UNINGÁ UNIDADE DE ENSINO SUPERIOR INGÁ FACULDADE INGÁ CURSO DE ESPECIALIZAÇÃO EM IMPLANTODONTIA PAULO DA SILVA

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1 UNINGÁ UNIDADE DE ENSINO SUPERIOR INGÁ FACULDADE INGÁ CURSO DE ESPECIALIZAÇÃO EM IMPLANTODONTIA PAULO DA SILVA A UTILIZAÇÃO DAS PROTEÍNAS MORFOGENÉTICAS ÓSSEAS (BMPs) NA IMPLANTODONIA PASSO FUNDO 2011

2 1 PAULO DA SILVA A UTILIZAÇÃO DAS PROTEÍNAS MORFOGENÉTICAS ÓSSEAS (BMPs) NA IMPLANTODONIA Monografia apresentada à unidade de Pósgraduação da Faculdade Ingá UNINGÁ Passo Fundo-RS como requisito parcial para obtenção do título de Especialista em Implantodontia. Orientador: Ms. Christian Schuh PASSO FUNDO 2011

3 2 PAULO DA SILVA A UTILIZAÇÃO DAS PROTEÍNAS MORFOGENÉTICAS ÓSSEAS (BMPs) NA IMPLANTODONIA Monografia apresentada à comissão julgadora da Unidade de Pós-graduação da Faculdade Ingá UNINGÁ Passo Fundo- RS como requisito parcial para obtenção do título de Especialista em Implantodontia. Aprovada em / /. BANCA EXAMINADORA: Prof. Ms. Christian Schuh - Orientador Prof. Prof.

4 3 AGRADECIMENTOS Ao Professor e Mestre Christian Schuh, meu Orientador, pela dedicação e atenção dispensadas. Ao Professor Dalvo Oliveira, pela indispensável colaboração. Aos colegas Daniel B. Nunes e Tobias Trevisan, pelo companheirismo e amizade compartilhados nos momentos de aprendizagem e descontração. À minha esposa, Roselei, pelo auxílio na execução desta monografia, e estímulo para o meu crescimento profissional, além do seu amor e companheirismo presentes em todos os momentos da nossa família. Às minhas filhas, Joana e Vitória, pela ternura sempre presente e pela compreensão neste período de ausências.

5 4 RESUMO O presente estudo é uma revisão de literatura a respeito do emprego das Proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) na implantodontia. É essencial para o sucesso do implante de titânio a presença de estrutura óssea suficiente que lhe de estabilidade e suporte ao tecido gengival, restabelecendo a função e a estética, semelhantes ao elemento dentário perdido. O objetivo deste trabalho foi analisar diferentes artigos avaliando o emprego das BMPs, indicadas para aumentar a quantidade, melhorar a qualidade e acelerar regeneração óssea. As BMPs foram descobertas em 1965 por Urist, atualmente são conhecidas vinte tipos, dentre as quais destaca-se a de numero 2 (BMP-2), por apresentar melhor propriedade osteoindutora, atraindo e estimulando a transformação das células mesenquimais indiferenciadas em osteoblastos, secretores de nova matriz óssea. Elas podem ser extraídas da cortical de ossos longos, ou por biologia molecular, clonando-se os genes responsáveis pela sua produção (Proteína morfogenética óssea recombinante humana - rhbmp). Devido às características físicas, o uso desse material requer sua associação a um carreador, atualmente, a esponja de colágeno absorvível (ACS) é a mais utilizada. Concluiu-se que é necessário a descoberta de novos carreadores facilitando a estabilidade mecânica no leito receptor e outras técnicas de fabricação da BMP para redução de custos. Palavras-chave: Proteína Morfogenética Óssea, Implantes Dentários, Proteínas Recombinante.

6 5 ABSTRACT This study is a review of Bone Morphogenetic Proteins application in implantology. Presence of bone structure is essencial for dental implant stability and success, and for gingival tissue support, restoring function and aesthetics similar to the lost dental element. The objective of this study was to analyse different articles evaluating the use of BMPs, which are indicated to increase bone quantity and quality, improving bone regeneration process. The BMPs were discovered in 1965 by Urist, and, at this moment, 20 types are known. BMP number 2 (BMP-2) is most emphazed, because it s best osteoinductive property, which attracts and stimulate the undifferentiated mesenchymal cells to transform into osteoblasts. BMPs can be extracted from long bones cortical, or by molecular biology, cloning the genes that are responsible for it s production (Bone Morphogenetic Protein Recombinant Human-rhBMP). Because of the physical characteristics, the use of this material requires association to a carrier. Nowadays, absorbable collagen sponges (ACS) are most used carrier. It can be concluded that new carrier discovery is necessary to smooth stability of this carriers in receptor site, as well as, new BMP manufactoring techniques to reduce costs. Keywords: Bone Morphogenetic Protein, Dental Implant, Recombinant Proteins.

7 6 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 2 REVISÃO DE LITERATURA PROPRIEDADES DA BMP COMO BIOMATERIAL CARREADORES OU ARCABOUÇOS MECANISMOS DE AÇÃO DAS BMPs OBTENÇÃO DAS BMPs A BMP E A IMPLANTODONTIA ILUSTRAÇÃO DE TÉCNICA... 3 CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... APÊNDICE

