MODELO EM RATOS WISTAR PARA ANÁLISE DE ALTERAÇÕES ATRIAIS RADIOINDUZIDAS: PAPEL DA CITOCINA TGFBETA1 NO DESENVOLVIMENTO DAS LESÕES

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1 2009 International Nuclear Atlantic Conference - INAC 2009 Rio de Janeiro,RJ, Brazil, September27 to October 2, 2009 ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE ENERGIA NUCLEAR - ABEN ISBN: MODELO EM RATOS WISTAR PARA ANÁLISE DE ALTERAÇÕES ATRIAIS RADIOINDUZIDAS: PAPEL DA CITOCINA TGFBETA1 NO DESENVOLVIMENTO DAS LESÕES Viviane Fernandes da Silva 1,2,3 ; Cherley Borba V. de Andrade 1,2 ; Ana Lucia Rosa do Nascimento 2 ; Claudia Marcello da Silva 1,2 ; Andreia Fortes Ribeiro 1,2,3 ; Carlos Alberto Mandarim-de-Lacerda 3 ; Jorge José de Carvalho 2 ; Carlos Eduardo de Almeida 1 1 Laboratório de Ciências Radiológicas Departamento de Biofísica e Biometria Rua São Francisco Xavier, 524 PHLC, sala Rio de Janeiro - RJ vivifis@gmail.com 2 Laboratório de Ultraestrutura e Biologia Tecidual Departamento de Histologia e Embriologia Boulevard 28 de setembro, 42 Pavilhão Américo Piquet Carneiro Rio de Janeiro RJ CEP 3 Laboratório De Morfometria e Morfologia Cardiovascular Departamento de Anatomia Humana Boulevard 28 de setembro, 42 Pavilhão Américo Piquet Carneiro Rio de Janeiro RJ CEP Resumo Em boa parte dos casos de câncer de mama, a radioterapia é utilizada, associada ou não a outros tratamentos. Vários trabalhos na literatura indicam que parte das mulheres tratadas em estagio inicial com radioterapia podem desenvolver, num tempo médio de 5 a 10 anos após o tratamento, doenças cardíacas radioinduzidas, dentre as quais pode-se mencionar a pericardite, as arritmias e o infarto do miocárdio. O objetivo deste trabalho é desenvolver um modelo radiobiológico em ratos Wistar para avaliação de alterações atriais radioinduzidas. Ratos Wistar machos foram anestesiados, imobilizados e irradiados com doses de 500, 1000 e 1500cGy no volume cardíaco, pré-definido através de tomografia. Os animais foram sacrificados após 15 dias de irradiação. Os átrios foram coletados, fixados em formaldeído e embebidos em parafina. Uma parte das amostras foi corada com hematoxilina-eosina (HE) e outra submetida à imunohistoquimica para visualizar a expressão da citocina TGFbeta1. Na observação das amostras com HE indicou lesão em vasos sanguíneos e discreto infiltrado inflamatório em algumas amostras. A imunohistoquímica mostrou intensa expressão da citocina TGFbeta1, principalmente na túnica intina dos vasos sanguíneos. Os dados indicam que os átrios desenvolvem alterações compatíveis à resposta inflamatória como

