Diagnóstico da Infecção Viral no doente Hematológico
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- Jerónimo de Vieira Gonçalves
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1 Diagnóstico da Infecção Viral no doente Hematológico Citomegalovirus Vírus Epstein-Barr HHV-6 BKV Mário Cunha, Luís Martins IPOLFG, EPE Serviço de Patologia Clínica Laboratório de Virologia Laboratório Acreditado NP ISO 15189
2 Resumo Vírus Diagnóstico da Infecção Viral no doente hematológico Outros vírus com impacto no doente hematológico Metodologia para detecção e quantificação viral Tipos de Amostra Expressão de Resultados Caso clínicos Conclusões 2
3 Os vírus provocam diferentes tipos de infecções - Infecções ocultas ou inaparentes (90%) - Infecções agudas Lise celular - Infecções latente - Infecções persistente - Infecções crónicas - Lise - Sintomas -Virémia acentuada - Infecções progressivamente lentas Panencefalite Esclerosante Sub aguda: patologia provocada não por défice imunitário mas por replicação defeituosa no CNS produção anormal da proteína M - Infecções Tumorogénicas Transformação celular EBV, HPV, HTLV I 3
4 Infecção Viral Vírus com impacto em doentes transplantados: Citomegalovirus (CMV) Vírus Epstein Barr (EBV) Herpes Humano Tipo 6 (HHV6) Vírus BK (BKV) 4
5 Família Herpesviridae Sub-Família Género Tipo Variante Alphaherpesvirinae Simplexvirus HSV1 HSV2 Betaherpesvirinae Gammaherpesvirinae Varicellavirus Cytomegalovirus Roseolavirus Lymphocryptovirus Rhadinovirus VZV Herpesvirus Humano 5 (CMV) Herpesvirus Humano 6 (HHV6) Herpesvirus Humano 7 (HHV7) Herpesvirus Humano 4 (EBV) Herpesvirus Humano 8 (HHV8) Variante A Variante B 5 Latência vs reactivação vs reinfecção
6 HCMV HCMV O Homem é o único reservatório Infecta células epiteliais ductais das glândulas salivares ou de rim Excretado regularmente na saliva e urina Infecções assintomáticas na infância Cadeia dupla DNA com 240 Kb In vitro: infecta fibroblastos humanos fetais (ciclo replicativo lento) Em pacientes imunossuprimidos, tem efeitos deletérios graves: Infecções pulmonares Hepatites Pneumonias intersticiais Gastrites Encefalites Etc. É uma das maiores causas de mortalidade ldd e morbilidade bldd em transplantados 6
7 HHV-6 Isolado em 1986 (Human B Lymphotropic Vírus), em pacientes com HIV/Doença linfoproliferativa (Science, Salahuddin ) Maior parte da população é seropositiva Receptor celular: CD46 Reactivação nas primeiras 2 a 4 semanas Apresenta duas variantes Variante A: Neurotróprica Variante B: Agente etiológico da Roseola infantum ou Exanthem subitum População normal: Encontra-se em saliva, sangue periférico, monócitos 7
8 HHV-6 (Cont.) Trans-activador de retrovirus endogenos Latência: Monócitos e Linfócitos DNA 8 Forma epissomal Forma integrada (CI-HHV-6): %. Poderá estar associado a: Sindrome Fadiga Crónica Alzheimer Esclerose Múltipla Miocardites Fibromialgias Autismo Em pacientes imunossuprimidos, tem efeitos deletérios graves: Infecções pulmonares Hepatites fulminantes Pneumonias intersticiais ti i i Encefalites Imunossupressor Etc.