8 7 1 INTRODUÇÃO A utilização de implantes de titânio para repor a estrutura dentária perdida é, sem dúvida, um marco histórico na Odontologia. Atualmente, os profissionais da área reconhecem os resultados positivos dessa técnica para a fixação de um ou mais elementos dentários. No entanto, para tal procedimento ter êxito, é de fundamental importância que o local onde será efetuado tenha estrutura óssea suficiente para dar estabilidade ao parafuso de titânio e suporte para o tecido gengival. Conforme Zétola e Pereira (2010), acredita-se que cerca de 25% dos pacientes não possuam essa característica para a instalação de implantes, necessitando de algum tipo de aumento ósseo que a anteceda. A literatura atual descreve vários procedimentos para ganho de osso em rebordo edêntulo e também para sua manutenção após a remoção do elemento dentário. Normalmente, nessas técnicas são utilizados biomaterias como terapia complementar na instalação de implantes. A técnica mais utilizada é a cirurgia com osso autógeno, considerado como Gold Standard por apresentar as melhores propriedades biológicas de todos os biomateriais: osseogenicidade, osseocondutção, osseoindução e osseopromoção. Porém, alguns aspectos ainda deixam a desejar nesse procedimento, como, por exemplo, o período de espera pós-enxerto, a qualidade óssea e a morbidade. Tais fatores podem ser melhorados com a utilização das Proteínas Morfogenéticas Ósseas (BMPs). O processo de remodelação óssea é muito dinâmico. Segundo Marx e Garg (1998), aproximadamente 0,7% do esqueleto humano é reabsorvido diariamente e substituído por osso saudável recém-formado. Portanto, em tese, todo o esqueleto é renovado a cada 142 dias. Isso ocorre em razão de os osteoblastos apresentarem um citoplasma intensamente basofílico, com grande presença de proteínas ribossômicas, relacionadas à síntese dos componentes da matriz óssea. Quando o osteoblasto deposita matriz óssea, ele também secreta a BMP, que fica retida na matriz mineral. Essa proteína é ácida-insolúvel e fica no osso até ser liberada através da ação dos

9 8 osteoclastos, que dissolvem o mineral sem afetar a estrutura orgânica da BMP. Ao ser liberada, a BMP adere à superfície das células mesenquimais indiferenciadas, o que provoca uma alteração genética, diferenciando-as em osteoblastos, dando continuidade ao processo de remodelação óssea. Segundo Gonçalves (1998), a resposta do osso frente à implantação das BMPs acontece de modo semelhante ao desenvolvimento do tecido ósseo no embrião. Seu uso é indicado em casos de grandes perdas ósseas por neoplasias, anomalias de desenvolvimento, infecções e inflamações, pois apresentam fatores indutores capazes de estimular a diferenciação das células fontes (mesenquimais) em células especializadas, induzindo a neoformação óssea e cartilaginosa. A neoformação do tecido ósseo e sua manutenção possibilitam a instalação de implantes que preservam as características funcionais e estéticas semelhantes às do elemento dentário perdido. Portanto, a proposta deste trabalho é realizar uma revisão bibliográfica sobre o que são as BMPs, seus tipos, suas propriedades e indicações para o restabelecimento da estrutura óssea perdida.

10 9 2 REVISÃO DE LITERATURA Em 1965, Urist induziu a neoformação óssea ao implantar pequenas porções de osso desmineralizado no tecido cutâneo de cobaias. Ele sabia que esses implantes eram de origem protéica, por isso, denominou o material de Proteínas Morfogenéticas Ósseas (BMPs). 2.1 PROPRIEDADES DA BMP COMO BIOMATERIAL Segundo a Sociedade Européia de Biomaterias (apud CARVALHO; BASSI; PEREIRA, 2004, p. 255), o termo biomaterial refere-se a qualquer substância, droga, combinação de substância natural ou sintética que pode ser usada por um período como parte de sistema tratado ou como reposição de algum tecido, órgão ou função do corpo. Algumas propriedades devem estar presentes nos biomateriais, tais como: não induzir a formação de trombos como resultado do contato entre o sangue e o biomaterial; não induzir resposta imunológica adversa; não ser tóxico; não ser carcinogênico; não perturbar o fluxo sanguíneo; e não produzir resposta inflamatória aguda ou crônica que impeça a diferenciação própria dos tecidos adjacentes. Para confirmar as propriedades anteriormente descritas, Bengston et al. (2006) avaliou a reação histológica da Proteína Morfogenética Óssea Recombinante Humana, tipo 2 (rhbmp-2), produzida através de engenharia genética) associada a arcabouço de osso mineral natural desnaturado (extraído do fêmur de vitelo) e implantada no tecido subcutâneo do dorso de 16 ratos. As peças foram removidas 7, 21, 40 e 112 dias após o implante. Histologicamente, na fase inicial, ocorreu formação de processo inflamatório agudo, identificado pelo exsudato de neutrófilos e depósito de fibrina. Porém, nos períodos finais do experimento, constatou-se que houve neovascularização de maior intensidade, reabsorção parcial dos implantes e que o tecido subcutâneo circundante apresentava aspecto de normalidade, evidenciando, assim, a biocompatibilidade dos implantes.

11 10 No entanto, Schwarz et al. (2008), em estudos histométricos realizados com cães, usando substitutos ósseos associados à rhbmp-2 e fator de diferenciação de crescimento recombinante humano 5 (rhgdf-5), observou que houve aumento do rebordo edêntulo das cobaias. Concluiu-se, então, que o uso de rhbmp-2 e rhgdf-5 foi eficiente na regeneração do rebordo ósseo, embora, seus carreadores (osso particulado heterógeno e bloco de mineral natural, recobertos por membrana colágeno), revelassem, após exame histoquímico, acentuado sinal de reatividade antígena para osteocalcina. Segundo Carvalho (2010), quanto a sua origem, os biomateriais utilizados em Implantodontia classificam-se em: autógenos ou autólogos obtidos de áreas doadoras do próprio indivíduo; homógenos ou homólogos obtidos de indivíduos de espécies semelhantes ao receptor; heterógenos ou xenógenos obtidos de indivíduos de espécies diferentes do receptor (bovino, suíno ou caprino); sintéticos ou aloplásticos podem ser metálicos, cerâmicos ou plásticos. Conforme o autor, os biomateriais classificam-se, ainda, quanto a sua propriedade biológica, em: a) Osseocondutora biomaterial com capacidade de conduzir o movimento de novo tecido ósseo através de sua matriz de suporte. Esses materiais são biocompatíveis e formam um arcabouço para que as células osseoblásticas depositem-se e proliferem. Caso este material seja inserido em local ectópico (não ósseo), ele não estimulará a neoformação óssea, permanecendo relativamente inalterado e encapsulado, ou sendo reabsorvido. b) Osseoindutora é a capacidade do biomaterial de induzir a osseogênese a partir do recrutamento de células imaturas e sua diferenciação em células osseoprogenitoras. Na Implantodontia, os agentes osseoindutores mais utilizados são os biomateriais homógenos e os autógenos.c) Osseogênica é a propriedade do biomaterial pela qual as células ósseas vivas remanescentes no enxerto mantêm a capacidade de formar matriz óssea. d) Osseopromotora caracterizada pelo uso de meios físicos que promovem o isolamento anatômico de um local, permitindo a seleção e a proliferação de um grupo de células, no caso, os osteoblastos. Observando todas as propriedades relacionadas anteriormente, pode-se afirmar que os enxertos ósseos autógenos são considerados, hoje, como Gold Standard, pois contêm as características osseogênicas (sugere que a atividade osseogênica dessas células tem a duração de quatro semanas - fase 1), osseoindutoras

