Congresso de Ciências Veterinárias [Proceedings of the Veterinary Sciences Congress, 2002], SPCV, Oeiras, Out. COMUNICAÇÕES LIVRES

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1 COMUNICAÇÕES LIVRES Reprodução pp Caracterização de um novo gene Delta (mdelta4) com expressão endotelial por técnicas de transgénese em mamíferos [Use of mammalian transgenic techniques to address the function of a novel endothelial specific Delta homologue, mdelta4] - Duarte, A.F.; Diniz, P.; Pimenta, J.; Benedito, R.; Trindade, A.; Matos, M.; Rodriguez, T.; Henrique, D.; Lopes da Costa, L Variação sazonal na produção de embriões bovinos produzidos in vitro entre 1996 e 2002 [Seasonal variation on in vitro bovine embryo production between 1996 and 2002] - Marques, C.C.; Pereira, R.M.; Baptista, M.C.; Vasques, M.I.; Horta, A.E.M Variação sazonal na qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro entre 1996 e 2002 [Seasonal variation on in vitro bovine embryo quality, between 1996 and 2002] - Marques, C.C.; Pereira, R.M.; Baptista, M.C.; Vasques, M.I.; Horta, A.E.M Influência da progesterona no desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro [Progesterone effect on in vitro bovine embryo production] - Pereira, R.M.; Marques, C.C.; Baptista, M.C.; Vasques, M.I.; Horta, A.E.M 121. Efeito das células epiteliais do oviducto bovino (BOEC) na capacidade fertilizante dos espermatozóides in vitro [Effect of bovine epitelial oviduct cells (BOEC) on in vitro fertilizing ability of bull spermatozoa] - Vasques, M.I.; Baptista, M.C.; Pereira, R.M.; Marques, C.C.; Horta, A:E.M Resposta da vaca mertolenga à superovulação com diferentes preparações hormonais de FSH [Response to superovulation of Mertolengo cows treated with two different FSH preparations] - Quaresma, M.A.; Lopes da Costa, L.F.; Robalo Silva, J Implementação em Portugal da técnica de fertilização in vitro em ovinos [Implementation of ovine in vitro fertilization technique in Portugal] - Baptista, M.C.; Marques, C.C.; Vasques, M.I.; Pereira, R.M.; Barbas, J.P.; Horta, A.E.M 124. Controlo hormonal da actividade mioeléctrica uterina [Hormonal control of uterine myoelectric activity] - Cavaco Gonçalves, S.; Vasques, M.I.; Marques, C.C.; Horta, A.E.M Influência do diluidor, época e exploração, nos resultados da IA em ovelhas de raça Saloia[Effect of semen extender, season and farm, on AI results in Saloia ewes] - Barbas, J.P.; Mascarenhas, R.D.; Horta, A.E.M.; Tavares, H.; Cannas-Serra, C.; Cardigos, L.; Moura, R.; Cannas Simões, J.P, 126. Efeito da aplicação vaginal de agentes dilatadores do cérvix (misoprostol e sulfato de terbutalina) sobre os resultados da IA em raças ovinas locais [Effect of vaginal application of cervix dilating agents (misoprostol and terbutalin sulphate) on AI results in ovine Portuguese local breeds] - Barbas, J.P.; Cavaco Gonçalves, S.; Baptista, M.C.; Marques, C.C.; Vasques, M.I.; Horta, A.E.M Comparação entre dois métodos de congelação de sémen de carneiros Merino Regional e Serra da Estrela ao longo do ano [Comparison of two freezing methods for Merino Regional and Serra da Estrela ram semen] - Barbas, J. P.; Baptista, C.; A.E.M. Horta

2 Reprodução Caracterização de um novo gene Delta (mdelta4) com expressão endotelial por técnicas de transgénese em mamíferos António Freitas Duarte, Patricia Diniz, Jorge Pimenta, Rui Benedito, Alexandre Trindade, Miguel Matos, Tristan Rodriguez*, Domingos Henrique**, Luís Lopes da Costa CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa; *National Institute of Medical Research, Mill Hill, Londres, Reino Unido; ** Unidade de Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa Face ao elevado grau de conservação do padrão de desenvolvimento vascular embrionário entre vertebrados, é provável que os mecanismos celulares e moleculares subjacentes sejam igualmente conservados. Recentemente identificámos e caracterizámos um novo gene homólogo Delta de ratinho, mdelta4, o qual é fortemente expresso nos vasos sanguíneos em desenvolvimento. Temos por objectivo obter mutantes de ganho- e perda-de-função que permitam dissecar o papel deste novo gene na angiogénese e no desenvolvimento embrionário. Para tal, temos vindo a implementar técnicas de engenharia genética, como a produção de clones recombinantes homólogos de células estaminais embrionárias (EE) e subsequente produção de quimeras para obter passagem á linha germinal das alterações genómicas introduzidas. Foram produzidos vários clones com a deleção específica de um alelo do mdelta4. Estas células mdelta4 +/- produziram, por agregação com embriões no estadio de 8 células, numerosas quimeras, 9 das quais apresentando passagem das células EE á linha germinal. Após rastreio por PCR de mais de 70 crias derivadas destas quimeras, chegou-se à conclusão que o alelo mutado não estava a ser transmitido. Após dissecção de fêmeas gestantes cruzadas com quimeras macho, foi identificada a presença de vários embriões mortos antes do dia 10.5 post-coitum, os quais se revelaram portadores do alelo mutado. Estes resultados preliminares indicam a haploinsuficiência do locus mdelta4, demonstrando a sua importância durante a embriogénese em mamíferos. Prosseguimos entretanto os estudos no sentido de caracterizar detalhadamente o fenótipo de perda-de-função recorrendo a técnicas histológicas

