG ''Atendemos todo Brasil, resultados via internet, FAÇA SEU CONVENIO E PARTICIPE DOS SEMINÁRIOS VETSCIENCE" INDIQUE ESTE INFORMATIVO VETSCIENCE PARA UM AMIGO Você recebeu este Informativo Técnico, pois acreditamos ser de seu interesse. Caso queira cancelar o envio de futuros s por favor responda a esta mensagem com a palavra CANCELAMENTO no campo ASSUNTO do .