For this purpose, it was firstly analyzed the optimal window of time/storage conditions to process lipoaspirate upon harvesting of the samples.

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1 Abstract There are two major types of stem cells with potential application in tissue engineering and regenerative medicine, namely, embryonic stem cells and adult stem cells. Embryonic stem cells (ESCs) offer exciting possibilities as they can give rise to cell types of the three germ layers, depending on culturing conditions. However it has been difficult to establish their culturing methodologies and the use of human ESCs involves ethical and legal considerations that are different in each country. Therefore, adult stem cells, which are present in several different tissues and organs, have been widely investigated. Many sources of these stem cells have been explored, such as blood, adipose tissue, umbilical cord, amniotic fluid, synovium, periosteum, and others, but the majority of the studies have focused on bone marrow. Nevertheless, adipose tissue has gained great attention as a source of adult stem cells since this is probably the most abundant and easily accessible source of stem cells for regenerative medicine applications. Adipose tissue can be found in all clinical relevant species and adipose-derived stromal/stem cells can differentiate along multiple lineage pathways. Moreover, the common procedure to harvest adipose tissue -the liposuction- is performed most frequently as elective surgery and is less traumatic and painful than that associated to the harvesting of bone marrow, for example. This also facilitates their use in autologous approaches. Therefore, the potential advantages of using human adipose-derived stem cells (hascs) in tissue engineering and regenerative medicine are well recognized. Nevertheless, the transplantation of these cells when exposed to animal-derived reagents presents severe risks, such as cell-mediated immune response, rejection, severe anaphylaxis, viral or bacterial infections, prions and as yet unidentified zoonoses. For this reason, it is essential to standardize isolation and culture procedures, and also to assess the potential of ASCs in pre-clinical models, documenting their safety and efficiency in specific regenerative strategies. With this in mind, the main goals proposed for this work were as follows: - Determine optimal parameters for storage and processing of adipose tissue samples; - Eliminate the use of xenogenic products while isolating and culturing ASCs, finding alternatives that will not change yield or regenerative potential of these cells; - Assess any significant difference in cells isolated from different fat depots; - Evaluate in vivo the regenerative potential of these cells, combined with adequate scaffold materials, in a bone tissue engineering strategy.

2 For this purpose, it was firstly analyzed the optimal window of time/storage conditions to process lipoaspirate upon harvesting of the samples. Lipoaspirate samples were kept at room temperature and processed in consecutive days (up to 4 days). Results demonstrated that cell isolation within the first 24 hours after tissue harvesting is crucial for the success of this procedure. Subsequently, alternatives to animal-derived products were evaluated for processing adipose tissue and passaging the cells, namely collagenase and trypsin products respectively. In both cases, the alternatives tested maintained total numbers of cells isolated and recovered, as well as their differentiation potential, revealing no changes in the expression of cell surface markers after treatment with each of the products studied. In a subsequent study it was evaluated the ratio between ASC and immune cells found in subcutaneous (SQ) and infrapatellar fat pads (IPFP) from the knee in osteoarthritic patients, and compared the immunophenotype and differentiation potential of ASCs isolated from subcutaneous fat depots from these patients and healthy donors. No significant differences were found in either of the comparisons; therefore IPFP provides a potential source of ASCs for tissue engineering and regenerative medical applications comparable to that of subcutaneous adipose tissue. Finally, the in vivo regenerative potential of ASCs was evaluated in a tissue engineering approach, i.e. combined with a scaffold material. Cells were seeded onto SPCL scaffolds, which were developed at 3B s research group and for which there are reported evidences of suitability for bone regeneration strategies. Critical size defects were created in a nude mice calvaria model and scaffolds with and without ASCs were implanted. Results clearly demonstrated that SPCL scaffolds exhibit adequate porous structure to support cell adhesion and proliferation and also tissue ingrowth upon implantation of the construct. These outcomes showed the potential of SPCL scaffolds to be used in tissue engineering strategies to regenerate bone tissue defects, and moreover, that ASCs enhance the regeneration of bone tissue providing enhanced tissue formation. In summary, these studies allowed the optimization of ASCs isolation and culture methodologies, and demonstrated the importance of these cells in tissue engineering and regenerative medicine approaches, namely in bone tissue regeneration. These outcomes have direct implication on the broader implementation and application of ASCs in clinical practice, establishing these cells as a promising alternative for tissue engineering therapy.