3 Use of mammalian transgenic techniques to address the function of a novel endothelial specific Delta homologue, mdelta4 António Freitas Duarte, Patricia Diniz, Jorge Pimenta, Rui Benedito, Alexandre Trindade, Miguel Matos, Tristan Rodriguez*, Domingos Henrique**, Luis Lopes da Costa CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa; *National Institute of Medical Research, Mill Hill, Londres, Reino Unido; ** Unidade de Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa Given the high degree of conservation of the general pattern of the embryonic vascular system, it is likely that the cellular and molecular mechanisms underlying that patterning process may also be conserved across vertebrates. We have recently identified and characterized a novel mouse Delta homologue, mdelta4, which is strongly expressed in the developing blood vessels of mouse embryos. To understand the role of this gene in angiogenesis and embryonic development in general, we have been implementing a number of genetic engineering technologies, such as gene targeting in embryonic stem (ES) cells and production of germline transmitting chimeras. So far, a number of homologous recombinant clones in which the mdelta4 gene was replaced by a gene targeting vector were poduced and used to generate 9 germline transmitting chimeras through agreggation with 8-cell stage embryos. After screening more than 70 ES-cell derived offspring, we came to the conclusion that the mutated allele was not being transmitted. Females were dissected after crossing with these chimeras, allowing the identification of embryos, which had died before day 10.5 post-coitum and proved to be hemizygous to mdelta4. These are preliminary results, which indicates haploinsuficiency in the mdelta4 locus, a finding that emphasizes its importance in mammalian embryogenesis. Meanwhile, we will attempt to fully characterize this loss-of-function phenotype through histological studies

4 Reprodução Variação sazonal na produção de embriões bovinos produzidos in vitro entre 1996 e 2002 Marques, C.C.; Pereira, R.M.; Baptista, M.C.; Vasques, M.I.; Horta, A.E.M. Departamento de Reprodução, Estação Zootécnica Nacional-INIA, Vale de Santarém; <dfra.ezn@mail.telepac.pt> Apresenta-se a estatística da produção in vitro de embriões bovinos em sistema de co-cultura com células da granulosa no nosso laboratório, de 1996 a 2002 e a sua variação sazonal. De um total de 4377 ovários processados em 150 sessões de cultura, obtiveram-se oócitos dos quais foram cultivados O número médio de oócitos recolhidos por ovário (8,4 ± 2,7) e a taxa de maturação dos oócitos (82,5% ± 0,08) não variaram significativamente entre anos. Pelo contrário, as taxas de clivagem, de embriões com 8 dias (D8) e de embriões extrusados, mostraram uma variação significativa entre os anos do estudo, com valores médios mínimos e máximos de 56,1-80,6%, 12,3-29,6% e 42,2-67,5%, respectivamente. Em relação às épocas do ano, somente a taxa de oócitos recolhidos/ovário e a percentagem de embriões em D8 mostraram variações significativas entre estações. O número de oócitos por ovário na Primavera (9,2) foi superior (P<0,05) ao observado no Outono (7,6) e a percentagem de embriões em D8 no Inverno (17,5%) foi inferior (P<0,02) à observada na Primavera (23,2%), Verão (26,1%) e Outono (26,4%). As percentagens de oócitos maturados (82,5% ± 0,08), de embriões clivados (69,6% ± 14,7) e extrusados (58,0% ± 31,3) não variaram entre épocas. Em todas as fases de produção de embriões neste sistema de cultura in vitro, verificou-se que os embriões extrusados e os embriões em D8 são as fases que apresentam maiores coeficientes de variação às médias (53,9% e 51,6%, respectivamente), seguindo-se o número de oócitos por ovário (32,5%), a percentagem de embriões clivados (21,1%) e por último a taxa de maturação dos oócitos (9,9%) com a menor variação. O rendimento global de produção de embriões foi de 23,5%, quando considerada a população total de embriões clivados. Os resultados mostram que o sistema in vitro de produção de embriões bovinos em cocultura com células da granulosa mostraram variações sazonais em relação ao número de oócitos recolhidos por ovário, com diminuição no Outono em relação à Primavera, sugerindo que naquela época os ovários das fêmeas dadoras estão menos activos, para o que pode ter contribuído uma distribuição desequilibrada da idade das fêmeas abatidas. O Inverno mostrou ser a época do ano mais desfavorável para a cultura dos embriões entre a clivagem e o dia 8, indicando que podem ter existido condições térmicas acidentais desfavoráveis na manipulação dos ovários entre o matadouro e o laboratório. Os resultados do nosso sistema de produção de embriões, embora se encontrem dentro dos padrões obtidos por outros laboratórios mundiais de referência, apontam a necessidade de identificar e controlar os factores na origem de elevadas variações nas taxas de embriões D8 e extrusados e dos ainda baixos rendimentos de embriões transferíveis

5 Seasonal variation on in vitro bovine embryo production between 1996 and 2002 Marques, C.C.; Pereira, R.M.; Baptista, M.C.; Vasques, M.I.; Horta, A.E.M. Departamento de Reprodução, Estação Zootécnica Nacional-INIA, Vale de Santarém; Data from seasonal variation on in vitro bovine embryo production (IVP) in our laboratory from 1996 to 2002 is presented. Embryos were co-cultured with granulosa cell monolayers and this statistics concerns only non-experimental groups using the IVP standard method. A total of oocytes collected from 4377 ovaries led to oocytes going to maturation in 150 in vitro culture sessions. The number of colleted oocytes per ovary (8.4 ± 2.7) as well as the oocyte maturation rate (82,5% ± 0,08) were similar among years. On the other hand, cleavage, D8 and extruded embryo rates, showed significant differences among years, with minimums and maximums of %, % and %, respectively. Concerning seasons, significant differences were observed only on collected oocytes/ovary (P<0.05) and D8 embryo rate (P<0.02). Spring gave significant more oocytes/ovary (9.2) than autumn (7.6) and significant less D8 embryo rates were achieved in winter (17.5%) than in spring (23.2%), summer (26.1%) and autumn (26.4%). Oocyte maturation rate (82.5% ± 0.08), cleavage rate (69.6% ± 14.7) and extrusion rate (58.0% ± 31.3) did not differ among seasons. Analysing each of the production steps, extruded and D8 embryo rates were those with higher coeficient of variation from means (53.9% and 51.6%, respectively), followed by oocytes/ovary (32.5%), cleavage rate (21.1%) and finally the oocyte maturation rate with the lesser variation (9.9%). The global net embryo production (D8) was 23.5%, from cleaved oocyte population. Results show that this in vitro bovine embryo production system in co-culture with granulosa cells monolayers show seasonal variations with collected oocytes/ovary beeing reduced in autumn vs. spring. This may be linked to a minor ovarian activity due to younger donnor heifers reaching the abattoir during this season. Winter was identifyed as the worst season as it affected embryo culture between cleavage and D8 embryos, suggesting that accidental cool temperature conditions affecting ovaries during handling between abattoir and the laboratory may have influenced later performances. Results obtained in our system although not so different from other worldwide laboratories, point out to the need of identification and control of those factors, which are causing such a large variation between culture sessions in D8 and extruded embryo rates as well as the yet small rates of transferable embryos