2 reação aos danos causados pela irradiação do tecido, sendo esta responsável pela produção da citocina TGFbeta1, considerada uma citocina pró-fibrótica em vários modelos de estudo de doença cardíaca. As lesões em nível atrial podem repercutir no correto funcionamento do sistema gerador de impulso cardíaco, podendo induzir arritmias e prejudicando a produção de peptídeos natriuréticos moléculas envolvidas na homeostase cardíaca. Introdução O câncer é uma doença considerada como um problema de saúde pública, pois é a primeira causa de morte nos países desenvolvidos e a segunda na América Latina e no Caribe (1). Os cânceres com o maior índice de mortalidade foram: o de pulmão, de estômago de fígado de cólon e de mama. Desse total de óbitos por câncer no ano de 2005, mais de 70% ocorreram em países de média ou baixa renda. Há uma estimativa que em 2020, o número de casos novos anuais seja em torno de 15 milhões, e que 60% desses casos ocorrerão em países em desenvolvimento, como o Brasil. No Brasil, para o ano de 2008 há uma estimativa de novos casos de câncer. É esperado para o sexo feminino um número de novos casos, dentro deste universo de novos casos cerca de 49 mil são de câncer de mama (2). Para o tratamento do câncer de mama, a radioterapia é indicada em grande parte dos casos podendo estar ou não associada a outros tratamentos (3). A radioterapia utiliza feixes de radiação ionizantes para destruir as células cancerígenas, porém, neste processo algumas células normais são atingidas e podem sofrer alterações genéticas e metabólicas radioinduzidas (4). Dentre os órgãos que sofrem as maiores alterações após radioterapia para câncer de mama pode-se citar o coração e o pulmão. Vários trabalhos indicam que um percentual das pacientes tratadas em estagio inicial da doença desenvolveu doenças cardíacas, tais como: pericardite, arritmias e infarto do miocárdio, em um tempo médio de 5 a 10 anos após o tratamento (4). Conclui-se que as doenças cardiovasculares nas pacientes em questão são devidas à radiação recebida durante o tratamento. As doenças cardíacas radioinduzidas se caracterizam pela fibrose, ou seja, acúmulo de matriz conjuntiva no miocárdio. A citocina TGFbeta1 está associada ao desenvolvimento de fibrose após lesões teciduais de diversas naturezas (4,5). O objetivo deste trabalho é desenvolver um modelo em ratos Wistar para avaliação de alterações atriais radioinduzidas. Materiais e métodos Animais Foram utilizados ratos Wistar machos, com idade aproximada de 3 meses. Durante todo o experimento os animais foram mantidos em ciclo claro/escuro de 12hs recebendo água e comida ad libitum. Todos os procedimentos foram realizados segundo normas (registro 243/2008) do Comitê de Ética em Experimentação Animal da UERJ.

3 Irradiação No momento da irradiação os animais foram anestesiados com tiopental sódico (15mg/Kg, via intraperitonial), imobilizados em suporte de isopor em decúbito dorsal e irradiados com feixes de fótons de energia nominal de 6MV num acelerador linear Varian Clinac2100C. As doses administradas foram de 500, 1000 e 1500cGy no volume cardíaco, pré-definido através de tomografia. Foi utilizado um material semelhante a tecido (bolus) com espessura de 0,5cm para garantir a distribuição homogênea da dose. Coleta de material e análise histológica Os ratos fora sacrificados 15 dias após irradiação. Os átrios foram separados e fixados em formaldeído a 10% e embebidos em parafina. Uma parte dos cortes foi submetida à coloração com hematoxilina-eosina (HE) para posterior analise por microscopia de luz. Imunohistoquimica com a citocina TGF-beta1 Uma parte dos cortes foi submetida a imunohistoquimica para visualizar a expressão da citocina TGFbeta1. Após a recuperação antigênica em tampão citrato a 60ºC e ph6,0, os cortes foram incubados com o anticorpo anti-tgfbeta1 (Santa Cruz Biotecnologia) por 24 horas a 4ºC. A ligação antígeno-anticorpo foi revelada usando o sistema DAB (DAKO, Inc). uma contra-coloração com hematoxilina foi feita para evidenciar os núcleos. As amostras foram analisadas por microscopia de luz. Resultados Após a irradiação dos animais e coleta dos átrios, a observação das amostras coradas com HE indicou lesão em vasos sanguineos, tais como estenose e extravasamento sanguineo (indicando possível rompimento da parede do vaso). Foi observado também discreto infiltrado inflamatório em algumas amostras. A analise imunohistoquimica mostrou intensa expressão da citocina TGFbeta, principalmente na túnica intima dos vasos sanguineos. A figura 1 mostra o padrão de expressão em alguns animais.