12 11 (refere-se à liberação de proteína osseomorfogenética, permanece entre duas semanas e seis meses fase 2), osseocondutoras (é mantida por meio de sua matriz inorgânica fase 3) e osseopromotoras (quando a cortical dos blocos ósseos atuam como membrana fase 4). Euda et al. (2007), buscou verificar a capacidade de osseoindução do complexo BMP (BMP + carreador) utilizado em implantes de titânio, em 6 coelhos. Os animais foram divididos em dois grupos: grupo 1- enxerto de osso autógeno; grupo 2: - BMPs. Um total de 12 implantes de titânio puro foram usados, sendo instalados 2 em cada metáfise proximal da tíbia esquerda de cada coelho. Foram produzidos defeitos ósseos de 2,5mm X 4mm, expondo as roscas dos implantes e, depois, foram preenchidos com os 2 tipos de materiais estudados (osso autógeno e complexo BMP). Decorridos 42 dias, em ambos os grupos houve a total neoformação óssea, com grande concentração de células (osteócitos), lamelas de fibras colágenas concêntricas ao canal de Havers, cartilagem hialina, estando o osso em processo de maturação, ou seja, incapaz de resistir às pressões. No grupo 2, ocorreu também a neoformação óssea sem remanescentes de cristais de hidroxiapatita. Sistemas haversianos foram vistos regularmente nos processos ósseos que preencheram as roscas do parafuso. Nenhum tecido fibroso ou células foram encontrados na interface. O osso novo que tinha se formado dentro da interface estava em processo de maturação, com osteócitos, amplos canais medulares e nichos cartilaginosos. Ao serem utilizadas, as BMPs, conferem a propriedade de osseoindução ao sítio cirúrgico e aceleram a neoformação óssea. Segundo Ellis III (2005), a osseogênese do tecido transplantado em um mesmo paciente, de uma área para outra, ocorre, inicialmente, com as células do tecido transplantado que proliferam e formam novo osteóide. A quantidade de regeneração óssea depende das células que sobreviveram ao ato cirúrgico, visto que o suprimento sanguíneo é interrompido e a nutrição inicial desse tecido ocorre por difusão dos nutrientes que estão em volta do tecido ósseo transplantado. Logo, um número considerável de células morre durante o procedimento. Mesmo assim, essa fase é responsável pela maior parte da quantidade de osso neoformado. A partir da segunda semana, acontece intensa angiogênese e proliferação fibroblástica do leito receptor.

13 12 Os fibroblastos e outras células mesenquimais indiferenciadas transformam-se em osteoblastos que depositam novo osso, evidenciando, desse modo, a presença de uma proteína no tecido ósseo, induzindo essa reação do tecido gengival que envolve o leito receptor. Essa proteína é produzida naturalmente nas células do organismo e é considerada um fator de crescimento que tem o papel de controle da síntese protéica, culminando, entre outros, com o controle do processo natural de mitose, diferenciação e migração celular. As moléculas desses fatores são produzidas em pequena quantidade e são de difícil isolamento, atuando nas células vizinhas por via parácrina, ou por via autócrina sobre a própria célula, isto é, como mediadores químicos locais sem nenhum efeito sistêmico. As BMPs estimulam o crescimento de tecido ósseo, sendo secretadas fisiologicamente por células da medula óssea, plaquetas, células musculares e osteoblastos (ZÉTOLA; PEREIRA, 2010). Com o objetivo de confirmar esses dados, De Marco (2007) realizou um estudo para avaliar a imunolocalização do fator de crescimento BMP-2 em enxerto ósseo autógeno, com bloco recoberto ou não por membrana de politetrafluoretileno (PTFE), na fase inicial da reparação óssea. Quarenta e oito ratos foram separados em dois grupos: no Grupo 1 foi realizado enxerto ósseo autógeno (E); e, no Grupo 2, o enxerto ósseo autógeno foi recoberto com membrana (ME). Os cortes foram submetidos à reação imunoistoquímica e avaliados em períodos de 0 horas, 3, 7, 14, 21 e 45 dias. Realizou-se a avaliação das seguintes regiões dos enxertos: as bordas, o enxerto, o tecido conjuntivo superior ao enxerto, a interface e o leito. Observou-se que a marcação intracitoplasmática da BMP-2 teve maior concentração em área de revascularização e angiogênese. Além disso, as células osteoprogenitoras, osteoblastos e osteócitos apresentaram identificação intracitoplasmática para BMPs, indiferentemente do período ou da estrutura analisada. De modo geral, avaliando as estruturas, constatou-se marcação em maiores quantidades de BMPs no bordo, na interface e no tecido conjuntivo superior ao enxerto, independentemente do grupo analisado. As menores concentrações foram encontradas no enxerto. O grupo com membrana apresentou concentração mais tardia de BMPs do que o grupo sem membrana, exceto na região da interface e do leito. A atividade de neoformação óssea