6 Reprodução Variação sazonal na qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro entre 1996 e 2002 Marques, C.C.; Pereira, R.M.; Baptista, M.C.; Vasques, M.I.; Horta, A.E.M. 1 Departamento de Reprodução, Estação Zootécnica Nacional-INIA, Vale de Santarém; <dfra.ezn@mail.telepac.pt> Neste trabalho apresenta-se a estatística sobre a variação da qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro nas fases de mórula a blastocito, ilustrando as variações ocorridas de 1996 a 2002 e entre estações do ano, no nosso laboratório. Os embriões em co-cultura com células da granulosa foram classificados ao 8º dia de cultura em grau 1, muito bom (G1) a grau 4 (G4) mau. Os embriões classificados até G3 (inclusive) são normalmente considerados elegíveis para os programas de transferência embrionária e os de G4 rejeitados. Nas 145 sessões de cultura efectuadas, os 1496 embriões classificados distribuíram-se em 4,7%, 24,4%, 33,2% e 37,7% nas categorias G1, G2, G3 e G4, respectivamente. Observaram-se diferenças significativas entre anos nas taxas de embriões classificados em G2 (min em 2001: 14,1%; max em 2002: 32,6%), G3 (min. em 2001: 18,2%; max. em 2000: 46,8%) e G4 (min. em 2000: 25,1%; max. em 1997: 63,5%). Os embriões classificados em G1 não variaram significativamente ao longo do período estudado. A taxa de embriões classificados em G4 correlacionou-se negativamente (P<0,05) com a dos embriões G1 (-0,34), G2 (-0,59) e G3 (-0,65). O mesmo tipo de correlação foi somente observado entre a taxas de embriões G1 e G2 (-0,20). Os embriões de pior qualidade (G4) predominaram significativamente nos anos de 1997, 1998 e 2001, enquanto que nos restantes 4 anos predominaram os embriões de G3. A taxa de embriões obtida em cada categoria não variou significativamente entre épocas do ano. Com excepção do Verão, nas outras épocas do ano verificou-se um aumento linear da percentagem de embriões de G1 para G4. Contudo, no Verão verificou-se um aumento somente até G3 e uma diminuição em G4, traduzindo uma melhoria da qualidade dos embriões. Os resultados mostram existir variação significativa da qualidade dos embriões entre os anos do período a que respeitou o estudo. Os factores na origem desta variação não puderam ser detectados. O verão foi a época do ano em que a qualidade dos embriões foi superior, sugerindo a existência de factores que, actuando sobre as fêmeas dadoras de oócitos ou no processamento dos ovários, favorecem a obtenção de embriões in vitro de melhor qualidade

7 Seasonal variation on in vitro bovine embryo quality, between 1996 and 2002 Marques, C.C.; Pereira, R.M.; Baptista, M.C.; Vasques, M.I.; Horta, A.E.M. Departamento de Reprodução, Estação Zootécnica Nacional-INIA, Vale de Santarém; Variations on in vitro bovine embryo quality from 1997 to 2002 and among seasons are presented. Embryos stages from late morula to blastocyst, produced in our laboratory, were classified at day 8 of culture from very good (grade 1 - G1) to bad (grade 4 - G4). Embryos scored G1 to G3 are usually eligible for ET programs and G4 rejected. In 145 embryo culture sessions studied, the 1496 classified embryos were allocated as 4.7%, 24.4%, 33.2% and 37.7% in categories G1, G2, G3 and G4, respectively. Embryo rates in categories G2 (min 2001: 14,1%; max 2002: 32,6%), G3 (min. 2001: 18,2%; max. 2000: 46,8%) and G4 (min. 2000: 25,1%; max. 1997: 63,5%), showed significant differences among years. No significant differences in G1 graded embryos were found between years, representing 4.7%. The rate of embryos classified as G4 was negatively correlated (P<0.05) with those of G1 (-0,34), G2 (-0,59) and G3 (-0,65). The same kind of correlation was found between G1 and G2 embryo rates (-0,20). The worst graded embryos (G4) significantly predominated in 3 years (1997, 1998 and 2001), while G3 embryos presented the higher rate in the remaining 4 years. There were no significant variations among seasons for each of the categories considered alone. Exception made for summer; there was a linear increase in embryo rates from G1 to G4 grades. In the summer season, however, embryo rates showed an increase only from G1 to G3 followed by a decrease in G4 graded embryos, traducing better quality embryos. The results show that embryo quality varied significantly among the years of study but responsible factors were not identified. Embryo quality was higher in summer, suggesting a beneficial role on better embryo quality production, of unknown factors in the ovary processing system or in ovary donors

8 Reprodução Influência da progesterona no desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro Pereira, R.M., Marques, C.C., Baptista, M.C., Vasques, M.I. and Horta, A.E.M. Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional - INIA, Vale de Santarém. Portugal. <dfra.ezn@mail.telepac.pt> Pretendeu-se estudar a influência da progesterona na dinâmica e qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro. Utilizaram-se dois sistemas de co-cultura de embriões e células da granulosa ou células epiteliais do oviducto bovino (BOEC) refrescados com meio de cultura (TCM % de soro) suplementado ou não com progesterona (33,52 ng ml -1 ) e/ou um inibidor dos receptores de progesterona (onapristone - OP, 0,01 mg ml -1 ). Vinte e duas horas após a inseminação dos oócitos maturados in vitro com sémen descongelado e submetido a um processo de swim-up, procedeu-se à divisão dos presumíveis zigotos em 5 grupos (Granulosa, n= 514; Granulosa com OP, n=509; BOEC, n=490; BOEC com progesterona, n=500; BOEC com progesterona e OP, n=502). Os embriões prosseguiram o seu desenvolvimento em co-cultura mantendo-se os respectivos tratamentos até aos dias de idade. Os resultados não evidenciaram diferenças entre os dois sistemas de cultura de embriões utilizados. A progesterona apresentou um efeito negativo no desenvolvimento embrionário interferindo no número e dinâmica de embriões em D8 produzidos em co-cultura com BOEC. Este efeito desapareceu na presença do OP. No sistema de co-cultura com células da granulosa e embriões, onde a progesterona é sintetizada, a inibição dos receptores de progesterona não influenciou significativamente o desenvolvimento embrionário. Estes resultados indicam que a progesterona interfere no desenvolvimento embrionário através de diferentes mecanismos de actuação dependendo das células presentes no sistema de cocultura