9 EBV Agente etiológico da mononucleose infecciosa (doença do beijo) Genoma sob a forma linear, epissomal e integrado Ciclo Replicativo: Lítico: genoma linear Latência: Forma Epissomal/ Integrada Tem vários tipos de latência Capacidade de imortalização de células in vitro Vírus Oncogénico: Carcinoma Nasofaringe Linfoma de Burkit Outros Linfomas Doenças Linfoproliferativas Pós Transplante EBNA1: proteína de regulação, responsável pela manutenção da forma epissomal 9
10 BKV Pertence a família Polyomaviridae Cadeia dupla DNA com 5000 pb Infecções assintomáticas na infância Latência - uroepitélio A seropositiva aumenta com a idade Está associado a: Cistites hemorrágicas Nf Nefropatia pos transplante renal Encefalites Pneumonias Retinites 10
11 Detecção Viral vs Amostra Detecção Directa: Antigenémia (CMV) PCR em Tempo Real Mais rápido Permite monitorização (quantificação) Amostra: Plasma Cópias/mL Lavado Bronco Alveolar Liquido Céfalo Raquidiano Urina Soro Detecção Indirecta: Anticorpos da classe IgM, IgG e IgA Pouca utilidade em contexto hematológico Só utilizada no estudo do perfil serológico 11 Antigenémia CMV (pp65)
12 Monitorização Viral (cont.): Detecção Directa por PCR em Tempo Real: Permite monitorização continua da carga viral do paciente: Expressão de Resultados: cópias/ml ou UI/mL Detectado (Valor superior ao Limite Quantificação, expresso em Cópias/ml: Carga Viral CMV, EBV, HHV6, HHV8 Detectado inferior ao Limite de Quantificação (LQ) Não detectado 12
13 Monitorização Viral (cont.): PCR em Tempo Real: Curva de calibração: Periodicidade diária Realização de quatro diluições seriadas, em triplicado Avaliação dos resultados por Regressão Linear: Avaliação de Outliers: Teste Grubbs Linearidade: Análise de Resíduos, p-value 13
14 PCR em Tempo Real 14
15 Monitorização Viral: Transplante de Medula Óssea Tratamento pré-emptivo (aciclovir) Monitorização, em média, até ao dia +100 HCMV: bissemanalmente HHV-6 e EBV: semanalmente Técnicas usadas: Antigenémia: HCMV (proteína não estrutural, pp65) PCR em Tempo Real (qpcr) Carga Viral (Cópias/mL) HCMV EBV HHV-6 Serologia: Estudo do perfil serológico do receptor/dador, d antes do transplante 15
16 Alo-Transplante UTM Nº de Pacientes: 87 Idades: 27 anos [1; 63] Sexo Masculino: Idade Média: 24,3[1; 63] Sexo Feminino: Idade Média: 29,8[1; 57] ,8 24, Idade (Total) Masc. Feminino Média Min. Máx. 16
17 Alo-Transplante UTM Diagnóstico: Leucémias: 48 Mieloide Crónica - 8 Mieloide Aguda - 26 Linfoide id Aguda - 9 Linfoide Crónica - 3 Outras - 2 Linfomas: 12 Hodgkin - 4 Não Hodgkin - 8 Aplasias/Anemias: 13 Outras: Mieloma Multiplo, Mielofibrose, Sind. Mielo Displásico Tipo de Transplante Relacionados: 44 1 Singénico (gémeos idênticos) Não Relacionados: 43 17
18 Diagnóstico Diagnóstico Nº Sexo TipoTransplante Leucémia LMA 26 M: 12; F: 14 NR: 11; Rel.: 15 N=48 LMC 8 M:2; F: 6 NR: 4; Rel.: 4 LLA 9 M: 2; F7 NR: 6; Rel.: 2 LLC 3 M:1; F: 2 NR: 1; Rel.: 2 Outros 2 M:1; F: 1 NR: 1; Rel.: 1 Linfoma LNH 8 M: 4; F: 4 NR: 4; Rel.: 4 N=12 LH 4 M: 1; F: 3 NR: 4 Aplasias/Anemias B talassémia 4 M:3; F: 1 NR: 1; Rel.: 3 N=13 Anemia aplastica 4 M:2; F: 2 NR: 2; Rel.: 2 Outros 5 M: 1; F: 4 NR: 3; Rel.: 2 Outros Sind. Mielodisplásico 7 M: 4; F: 3 NR: 4; Rel.: 3 N=12 Sind. Wisckott-Aldrich 2 M: 4 NR: 1; Rel.: 1 18