14 13 ocorreu antes no grupo sem membrana. No grupo com a membrana, essa atividade foi mais lenta, indicando áreas com gradativa revascularização. No tecido conjuntivo superior ao enxerto, a maior proporção de concentração ocorreu no grupo sem membrana no 7º dia; e, no grupo com a membrana, aos 21 dias. 2.2 CARREADORES OU ARCABOUÇOS A utilização em larga escala das BMPs encontra alguns obstáculos. Por elas apresentarem um peso molecular relativamente baixo, de fácil difusão nos fluidos corporais, há dificuldades para mantê-las em concentração terapêutica nas feridas cirúrgicas. Por difundirem-se rapidamente na própria vascularização do local, em lugares onde as BMPs foram administradas sem um carreador, as proteínas não foram detectadas poucas horas depois da utilização. Consequentemente, seu efeito não foi significativo. Desse modo, conclui-se que é necessário manter a BMP-2 por um determinado período no local onde se deseja fazer o aumento ósseo. Somente assim, uma quantidade significativa de células indiferenciadas poderá ser induzida a produzir grande quantidade de matriz óssea (MAZZONETTO; NASCIMENTO, 2010). Segundo MAGINI et al. (2005), o arcabouço ideal que permite e favorece a proliferação das células coletadas e cultivadas deve ser: tridimensional; altamente poroso (com poros interconectados); biocompatível com a sua taxa de absorção; portador de uma superfície apropriada para adesão, proliferação e diferenciação celular; possuidor de propriedades mecânicas semelhantes ao sítio receptor. Inúmeros materiais estão sendo testados como carreadores, entre esses estão: a esponja de colágeno absorvível (ACS), a matriz óssea descalcificada, o ácido hialurônico, a matriz óssea bovina sem proteína, a hidroxiapatita, o fosfato de cálcio, o ácido polilático e o polimetilmetacrilato. O carreador mais pesquisado e mais difundido na atualidade é a ACS, por promover uma melhor angiogênese e replicação celular local, por não causar reação imunogênica, ser moldável e manter o espaço para a neoformação óssea. Além disso, une-se prontamente à BMP-2 e permite a infiltração das células indiferenciadas que se transformarão em osteoblastos (ZÉTOLA; PEREIRA, 2010).

15 14 Yoshidal et al. (1999), avaliou o uso de colágeno tipo 1 e hidroxiapatita porosa como carreador de rhbmp-2 para o reparo ósseo em defeitos cirúrgicos criados na mandíbula de 30 coelhos, divididos em 2 grupos: grupo 1 15 coelhos com colágeno, hidroxiapatita porosa e rhbmp-2; grupo 2 (controle) 15 coelhos com colágeno, hidroxiapatita porosa sem rhbmp-2. Os animais foram sacrificados após 3, 7, e 21 dias. Depois de 3 dias, não houve diferença entre os grupos. Aos 7 dias, no grupo com rhbmp-2 notou-se a presença de osso imaturo; no grupo controle, houve infiltrado de células mesenquimais em alguns poros. Decorridos 21 dias, no grupo com a proteína havia vasos sanguíneos e osso trabecular alinhados às paredes dos poros da hidroxiapatita; já no grupo controle, havia infiltrado de células mesenquimais em alguns poros. Jung et al. (2007), testou uma matriz sintética de polietilenoglicol (PEG) como carreador da rhbmp-2, instalando, na calvária de 10 coelhos, 4 cilindros ocos de titâneo, da seguinte forma: 1º cilindro (controle): vazio; 2º cilindro: combinação de PEG+HA/TCP (hidroxiapatita/ fosfatotricalcio); 3 cilindro: combinação de PEG + HA/TCP e rhbmp-2 10mg; 4º cilindro: combinação de PEG +HA/TCP e rhbmp-2 30mg. A análise histomorfométrica mostrou regeneração óssea significativa nos grupos 3 e 4 se comparados aos grupos 1 e 2. Pôde-se concluir que, em coelhos, o uso de PEG contendo grânulos de HA/TCP preenche os requisitos de carreador ideal para liberação lenta e gradual da rhbmp-2 no sítio receptor. Jorge (2004), ao desenvolver sua tese de doutorado, testou outros tipos de carreadores através de estudo imunoistoquímico da incorporação de enxerto ósseo com BMP-2 na mandíbula de ratos. No experimento, 75 animais com defeitos ósseos na mandíbula de tamanho não reparável espontaneamente, foram divididos em 3 grupos: grupo 1: controle foi usado osso autógeno fresco do ilíaco; grupo 2: enxerto alógeno autoclavado; grupo 3: enxerto alógeno autoclavado + BMP-2 e colágeno tipo IV. Os ratos foram sacrificados em 14, 21 e 28 dias. Suas mandíbulas foram histologicamente avaliadas por coloração de eosina e hematoxicilina; por reação imunohistoquímica com anticorpos IHH, SHH e osteopontina; e, radiograficamente, as imagens foram avaliadas por densitometria óptica, com testes estatísticos. Concluiu-se

16 15 que, no grupo 2, a neoformação óssea foi limitada aos cotos mandibulares com reabsorção mais lenta do enxerto, sendo que grande parte desse não estava unida à mandíbula. Já no grupo 3, houve remodelação óssea intensa, com preenchimento do espaço medular por neoformação e união do enxerto com a mandíbula. Em seu experimento, Mendes (2006) provocou cavidades ósseas de 3mm de diâmetro, em 30 ratos. As cavidades foram preenchidas com biomaterial (conforme a divisão em 5 grupos) e recobertas por membrana. O autor analisou-as microscópica e histometricamente, conforme seu preenchimento: grupo 1: controle; grupo 2: osso desmineralizado; grupo 3: osso desmineralizado associado às BMPs; grupo 4: osso composto; grupo 5: osso composto associado às BMPs. No grupo controle, os resultados de neoformação óssea foram sempre melhores, se comparados aos grupos experimentais. Quando os materiais foram associados às BMPs, a neoformação óssea foi acentuadamente melhorada, principalmente nos períodos de 10 e 20 dias (período que coincide com a atividade de diferenciação tecidual). Essa acentuada melhora deve-se, provavelmente, ao potencial osseoindutor do pool de BMPs. Porém, nas cavidades ou defeitos ósseos em cujo interior foram utilizados os biomateriais, sempre ocorreu retardo de sua cronologia. Esse fato deve-se à presença de infiltrado inflamatório agudo com predominância de neutrófilos polimorfonucleares em torno desses materiais. No entanto, é importante o entendimento de que, em algumas situações clínicas nas quais se deseje a manutenção da espessura e volume alveolar, ou mesmo em levantamentos de assoalho de seio maxilar, o uso de biomateriais classificados como substitutos ósseos, pode ser uma opção, desde que sejam respeitados os limites biológicos que o material apresenta e que se obedeça rigidamente às suas indicações. Corroborando com essas afirmações, o estudo de Mendonça et al. (2007), avaliou histologicamente o processo de reparo ósseo, após a utilização de BMPs (Gen-Pro - Proteína Morfogenética Óssea de embrião bovino, Genius Baumers) associadas à hidroxiapatita como carreador. Criou-se um defeito ósseo no fêmur de 24 ratos, que foram divididos em 2 grupos: grupo 1(controle) - defeitos preenchidos com coágulo sanguíneo; grupo 2: defeitos preenchidos com Gen-Pro. Os animais foram sacrificados