9 Progesterone effect on in vitro bovine embryo production Pereira, R.M., Marques, C.C., Baptista, M.C., Vasques, M.I. and Horta, A.E.M. Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional - INIA, Vale de Santarém. Portugal. <dfra.ezn@mail.telepac.pt> The objective of this study was to examine the effects of progesterone on in vitro bovine embryo development and quality. Two coculture systems of embryos and granulosa cells (GC) or bovine epithelial oviduct cells (BOEC) refreshed with embryo culture medium (TCM199 and 10% of oestrus cow serum) supplemented or not with progesterone (P4; ng ml -1 ) and/or a progesterone receptor inhibitor (onapristone, OP; 0.01 mg ml -1 ). Presumptive zigotes were transfered to monolayers after in vitro maturation and fertilization of bovine oocytes with thawed swim-up selected sperm. Embryo development was carried out according to the following groups: GC (n=514); GC plus OP (n=509); BOEC (n=490); BOEC plus P4 (n=500); BOEC plus P4 and OP (n=502). Embryos were checked for further development until the end of culture at day 12 (D12) or day 13 (D13). No differences were found in blastocyst rate and quality between embryos cultured under the two coculture systems when no treatments were added. Progesterone negatively affected blastocyst rate in BOEC system. This negative effect was anulated when progesterone inhibitor (OP) was added to the culture medium. Supplementation with OP had no significant effect on embryo development in granulosa cell coculture system, where progesterone is naturally sinthesized. These results demonstrate that progesterone influences early bovine embryo development through different biochemical mechanisms according to the cell type used in the coculture system

10 Reprodução Efeito das células epiteliais do oviducto bovino (BOEC) na capacidade fertilizante dos espermatozóides in vitro Vasques, M.I.; Baptista, M.C.; Pereira, R.M.; Marques, C.C.; Horta, A:E.M. Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional - INIA Vale de Santarém; <dfra.ezn@telepac.pt> Pretendeu testar-se o efeito de diferentes estratégias de fertilização na produção in vitro de embriões bovinos. Utilizaram-se BOEC oriundas de oviductos na fase folicular do ciclo para a capacitação dos espermatozóides (SPZ) após o swim-up, com ou sem meio de fertilização (meio Talp suplementado com heparina, penicilamina, hipotaurina e epinefrina). O sémen bovino foi descongelado e submetido a um processo de swim-up. Os oócitos maturados foram divididos em 4 grupos: testemunha - fertilização em gotas (40 ìl) de meio fertilização (n=334); BOEC+SPZ - fertilização em gotas (100 ìl) de meio de cultura de embriões (TCM199+10% soro bovino) com BOEC e onde os SPZ se encontravam em incubação prévia durante 1 a 4 horas (n=329); BOECFERT+SPZ - fertilização em gotas (100 ìl) de meio de fertilização com BOEC e onde os SPZ se encontravam em incubação prévia durante 1 a 4 horas (n=320) e FERTves - fertilização em gotas (40 ìl) de meio fertilização com vesículas BOEC (n=329). Os presumíveis zigotos, 22 horas após a inseminação dos oócitos, foram transferidos para o sistema de co-cultura com BOEC. Foi avaliada a viabilidade dos SPZ pós swim-up, 1-4 horas pós incubação com BOEC e 22h após a inseminação dos oócitos por coloração vital (azul tripan a 0,4%). A viabilidade dos SPZ 1 a 4 horas pós incubação com BOEC em meio de fertilização foi superior à da viabilidade em meio de embriões, situação que se inverte às 22 horas. A taxa de clivagem do grupo BOEC+SPZ foi significativamente (P<0,0001) inferior à dos outros grupos. As diferentes estratégias de fertilização utilizadas repercutiram-se posteriormente nas taxas de embriões D7 e D8 apresentando o grupo BOECFERT+SPZ mais embriões nestes dias que os grupo BOEC+SPZ e testemunha (P=0,02 e P=0,08, respectivamente). Conclui-se que a presença das BOEC durante a capacitação dos SPZ e fertilização dos oócitos é benéfica para a produção in vitro de embriões bovinos, desde que utilizado o meio de fertilização referido

11 Effect of bovine epitelial oviduct cells (BOEC) on in vitro fertilizing ability of bull spermatozoa Vasques, M.I.; Baptista, M.C.; Pereira, R.M.; Marques, C.C.; Horta, A:E.M. Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional - INIA Vale de Santarém; <dfra.ezn@telepac.pt> The influence of different in vitro fertilization procedures on bovine embryo production was studied. Bovine oviduct epithelial cells collected from follicular phase of the cycle were used to incubate spermatozoa (SPZ) after the swim up procedures, with or without fertilization medium (modified Tyrodes medium suplemmented with heparin, penicillamine, hipotaurine and epinephrine). Frozen semen was thawed and capacitated in modified Tyrodes medium supplemented with caffeine for 60 minutes at 38,5ºC. After maturation, oocytes were randomly alloted into four groups, followed by fertilization in 40µL droplets of fertilisation medium (CONTROL, n=334); in 100µL droplets of culture medium (TCM 199 supplemented with 10% oestrus cow serum) with BOEC monolayers previously incubated with spz for 1 to 4 hours (BOEC+SPZ, n=329), in 100µl droplets of fertilization medium with BOEC monolayers previously incubated with spz for 1 to 4 hours (BOECFERT+SPZ, n=320) and in 40 µl droplets of fertilization medium with BOEC vesicles (FERTves, n=329). Presumptive zygotes were transferred to BOEC monolayers at 22 hours after insemination for further development. Post-swim-up semen viability, 1 to 4 hours post-incubation in BOEC and at 22 hours post-insemination (pi), was assessed by tripan blue vital stain (0,4%). Semen viability 1 to 4 hours post-incubation in BOEC with fertilisation medium was higher than viability in culture medium, but this pattern was reversed at 22 hours pi. Cleavage rate in BOEC+SPZ was significantly lower than in all other groups (P<0.0001). Different fertilisation protocols further influenced embryo rate production. Day 7 and D8 embryo production was higher in BOECFERT+SPZ than in BOEC+SPZ or CONTROL groups (P=0.02 and P=0.08, respectively). In conclusion, spermatozoa capacitation and oocyte fertilisation in the presence of BOEC have benefitial effects on in vitro bovine embryo production, providing fertilisation medium is used