3 Resumo Existem dois tipos de células com grande potencial de aplicação em engenharia de tecidos e medicina regenerativa, nomeadamente as células estaminais embrionárias e as células estaminais adultas. As células estaminais embrionárias oferecem excitantes possibilidades uma vez que retêm a capacidade de se diferenciarem nos vários tipos celulares de qualquer uma das camadas germinativas, dependendo das condições de cultura. No entanto, tem sido difícil estabelecer a metodologia de cultura adequada, e o seu uso acaba por estar envolvido em questões éticas e legais que variam em cada país. Assim, o uso de células estaminais adultas, que podem ser encontradas em diferentes tecidos e orgãos, tem sido amplamente investigado. Muitas fontes deste tipo de células tem sido exploradas, como o sangue, tecido adiposo, cordão umbilical, líquido amniótico, sinóvia, periósteo, cartilagem, entre outros, mas a maioria dos estudos focam a medula óssea. Não obstante, o tecido adiposo tem conseguido muita atenção como fonte de células estaminais adultas, uma vez que se trata provavelmente da fonte mais abundante e de fácil acesso para aplicações de medicina regenerativa. O tecido adiposo pode ser encontrado em todas as espécies clinicamente relevantes e as células estaminais derivadas do tecido adiposo podem diferenciar-se em múltiplas linhas celulares. Para além disto, o procedimento de recolha destas células, a lipoaspiração, é geralmente executado como cirurgia electiva, estética e de ocasião, e é muito menos traumático e doloroso, e envolvendo menos riscos do que, por exemplo, a recolha de medula óssea, ou menos considerações éticas e legais que o uso de células embrionárias. Todo o potencial do uso das células estaminais derivadas do tecido adiposo em engenharia de tecidos e medicina regenerativa, é bem reconhecido. Torna-se assim necessário padronizar a sua utilização, isolamento e cultura; reduzir ou eliminar o risco de resposta imunitária mediada por células, o risco de anafilaxia, infecção vírica ou bacteriana, priões e zoonoses ainda não identificadas, que o transplante destas células quando usados reagentes de origem animal pode induzir. Tendo isto em mente, os principais objectivos propostos para este trabalho foram os seguintes: - Determinar parâmetros óptimos de armazenamento e processamento de amostras de tecido adiposo; - Eliminar o uso de reagentes xenogénicos no isolamento e cultura destas células, encontrando alternativas que não alterem os números totais de células obtidas nem o seu potencial regenerativo;

4 - Verificar se existem diferenças significativas nas células isoladas de diferentes locais de recolha de tecido adiposo; - Aplicar estas células in vivo de forma a avaliar o seu potencial regenerativo em modelo de regeneração óssea. Para este propósito, foi avaliado o intervalo de tempo em que pode ser processado o lipoaspirado de forma a conseguir obter um número óptimo de células. Os lipoaspirados foram mantidos a temperatura ambiente e processados durante 4 dias consecutivos. Os resultados demonstraram que o isolamento durante as primeiras 24 horas após recolha do tecido, são fundamentais para o sucesso do procedimento. Em seguida, foram procuradas alternativas a produtos de origem animal, para o processamento e cultura das células, nomeadamente a colagenase usada na digestão enzimática do tecido adiposo e a tripsina usada na passagem das células em cultura. Em ambos os casos, as alternativas testadas, permitiram a manutenção dos números totais de células isoladas e cultivadas, e do seu potencial de diferenciação, não evidenciando nenhum tipo de alteração na expressão de marcadores de superfície após o tratamento com os diferentes produtos. Um dos estudos realizados avaliou diferenças entre o rácio de células imunitárias e células estaminais encontradas nos depósitos de gordura subcutânea do joelho (SQ) e infrapatelar (IPFP) de doentes com osteoartrite, e comparou o imunofenótipo e potencial de diferenciação das células isoladas de depósitos subcutâneos de pessoas saudáveis com as de pessoas com osteoartrite, não tendo sido encontradas diferenças significativas em nenhum dos casos. Assim, a gordura infrapatelar, pode ser uma fonte de células estaminais derivadas do tecido adiposo comparável às do tecido adiposo subcutâneo. Por último, foi avaliado in vivo o potencial regenerativo das células estaminais derivadas do tecido adiposo numa abordagem de engenharia de tecidos, isto é, combinadas com uma estrutura tridimensional de suporte adequada. As células foram semeadas em SPCL (mistura de amido com policaprolactona), um biomaterial desenvolvido no grupo 3B s e com comprovado potencial em aplicações de regeneração óssea. Foram induzidos defeitos críticos craniais em murganhos atímicos, e os suportes tridimensionais de SPCL foram implantados com e sem células. Os resultados obtidos, demonstraram que as estruturas tridimensionais de SPCL possuem propriedades mecânicas e porosidade adequadas para suportar a adesão e proliferação celular, bem como a neoformação de tecido, após implantação. Estes resultados confirmaram o potencial do SPCL em estratégias de engenharia de tecidos para regeneração óssea, e mais ainda, que a presença de células estaminais potencia a regeneração tecidular.

5 Concluindo, estes trabalhos permitiram a optimização de metodologias de isolamento e cultura de células estaminais do tecido adiposo, e demontraram a sua importância em estratégias de engenharia de tecidos e medicina regenerativa, nomeadamente o seu potencial no campo da regeneração óssea. Os resultados obtidos, permitirão uma implementação e aplicação mais alargadas das células estaminais do tecido adiposo na prática clínica, estabelecendo-se como promissora alternativa terapêutica em engenharia de tecidos. O resumo em Português desta Tese não se encontra redigido segundo o novo acordo ortográfico.