17 16 em 15, 21 e 30 dias. Nos períodos de 15 e 21 dias, observou-se uma neoformação óssea maior no primeiro grupo do que segundo. Porém, em 30 dias, todos os defeitos ósseos estudados alcançaram reparação. O diferente grau de resolução refere-se à presença do material implantado, que exacerbou a resposta inflamatória de grau moderado em 100% do grupo 2. No grupo 1, a resposta inflamatória foi leve, o que permitiu maior velocidade da neoformação de trabéculas ósseas. Portanto, o biomaterial testado promoveu efeito biomodulador positivo sobre a neoformação óssea. Do mesmo modo, Calixto et al. (2007) analisou histometricamente a capacidade do material Gen-Pro associado à hidroxiapatita microgranular, para estimular o reparo ósseo alveolar em ratos. Os resultados sugerem que a mistura de BMPs associadas à hidroxiapatita microgranular absorvível não garantem um carreador adequado a um sistema de liberação lenta compatível com a neoformação óssea, portanto inadequado à osseoindução. Por outro lado, no trabalho de Lourenço (2002), foram criados defeitos ósseos cirúrgicos na calvária de 45 coelhos. Esses defeitos foram preenchidos com BMPs extraídas de ossos longos de renas jovens, combinadas com o compósito carbonato de cálcio-colágeno, tanto em forma granular, quanto em forma de bloco. Nos sítios controle, os defeitos foram preenchidos com osso autógeno (controle positivo) associado com as duas formas do compósito. O controle negativo não recebeu nada. Os animais foram sacrificados após 4,6 e 10 semanas. Concluiu-se que, tanto as BMPs extraídas de rena e combinadas com o compósito carbonato de cálcio-colágeno, quanto o osso autógeno associado ao compósito, tiveram osseogêneses semelhantes nos dois grupos e não apresentaram reações inflamatórias desfavoráveis. A análise tomográfica apresentou um quadro de resultados semelhantes aos obtidos com a histomorfometria. 2.3 MECANISMO DE AÇÃO DAS BMPs Segundo Marx e Garg (1998), existem 3 tipos diferentes de células no tecido ósseo: osteoblastos, osteócitos e osteoclastos. Os osteoblastos estão associados à osseogênese, por isso o seu citoplasma é intensamente basofílico, ao contrário dos

18 17 outros tipos de célula. Isso sugere a presença de proteínas ribossômicas que estão relacionadas à síntese dos componentes da matriz óssea. Quando o osteoblasto deposita matriz óssea, ele também secreta a BMP, que fica retida na matriz mineral. Essa proteína é ácida-insolúvel e fica no osso até ser liberada através da ação dos osteoclastos, que dissolvem o mineral sem afetar a estrutura orgânica da BMP. Essa BMP, ao ser liberada, adere à superfície das células mesenquimais indiferenciadas, o que provoca uma alteração genética, diferenciando-as em osteoblastos, dando continuidade ao processo de remodelação óssea. Há cerca de 20 tipos de BMPs identificados que desempenham o papel de desenvolvimento fetal, função múltipla e características osseoindutivas. Das proteínas atualmente disponíveis para estudos, sabe-se que as BMPs-2, 6 e 7 têm as melhores propriedades osseogênicas, ou seja, estimulam as células mesenquimais indiferenciadas a transformar-se em osteoblastos, secretores de matriz óssea (MAZZONETTO; NASCIMENTO, 2010). Campisi et al (2003), realizou distração osseogênica em um lado da mandíbula de 14 coelhos machos para avaliar a presença das BMPs-2,4,7. Todas as BMPs foram encontradas em grande concentração no tecido conjuntivo vascularizado durante o período de distração. As BMPs-2 e 4 tiveram alta concentração nas células osseoblásticas durante o período de distração e de consolidação. Já a BMP-7 foi encontrada em quantidade relativamente menor durante o período de distração. Conforme Zétola e Pereira (2010), as BMPs são glicoproteínas de baixo peso molecular. São homodiméricas, cujas cadeias estão ligadas por pontes de dissulfeto; a dimerização é um pré-requisito para que a molécula tenha a capacidade de ligar-se ao seu receptor e induzir o processo de formação óssea. Para cada tipo de fator de crescimento há um receptor ou um conjunto de receptores específicos presentes na superfície da membrana de algumas células. A célula somente responde a um fator de crescimento se possuir, em sua membrana citoplasmática, o receptor específico. Os mecanismos de ação da BMP-2 no processo de formação do novo osso são: Implantação - a BMP-2 mais o ACS são implantados no defeito ósseo; quimiotaxia - migração de células mesenquimais indiferenciadas (CMI) e outras células portadoras

19 18 de receptores para BMP-2; Ligação da BMP-2 com o receptor protéico transmembrânico - formação das proteínas que atuam como fatores de transcrição (SMAD); Proliferação - baterias gênicas ativadas por SMAD, promovem a proliferação celular; Diferenciação - outras baterias gênicas, também ativadas por SMAD, promovem a diferenciação das células em ósseoblastos; Angiogênese e neoformação óssea - os ósseoblastos iniciam a síntese da matriz óssea e respondem ao estímulo local de forças mecânicas para produzirem um novo tecido mineralizado, além da neoformação vascular; Remodelagem - o tecido ósseo neoformado remodela-se em resposta ao meio local e às forças mecânicas aplicadas. Após analisar vários estudos a respeito do uso, funcionamento e resultados clínicos das BMPs, Sykaras e Opperman (2003) concluíram que essas proteínas têm papel fundamental na regulação, indução, manutenção e reparação óssea, atuando em receptores das superfícies celulares por vias autócrinas e parócrinas (ação direta ou indireta das BMPs sobre as citocinas e fatores de crescimento), iniciando, assim, uma sequência de eventos que provocam diferenciação das células mesenquimais (osteoprogenitores). Foram observados outros aspectos, como as condições microambientais, dose, material carreador e parâmetros geométricos dessa matriz que têm papel determinantemente crítico na formacocinética da ação e do resultado biológico da BMP durante o reparo da ferida. O seu potencial osseogênico é de enorme interesse como agente terapêutico para cura de fraturas ósseas, prevenção da osteoporose, tratamento de defeitos periodontais e para aumentar a formação óssea em torno de materiais aloplásticos implantados no osso. 2.4 OBTENÇÃO DAS BMPs Em seus experimentos, Issa et al. (2007) introduziu cápsulas de colágeno com rhbmp-2 entre o tecido muscular e o cutâneo, na região abdominal de ratos, para avaliar, através de análise espectofotométrica, o grau de pureza da rhbmp-2 utilizada. Observou que a referida pureza era de 86%. Clinicamente, foi encontrada grande