12 Reprodução Resposta da vaca mertolenga à superovulação com diferentes preparações hormonais de FSH Quaresma, M.A., Lopes da Costa, L.F., Robalo Silva, J. CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Rua Prof. Cid dos Santos Lisboa A resposta superovulatória após aplicação de duas preparações de FSH (Folltropin, Vetrepharma e FSH-P, Schering Corporation) foi estudada em vacas Mertolengas (n=21), com mais de 60 dias de pós-parto. Os tratamentos de superovulação (Grupo Folltropin; n=10 e Grupo FSH-P; n=11) foram iniciados dez a onze dias após a ocorrência do estro de referência, que foi induzido pela aplicação de um tratamento de norgestomet durante dez dias (Crestar, Intervet). As vacas tratadas com o Folltropin receberam 400 mg NIH FSH-P1, enquanto as tratadas com FSH-P receberam 36 mg Unidades Armour. Em ambos os casos a dose total foi dividida em 8 alíquotas iguais, as quais foram aplicadas consecutivamente durante 4 dias, com intervalo de 12 horas. As vacas de ambos os grupos foram injectadas com 22,5 mg PGF2α (Prosolvin, Intervet) aquando da sexta e da sétima injecções de FSH. A percentagem de vacas com resposta superovulatória foi semelhante nos dois grupos, mas a produção de embriões viáveis e a taxa de fertilização foi significativamente mais elevada (P <0,01) no Grupo Folltropin do que no Grupo FSH-P (6,4±3,7 versus 1,6±1,9 embriões/vaca e 92,2%; versus 32,3% nas vacas dos Grupos Folltropin e FSH-P, respectivamente). Os embriões viáveis do Grupo Folltropin apresentaram um maior desenvolvimento embrionário que os seus congéneres do Grupo FSH-P (51,7% de blastocistos versus 7,7% nos Grupos Folltropin e FSH-P, respectivamente), o que estava associado, no momento da recolha dos embriões, a concentrações plasmáticas de progesterona significativamente mais altas nesse grupo (29,8±5,4 versus 15,3±3,7; P <0,05). No entanto, a taxa de gestação foi significativamente mais baixa (P <0,05) após transferência de embriões provenientes da superovulação com Folltropin do que com FSH-P. Isto poderá traduzir o efeito da assincronia entre o desenvolvimento do embrião e o ambiente uterino. O número total de recolhas, sugere que esta raça autóctone apresenta boa resposta superovulatória. A baixa taxa de fertilização nas fêmeas do Grupo FSH-P confirma sugestões anteriormente proferidas, que responsabilizam os elevados níveis de LH pela redução da taxa de fertilização. Os resultados também sugerem que o desenvolvimento dos embriões se relaciona com as concentrações de progesterona, tal como observado por outros autores na ovelha

13 Response to superovulation of Mertolengo cows treated with two different FSH preparations Quaresma, M.A., Lopes da Costa, L.F., Robalo Silva, J. CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Rua Prof. Cid dos Santos Lisboa The response to superovulation with two FSH preparations (Folltropin, Vetrepharma and FSH-P, Schering Corporation) was studied in parous Mertolengo cows (n=21) with more than 60 days of calving. The superovulatory treatments (Group Folltropin; n=10 and Group FSH-P; n=11) started ten to eleven days after a reference oestrus that followed a 10 days norgestomet treatment (Crestar, Intervet). Folltropin treated cows received 400 mg NIH FSH-P1 and FSH-P treated cows received 36 mg Armour units. In both cases the product was divided in 8 equal doses, given during 4 consecutive days, at 12 hours interval. All cows were injected with 22.5 mg PGF2α (Prosolvin, Intervet) at the time of the 6 th and 7 th FSH injections. The percentage of cows with superovulatory response was identical in both groups, but viable embryo production and oocyte fertilization rate were significantly greater (P <0.01) in Folltropin than in FSH-P treated cows (6.4±3.7 versus 1.6±1.9 embryos/cow and 92.2% versus 32.3% for Folltropin and FSH-P cows, respectively). The viable embryos recovered from Folltropin Group showed a more advanced development than those recovered from the FSH-P Group (51.7% at blastocyst stage in Folltropin versus 7.7% in FSH-P Group). This was associated to significantly higher plasma progesterone concentrations, at embryo recovery (29.8±5.4 versus 15.3±3.7, P <0.05). However, pregnancy rate was significantly lower in Folltropin than in FSH-P derived embryos, which may reflect the effect of asynchrony between embryo development and recipient uterine environment. Total ova recovered showed that this native cattle breed has good superovulatory response. The low oocyte fertilization rate in FSH-P treated cows confirms the suggestion of others that the high LH content of this hormone preparation may negatively affect fertilization. The results also suggest that embryo development is related to progesterone concentrations, like observed by others in sheep

