Faculdade de Medicina Veterinária

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1 Faculdade de Medicina Veterinária RELATÓRIO FINAL PROJETO E-020/2006 EFEITO DE TRÊS CRIOPROTETORES SOBRE A MEMBRANA DE CÉLULAS ESPERMÁTICAS DE OVINOS Bolsista: Patrícia Soares Orientador: Prof. Dr. José Octavio Jacomini Uberlândia MG Março de 2007

2 1 Efeito de três crioprotetores sobre a membrana de células espermáticas de ovinos PATRÍCIA SOARES ¹, EURÍPEDES VILELA DA SILVA ², JOSÉ OCTAVIO JACOMINI ³ RESUMO O armazenamento do sêmen por um longo período, permitindo o seu posterior uso representa uma importante ferramenta para criadores que desejam resguardar o potencial genético de seus reprodutores. O meio diluente e o crioprotetor são utilizados com o intuito de proteger os espermatozóides dos choques térmicos e osmóticos que ocorrem durante o processo de congelamento, já que este pode causar danos irreversíveis aos espermatozóides. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito dos crioprotetores: glicerol (GLI), etilenoglicol (EGL) e dimetilformamida (DMF), sobre a membrana das células espermáticas de ovinos quando igualadas as osmolaridades destes meios. A fração espermática do ejaculado de 16 ovinos foi avaliada macro e microscopicamente e, destes foram selecionados 4 reprodutores para a realização deste estudo. Observou-se para tanto a reação dos espermatozóides aos testes hiposmótico e aos crioprotetores. A avaliação consistiu na alteração morfológica das células espermáticas em ambos os testes. O resultado encontrado no teste hiposmótico foi de 17,08 ± 4,46 espermatozóides reativos. A avaliação dos crioprotetores obteve como resultado 9,63 ± 4,12 espermatozóides reativos ao etilenoglicol, 21,88 ± 5,47 reativos ao glicerol e 10,13 ± 4,27 responderam a dimetilformamida. Concluiu-se, nesta etapa, que o glicerol obteve maior efeito protetor sobre as membranas dos espermatozóides, podendo exercer melhor atividade crioprotetora se utilizado na preservação do sêmen ovino. PALAVRAS-CHAVE: Membrana celular, Ovinos, Glicerol, Etilenoglicol, Dimetilformamida. 1 Bolsista FAPEMIG/UFU, acadêmica do curso de Medicina Veterinária FAMEV-UFU, Rua Alberto Alves Cabral,1379. B.Santa Mônica, Uberlândia-MG, CEP Endereço eletrônico: psoares.vet@hotmail.com 2 Acadêmico do curso de Medicina Veterinária FAMEV-UFU. Endereço eletrônico: euripedes_vilela@hotmail.com. 3 Orientador/ Professor do curso de Medicina Veterinária FAMEV-UFU. Endereço eletrônico: jojacomini@ufu.com.br

3 2 Effect of three cryoprotectors on the membrane of spermatic cells of sheep ABSTRACT The long-term storage of frozen semen represents a tool for breeders that want to preserve the genetic potential of their sires. The diluents and the cryoprotectants are used with intention to protect the spermatozoa of the thermal and osmotic shocks that occur during the freezing process, since this can cause irreversible damages to the spermatozoa. The objective of the present study was to evaluate the effect of thinners the cryoprotectants: glycerol (GLI), ethylene glycol (EGL) and dimethylformamide (DMF), on the membrane of spermatic cells of sheep when equaled the osmolality of these medium. The spermatic fraction of the ejaculated one of 16 sheep was evaluated macro and microscopically e, of these 4 reproducers for the accomplishment of this study had been selected. It was observed in such for the reaction of the spermatozoa hypoosmotic tests and the cryoprotectants. The evaluation consisted of the morphologic alteration of the spermatic cells in both the tests. The result found in the hypoosmotic test was of 17,08 ± 4,46 reactive spermatozoa. The evaluation of the cryoprotectants got as resulted 9,63 ± 4,12 reactive spermatozoa to ethylene glycol, 21,88 ± 5,47 reagents to glycerol and 10,13 ± 4,27 had answered the dimethylformamide. It was concluded, in this stage, that glycerol had greater protective effect on the membrane of spermatozoa, being able to better exert cryoprotectant if used activity in the cryopreservation of the sheep semen. KEY WORDS: Celular membrane, Sheep, Glycerol, Etilenoglicol, Dimethylformamide. 1 INTRODUÇÃO A mais antiga biotecnologia e que provocou notáveis ganhos genéticos no melhoramento dos animais domésticos foi a inseminação artificial. Em ovinos, as primeiras inseminações ocorreram de 1901 a 1905, realizadas pelo médico veterinário russo Elias Ivanov (LIMA, 2000). A inseminação artificial (IA) apresenta limitações tais quais: mão de obra habilitada, equipamentos especiais, conhecimento do reprodutor escolhido, boas instalações. Porém, suas vantagens, são inquestionáveis, uma vez que permite