19 Alo-Transplante UTM Desfecho: 14/87 (16%) pacientes faleceram: Em média, faleceram ao dia +187 pós transplante Tipo de Transplante: 9 Alo-Transplante Não Relacionados 5 Alo-Transplantes Relacionados, dos quais um é Singénico Diagnóstico: Leucémias: 7 (LLA:3; LMA: 4) Linfomas: 5(LH: 1; LNH: 4) Mielofibrose: 1 Sind. Mielodisplásico: 1 19
20 Serologia Pré Transplante Serologia CMV HHV-6 EBV Positivo 81,6% 82,8% 8% 83,9% Negativo 8,4% 7,2% 6,1% 20
21 Antigenémia CMV pp65 Alo-Transplante Relacionado vs Não Relacionado HCVM Antigenémia Nº Pacientes Positivos Número Médio Amostras 1ª Amostra Positiva % Amostras Positivas Média Células/ Alo-Transplante Não Relacionado Alo-Transplante Relacionado Alo-Transplante Relacionado e Não Relacionado 29/87 (33%) 23/87 (26%) 52/87 (59%) 52, Dia +29 Dia +84 Dia ,8% 13% 18% 4 Células/ ,4 Células/ Células/
22 Carga Viral CMV Alo-Transplante Relacionado vs Não Relacionado HCMV Carga Viral Alo-Transplante Não Relacionado Alo-Transplante Relacionado Total Nº Pacientes Positivos Número Médio Amostras 1ª Amostra Positiva % Amostras Positivas 35/87 (40%) 37/87 (43%) 72/87 (83%) Dia +16 Dia +45 Dia % 25% 32% Média Cópias/ml 1046 cópias/ml 584 cópias/ml 829 cópias/ml 22
23 EBV Alo-Transplante Relacionado vs Não Relacionado EBV Carga Viral Nº Pacientes Positivos Número Médio Amostras 1ª Amostra Positiva % Amostras Positivas Média Cópias/ml Alo-Transplante Não Relacionado Alo-Transplante Relacionado Alo-Transplante Relacionado e Não Relacionado 21/77 (27%) 11/77 (14%) 32/77 (41%) Dia +79 Dia +114 Dia % 18% 14% 5831 cópias/ml 1211 cópias/ml 4511 cópias/ml 23
24 HHV-6 Alo-Transplante Relacionado vs Não Relacionado 24 HHV-6 Alo-Transplante a Não Relacionado Alo-Transplante a Relacionado Total (Pacientes com HHV-6 CI= 4) Com Sem Com Sem Com Sem Integ. Integ. Integ. Integ. Integ. Integ. Nº Amostras 34/84 32/84 22/84 20/84 56/84 52/84 Positivas (40%) (38%) (26%) (24%) (67%) (62%) Número Médio Amostras 1ª Amostra Positiva % Amostras Positivas Média Cópias/ml Dia +43 Dia + 45 Dia +66 Dia + 69 Dia +52 Dia % 11% 13% 9% 15% 10% cópias/m l n= cópias/ ml n= cópias/ml n= cópias/ ml n= cópias/ml n= cópias/ ml n=38
25 Vírus BK BK Virus Alo-Transplante Não Relacionado Alo-Transplante Relacionado Total Plasma Urina Plasma Urina Plasma Urina Nº Amostras 10/11 8/13 11/12 18/24 17/20 6/8 (75%) Positivas (91%) (62%) (92%) (75%) (85%) Número Amostras 1ª Amostra Positiva % Amostras Positivas Média Cópias/ml Dia + 67 Dia +22 Dia + 36 Dia + 25 Dia +53 Dia % 78% 18% 40% 26% 54% ,2x ,6x ,7x10 8 cópias/ml cópias/ ml cópias/ml cópias/ ml cópias/ml cópias/ ml n=5 n= 24 n= 4 n=10 n= 9 n=17 25