14 Reprodução Implementação em Portugal da técnica de fertilização in vitro em ovinos Baptista, M.C.; Marques, C.C.; Vasques, M.I.; Pereira, R.M.; Barbas, J.P. e Horta, A.E.M. Departamento de Reprodução, Estação Zootécnica Nacional-INIA, Vale de Santarém; <dfra.ezn@mail.telepac.pt> Pretendeu-se implementar a técnica de fertilização in vitro (IVF) em ovinos utilizando sémen congelado de carneiros das raças Merino e Serra da Estrela desde Recolheram-se no matadouro local de Santarém (Santacarnes), 1563 ovários de fêmeas ovinas de idade igual ou inferior a 1 ano dos quais se aspiraram 4535 oócitos (265 ovários em 2000 dos quais foram recolhidos 561 oócitos, 896 durante 2001 dos quais se aspiraram 2712 oócitos e 402 ovários em 2002 fornecendo 1262 oócitos). Para a fertilização in vitro o sémen, proveniente de dois métodos de congelação, foi sujeito a um processo de capacitação pelo método de swim-up (meio de Brackett e Olliphant + 20% de soro de ovelha em cio). Os oócitos maturados in vitro foram inseminados usando uma concentração de 1 x 10 6 spz ml 1. No suporte ao desenvolvimento embrionário foram utilizados dois sistemas de co-cultura, células da granulosa e células BOEC (células epiteliais de oviducto bovino). A taxa de clivagem foi determinada 48 horas após a inseminação e o desenvolvimento embrionário acompanhado até aos 12 dias. A taxa média de recolha do oócitos por ovário foi de 2,12 para o ano de 2000, 3,03 em 2001 e 3,13 em 2002 (média: 2,8 oócitos por ovário). A taxa global de maturação (oócitos maturados/oócitos cultivados) foi de 67,9% (1º ano: 64,5%; 2º ano: 64,3%; 3º ano: 74,9%). A mobilidade individual média do sémen após o swim-up foi de 5,7% com o pior método de congelação do sémen (2000), ascendendo para 35,1% após modificações nas rampas de congelação do sémen e alterações nos meios de capacitação a partir de Após swim up, o índice de aglutinação e a mobilidade individual espermáticos mostraram uma correlação significativa (r=0,67; P<0,001). Em 2001, as melhorias qualitativas observadas nos spz permitiram passar da ausência total de clivagem para valores de 23,2% (22,1% no sistema de co-cultura com células da granulosa e de 25% no sistema de cultura BOEC) e 48,2% em 2002 (co-cultura de granulosa). Em 2001 obtiveram-se embriões em D8 em apenas 3 sessões com taxas de 30,4%, 6,5% e 27,3%. Numa destas sessões obtiveram-se 6 embriões extrusados em D10, sendo 4 na co-cultura com BOEC e 2 na co-cultura com células da granulosa. Em 2002, obtiveram-se em D7 sessenta mórulas em 8 de 9 sessões (15,9%) e em D8 dezoito blastocistos (6,1%) em 4 de 9 sessões. Os resultados mostram que a taxa de maturação de oócitos ovinos é aceitável e que a fertilização in vitro depende da utilização de sémen congelado com boa qualidade. As taxas de clivagem melhoraram ao longo do tempo, e as de embriões são promissoras, mostrando ser ainda necessário identificar e corrigir factores que estão na origem da variabilidade entre sessões

15 Implementation of ovine in vitro fertilization technique in Portugal Baptista, M.C.; Marques, C.C.; Vasques, M.I.; Pereira, R.M.; Barbas, J.P. e Horta, A.E.M. Departamento de Reprodução, Estação Zootécnica Nacional-INIA, Vale de Santarém; <dfra.ezn@mail.telepac.pt> Since 2001, the in vitro fertilization technique (IVF) was implemented in our laboratory using frozen semen from Merino and Serra da Estrela rams. A thousand and five hundered sixty-three ovaries were collected from young female ewes with less than one-year age which supplied 4535 oocytes (265 ovaries and 561 oocytes in 2000; 896 ovaries in 2001 and 2712 oocytes; 402 ovaries and 1262 oocytes in 2002), were collected at a local abattoir. Thawed semen (1 x 10 6 spz ml 1 ), frozen by two different methods, was used to fertilize matured oocytes after a swim up procedure (Brackett and Olliphant medium + 20% of ewe estrous serum). Cleavage rates were determined 48 h after insemination. Granulosa and bovine oviduct epithelial cells (BOEC) were used to support embryo development during 12 days. Each ovary supplied an average of 2.12 oocytes in 2000, 3.03 in 2001 and 3.13 in 2002 (mean: 2.8 oocytes/ovary). The global oocyte maturation rate (matured/cultured) was 67.9% (64.5%, 64.3% and 74.9% for 2000, 2001 and 2002, respectively). Sperm motility after swim up was 5.7% with the worst freezing method (2000), rising up to 35.1% after introducing changes in semen freezing and capacitation medium (2001). After swim up, sperm aglutination index and sperm motility were highly correlated (r=0,67; P<0,001). The improvements observed in sperm quality during 2001 allowed growing from null cleavage rates to 23.2% (22.1% with granulosa and 25% with BOEC co-culture) and 48.2% in 2002 (only granulosa co-culture). D8 embryos were achieved only in 2001 culture sessions with rates of 30.4%, 6.5% and 27.3%. At one of these sessions 6 extruded embryos were obtained in D10 (4 with BOEC and 2 with granulosa cocultures). In 2002, sixty D7 morulae in 8 out of 9 sessions (15.9%) and eighteen D8 blastocysts in 4 out of 9 sessions (6,1%) were obtained. Results show that ovine oocyte maturation rate is acceptable and that IVF depends on using frozen semen with good quality. Cleavage rates improved with time and experience, and D8 embryo rates are promising in spite of a few number of sessions succeeding. It urges to identify and correct factors underlying on the accounted variation in embryo production

16 Reprodução Controlo hormonal da actividade mioeléctrica uterina S. Cavaco Gonçalves, M.I. Vasques, C.C. Marques, A.E.M. Horta Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional-INIA, Vale de Santarém. Este trabalho teve como objectivo avaliar o efeito das hormonas estradiol e progesterona e do antagonista da progesterona onapristone, administrados individualmente ou em associação, sobre a actividade mioeléctrica uterina (EMG). Foi utilizada uma ovelha adulta ovariectomizada da raça Merino, na qual previamente foram implantados dois eléctrodos na extremidade proximal do corno próximo à junção com o oviducto (corno proximal - CP), dois eléctrodos na porção intermédia do corno (corno médio - CM) e dois eléctrodos no corpo uterino (CUT). No momento dos registos, sempre com 30 minutos de duração, os eléctrodos foram ligados a um sistema modular computorizado LABLINK V da Coulbourn Instruments. Além dos registos realizados diariamente, durante 9 dias, no animal sem qualquer tratamento (Grupo Testemunha), foram realizados registos da EMG após administração dos seguintes fármacos: 12,5 mg de progesterona (grupo P), 30 µg de estradiol-17β (grupo E), 65 mg de onapristone (grupo ZK), estradiol-17 β e onapristone (grupo EZK) e progesterona e onapristone (grupo PZK). Em cada tratamento foram realizados registos da EMG em momentos pré-determinados, de acordo com a cinética plasmática esperada da droga administrada. A administração de progesterona induziu de uma forma geral, nas três porções uterinas em estudo, uma redução da EMG, o que poderá traduzir uma redução da actividade uterina. A dose de progesterona administrada não foi, contudo, suficiente para induzir um bloqueio total da actividade uterina bem como um efeito continuado da hormona, tendo sido observada uma interrupção temporária do seu efeito inibidor, quer no CP, quer no CUT. A administração de estradiol-17β conduziu a um aumento da EMG em todas as porções uterinas em estudo, depois de uma redução inicial no CP e no CM. O antagonista da progesterona onapristone (grupo ZK) parece actuar diferencialmente nas três porções uterinas, uma vez que ao nível do CM houve um aumento da EMG, enquanto no CUT se verificou uma redução. Quanto ao CP a resposta foi de menor duração e não uniforme, com uma redução inicial, um aumento intermédio seguido, às 22,5 horas pós administração da droga, de uma resposta igual à da Testemunha. A associação desta droga quer com progesterona (grupo PZK), quer com estradiol-17β (grupo EZK), causou modificações semelhantes. Assim, ao nível do CP e do CUT foi observado um aumento de actividade, enquanto que no CM se verificou uma alternância entre períodos de maior actividade e períodos de menor actividade. A análise da actividade coordenada nos 3 locais de registo (CP, CM e CUT) revela uma redução significativa desta actividade em todos os grupos tratados em relação à Testemunha, o que traduzirá a existência de uma actividade menos organizada, situação que surge agravada no grupo EZK, no qual há um aumento significativo da actividade descoordenada (CP CUT CM ou CM CUT CP). Foi igualmente observada uma inversão no sentido das contracções coordenadas em 3 pontos, com predomínio do sentido posterior. A administração do antagonista da progesterona parece assim, causar modificações da motilidade uterina, que poderão ser as responsáveis pela ausência de fertilização a ela associada e anteriormente por nós detectada