4 3 maior aproveitamento do reprodutor, facilita a seleção genética, evita consangüinidade, diminui a quantidade de reprodutores na propriedade, possibilita estocagem de sêmen, elimina doenças de reprodução no rebanho, permite maior controle e organização da propriedade, e ainda, permite o acesso de reprodutores de altos índices, a criadores com condições financeiras limitadas. O desenvolvimento de técnicas adequadas para preservação de sêmen é um dos passos mais importantes no avanço da reprodução animal nas diferentes espécies e vem sendo conseguido através da aplicação de biotécnicas cada vez mais modernas (PAPA et al., 2000). Suarez (1998) afirmou que 50% dos espermatozóides em amostras normais são perdidos durante os processos de criopreservação, e conseqüentemente há necessidade de se utilizar um número maior de espermatozóides para uma IA com sêmen congelado quando comparado a amostras de sêmen fresco. Segundo Evans & Maxwell (1987), Maxwell & Salamon (1993), Salamon & Maxwell (1995) e Salamon & Maxwell (2000) entre a faixa de 20ºC e 0ºC, há maior susceptibilidade das células espermáticas ao choque térmico, causador de mudanças irreversíveis aos espermatozóides. Neste sentido os meios diluidores exercem papel fundamental na preservação do sêmen, quer no processo de refrigeração ou congelamento, além do papel de expansor do volume seminal, permitindo seu fracionamento. A diluição do sêmen é essencial para o sucesso da técnica de criopreservação, pois os componentes dos meios diluidores fornecem condições para a sobrevivência do espermatozóide, auxiliando na preservação da integridade da membrana plasmática, que pode sofrer alterações devido às mudanças de temperatura. O diluidor contém fontes energéticas para o espermatozóide, estabiliza o ph do meio (LINDE- FORSBERG, 1991; ENGLAND, 1993) e deve prevenir alterações acrossômicas, preservando uma das habilidades do espermatozóide que é a reação acrossômica (SIRIVAIDYANPONG et al., 2000). O processo de criopreservação das células espermáticas resulta em diminuição da fertilidade quando comparado com sêmen fresco. Este prejuízo se dá pela perda da viabilidade espermática ou por danos na capacidade funcional dos espermatozóides sobreviventes (WATSON, 2000). Salamon e Maxwell (1995) afirmaram que apesar de 40 a 60% dos espermatozóides do sêmen de carneiros apresentarem motilidade pósdescongelação, somente 20 a 30% deles permanecem biologicamente inalterados.