26 Antigenémia pp65 vs. Carga Viral CMV Nº médio amostras com resultado emparelhado: 51 72/87 (88%)pacientes com resultado concordante 23 (26%) paciente com CV CMV Não Detectado e Negativo para antigenémia pp65 8 pacientes com CV CMV inferior ao LQ 2 NR - pp65: 0.5 células/ Rel - pp65: 0.8 células/ pacientes com CV CMV superior ao LQ: Média de CV CMV: 965 cópias/ml Média de Células Positivos de pp65: 3.9 células/ NR CV CMV: 1168 cópias/ml; pp65: 4,4 Cel. +/50k 16 Rel CV CMV: 648 cópias/ml; pp65: 3 Cél. +/50k 1ª Amostra Positiva: CV CMV vs pp65 Antigenémia pp65 Positivo i Negativo CV Positivo pp65: 28 dias (valor médio) CV CMV:12 dias (valor médio) CMV Negativo pacientes com resultado discordante: 7 apresentam CV CMV > ao LQ - Média CV CMV: 268 cópias/ml 3 com pp65 Positiva e CV CMV Não Detectado 26
27 CV HCMV vs CV HHV-6 40/87 apresentam DNAemia de HCMV e HHV-6 1ª Amostra com resultado Detectado : HCMV: +26 dias HHV-6: +55 dias Carga Viral Média: HCMV: 905 cópias/ml (Sem HHV6-CI: 876 cópias/ ml HHV-6: 9928 cópias/ml (Sem HHV6-CI: cópias/ ml) Tipo de Transplante: Não Relacionado: 29 Relacionado: 19 27
28 CV HCMV vs CV HHV-6 vs CV EBV 21/87 apresentam DNAemia de HCMV, HHV-6 e EBV 1ª Amostra com resultado Detectado : HCMV: +27 dias HHV-6: +57 dias EBV: +81 dias Carga Viral Média: HCMV: 978 cópias/ml HHV-6: 2793 cópias/ml EBV: 6007 cópias/ ml Tipo de Transplante: NR 29; R 19 1 paciente faleceu: NR 28
29 Vírus BK Monitorização de plasma e urina: Poucos pacientes em estudo Aparece mais cedo na urina: +14 dias Diferenças entre Alo-Tx Relacionados e Não Relacionados: 1ª Amostra Positiva: +25 vs +22 (semelhante) CV BKV (Urina): mais elevada 1 log em Não Relacionados (10 7 vs 10 8 ) Maior % Amostras Positivas em Não Relacionado: 40% vs 78% 29
30 Pacientes sem CV CMV 30 4 Pacientes com DNAémia EBV: 1 Amostra Positiva: +43 dias 490 cópias/ ml (n=2) 3 NR; 1 Rel. 1 dos pacientes com HHV6-CI 2 faleceram 7 Pacientes com DNAéma HHV6 1 Amostra Positiva: +26 dias 4942 cópias/ ml (n=6) 5 NR; 2 Rel. 3 faleceram
31 Pacientes que faleceram 14/87 (16%) pacientes faleceram: Em média, faleceram ao dia +187 pós transplante Tipo de Transplante: 9 Não Relacionados 5 Relacionados Idade: 36 [3, 59] 1º Am. POS Quant. n pp dias 5,5 cel./50k 6 CV CMV + 22 dias 712 cop/ml 9 CV EBV -9 dias < LQ 3 CV HHV dias 590 cop/ ml 11 31
32 Análise de casos: nº1 Carga Viral CMV vs Antigenémia Carg ga Viral An ntigeném mia CMV Dias Pós Transplante 0 32 Nº Cópias CMV Antigenémia pp65
33 Análise de casos: nº Paciente 1 Carga Viral CMV - EBV - HHV6 600 CMV e HHV6 Car rga Viral Carga Vir ral EBV Nº Cópias CMV Nº Cópias HHV6 Nº Cópias EBV 0 33 LNH AT-NR
34 Análise de casos: nº32 Antigenémia pp65 e CV CMV Carga a Viral CM MV Ant igenémi ia pp Nº Cópias CMV Antigenémia pp65 34 LMA AT-NR 0
35 Análise de casos: nº 32 Carga Viral CMV - EBV - HHV EBV Carg ga Viral Dias Pós Transplante Nº Cópias HHV6 Nº Cópias CMV Nº Cópias EBV 35 LMA AT-NR Carga Vir ral CMV e HHV6
36 Análise de casos: nº Carga Viral e Antigenémia pp65 8 Carga a Viral CM MV Anti genémia pp Nº Cópias CMV Antigenémia pp º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - LLC AT-NR
37 Análise de casos: nº 53 Carga Viral CM MV e EBV Carga Viral CMV - EBV - HHV Carga Viral HH HV Dias Pós Transplante 0 Nº Cópias CMV Nº Cópias EBV Nº Cópias HHV6 37 LLC AT-NR
