PRÁTICAS LABORATORIAIS EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

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1 UNESP- UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CÂMPUS DE JABOTICABAL FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS Departamento de Patologia Veterinária PRÁTICAS LABORATORIAIS EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA HÉLIO JOSÉ MONTASSIER (Professor Adjunto - Disciplina de Imunologia Veterinária ) JABOTICABAL - SP

2 NORMAS GERAIS PARA AS AULAS PRÁTICAS DE IMUNOLOGIA 1.-Antes de entrar no laboratório, o estudante deverá vestir avental. 2.-Não comer, não fumar e não beber água das torneiras durante a aula. 3.Não trazer animais domésticos (cães e gatos) para dentro do laboratório. 4.-Evitar levar quaisquer dos materiais destinados às aulas práticas à boca. 5.-Antes e depois de realizar as atividades práticas, limpar o local de trabalho, com papel toalha ou algodão embebido em álcool. Conferir no início e no final da aula o material recebido para a execução da aula prática (vidraria, plásticos, seringas, agulhas, estantes, canetas de retro-projetor, material cirúrgico, microscópios, etc.) 6.-Antes de iniciar a experimentação leia com cuidado todos os itens da apostila, ou roteiro de aula prática, verificando se o material necessário à condução do experimento está ou não completo. No caso de falta de um ou mais materiais dirigir-se ao professor ou ao técnico. 7.-Cuidados, muita organização e bom-senso quando for manipular animais de biotério, nas aulas práticas de imunização. Evitar manipulações exageradas e causar maior estresse aos animais. 8.-Terminados os trabalhos práticos, verifique se as torneiras de água e gás estão fechadas, as tomadas das lâmpadas desligadas e, quando forem usados os microscópios, se eles estão limpos. 9.-Evite transportar os materiais montados e organizados para as aulas práticas em cada um dos lados das bancadas (normalmente, são 6 grupos de práticas para cada turma e, excepcionalmente, em aulas práticas demonstrativas, esse número pode ser menor, o que será comunicado pelo professor).

3 Aula prática 1 TÉCNICA DE DILUIÇÕES SERIADAS: Séries com razão constante e diluições sucessivas. Nesta técnica, transferem-se volumes sucessivamente de um tubo para outro seguinte, ao qual se adicionou quantidade adequada de diluente. Exemplo 1. Diluições sucessivas com razão constante igual a 2 (figura 01) 1) Distribuir numa série de tubos com l ml de diluente. 2) Ao tubo l adicionar l ml do material. 3) Transferir l ml do tubo l para o tubo 2. 1ml Material 1ml de salina em todos 1 1/2 1ml 1ml 1ml 1ml ml 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 6 Figura 01 4) Transferir l ml do tubo 2 para o tubo 3. 5) Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série. As diluições obtidas serão: l:2; l:4; l:8; l:l6; l:32;l:64 Exemplo 2. Diluições sucessivas com razão constante igual a l0 (figura 02) 1) Distribuir 9ml de diluente numa série de tubos. 2) Ao tubo 1 adicionar 1 ml do material não diluído. 3) Transferir 1 ml do tubo 1 para o tubo 2. 4) Transferir 1 ml do tubo 2 para o tubo 3. 5) Prosseguir da mesma maneira até o último tubo da série.

4 As diluições obtidas serão: 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10.000; e 1: ml Material 1 1ml 1ml 1ml 1ml /10 1/100 1/ / / Figura 02 Problemas: 1. Como você faz para diluir um soro a 1/50;1/100;1/200;1/400 e 1/800? 2. Como você procede para diluir um vírus de 10-3 a 10-8? Perguntas: 1. Qual o procedimento geral para se preparar uma suspensão antigênica bacteriana a 5%? 2. Como se faz para preparar uma solução antigênica de gamaglobulina bovina a 0,1%, num volume final de 5ml? 3. Qual das preparações antigênicas acima (exercícios 1 e 2) será usada para a obtenção de soros: a) Precipitantes b) Aglutinantes 4. Qual(is) a(s) principal(is) finalidade(s) de se fazer uma escala de diluições seriadas? 5. O que são: a) Solução anti-coagulante de Alsever b) Solução salina d) Soro c) Plasma e) Solução salina tamponanda