17 Hormonal control of uterine myoelectric activity S. Cavaco Gonçalves, M.I. Vasques, C.C. Marques, A.E.M. Horta Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional-INIA, Vale de Santarém. In this work we intended to study the effect of progesterone, oestradiol and progesterone antagonist onapristone, given alone or in association, on uterine myoelectric activity (EMG). It was used an ovariectomized Merino ewe with previously implanted electrods. Two electrods were implanted on the uterine horn near to the ampullary-isthmic junction (CP), two on the middle portion of the uterine horn (CM) and a third pair on the uterine body (CUT). The electrods were connected to a computer-based modular system, LABLINK V (Coulbourn Instruments ). EMG was monitored daily during 30 minutes periods for 9 days long on the animal without any treatment (group Testimony). It was also monitored in pre-determined moments according to the drug administered, after administration of 12,5 mg of progesterone (group P), 30 µg of oestradiol-17β (group E), 65 mg of onapristone (group ZK), oestradiol-17β plus onapristone (group EZK) and progesterone plus onapristone (group PZK). Progesterone administration induced a reduction in EMG on the three uterine portions, which may reflect a reduction in uterine activity. The amount of the hormone given seemed to be insufficient to completely block uterine activity, as an interruption on the above referred blockage was observed on CP and CUT. Oestradiol-17β administration increased EMG on all uterine portions after an initial reduction on CP and CM. The three uterine portions seem to react differently to onapristone administration, CM exhibiting an increase in EMG and CUT a reduction. CP exhibited an initial reduction which was followed by an interpolate increase, with EMG being equal to Testimony by 22,5 hours after onapristone administration. The association of onapristone with oestradiol-17β (group EZK) or progesterone (group PZK) induced similar effects, CP and CUT exhibiting increased EMG and CM an alternation between periods of increased and reduced activity. Co-ordinated activity between CP, CM and CUT was reduced in treated groups when compared with Testimony revealing a less organized activity in those groups. In EZK group it was also noted an increase in uncoordinated activity (CP CUT CM or CM CUT CP). Coordinated activity between three uterine portions revealed also an inversion of direction, being hindered direction activity predominant. The modifications in uterine motility described above may be responsible for the lack of fertilization associated with onapristone administration detected in a previous work

18 Reprodução Influência do diluidor, época e exploração, nos resultados da IA em ovelhas de raça Saloia Barbas, J.P.; Mascarenhas, R.D.; Horta, A.E.M.; Tavares, H.*; Cannas-Serra, C.*; Cardigos, L.*; Moura, R.*; Cannas Simões, J.P.** Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional-INIA, Vale de Santarém; *Direcção Regional do Ribatejo e Oeste, 2000 Santarém; **Associação Criadores de Bovinos da Raça Preta, Ap 118, 2135 Samora Correia Pretendeu-se com este trabalho verificar o efeito de alterações no diluidor seminal, da época e da exploração nos resultados reprodutivos de ovelhas Saloias inseminadas artificialmente. Este trabalho decorreu em duas explorações (PEP e HGV) com ovelhas multíparas de raça Saloia mantidas em regime de pastoreio e exploradas na função leiteira. A indução e sincronização do estro foi efectuada com esponjas vaginais contendo 40 mg de FGA (Chronogest ), sendo administrados 500 UI de ecg (Intergonan ) no momento da sua remoção. O sémen foi recolhido com vagina artificial sendo seleccionados para a IA ejaculados com mobilidade massal 3 e percentagem de espermatozóides móveis 70 %. Na exploração PEP inseminaram-se (sem prévia detecção de estro) dois grupos de ovelhas, um em Abril (Grupo 1; n=379) e outro em Setembro (Grupo 2; n=104). Na exploração HGV inseminou-se um grupo de ovelhas em Abril (Grupo 3; n=101). Em cada grupo foram testados dois diluidores de sémen, um à base de leite de vaca desnatado (diluidor L) e outro com meio Tris (Trizma Base, Sigma) adicionado de 1,5 % de gema de ovo (diluidor O). As ovelhas receberam uma única inseminação com uma dose de sémen refrigerado (15ºC) contendo 300 milhões de espermatozóides totais, 55 horas após a remoção das esponjas vaginais. Nas ovelhas inseminadas em Abril utilizando o diluidor L (Grupo 1, n=181) a fertilidade, a prolificidade e a fecundidade foram respectivamente 35%, 156% e 55%, vs 28%, 134% e 38% com a aplicação do diluidor O (n=198), havendo uma diminuição significativa (P=0,04) na prolificidade e fecundidade com o diluidor O. Nas inseminações de Setembro (PEP; Grupo 2), utilizando o diluidor L (n=47), a fertilidade, a prolificidade e a fecundidade foram respectivamente de 47 %, 150 % e 71 % vs 30 %, 147 % e 44 % com o diluidor O (n=57), sendo a fertilidade e fecundidade significativamente inferiores neste último (P=0,07). Na exploração HGV (Grupo 3) e usando o diluidor L (n=58) em Abril, a fertilidade, a prolificidade e a fecundidade foram respectivamente de 50 %, 159 % e 79 % vs 47 %, 160 % e 74 % recorrendo ao diluidor O (n=43), não se registando diferenças significativas. A fertilidade e fecundidade em Abril, foi significativamente diferente entre explorações, com qualquer dos diluidores. Observou-se um efeito directo da exploração sobre a fertilidade e fecundidade, independentemente do tipo de diluidor utilizado. As diferenças na fecundidade entre diluidores foram anuladas pelo tipo de exploração. O diluidor de leite originou um aumento da fertilidade somente em Setembro, sugerindo existir uma interacção entre a época e o tipo de diluidor