5 4 Os danos básicos que os espermatozóides sofrem durante o processo de congelamento podem ser ultra-estruturais ou físicos, bioquímicos ou funcionais. O processo de criopreservação exerce efeitos negativos principalmente sobre a membrana celular, particularmente vulnerável a este processo. Espermatozóides de carneiros são mais sensíveis a criopreservação que de touros (WATSON, 1972). Diferenças entre as membranas da célula espermática de carneiros foram observadas por Holt e North (1985). As membranas celulares ancoramse no citoesqueleto, desta forma, qualquer alteração nessa estrutura pode de alguma maneira, repercutir negativamente na função celular. A integridade da membrana espermática exerce um papel fundamental na sobrevivência do espermatozóide no trato genital da fêmea e na manutenção de sua capacidade fertilizante (PARKS & GRAHAM, 1992). Existem três membranas no espermatozóide: membrana plasmática, membrana do acrossomo e membrana mitocondrial, com exceção da última, as outras apresentam diferenças em domínios na sua estrutura e comportamento (PARKS & GRAHAM, 1992; WATSON, 1995). O modelo estrutural básico da membrana espermática é igual ao modelo biológico clássico formado por duas camadas de fosfolipídios com proteínas integrais e glicoproteínas de superfície de ligação e glicolipídios organizados em um mosaico fluido (SINGER; NICHOLSON, 1972). Dentro do conceito de assimetria de fosfolipídio, na qual cada tipo de fosfolipídio tem uma preferência na sua orientação específica na bicamada, existe também o fato de que a quantidade e o tipo de fosfolipídio mudam de acordo com a espécie animal, tudo isso pode de certa forma, estar relacionado à estabilidade da membrana celular (HAMMERSTED et. al., 1990). O declínio na motilidade observado após congelamento e descongelamento da célula espermática pode ser explicado, em parte, pelas mudanças no transporte ativo e permeabilidade da membrana plasmática na região da cauda e/ou à disponibilidade de energia ou danos nos elementos do axonema (WATSON, 1995). O grau de desnaturação do DNA durante a criopreservação também pode ser influenciado pelo diluente, tendo efeito negativo na subseqüente fertilidade (KARABINUS et. al., 1991). Quando uma solução é submetida a temperaturas abaixo do ponto de congelamento, cristais de gelo são formados fora da célula, o que aumenta a pressão osmótica extracelular pela

6 5 concentração de solutos na água não congelada. No caso da temperatura baixa, haverá pouco líquido não congelado e alta pressão osmótica, tornando o ambiente não apropriado para a célula. Como conseqüência de tudo isso deve ser utilizada uma rápida taxa de resfriamento entre 15 a 60º C/min, o que tem sido estabelecido empiricamente como responsável por melhores taxas de sobrevivência (WATSON, 2000). Watson (1995) propõe que ótima taxa de resfriamento pode ser determinada segundo a sensibilidade do espermatozóide ao estresse osmótico. Conforme resultados de estudos empíricos ao longo de várias décadas, muitos fatores podem afetar a sobrevivência dos espermatozóides, estes fatores incluem dentre outros a composição dos meios e os crioprotetores usados para congelação (LIU et al., 1998; GUTHRIE et al. 2002). As células espermáticas necessitam para sua sobrevivência ao processo de congelamento de um ou mais agentes crioprotetores, que são classificados como agentes crioprotetores não penetrantes (extracelulares) e agentes crioprotetores penetrantes (intracelulares) (MAZUR, 1980). O mecanismo de ação dos agentes crioprotetores não penetrantes baseia-se na proteção dos espermatozóides contra os efeitos osmóticos durante o processo de congelamento, promovendo um meio hipertônico que induz a saída de água das células levando a desidratação, ou seja, eles agem no meio extracelular, reduzindo assim a possibilidade da formação de cristais de gelo intracelular. Estes são representados pelos açúcares, lipoproteínas da gema do ovo e proteínas do leite. (AMANN & PICKETT, 1987). Após as conclusões de Phillips e Lardy (1940) sobre a proteção da gema de ovo aos espermatozóides quando estes são submetidos ao rápido congelamento, ou choque frio, tem-se utilizado amplamente a gema de ovo na conservação dos espermatozóides de mamíferos. As lipoproteínas de baixa densidade da gema de ovo, especificamente os fosfolipídios, têm sido determinadas como componentes efetivos na preservação e proteção do espermatozóide. É conhecido que a perda de fosfolipídios pela membrana da célula espermática é uma das causas da diminuição da viabilidade (PARKS & GRAHAM, 1992). Os crioprotetores penetrantes são substâncias que tem a capacidade de proteção intracelular das células espermáticas (NASH, 1966). O mecanismo de ação destes crioprotetores baseia-se em estruturas que promovem ligações de hidrogênio com as moléculas da água.