5 Aula prática 2 PURIFICAÇÃO PARCIAL DOS ANTICORPOS PRESENTES NO SORO NORMAL ATRAVÉS DA PRECIPITAÇÃO DA FRAÇÃO GAMA-GLOBULINA COM SULFATO DE AMÔNIO. 1. INTRODUÇÃO - GENERALIDADES Para estudar a estrutura dos Acs é necessário purificá-los previamente. Tal purificação é de grande interesse prático, pois diminui consideravelmente as reações produzidas pelos soros quando eles são utilizados com finalidades profilática ou terapêutica. Os métodos usados para purificação dos Acs se filiam a duas modalidades: métodos não específicos e específicos. Os primeiros se baseiam em técnicas de fracionamento físico ou físico-químico e não permitem separar as gamaglobulinas normais dos Acs. Os métodos específicos, por outro lado, baseiam-se na dissociação ou eluição dos imunocomplexos e permitem obter os Acs em alto grau de pureza, livres de imunoglobulinas (Igs) inespecíficas. São os métodos de escolha para estudos experimentais, porém, não podem ser aplicados aos soros terapêuticos em virtude de baixo rendimento inerente ao processo de purificação. O método de precipitação com sais neutros ("Salting-out") é de uso corrente e utiliza, sobretudo, o sulfato de amônio e o sulfato de sódio. De modo geral, quando se deseja precipitar todas as globulinas de um soro sanguíneo, adiciona-se sulfato de amônio a 50% de saturação ou sulfato de sódio a 22% de saturação (a 37ºC) permanecendo solúvel apenas a fração albumina. Outra maneira é precipitar as frações Gama e Beta globulina que contêm praticamente a maior parte das proteínas com função de Acs com sulfato de amônio a 40% de saturação ou com sulfato de sódio a l9% de saturação (a 37ºC). No nosso caso, será utilizado o método de precipitação das frações gama e beta globulina com sulfato de amônio a 40% de saturação.

6 2. MATERIAL - 5ml de soro sanguíneo - 5ml solução salina tamponada com fosfatos (PBS) - solução de sulfato de amônio a l00% de saturação - becker de 50ml - pipeta de lml, 2ml, 5ml, l0ml - tubos cônicos plásticos de centrífugas - bastões de vidro pequenos e grandes - provetas de 25, 50ml e 1000ml - saco de diálise, cordonê - becker de 2 litros - pipeta pasteur e tetina - erlenmeyer de 125 e 250 ml 10ml de solução Figura MÉTODOLOGIA 3.1. Juntar 5ml de soro com 5ml de P.B.S Calcular o volume de sulfato de amônio a l00% de saturação que deverá ser acrescentado a mistura de soro mais P.B.S. no volume final de l0ml; volume de sulfato de amônio a l00% de saturação onde: V - volume final de soro + PBS C - A saturação do sulfato de amônio desejado (40%) V x C X = l00-c

7 3.3. Sob agitação cuidadosa, acrescentar gota a gota o volume calculado do sulfato de amônio a l00% de saturação, para dar uma saturação final de 40%. Soro + PBS Proteínas solúveis Proteína H O H Proteína / Globulinas Camada de Solvatação Figura Continuar agitando por mais 30 minutos Transferir o volume para os tubos de centrífuga e levar a centrífuga a 3000rpm por l5 minutos. + Sulfato de Amônio Remoção da Camada de Solvatação Precipitação das Globulinas Figura Descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com solução de sulfato de amônio a 42% de saturação, isto é deve-se centrifugar e descartar o sobrenadante, ressuspender com cuidado o sedimento na solução de sulfato de amônio a 42% de saturação. Obs.: Cálculo da solução do sulfato de amônio a 42% de saturação: X = V x C X = Vol. de sulfato de amônio a 100% de saturação C X = 30 x V = Vol. desejado da solução (30 ml) C = Saturação final do sulfato de amônio (42% de saturação)