20 19 quantidade de osso recém-formado, o que leva a concluir que o grau de pureza da proteína usada é um importante fator que influencia diretamente no índice de formação do novo osso. Essa proteína é uma substância sintética, que age quimiotaticamente na diferenciação celular. Desse modo, o processo de obtenção das BMPs torna-se muito importante, pois quanto maior for o grau de pureza do material utilizado, melhor será a resposta do leito receptor. Inicialmente, a BMP-2 foi isolada a partir de matriz óssea bovina desmineralizada. Entretanto, para isolar poucos microgramas de BMP-2, são necessários quilogramas de matriz óssea bovina desmineralizada, tornando o processo laborioso e de alto custo (ZÉTOLA; PEREIRA, 2010). Lourenço (2002) utilizou BMPs extraídas de ossos longos de renas jovens, através de um processo no qual foram removidos o periósteo e o osso medular, por meio de jatos de água sob alta pressão, mantendo-se, assim, apenas os ossos corticais. Esses ossos foram cortados com uma serra vertical, em cilindros de 5,0cm de comprimento e imediatamente acondicionados em recipientes contendo nitrogênio líquido. Depois de aproximadamente dez minutos, os ossos foram transformados em grânulos de 500 microns (utilizando máquina de pulverização), acondicionados em recipiente plástico e mantidos sob refrigeração de - 80 o C, para iniciar o processo de desmineralização. Nesse procedimento, foram utilizados dois litros de ácido clorídrico (HCl0,6M) para cada quilo de osso granulado, por dois períodos de 48 horas cada um, em centrifugação lenta e constante de aproximadamente 50rpm, em câmara fria, a 4 o C. Após o primeiro período de 48 horas, aguardou-se a decantação do osso granulado, houve a troca de todo o conteúdo de ácido clorídrico e prosseguiu-se por mais um período de 48 horas de centrifugação constante. Depois de nova decantação, todo o ácido clorídrico foi removido e o osso granulado foi submetido à lavagem com água pura, esterilizada e deionizada, por duas vezes. Somente depois desse processo, o osso granulado desmineralizado estava pronto para a extração das proteínas não colagênicas, inclusive as Proteínas Morfogenéticas Ósseas. Na extração, utilizou-se a aminometanamidina 4M (Practical Grade - Sigma G CH5N3 HCl). Nessa fase, para cada quilo de osso foram usados três litros de guanidina hidroclorídrica,

21 20 mantidos em centrifugação lenta (50rpm) e constante, por dois períodos de 48 horas, em câmara fria, a 4 o C. Após o primeiro período de 48 horas, aguardou-se a decantação do osso granulado, foi trocado todo o conteúdo de guanidina hidroclorídrica e prosseguiu-se por mais 48 horas de centrifugação constante. Toda a guanidina hidroclorídrica obtida nesses dois períodos de centrifugação lenta e constante foi submetida à centrifugação de fluxo contínuo (7000rpm), sob refrigeração. O líquido obtido foi filtrado em um sistema de fluxo tangencial, inicialmente com um filtro de 0,3 microns e, posteriormente, com um filtro de 10kD (Minitan - Milipore). O material foi dialisado contra água, por dois períodos de 24 horas, utilizando-se membrana Spectra PorR 4 MWCO: , e novamente foi submetido à centrifugação de fluxo contínuo descrita acima. O material insolúvel em água foi dissolvido em guanidina hidroclorídrica pura por um período de 24 horas e novamente submetido à centrifugação de fluxo contínuo. Descartou-se o material insolúvel em guanidina e a solução dialisada em 11 volumes de solução tampão de citrato 0,25M, ph3,1, por dois períodos de 12 horas, e novamente foi submetido à centrifugação de fluxo contínuo. O material insolúvel foi coletado e liofilizado em 0,09mbar, a - 57 o C, tomando a forma de pó. Segundo Zétola e Pereira (2010), devido à lentidão desse processo, ao seu alto custo e à pequena quantidade de material obtida no final, houve um estímulo para o uso de técnicas de biologia molecular, clonando os genes das BMPs e as suas expressões, em sistemas de culturas de células em larga escala. A tecnologia recombinante vem sendo utilizada para clonar e produzir grandes quantidades de proteína específica, denominada Proteína Morfogenética Óssea Recombinante Humana (rhbmp). É uma réplica exata da proteína natural. Sua produção pode ser realizada conforme os passos a seguir descritos. 1- Identificação do gene: refere-se à identificação e ao isolamento de um gene específico que carrega o código genético para fazer a BMP-2, isolada a partir de uma célula humana. 2 Recombinação: inserção de múltiplas cópias do gene da BMP-2 no genoma de outra célula. 3 Clonagem: as células que receberam as múltiplas cópias do gene da BMP-2 crescem e multiplicam-se, resultando em uma população homogênea de células filhas, produtoras de BMP Criação de um banco de células: as células são colocadas em um meio de cultura seletivo, no qual somente as que incorporaram a cópia do gene da