7 6 Estas ligações mudam a orientação da molécula da água nos cristais de gelo, criando um ambiente menos nocivo para as células (DALIMATA & GRAHOM, 1997). Os crioprotetores penetrantes utilizados em meios diluentes para congelamento de sêmen em animais domésticos são: etanol, etilenoglicol, glicerol, metanol e polietilenoglicol (DE LEEUW et al., 1993) e também as amidas, incluindo a acetamida, formamida, lactamida, dimetilformamida e bem como o dimetilsulfóxido (DMSO) (ASHWOOD & SMITH, 1987; MEDEIROS et al., 2002). A habilidade de um crioprotetor de se ligar ao hidrogênio da molécula de água é a mais importante característica de um bom crioprotetor (NASH, 1966). Karow (2001) estabeleceu a diferença da toxicidade dos agentes crioprotetores penetrantes por efeitos farmacológicos e bioquímicos e por injúrias físicas como a osmolaridade. A toxicidade de um agente crioprotetor penetrante está influenciada por sua concentração, momento de adição e temperatura em que é realizada a exposição da célula ao agente. O glicerol foi o primeiro crioprotetor a ser utilizado em espermatozóides (POLGE et. al., 1949). Seu efeito crioprotetor se relaciona à sua capacidade de ligação com a água e à baixa dissociação com sais, portanto, diminuindo a osmolaridade do meio de congelamento. Estas propriedades são favorecidas por sua capacidade de atravessar facilmente a membrana celular, mantendo a osmolaridade interna e externa. No congelamento de sêmen de garanhões o etilenoglicol tem sido estudado e comparado com o glicerol. Mercante et. al. (1995) observaram efeito similar entre eles para vigor e motilidade, porém com uma vantagem positiva para o etilenoglicol. Entretanto, Arruda (2000) analisou a substituição do glicerol pelo etilenoglicol como agente crioprotetor de espermatozóides de garanhões, e concluiu que o etilenoglicol e o glicerol têm propriedades crioprotetoras semelhantes. As amidas são moléculas que tem três pontes de ligação ao hidrogênio, três a menos que o glicerol. Esta característica torna-as menos solúveis em água e menos viscosa que o glicerol, resultando em uma menor permeabilidade à membrana (NASH, 1966), esta característica pode diminuir a possibilidade de danos celulares por estresse osmótico causado por outros crioprotetores (BALL & VO, 2001). Recentemente, as amidas, principalmente a dimetilformamida, têm sido adicionadas como crioprotetores nos meios de diluição do sêmen eqüino com bastante êxito (ALVARENGA, 2000;

8 7 MEDEIROS, 2003); entretanto, são poucos os trabalhos que utilizam esse crioprotetor para sêmen bovino. Nagase et. al. (1972) encontraram boa crioproteção com uso de formamida e lactamida no sêmen de bovinos. O etilenoglicol tem sido usado com sucesso em sêmen eqüino (ARRUDA, 2000) e em pequena escala em sêmen bovino, sendo que alguns trabalhos mostraram vantagem frente ao glicerol e ao dimetilsulfóxido, devido a seu pequeno efeito osmótico, mantendo o tamanho ou volume celular durante a criopreservação e evitando perda de motilidade (GUTHRIE et. al., 2002). Para avaliar o efeito do congelamento e das substâncias utilizadas para promovê-lo, o teste hiposmótico tem sido apresentado como um bom teste para avaliar a integridade das membranas dos espermatozóides em vários animais domésticos incluindo bovinos, eqüinos e suínos (FONSECA et. al., 2004). Entretanto, ainda não foi desenvolvido um método eficiente de teste hiposmótico para sêmen ovino. A criação de pequenos ruminantes tem experimentado uma grande expansão durante as duas últimas décadas. O melhoramento das raças acompanhado de tecnologias reprodutivas é necessário para avaliar e melhorar a eficiência reprodutiva. Em ovinos, a análise é baseada em cima de métodos desenvolvidos para outras espécies de animais domésticos. O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade do glicerol, do etilenoglicol e da dimetilformamida na preservação das células espermáticas de ovinos avaliandose parâmetros como motilidade, o vigor e integridade de membranas de células espermáticas. 2 MATERIAL E MÉTODOS Este experimento foi realizado no Laboratório de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Uberlândia e em criatórios da região de Uberlândia MG, durante o período de março de 2006 a março de Os ejaculados foram coletados de 16 animais em quatro criatórios da região. Todos os animais foram submetidos ao exame andrológico e ao espermograma. Por meio da análise dos andrológicos e dos ejaculados escolheu-se um criatório e 4 carneiros da raça Santa Inês, com idades entre 8 e 24 meses. Os reprodutores foram mantidos em pastagem Tifton (Cynodon spp cv 85), com água e sal mineral ad libitum e suplementação com ração e feno (período da seca), além dos cuidados sanitário-profiláticos necessários.