8 destilada X = 21,72 ml de sulfato de amônio a 100% de saturação + 30 ml de água Figura Após a última lavagem, descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 ml de PBS com cuidado e com o uso de pipeta Pasteur O sedimento ressuspenso deve ser colocado dentro do saco de diálise, esse deve ser fechado e se coloca para dialisar contra salina. Deixa-se dialisar por 2 dias a 4ºC, com duas trocas de líquido de diálise ao dia. 4. Retira-se a fração precipitada do saco de diálise e guarda-se em congelador a - 20ºC para ser testada por imunodifusão. PERGUNTAS 1) O que são imunoglobulinas e quais as suas principais propriedades físicoquímicas e biológicas? 2) Qual o objetivo de se purificar anticorpos? 3) Como atua o sulfato de amônio sobre moléculas de imunoglobulinas e por que é importante se conhecer o grau de saturação sulfato de amônio para fazer a separação das imunoglobulinas? 4) O que é diálise, e por que esse processo é empregado nesse caso?

9 Aula prática 3 IMUNOHEMÓLISE - Experiência de Erlich Morgenroth Modificada I. OBJETIVOS Demonstrar os elementos que participam da reação de imunohemólise de hemácias de carneiro: (figura 07) (Ag) Antígeno - Hemácias de carneiro (E) (Ac) Anticorpos - Hemolisina de coelho anti-e (C) Complemento - Soro normal de cobaia C Ac Ag Figura 07 II. MATERIAL l) Estante para tubo de hemólise (l2x75mm) 2) 3 tubos de ensaio l2x75mm 3) 4 pipetas de lml com graduação centesimal 4) Suspensão de hemácias de carneiro a 5% 5) Hemolisina (já diluída) 6) Complemento (soro normal de cobaia) já titulado 7) Solução fisiológica

10 III. TÉCNICA l) Numerar os tubos l, 2 e 3 2) Pipetar 0,lml de suspensões de hemácias nos 3 tubos 3) Pipetar 0,lml de hemolisina nos tubos l e 2 4) Pipetar 0,5ml de complemento nos tubos l e 3 5) Pipetar solução fisiológica: (figura 08) - 0,8ml no tubo l - l,3ml no tubo 2-0,9ml no tubo 3 6) Incubar em B.M. a 37ºC por 30 minutos Solução Tampão Complemento Hemolisina Hemácia s 0,8ml 0,5ml 0,1ml 0,1ml 1,3ml 0,1ml 0,1ml ,9ml 0,5ml 0,1ml Figura 08 IV - RESULTADOS E INTERPRETAÇÃO Uma vez realizada a leitura da experiência procedente, prosseguir do seguinte modo: 7) Centrifugar os tubos 2 e 3 8) Abandonar o sobrenadante do tubo 2

11 9) Decantar o sobrenadante do tubo 3 sobre as hemácias do tubo 2 e agitar este tubo para ressuspender as hemácias 10) Sobre o sedimento do tubo 3, colocar hemolisina (0,lml) e solução salina (l,3ml). Agitar para ressuspender as hemácias 11) Incubar os tubos 2 e 3 em B.M. a 37ºC por 30 minutos Figura 09 Tubo 1 Figura 10 Tubo 2 Figura 11 Tubo 3 V. RESULTADOS FINAIS E INTERPRETAÇÃO 2 3 Tubo 2 Tubo 3 Figura 12

12 PERGUNTAS 1) Quais os elementos que participam de uma reação de imunohemólise e qual o papel de cada um deles nessa reação? 2) O que é Sistema Complemento? 3) Em que circunstâncias o Sistema Complemento é ativado na ausência de anticorpos?