19 Effect of semen extender, season and farm, on AI results in Saloia ewes Barbas, J.P.; Mascarenhas, R.D.; Horta, A.E.M.; Tavares, H.*; Cannas-Serra, C.*; Cardigos, L.*; Moura, R.*; Cannas Simões, J.P.** Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional-INIA, Vale de Santarém; *Direcção Regional do Ribatejo e Oeste, 2000 Santarém; **Associação Criadores de Bovinos da Raça Preta, Ap 118, 2135 Samora Correia The effect of two semen extenders, season and type of exploitation were evaluated on reproductive parameters of AI ed Saloia ewes. This work was performed in two different exploitations (PEP and HGV) with multiparous Saloia ewes kept for milk production in an extensive system. Oestrus and ovulation were synchronized with vaginal sponges (Chronogest, 40 mg) and i.m. injection of ecg (Intergonan, 500 IU, at sponge removal). Semen was collected with an artificial vagina and only ejaculates with good sperm wave (scoring 3) and progressive (scoring >70%) motion were selected. AI was performed on unchecked oestrus ewes 55 h after sponge removal with a single dose of refrigerated semen (300 million total spz). In PEP exploitation AI was done in April (Group 1; n=379) and September (Group 2; n=104) and in HGV only in April (Group 3; n=101). Each group received two different semen extenders based on skim milk (SM) and Tris medium plus 1,5% egg-yolk (EY). April AI ed ewes (PEP, Group 1) with SM extender (n=181) compared with those receiving EY (n=198), showed 35%, 156% e 55%, vs 28%, 134% e 38% for fertility, prolificacy and fecundity, respectively, with significant differences on fertility and fecundity (P=0.04). In September (PEP, Group 2), SM (n=47) vs. EY (n=57) showed 47 %, 150 % e 71 % vs 30 %, 147 % e 44 % for fertility, prolificacy and fecundity, respectively, fertility and fecundity being significantly different between extenders (P=0.07). In HGV exploitation (Group 3), SM (n=58) vs EY (n=43) showed 50 %, 159 % e 79 % vs 47 %, 160 % e 74 % for fertility, prolificacy and fecundity, respectively, with no differences between extenders. Fertility and fecundity in April concerning both extenders are significantly different between exploitations. A direct effect of exploitation on fertility and fecundity, independently of the extender used was observed. Fecundity differences between extenders were abolished by the exploitation factor. Extender SM allowed an increase on September fertility, but not in spring, suggesting that an interaction between season and extender effects exists

20 Reprodução Efeito da aplicação vaginal de agentes dilatadores do cérvix (misoprostol e sulfato de terbutalina) sobre os resultados da IA em raças ovinas locais Barbas, J.P.; Cavaco Gonçalves, S.; Baptista, M.C.; Marques, C.C.; Vasques, M.I.; Horta, A.E.M. Departamento de Reprodução Animal, Estação Zootécnica Nacional INIA, Vale de Santarém Pretendeu avaliar-se o efeito da administração dos agentes dilatadores cervicais misoprostol (PGE 1 ) e sulfato de terbutalina (β-agonista), no momento da IA com sémen refrigerado, sobre a fertilidade (fert.), prolificidade (prol.) e fecundidade (fec.). Foram utilizadas três raças de ovelhas, a Merino (n=46), a Saloia (n=312) e a Serra da Estrela (n=66), localizadas em explorações diferentes. A sincronização do estro e a indução da ovulação foram realizadas com esponjas vaginais, contendo 40 mg de FGA (Chronogest ) e 500 UI de ecg (Intergonan ), administradas no momento da remoção das esponjas. As ovelhas foram inseminadas sem prévia detecção do estro, 55 horas após a remoção das esponjas vaginais, com uma dose de sémen refrigerado (+15 ºC) contendo 300 milhões de espermatozóides totais. Nas ovelhas tratadas administrou-se por via transvaginal 400 µg de misoprostol e 2,5 mg de sulfato de terbutalina imediatamente após a IA. No efectivo Merino, a fert., a fec. e a prol. foi respectivamente de 65 %, 90 % e 138 %, nas ovelhas controlo (n=20) e de 46,2 %, 76,9 % e 167 %, respectivamente, nas ovelhas tratadas (n=26). Não houve diferenças significativas entre grupos. Nas ovelhas Saloias que serviram de controlo (n=146) registaram-se 39 % (fert.), 54,8 % (fec.) e 140 % (prol.), e 34,3 %, 48,8 % e 142 %, respectivamente nas ovelhas tratadas (n=166), não havendo diferenças entre grupos. Nas ovelhas controlo da raça Serra da Estrela (n=32) registaram-se 53,1 % (fert.), 75 % (fec.) e 141 % (prol.) sendo os valores homólogos nas tratadas (n=34) de 35,3 %, 58,9 % e 158 %, não havendo variações significativas entre grupos. Agrupando todos os animais que serviram de controlo (n=198), independentemente da raça, obtiveram-se 43,9 % (fert.), 61,6 % (fec.) e 140 % (prol.) sendo os valores homólogos nas tratadas (n=226), 35,8%, 53,1 % e 148 %. Nas ovelhas controlo a fert. foi tendencialmente superior à das tratadas (p<0,08). O efeito cervico-dilatador da associação destas drogas, anteriormente evidenciado em estudos de penetrabilidade cervical, não se confirmou benéfico sobre os parâmetros reprodutivos quando da sua administração durante a IA. Isto poderá ser devido à forma de administração das drogas provocando alterações no transporte e/ou capacitação do esperma