9 8 Foram realizadas três coletas de sêmen de cada animal por meio de estimulação elétrica (eletroejaculador). Imediatamente após a coleta, o sêmen foi acondicionado em banho-maria a 37 ºC, observando seu aspecto, sendo o volume determinado no próprio tubo de coleta (graduado). As avaliações da motilidade, do turbilhonamento, do vigor e da concentração espermática foram realizadas com o auxílio de um microscópio óptico. A motilidade e o vigor foram observados pela deposição de uma gota de sêmen entre lâmina e lamínula, sendo a motilidade determinada pela porcentagem de espermatozóides com movimento e o vigor avaliado com base na qualidade do movimento retilíneoprogressivo e sua velocidade em uma escala de 0 a 5. O turbilhonamento foi avaliado pela deposição de uma gota sobre a lâmina aquecida observando-se movimentos de onda em escala de 0 a 5. Finalmente, a concentração espermática foi determinada pela contagem de células em câmara de Neubauer, após diluição (1:400) de uma amostra de sêmen (20µL) em Citrato de sódio (2,94%) formolado (5%). Uma alíquota de 20 µl de sêmen foi adicionada a uma solução de Citrato de sódio formolado para avaliação morfológica com o objetivo de ser comparado ao efeito dos testes hiposmótico e dos crioprotetores. Uma vez avaliada a concentração, o vigor, a motilidade e o turbilhonamento da amostra seminal, três alíquotas (20 µl) de sêmen foram distribuídas em tubos contendo diluidor (1 ml) à base de Citrato (2,94) preparado com três crioprotetores diferentes: glicerol 7,42% (GLI), etilenoglicol 4,97% (EGL) e dimetilformamida 5,89% (DMT), sendo igualadas as osmolaridades destes para retirar o efeito desta variável e avaliar a integridade funcional da membrana plasmática dos espermatozóides. As três soluções, acrescidas do sêmen, foram submetidas à incubação por 40 minutos. Decorrido este tempo, uma alíquota de 80 µl de cada amostra foi adicionada a um tubo contendo 1 ml de solução hiposmótica. Para efeito de comparação, uma alíquota (20 µl) de sêmen in natura foi adicionada a um tubo contendo 1 ml de solução hiposmótica (125 mosm) fixada em formol, após 40 minutos de incubação. Procedeu-se à leitura do percentual de espermatozóides reativos ao teste hiposmótico, em preparação úmida entre lâmina e lamínula sob objetiva de imersão, em microscopia de contraste de fase com aumento de 1000 vezes (Microscópio Olympus BX41). Foram contadas cem células (JEYENDRAN et al., 1984) por amostra, incluindo-se os dobramentos de cauda que