4 a b c d Figura 1: Fotomicrografias indicando a expressão da citocina TGFbeta1 nos animais irradiados. a: controle; b: 500cGy; c: 1000cGy; d: 1500cGy. As setas indicam o local de expressão da citocina. Discussão Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um modelo em ratos Wistar para analisar as alterações atriais radioinduzidas. Os dados indicam que, 15 dias após a irradiação, o átrio desenvolve alterações compatíveis com resposta inflamatória como reação aos danos causados pela irradiação do tecido. Kruse e colaboradores (5) desenvolveram um modelo em ratos Sprague-Dawley e encontraram padrão semelhante de alterações morfológicas. Esta resposta inflamatória é responsável pela produção da citocina TGFbeta1, que é considerada uma citocina pró-fibrótica em vários modelos de estudo de doença cardíaca (4). A expressão aumentada da citocina TGFbeta1 pode desencadear o acumulo de matriz conjuntiva de maneira desordenada caracterizando o processo de fibrose (6). As alterações vasculares observadas neste modelo corroboram a radiossensibilidade das células endoteliais da túnica intima. Alguns modelos indicam que as alterações observadas nestas células sejam precursoras de danos teciduais em maior escala, que podem alterar o funcionamento cardíaco (6, 7). Adicionalmente, as alterações em

5 células endoteliais podem desencadear a formação de placa aterosclerótica por induzir alterações em células musculares lisas da túnica média dos vasos sanguineos (8). Adicionalmente, as lesões a nível atrial podem repercutir no correto funcionamento do sistema gerador de impulso cardíaco (nodo sino atrial), podendo induzir arritmias (5). Cabe ressaltar ainda que, as lesões atriais podem prejudicar a produção de peptídeos natriuréticos, moléculas envolvidas na homeostase cardíaca (9). Os dados obtidos neste trabalho mostram que a expressão da citocina TGFbeta1 em tecido atrial irradiado é um indicador de lesão e que, as lesões em células endoteliais são um dos primeiros eventos observados na doença cardíaca radioinduzida. Trabalhos posteriores são necessários para avaliar a evolução da lesão meses após a irradiação. Agradecimentos A FAPERJ e ao CNPq pelo apoio financeiro. Referências 1 - Instituto Nacional de Câncer. Boletim de noticias do INCA n.1. Acesso em 18/06/ Instituto Nacional de Câncer. Estimativa/2008 incidência de câncer no Brasil. Acesso em 18/06/ Liu H, Xiong M, Xia Y-F et al. Studies on pentoxifiline and tocopherol combination for radiation-induced heart disease in rats. Int J Radiation Oncology Biol. Phys. 73(5): Hogle, WP. The statte of the art in radiation therapy. Seminars in Oncology Nursing 22(4): Kruse JJCM, Zurcher C, Strootman EG, Bart CI, Schlagwein N, Leer JWH, Wondergem J. Structural changes in the auricles of the rat heart after local ionizing irradiation. Radiotherapy and Oncology 58: Schultz-Hector S, Trott KR. radiation-induced diseases: is the epidemiologic evidence compatible with the radiobiological data? Int J Radiation Oncology Biol. Phys. 67(1): Gaugler MH, Vereycken-Holler V, Squiban C, Vandamme M, Vozenin-Brotons MC, Benderitter M. Pravastatin limits endothelial activation after irradiation and decreases the resulting inflammatory and thrombotic responses. Radiation research 163: Andreassi, Botto. DNA damage as new emerging risk factor in atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med 13: Kruse JJ, Strootman EG, Bart CI, Visser A, Leer JW, Wondergem J. Radiationinduced changes in gene expression and distribution of atrial natriuretic peptide (ANP) in different anatomical regions of the rat heart. Int J Radiat Biol. 78(4):

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