22 21 BMP-2 continuam a proliferar-se. Elas são armazenadas em pequenas cápsulas, formando o banco de células para futura produção de linhagens de células de BMP Armazenamento do banco de células: as células são congeladas em lotes e armazenadas a -135ºC. São descongeladas à medida que a produção da proteína faz-se necessária. O banco otimiza o processo, evitando um novo isolamento do gene da proteína. 6 - Cultura das células: as células são descongeladas e colocadas em meio de cultura, iniciando a produção de BMP Produção por biorreatores e filtragem: as células são cultivadas em larga escala por aproximadamente 3 dias, sendo filtradas e descartadas. 8 - Purificação da rhbmp-2: após o descarte das células, a rhbmp-2 é purificada por meio de colunas de cromatografia. 9 - Nanofiltragem: maximiza o processo de segurança contra doenças infectocontagiosas Controle de qualidade. Outra opção para a diferenciação celular é a associação de células-tronco, também conhecidas como células-fonte ou stem cel. São definidas como células com baixo grau de diferenciação, que possuem a capacidade de se autorreproduzir, bem como de gerar células diferenciadas, de tipos especializados de tecidos. Inúmeros trabalhos relatam a utilização da terapia celular por meio de transplantes de células progenitoras no tratamento de doenças degenerativas, em alterações do desenvolvimento humano e na regeneração de tecidos. Em Odontologia, a expectativa é de novas alternativas na regeneração dentinopulpar, na regeneração do tecido periodontal, na regeneração óssea e na regeneração da cartilagem da articulação temporomandibular (LEITE SEGUNDO; VASCONCELOS, 2007). É o caso do estudo de Oliveira (2010), que provocou defeito ósseo tibial em 18 cães, dividindo-os em 3 grupos: grupo 1(controle) - lesão tratada com esponja de gelatina embebida em solução fisiológica; grupo 2 - esponja de gelatina embebida em aspirado de medula óssea (MO) do osso ilíaco; grupo 3 - esponja de gelatina embebida em aspirado de MO e proteína morfogenética óssea recombinante humana 2 (rhbmp- 2). Para avaliação, foram utilizados estudos radiográficos e marcadores monocristais Qtracker, em microscópio com luz fluorescente, para identificar a presença de célulastronco mononucleares (CTM). Entre as células identificadas pelo marcador estão as células da linhagem óssea. No grupo 3, o crescimento ósseo mostrou-se melhor no 15º

23 22 e 30º dias, bem como 90% dos cães já apresentavam cicatrização completa do defeito aos 45 dias. Concluiu-se que, no experimento, as células-tronco mononucleares induziram à aceleração da cicatrização do defeito ósseo na tíbia dos cães. Associando as células-tronco à rhbmp-2 o processo de cicatrização é ainda mais acelerado. 2.5 A BMP E A IMPLANTODONTIA O estímulo à produção de osso novo e a melhora da sua qualidade com o uso da BMP foi estudado por Rachmiel et al. (2004) em experimentos aplicando rhbmp-2 como reforço na formação óssea durante a distração alveolar, em 10 ovelhas, divididas em 2 grupos: grupo 1 - controle; grupo 2 - injeção de dose única de 10ml de rhbmp-2 no 5º dia após o início da distração osseogênica. Após 12 semanas de consolidação do dispositivo da distração osseogênica, foi realizada biópsia para exame histológico, imuno-histoquímico e morfométrica do osso recém-formado. Concluiu-se que o uso do rhbmp-2 aumentou a qualidade óssea e encurtou o período de consolidação da distração, permitindo, desse modo, instalar mais cedo o implante em áreas submetidas a essa técnica de ganho do tecido ósseo. Lourenço (2002) comparou o uso das BMPs extraídas de ossos de renas, associadas a implantes rosqueáveis de titânio 3.75mm X 11.5mm, instalados em alvéolos cirúrgicos na tíbia de 30 coelhos. Antes da instalação dos implantes, preencheram-se os alvéolos com compósito carbonato de cálcio-colágeno combinado com BMP. Nos outros grupos, os sítios foram preenchidos com carbonato de cálciocolágeno, colágeno, e no controle negativo nenhum tipo de material foi inserido. Concluiu-se que as BMPs extraídas de rena e combinadas ao compósito carbonato de cálcio-colágeno promoveram osseogênese superior aos outros grupos, formando maior percentual de contato ósseo linear na superfície do implante e maior volume percentual de osso no interior de suas roscas. Observou-se que, ao associar materiais de enxerto contendo BMPs a implantes de titânio, ocorreu um aumento da qualidade do contato osso/implante, o que permitiria uma diminuição do tempo de espera entre a cirurgia de instalação de implantes e a reabilitação protética nos casos em que o osso apresenta-se pouco denso e com espaços medulares amplos.

24 23 O estudo realizado por Pacheco et al. (2010) objetivou avaliar a densidade cicatricial radiográfica em implantes bioativos recobertos por rhbmp-2 humana e compará-los a implantes de superfície rugosa (implante controle). Para isso, foram utilizados 24 implantes em 12 pacientes. Cada paciente recebeu 2 implantes contíguos: um implante controle e outro tratado (implante experimental que recebeu aplicação de solução de rhbmp-2 dissolvida em 1,2 mg/ml de álcool polivinílico e glutaraldeído 0,05% e posteriormente uma camada seca de filme à base de PLA-PGA, permitindo liberação mais rápida e intensa de rhbmp-2). Os implantes foram mantidos a 4ºC até o momento da instalação. Concluiu-se que os implantes experimentais promoveram, em média, melhora significativa no aumento da densidade óssea pós-operatória quando comparados aos implantes-controle. Portanto, o estudo indica que o uso de rhbmp-2 permite um incremento ao estímulo da densidade óssea. Esse fato é importante não apenas para o êxito da fixação, como também para a melhoria das condições locais de suporte ósseo em regiões de menor índice de sucesso dos implantes. Por outro lado, Silva (2005), realizou avaliação clínica e histológica da eficácia de enxerto heterógeno associado à BMP, ambos de origem bovina, em cirurgia de levantamento de seio maxilar. Foram comparados, clínica e histologicamente, 10 pacientes com levantamento de seio maxilar bilateral. Em um lado utilizou-se osso autógeno; em outro, associou-se matriz óssea orgânica bovina (Gen-Ox) à BMP de embrião bovino (Gen-Pro ). Após um período de 6 a 11 meses, foi feita avaliação clínica da área enxertada e biópsia com broca trifina na região adjacente ao eixo dos implantes inseridos. Constatou-se que na área teste o osso apresentava trabeculado ósseo menos compacto e menos organizado que o osso autógeno. Lutz et al. (2008) realizou este estudo com o objetivo de avaliar a taxa de formação óssea em defeitos ósseos perimplantares e osseointegração de implantes recém -instalados utilizando BMP-2. Serviram como cobaias 8 porcos domésticos, em cada qual foram realizados 9 defeitos ósseos (10mm de diâmetro X 7mm de profundidade) na calvária. No centro desses defeitos, instalou-se um implante de 3.5mm X 14mm. Os implantes estavam 7mm intraósseos. Os animais foram divididos em 4 grupos, cada qual com 18 defeitos: grupo 1 - uso de BMP-2 e esponja de