10 9 pudessem ser classificados como patológicos, pois estes seriam descontados quando diminuídos dos dobramentos observados na morfologia espermática. Para tal cálculo foi utilizada a seguinte fórmula: HO (%) = [% de alterações na região da cauda (peça principal) após teste HO] [% de alterações na região da cauda (peça principal) antes do teste HO] (MELO & HENRY, 1999). Para avaliar o efeito dos crioprotetores sobre a membrana plasmática dos espermatozóides foi colocada em uma lâmina uma gota de sêmen diluído nos crioprotetores, colocando-se lamínula e realizando-se vedação com esmalte. Assim que os espermatozóides se estabilizaram foram avaliadas, em imersão, alterações de cauda, peça intermediária e na estrutura geral das células espermáticas. Foram contadas cem células por amostra. Para avaliar o efeito dos crioprotetores foi adotado o mesmo critério de avaliação realizado com a solução hiposmótica. Para o cálculo foi utilizada a seguinte fórmula: Crioprotetor (%) = (% de alterações na cauda no teste com crioprotetor) (% de alterações na cauda no teste sem crioprotetor). 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO As características da fração espermática dos ejaculados são apresentadas na Tabela 1. Tabela 1. Espermograma e Exame andrológico dos animais utilizados no experimento. Animal Idade (meses) C.E (cm) Volume (ml) Aspecto TBM MOT (%) Vigor Concentração 1* 24 31,0 0,7 Aquoso 3,5 70 3,0 4,50 X * 18 29,0 2,0 Aquoso 3,0 75 3,5 1,60 X * 28 34,0 2,5 Cremoso 5,0 85 4,0 5,40 X * 12 31,0 2,4 Cremoso 4,0 80 4,0 4,70 X 10 9 * Média entre as três coletas; C.E. - Circunferência Escrotal; TBM Turbilhonamento; MOT - Motilidade Durante a realização do exame andrológico, medida de extrema importância é a tomada da circunferência escrotal. O tamanho dos testículos está diretamente relacionado com a capacidade de produção espermática. Animais com testículos mais desenvolvidos apresentam maior volume e maior concentração espermáticos no ejaculado, podendo servir a maior número de fêmeas ou produzir maior número de doses de sêmen, quando em rotina de coleta e congelação.

11 10 A produção espermática está altamente correlacionada com o peso do testículo e, a medida da circunferência escrotal tem sido usada como indicador da produção espermática em várias espécies (DYRMUNDSSON, 1973). Freitas (1991) avaliaram ovinos das raças Santa Inês, Somalis e Morada Nova, de 6 a 36 meses de idade, com a circunferência escrotal variando de 24,8 a 33,0 cm e concluíram que este parâmetro deve ser relacionado com o peso e idade dos animais, e aqueles que não apresentarem perímetro escrotal esperado compatível com a idade de reprodução devem ser descartados. Por estes dados, os carneiros selecionados para o experimento estão dentro do padrão considerado adequado. O volume do sêmen varia de acordo com o método de coleta, com a idade do animal, estação e freqüência das coletas. Segundo Hafez & Hafez (2004), o volume ejaculado varia de 0,5 a 2 ml em animais adultos e de 0,5 a 0,7 ml em carneiros jovens. A determinação da motilidade envolve estimativas subjetivas de viabilidade dos espermatozóides. Segundo o Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (1998), os padrões seminais de ovinos desejáveis para motilidade, vigor, turbilhonamento e concentração espermática são 75% e 3x10 9, respectivamente. A leitura da morfologia espermática do ejaculado dos ovinos, neste estudo, revelou as seguintes médias: alterações de cabeça (2,11 ± 3,22); gota citoplasmática proximal (0,5 ± 1,0); gota citoplasmática distal (0,5 ± 1,0); peça principal (3,79 ± 2,08); A média de espermatozóides classificados como normais foi de 79,53 ± 13,57. Na Figura 1 são demonstradas algumas das alterações observadas nesta etapa. Figura 1 - Morfologia espermática do ejaculado sem tratamento observado em microscópio de contraste de fase. Aumento de 1000X. (A) Espermatozóide Normal; (B) Cabeça isolada; (C) Cabeça ulcerada; (D) Cauda isolada; (E) cauda enrolada; (F) Gota citoplasmática distal. A leitura da morfologia espermática no teste hiposmótico, após 40 minutos de incubação, revelou as seguintes médias: alterações de cabeça (4,4 ± 3,45); gota citoplasmática proximal (3,26 ± 4,69); gota citoplasmática distal (3,26 ± 4,84); peça principal (20,87 ± 8,40); A média de