13 Aula prática 4 REAÇÃO DE SOROAGLUTINAÇÃO As reações de aglutinação são reações de floculação celular em que o antígeno é constituído por suspensão homogênea de células. Estas células podem ser bactérias, hemácias etc, que normalmente são vistas no microscópio, mas quando aglutinadas, elas formam flocos ou flóculos que são aglomerados visíveis a olho nu. Um dos requisitos essenciais para se proceder a reação de aglutinação é que se possua uma suspensão celular estável. É óbvio, também, que tal reação se verifica somente com antígenos que estão situados na superfície celular. Características dos antígenos e anticorpos envolvidos na reação de soroaglutinação: Antígenos aglutinantes de natureza particulada (insolúveis), como células procariotas e eucariotas. Devem ser, no mínimo, bivalentes. Características dos anticorpos envolvidos na reação de soroaglutinação: Depende da classe isotípica Ig M tem maior atividade aglutinante, enquanto que a Ig G tem menor atividade. Anticorpos devem ser, no mínimo, bivalentes quanto à capacidade de se ligar aos antígenos específicos. Explicação do fenômeno da aglutinação: Duas explicações são mais correntemente aventadas: 1) Revestimento da superfície do antígeno pelo anticorpo o que transformaria a suspensão celular de hidrófila em hidrófoba e daí a aglutinação. (figura 13) Antígenos particulados hidrófilos Perda da camada de solvatação Figura 13 Hidrófobo Agregação - Aglutinação

14 2) Teoria "das malhas" da qual os aglomerados seriam constituídos de células ligadas entre si pelos anticorpos. (figura 14) Excesso de Anticorpos Excesso de Antígenos Zona de Equivalência Figura 14 Técnicas das reações de aglutinação: As reações de aglutinação podem ser executadas sobre lâminas de microscopia ou placas de vidro, em tubos de ensaio e em microplacas. Elas podem ser: 1) Reações qualitativas. 2) Reações quantitativas. Na aula prática, os alunos terão uma demonstração sobre reação de aglutinação quantitativa feita em placas (micrométodo) usando soros anti-hemácias de carneiro e suspensão antigênica de hemácias de carneiro.

15 e 7). Material necessário: 1) Microplacas plásticas para hemaglutinação. 2) Soros de camundongos (imunização feita em aula prática pelos grupos 2, 6, 3 3) Suspensão de hemácias de carneiro a 1%. 4) Solução salina (0,l5M). 5) Micropipetadores de 25 ul Técnica da Reação: 1) Adicionar um volume de 25ul de diluente (PBS) em todas as cavidades das fileiras A e B da microplaca (0,025ml). 2) Colocar na primeira cavidade da fileira A1 e B1 25ul (0,025ml) do soro positivo de camundongos 3) Com uma micropipeta de 25ul, começar a homogeneizar a primeira cavidade da fileira A, contendo o soro e, sem tocar na superfície ou na borda da placa, transferir 25ul para a segunda cavidade da fileira A2. Novamente homogeneizar bem e, com os mesmos cuidados, transferir 25ul para a terceira cavidade e assim sucessivamente até a 11ª cavidade (A11), pois para a última não será transferida nenhum volume da diluiçao dos soros e esta cavidade servirá como controle da suspensão antigênica de hemácias. No final, portanto, queremos as seguintes diluições dos soros: l/2, l/4, l/8, l/l6, l/32, l/64, l/l28, l/256, l/5l2, l/l024, l/ ) Repetir a mesma operação para a fileira B 5) Colocar em todas as cavidades das duas fileiras 25ul (0,025ml) da suspensão de hemácias de carneiro. 6) Agitar com cuidado a placa e incubar por 60 minutos à temperatura ambiente. 7) Fazer a leitura da reação e, comparando os resultados dos soros e fazer a interpretação dos resultados.

16 A /2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 1/2048 Controle B C D E F Figura 15 PERGUNTAS 1) Quais os mecanismos da reação de soroaglutinação? 2) Que tipos de antígenos são revelados pela reação de soroaglutinação? 3) Qual(is) a(s) utilidade(s) da reação de soroaglutinação? 4) Como se procede para titular um soro aglutinante?