25 24 colágeno; grupo 2 - uso de BMP-2 e osso autógeno; grupo 3 - uso de osso autógeno; grupo 4 - uso de colágeno. Quatro animais foram abatidos após 7 dias e os outros quatro, após 28 dias. Depois de 7 dias não houve diferença significativa entre os grupos. Decorridos 28 dias, constatou-se que nos grupos em que a BMP-2 foi usada houve uma remineralização superior à ocorrida nos grupos que não utilizaram a proteína. Concluiu-se que o uso da BMP-2 produziu um efeito positivo considerável, tanto na osseointegração, quanto na regeneração do defeito ósseo se comparado aos resultados obtidos somente com o uso do colágeno ou do osso autógeno. Estudo semelhante foi desenvolvido por Wikesjö, Sorenson e Wozney (2001) com implantes instalados em defeitos ósseos de tamanho crítico, na região dos prémolares da mandíbula de cães. Os parafusos de 10mm foram colocados 5mm intraósseos. Decorridos 4 meses, foram expostos cirurgicamente, observando-se que houve seu completo recobrimento por osso. Concluíram que o uso de rhbmp-2 promove uma osseogênese previsível, induzindo à neoformação óssea em defeitos clinicamente relevantes no esqueleto crânio-facial. Segundo os autores, tal constatação surtiria efeitos significativos na maneira de praticar a Odontologia. Chin (2005), utilizou rhbmp-2 como opção para substituir osso autógeno removido da crista ilíaca em reparação de 50 fissuras alveolares de 43 pacientes (crianças e adolescentes). A união óssea foi bem sucedida em 49 dos 50 locais. Associou-se distração osseogênica e rhbmp-2. O osso alveolar reconstruído respondeu clinica e histologicamente como osso normal durante a erupção dos dentes naturais e no movimento ortodôntico. Segundo o autor, é necessário determinar um protocolo ideal para a utilização desse material na reparação de fissuras alveolares como uma alternativa viável à remoção de osso da crista ilíaca. Moreira (2004) realizou um estudo para avaliar o conhecimento e o uso clínico, pelos cirurgiões buco-maxilo-faciais, no Brasil, de Proteínas Morfogenéticas Ósseas, como auxílio em reparos de defeitos ósseos da face. Para isso, distribuiu-se questionários direcionados, que foram lidos e respondidos pelos participantes, na frente do pesquisador, e devolvidos imediatamente. Foram analisados 100 questionários preenchidos por

26 25 profissionais da área de cirurgia e traumatologia buco-maxilo-facial, que estiveram presentes no XVII Congresso Brasileiro de Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial, realizado em Gramado/RS - Brasil, em setembro de A distribuição dos questionários aos participantes foi aleatória, independentemente de sua origem, formação, estado em que trabalha, sexo, idade e tempo de formação. Concluiu-se que a pouca utilização dessas proteínas deve-se à falta de dados clínicos e de divulgação sobre as BMPs. Esses aspectos prolongam o período de introdução da utilização da proteína na clínica e sua consequente aplicação rotineira. Outro fator que contribui para seu pouco uso é o alto custo de aquisição das BMPs no Brasil. Muitos profissionais não utilizam nenhum tipo de material, ou procuram algo de acesso facilitado e custo menor. A pesquisa mostrou também que, entre os participantes que utilizam ou já utilizaram as BMPs, há uma unanimidade quanto ao grande potencial dessa proteína como auxiliar no processo de reparação de defeitos ósseos. 2.6 ILUSTRAÇÃO DE TÉNICA Os dois casos clínicos seguintes pertencem a Zétola e Larson (2010), os quais preconizaram o uso de proteção mecânica, através de membranas com reforço de titânio, ou de placas de titânio, ou até mesmo de telas desse material para que a utilização da rhbmp-2 seja mais efetiva na reconstrução de maxila atrófica: Caso 1: Instalação de implantes na região anterior de maxila com defeito de espessura, associada a enxerto de membrana de colágeno embebida em rhbmp-2. Figura 1: Perfuração inicial para instalação de implantes.

27 26 Figura 2: Aspecto vestibular demonstrando as fenestrações na tábua óssea. Figura 3: Instalação de implantes Straumann Sla de 3.3x12mm palatinizados e enxerto de esponja de colágeno embebida em rhbmp-2 protegida por uma tela de titânio. atrófica. Caso 2: Enxerto de esponja de colágeno embebida em rhbmp-2 em maxila

28 27 Figura 1: Exposição da estrutura óssea da maxila atrófica. Figura 2: Colocação da esponja de colágeno embebida por rhbmp-2 e utilização de placas de titânio na manutenção do arcabouço para a formação óssea.

29 Figura 3: Imagem de tomografia computadorizada anterior ao procedimento cirúrgico e após quatro meses e meio. 28

30 29 3 CONCLUSÃO concluir que: Através dos trabalhos apresentados nesta revisão bibliográfica, pode-se - a osseoindução proporcionada pelas BMPs é, indiscutivelmente, a principal propriedade responsável por sua indicação para o ganho de rebordo ósseo na Implantodontia; - o alto custo de obtenção das BMPs é um importante fator que inibe sua maior utilização em procedimentos que necessitem de aumento e manutenção de tecido ósseo; - a descoberta de um carreador que preencha todos os requisitos de arcabouço ideal possibilitará maior difusão do uso das BMPs.

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