12 11 espermatozóides classificados como normais foi de 68,21 ± 8,13. Na Figura 2 estão demonstradas algumas alterações observadas nos espermatozóides submetidos ao teste hiposmótico. Na avaliação da utilização de glicerol como crioprotetor, a leitura da morfologia espermática revelou as seguintes médias: alterações de cabeça (5,25 ± 3,30); gota citoplasmática proximal (4,0 ± 2,77); gota citoplasmática distal (0,75 ± 0,95); peça principal (42,75 ± 7,88); A média de espermatozóides classificados como normais foi de 40,25 ± 2,75. Figura 2 - Morfologia espermática do ejaculado submetido ao teste hiposmótico observado em microscópio de contraste de fase. Aumento de 1000X. (A) Cabeça isolada; (B) Cauda dobrada com gota citoplasmática distal; (C) Espermatozóide Normal; (D) Cauda com gota citoplasmática distal. A leitura da morfologia espermática no teste que teve etilenoglicol como crioprotetor revelou as seguintes médias: alterações de cabeça (12,25 ± 1,70); gota citoplasmática proximal (1,75± 1,70); gota citoplasmática distal (1,75 ± 0,95); peça principal (30,5 ± 9,11); A média de espermatozóides classificados como normais foi de 53 ± 6,48. Na Figura 3 são demonstradas algumas das alterações observadas neste teste. Figura 3 - Morfologia espermática do ejaculado submetido ao teste com etilenoglicol observado em microscópio de contraste de fase. Aumento de 1000X. (A) Espermatozóide Normal; (B) Cauda enrolada; (C) Cauda fortemente enrolada. Algumas alterações desta etapa são demonstradas na Figura 4. Utilizando-se como crioprotetor a dimetilformamida, as alterações observadas obtiveram as seguintes médias: alterações de cabeça (5,25 ± 3,40); gota citoplasmática proximal (2,0 ± 1,82); gota citoplasmática distal (3,0 ± 0,81); peça principal (31 ± 8,13); A média de

13 12 espermatozóides classificados como normais foi de 58,75 ± 15,28. Figura 4 - Morfologia espermática do ejaculado submetido ao teste com glicerol observado em microscópio de contraste de fase. Aumento de 1000X. (A) Cauda fortemente enrolada; (B) Cabeça isolada. Na figura 5 estão representadas algumas das alterações observadas no teste com dimetilformamida. Figura 5 - Morfologia espermática do ejaculado submetido ao teste com dimetilformamida observado em microscópio de contraste de fase. Aumento de 1000X. (A) Espermatozóide normal; (B) Cauda fortemente enrolada. Comparando as alterações na cauda dos espermatozóides antes e após o teste hiposmótico, determinou-se o percentual de células reativas ao teste HO, que foi de 17,08 ± 4,46. Já na avaliação dos crioprotetores os resultados obtidos foram: espermatozóides reativos ao etilenoglicol 9,63 ± 4,12; reativos ao glicerol 21,88 ± 5,47 e a dimetilformamida 10,13 ± 4,27. Assim como demonstrado em outras espécies de animais domésticos (CORREA et. al., 1997; NEILD et. al., 1999), os espermatozóides ovinos apresentaram um resultado similar quando expostos ao teste hiposmótico. Isto ocorre devido à absorção de água pelas células espermáticas com membranas intactas aumentando seus volumes para estabelecer o equilíbrio entre o fluido do compartimento interno dos espermatozóides e o meio extracelular. Isto culmina numa expansão esférica da membrana plasmática da célula na região da cauda forçando a retração da mesma. Esta retração começa da extremidade final da cauda e prossegue pela peça intermediária diminuindo a pressão osmótica dos meios. Fonseca et. al. (2005) apontaram a solução hiposmótica a 125 mosm como aquela ideal para analisar alterações sobre a membrana plasmática das células espermáticas de bodes. Resultados