17 Aula prática 5 MÉTODO INDIRETO DE ELISA PARA DETECÇÃO E TITULAÇÃO DE ANTICORPOS DE COBAIA ANTI-GAMAGLOBULINA BOVINA Trata-se de um método extensivamente usado para detecção e/ou titulação de anticorpos específicos presentes em soros sangüíneos. A especificidade desse ensaio imunoenzimático é direcionada pelo antígeno presente na fase sólida (superfície da microplaca), o qual pode ser uma preparação altamente purificada, ou então preparações semi-purificadas, ou até mesmo brutas. Após adição e incubação do antígeno (Ag), as cavidades da microplaca serão lavadas para eliminar o excesso e os antígenos não ligados à superfície dessas mesmas cavidades. Os soros contendo os anticorpos contra esse Ag podem ser então adicionados, diluindo-os em tampão apropriado que impeça a ligação não específica dos anticorpos a sítios livres presentes na superfície da microplaca, os quais não foram ocupados pelas molécula de Ag. Os soros podem ser adicionados com diluição única, ou com diluição seriada. Após incubação das diluições séricas, as cavidades devem ser novamente lavadas para se eliminar o excesso de anticorpos não ligados. Os anticorpos combinados ao Ag são então detectados após incubação com o conjugado imunoenzimático anti-imunoglobulinas ou anti-ig G da espécie cujos anticorpos se pretende titular. O conjugado deve ser diluído no mesmo tampão em que foram diluídos os soros. Após incubação e lavagem das cavidades da microplaca, é adicionada às cavidades uma solução de substrato imunoenzimático (água oxigenada) e cromógeno (orto-fenilenodiamina), incubando-se a reação para desenvolvimento de cor e, ao final, depois de bloqueada a reação enzimática, devem ser lidas as densidades ópticas (DOs),em leitor de microplacas no comprimento de onda de 490nm. O esquema básico do método indireto do Elisa é o seguinte: Ag + Ac (?) + conjugado I.E. + S leitura de Dos Ag preparação antigênica solúvel de gamaglobulina bovina Ac soros-teste de cobaia Conjugado I. E. conjugado de Ig G de coelho anti-ig G de cobaia com peroxidase S substrato

18 Observar esquema abaixo: Antígeno Soro Antiglobulina Substrato Reação Marcada com enzimático de cor enzima Lavagem Lavagem Lavagem Antiglobulina marcada com enzima Substrato Enzimático Anticorpo Antígeno Bloqueador Figura 16 Material Preparação antigênica solúvel de gamaglobulina bovina Soros-teste de cobaias imunizadas anteriormente com antígeno citado + adjuvantes distintos (ACF Adjuvante Completo de Freund; AIF Adjuvante Incompleto de Freund; Al(OH) 3 Hidróxido de alumínio) Conjugado de Ig G de coelho anti-ig G de cobaia com peroxidase (enzima) Peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 água oxigenada) a 3% (substrato) Orto-Fenileno-Diamina OPD (cromógeno) Microplacas para Elisa

19 Tampão Carbonato-Bicarbonato ph 9,6 a 0,05M Tampão PBS ph 7,4 Tampão PBST ph 7,4 + 10% de LPD (Leite em Pó Desnatado) Solução de HCl concentrado 2N Procedimento 1. Adicionar volumes de 50 L da solução antigênica em sua diluição ideal de uso (1 g/ml) preparada em Tampão Carbonato-Bicarbonato (1:12500). Incubar a reação over-night, em geladeira. Ao final, lavar as cavidades da microplaca 4 5 vezes com PBS. 2. Bloquear as cavidades da microplaca através da adição de LPD a 10% em TCB, incubar a reação por 45 minutos a 37 º C. Ao final, lavar a microplaca como no item anterior. 3. Adicionar as diluições das amostras de soros-teste preparadas em tampão PBST + LPD. Incubar a reação por 60 minutos a 37 º C. Ao final, lavar novamente, conforme já descrito. 4. Adicionar o conjugado em sua diluição ideal de uso (1:2000) preparada em tampão PBST + LPD. Incubar por mais 60 minutos a 37 º C. Ao final, lavar novamente. 5. Adicionar a solução de substrato (H 2 O 2 ) + OPD. Incubar, sob proteção da luz, por 15 minutos e, então, bloquear a reação com HCl. 6. Fazer a leitura das DOs. Determinar a DO média dos controles para obtenção dos títulos de Acs presentes nos soros /100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/ / / / ACF A B AIF AlOH Sem Adjuvante C D E F G H