38 Análise de Casos: nº 46 Ca arga Viral / Antig genémia Carga Viral HCMV, EBV e HHV-6 Antigenémia CMV pp Dias Pós Transplante Antigenémia i pp65 Nº Cópias HHV6 Nº Cópias CMV Nº Cópias EBV Carg ga Viral EBV 38 Anemia aplastica Tx NR
39 Análise de Casos: nº 64 HV6 Carg ga Viral EBV e H Carga Viral CMV + EBV + HHV ,0 35,0 85,0 135,0 185,0 235,0 Nº Copias CV EBV Nº Copias CV HHV6 Nº Copias CV CMV 39 LLC AT-NR Carga Vi iral CMV
40 Lesões a HHV6 40
41 Conclusões: Citomegalovirus: Carga Viral ldo HCMV vs Antigenémia pp65 Mais pacientes com resultado Detectado (40% vs 33%) Mi Maior percentagem de Amostras por paciente com resultado Detectado (32% vs 18%) Detecção precoce (+31 dias vs +40 dias) Antigenémia requer Nº mínimo de células (1000 leucócitos/ul) Amostra recente (máximo 4 horas após colheita) enquanto que na CV HCMV só necessitamos de plasma A observação microscópica da antigenémia pp65 tem uma observação subjectiva ACV permite a monitorização i a partir do dia zero 41
42 Conclusões: Vírus Epstein-Barr Dinâmica viral diferente do CMV: + 91 dias CV EBV: 4511 cópias/ml, com valores mais elevados nos Alo-Tx Não Relacionados Importância no risco de desenvolvimento de Doença Linfoproliferativa Pós Transplante 42
43 Conclusões: Herpes Humano Tipo 6; Possível papel pp como: Agente? 11/14 (79%) pacientes com HHV6, + 61 dias Cofactor? Bystander? Possível trans-activador de outros vírus, nomeadamente HCMV Pacientes com DNAemia elevada de HHV-6: necessário avaliar a possibilidade de este se encontrar integrado no genoma da célula 43
44 Importância da Monitorização Pós Transplante Alo-Transplante Relacionado (R) vs Não Relacionado (NR) DNAemia e Antigenémia é mais elevada em NR do que R: pp65: 4 vs 2 Células/ HCMV: 1046 vs 584 Cópias/ml EBV: 5831 vs 1211 Cópias/ml HHV-6: vs 7631 Cópias/ml (inclui pacientes com HHV-6 CI) DNAemia/ Antigenémia CMV aparecem mais cedo em Alo- Transplantes Não relacionados Pode comprometer sucesso de transplante 44
45 Importância da Monitorização Pós Transplante Alo-Transplante Relacionado (R) vs Não Relacionado (NR) DNAemia e Antigenémia é mais elevada em NR do que R: pp65: 4 vs 2 Células/ HCMV: 1046 vs 584 Cópias/ml EBV: 5831 vs 1211 Cópias/ml HHV-6: vs 7631 Cópias/ml (inclui pacientes com HHV-6 CI) DNAemia/ Antigenémia CMV aparecem mais cedo em Alo-Transplantes Não relacionados Pode comprometer sucesso de transplante 45
46 Conclusões: As cargas virais permitem Detecção precoce Permite a monitorização a partir do dia zero (ao contrário da antigenémia) a) Estudo da Dinâmica viral - >Resultados quantificados(cópias/ml) 46
47 Conclusões: Herpes Humano Tipo 6; Possível papel pp como: Agente? Cofactor? Bystander? Possível trans-activador de outros vírus, nomeadamente HCMV Pacientes com DNAemia elevada de HHV-6: necessário avaliar a possibilidade de este se encontrar integrado no genoma da célula (ver paciente 46) Terapêutica antiviral 47
48 Agradecimentos 48
49 It is the laboratory that has helped turn medicine from Art into Science Stanley Zinberg
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