14 13 semelhantes foram encontrados para touros (PRASAD et. al., 1999). Comparando os resultados entre os testes hiposmótico com cada um dos crioprotetores, aquele que apresentou melhor resultado foi o glicerol, seguido pela dimetilformamida. O efeito dos crioprotetores sobre a membrana plasmática foi avaliado pelas alterações sobre a cauda. Aquelas células que apresentam alterações morfológicas são os espermatozóides que possuem membranas intactas, capazes de absorver água e restabelecerem o equilíbrio entre os meios intra e extracelular. Nesse sentido, o glicerol foi a substância que proporcionou maior proteção à membrana plasmática das células espermáticas. Uma vez que a osmolaridade dos diluentes foi igualada antes da realização dos ensaios, o efeito de cada um destes pôde ser melhor avaliado. Resultado similar foi encontrado por González (2004) em estudo com células espermáticas bovinas. Porém, a ordem de proteção teve o glicerol com melhor efeito protetor seguido pelo etilenoglicol e pela dimetilformamida. A diferença observada pode estar ligada ao fato de que há variações entre as células espermáticas dos animais em relação a variações osmóticas, principalmente no que se refere a uma maior capacidade da membrana plasmática para adaptação ao influxo e efluxo de água durante o processo de contato com o crioprotetor e mesmo do processo de criopreservação (AGCA & CRISTER, 2002). Watson & Martin (1972) relataram que os espermatozóides de carneiros são mais sensíveis a criopreservação que o de touros, o que também pode explicar o resultado obtido. Kundu et. al. (2000) formularam a hipótese que o mecanismo de proteção do glicerol se deve à capacidade de ligação dos átomos de hidrogênio dos grupos hidroxila com os átomos de oxigênio dos grupos fosfato dos fosfolipídios da membrana do espermatozóide, promovendo assim a estabilização da membrana durante o processo de criopreservação. A superioridade do glicerol na preservação da membrana plasmática (21,88 %) permite evidenciar o fato de que esta proteção ainda não é a ideal, pois ocorrem graves lesões à membrana plasmática, o que pode inviabilizar o processo reprodutivo. Portanto, mais pesquisas com estes e outros crioprotetores se fazem necessárias. Outros testes como reação acrossomal e mitocondrial, podem revelar ainda mais o efeito das substâncias aqui estudadas sobre os espermatozóides de ovinos. É importante ressaltar que qualquer crioprotetor causa efeitos físicos

15 14 (osmóticos) e farmacológicos sobre as células (KAROW, 2001). Muitos crioprotetores úteis para alguns tipos de células têm sido testados, porém poucos têm tido utilidade notadamente comprovada na preservação dos espermatozóides (WATSON, 1995). A ovinocultura é uma atividade em franca expansão no Brasil e estudos para avaliar a capacidade reprodutiva da espécie e melhorá-la pode contribuir ainda mais para o aumento da produtividade e da qualidade dos animais criados no país. 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGCA, Y.; CRITSER, J.K. Cryopreservation of spermatozoa in assisted reproduction. Seminars in Reproductive Medicine, v. 20, n. 1, p , ALVARENGA, M. A.; GRAHAM, J. K.; KEITH, S. L.; LANDIM-ALVARENGA, F. C.; SQUIRES, S. L. Alternative cryoprotectors for freezing stallion spermatozoa. In: INTERNATIONAL CONGRESS ON ANIMAL REPRODUCTION AND ARTIFICIAL INSEMINATION, 14., Proceedings... Stockholm, p CONCLUSÃO Conclui-se que o glicerol preserva melhor a membrana plasmática das células espermáticas de ovinos quando comparado à dimetilformamida e ao etilenoglicol em osmolaridades igualadas. A dimetilformamida apresentou melhor resultado que o etilenoglicol, porém este resultado não foi significativo. 5 AGRADECIMENTOS AMANN, R.P.; PICKETT, B.W. Principles of cryopreservation and a review of cryopreservation of stallion spermatozoa. Equine Veterinary Science, v. 7, p , ARRUDA, R.P. de. Efeito de diluidores e crioprotetores para espermatozóides eqüino pelo uso de microscopia de epifluorescência, citometria de fluxo, análises computadorizadas de motilidade (CASA), e da morfologia (ASMA) f. Tese (Livre Docência em Reprodução Animal) Faculdade de Medicina Animal e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo À Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG) pela Bolsa de Iniciação Científica concedida (Projeto E-20/2006). BALL, B.A.; VO, A. Osmotic tolerance of equine spermatozoa and the effects of soluble cryoprotectants on equine sperm motility, viability and membrane potential. Journal of Andrology, v.22, n.6, p , 2001.

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